Abstract
Alle next-generation sequencing (NGS) procedures omvatten testen uitgevoerd in het laboratorium bench ( "wet bench") en data-analyses met behulp van bioinformatica pijpleidingen ( "dry bench"). Beide elementen essentieel om nauwkeurige en betrouwbare resultaten, die van essentieel belang voor klinische laboratoria produceren. Gerichte NGS technologieën hebben in toenemende mate genade gevonden in de oncologie-toepassingen vooraf precisie geneeskunde doelstellingen te helpen, maar de werkwijzen omvatten vaak losgekoppeld en variabele natte en droge bank workflows en ongecoördineerde reagens sets. In dit rapport beschrijven we een werkwijze voor sequentiebepaling tegen kanker monsters met een 21-gen paneel als voorbeeld van een algehele gerichte NGS systeem. Het systeem integreert functionele DNA kwantificatie en kwalificatie, single-tube multiplex PCR verrijking, en de bibliotheek zuivering en normalisatie met behulp van analytisch-geverifieerd, single-source reagentia met een standalone bioinformatica suite.Daardoor nauwkeurige variant oproepen van lage kwaliteit en lage hoeveelheid formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) en fijne naald aspiratie (FNA) tumor biopsieën worden bereikt. De methode kan routinematig beoordelen kanker-geassocieerde varianten van een invoer van 400 amplificeerbaar DNA-kopieën, en is modulair opgebouwd om nieuwe gen inhoud tegemoet te komen. Twee verschillende types van analytisch ingestelde controles zorgt voor kwaliteitsborging en hulp bescherming call nauwkeurigheid klinisch relevante monsters. Een flexibele "tag" PCR stap bedt platform-specifieke adapters en index-codes om te proeven barcoding en verenigbaarheid met gemeenschappelijke benchtop NGS instrumenten mogelijk te maken. Belangrijk is dat het protocol is gestroomlijnd en kan 24 sequentie-ready bibliotheken te produceren in een enkele dag. Ten slotte is de aanpak koppelt natte en droge bank processen door de integratie van pre-analytisch monster kwaliteitscontrole resultaten direct in de variant bellen algoritmen om mutatie detectie nauwkeurigheid te verbeteren en te differentiëren vals-negatieve en indeterminate gesprekken. Deze doelgerichte NGS methode maakt gebruik van de vooruitgang in zowel wetware en software om high-diepte, multiplex sequencing en gevoelige analyse van heterogene kanker monsters voor diagnostische toepassingen te realiseren.
Introduction
Precisie medicijnen gebaseerd op de individualisering van diagnostische en therapeutische opties voor patiënten. De belofte van behandelingen op maat is een direct gevolg van een beter begrip van de ziekte trajecten die de koppeling van moleculaire diagnostiek en gerichte therapieën kunnen informeren. Bijvoorbeeld, het gebruik van moleculair-gerichte therapieën gestegen van 11% tot 46% 2003-2013 1, en anti-kanker geneesmiddelen zoals vemurafenib en crizotinib zijn FDA goedgekeurde met automatisch diagnostische tests. Met de mogelijkheid om nauwkeurig terug lage abundantie sequentie doelen uit sterk gemultiplexeerde sample sets, is de volgende generatie sequencing (NGS) naar voren gekomen als een voorkeursmethode voor het evalueren van genetische afwijkingen geassocieerd met kanker en het identificeren van moleculaire doelwitten voor precisie geneeskunde.
De meest voorkomende solide tumor biopten voor moleculaire testen omvatten in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) en fijne naald aspiratie (FNA) specimensens. Deze monsters zijn beladen met een lage hoeveelheid en / of lage kwaliteit nucleïnezuren die uitdagen accurate NGS assessments 2-5. De huidige commerciële NGS methoden voor de analyse van deze monsters zijn gebaseerd op een lappendeken van verschillende reagentia, protocollen en informatica tools die bewegende doelen van voortdurende verbeteringen te vertegenwoordigen. Bijvoorbeeld veranderingen in bepalingsbuffer chemie en / of software gebeurde elke 1-2 maanden voor de meest gebruikte gerichte NGS kits 6. Deze instabiliteit weerspiegelt een gebrek aan samenhang in de bouw en het verifiëren van een uniform systeem voor het NGS uitdagende types monster, in het bijzonder voor het testen van kanker, en legt een te grote last op laboratoria om samenhangende protocollen die zijn geoptimaliseerd van sample-to-resultaten te ontwikkelen. Inderdaad, een recent onderzoek van NGS gebruikers gewezen op de problemen van deze "snel veranderende" technologieën, samen met de eisen voor gevestigde, medisch-bruikbare inhoud, verschanst bioinformatica deskundigheid, een solidified en geïntegreerde procedure die snel kan worden uitgevoerd, en gestroomlijnde workflows en vereenvoudigde protocollen die te vergemakkelijken on-the-job training 7. In dit artikel wordt een uitgebreid systeem voor gerichte NGS beschreven dat deze lacunes adressen.
De gepresenteerde methodiek integreert alle stappen in de procedure van pre-analytische post-analytische bij zowel natte als droge banken om de nauwkeurigheid, gevoeligheid en betrouwbaarheid van de doelgroep kwantificering en opsporing verbeteren NGS van klinisch relevante kankergen loci. Deze aanpak begint met de kwantificering van de 'functionele' DNA 4 tot DNA-kwaliteit te beoordelen, begeleiden inbreng in het PCR verrijking stap, en bescherming tegen vals-positieve gesprekken die kunnen voortvloeien uit het verhoor van de zeer lage template exemplaren. Een single-tube multiplex PCR verrijkt vervolgens voor 46 loci in 21 kankergenen met behulp van slechts 400 amplificeerbaar DNA-kopieën, gevolgd door incorporatie van platform-specifieke sequenties voor NGS using gewone desktop sequencing instrumenten. Bibliotheken worden gezuiverd met behulp van een eenvoudige magnetisch bolletje procedure en gekwantificeerd met een roman, kalibratie-vrij qPCR assay. Een standalone bioinformatica suite, op basis van DNA-monster QC resultaten aan de oproep van de prestaties te verbeteren, biedt sequentieanalyse volgende NGS. We presenteren gegevens met behulp van deze systemen aanpak voor gerichte NGS naar base-substitutie mutaties, insertie / deleties (indels) te onthullen, en kopieer het aantal varianten (CNV) en lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumor biopten zoals FFPE en FNA samples, en run controles.
Protocol
Opmerking: Dit protocol beschrijft de gelijktijdige verwerking van monsters met een MiSeq NGS systeem, maar kan worden aangepast voor de Personal Genome Machine (PGM) instrument. De aanbevolen minimale DNA vermogen van 400 amplificeren template kopieën de zuiverheid kan produceren tenminste 3,000x mediaan dekking voor alle 96 monsters per run NGS en gelijkwaardige dekking diepte voor 24 monsters met behulp van de PGM op 318 chip. De werkwijze vereist ook het gebruik van een real-time PCR instrument.
1. DNA Functionele kwantificeren en Quality Control (QC)
- Dooi reagentia: 2x Master Mix, Primer Probe Mix, Remming Primer Probe Mix, 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), Diluent en de vier humaan genomisch DNA ijklijn standaarden (DNA standaard (50 ng / pl), DNA Standard (10 ng / pl), DNA Standaard (2 ng / pl) en DNA standaard (0,4 ng / pl)) (tabel 1). Vortex alle reagentia voor 10 sec en centrifuge bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.Houd de 2x master mix op ijs.
- Bereid een voldoende hoeveelheid master mix voor het totale aantal te testen monsters en bevatten 10% meer volume tekorten door pipetteren voorkomen. Bereid de master mix in een microcentrifugebuis met behulp van de volgende volumes per sample: 5 pi 2x Master Mix, 0,5 pi Primer Probe Mix, 0,5 ul Remming Primer Probe Mix, 0,05 ui ROX en 2,95 ul Diluent. Vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.
- Voeg 9 pi Master Mix in putjes van een 96-wells plaat.
- Voeg 1 ul van de DNA standaarden in tweevoud een kalibratiekromme te genereren. Meng door pipetteren en neer 5 keer.
- Zorg ervoor dat de nucleïnezuurmonster goed gemengd is voor gebruik. Voeg 1 pl monster naar de master mix en meng door pipetteren op en neer 5 keer.
- Seal de plaat, vortex gedurende 10 seconden en centrifuge op maximale snelheid gedurende 10 seconden om de inhoud te verzamelen.
- Plaats de plaat in de PCR System. Wijs beide FAM (functioneel kwantificering) en Victoria (functionele remming) detectoren voor elk monster volgens de instructies van de fabrikant. Voer PCR cycli van 10 minuten bij 95 ° C en 40 cycli (15 sec bij 95 ° C, 1 min bij 60 ° C).
- Analyseer de qPCR gegevens door het genereren van een lineaire regressie grafiek voor elk van de dubbele DNA standaarden gebruikt softwareprotocollen.
- Zet de Log 10 van het kopieaantal voor elke DNA standaard op de x-as en de bijbehorende FAM Cq waarde op de y-as.
- Controleer of de resultaten binnen het dynamische bereik van de DNA standaarden ijkcurve het nucleïnezuurmonster vallen, en bereken de concentratie van de onbekende DNA in "functionele" of amplificeerbaar kopieaantal per pi van de overeenkomstige positie op de referentiestandaard curve. Figuur 1 toont voorbeelden van kalibratiecurven die voorbij en is mislukt. </ Li>
- Bepalen of versterking in elke reactie optrad door te controleren op de aanwezigheid van het niet-humane doelwit amplicon in de VIC kanaal.
Opmerking: Als een positieve controle, de inhibitie Primer Probe Mix bevat primers die specifiek zijn voor een niet-humane exogeen target en het bijbehorende sjabloon. De remming Primer Probe Mix is een onderdeel van de master mix die wordt toegevoegd aan elke reactie, waaronder de niet-template control (NTC). Bij afwezigheid van een remmer, moet het PCR product voor de niet-menselijk doel altijd gedetecteerd in de VIC kanaal. Een "undetected" Cq een monster in de VIC kanaal de aanwezigheid van PCR remmers die kunnen profiteren van latere reiniging van het monster voorafgaand aan verdere verwerking.
2. Bibliotheek Bereiding: genspecifieke (GS) PCR
- Bereid een voldoende hoeveelheid master mix het totale aantal te testen monsters en bevatten 10% meer volume tekorten door pipett voorkomening. Bereid de GS PCR Master Mix in een microcentrifugebuis met de volgende hoeveelheden per monster: 5 pl 2x Amplificatie Master Mix (Tabel 1) en 1 pl Pan Cancer Primer Panel (tabel 1). Meng door pipetteren en neer, vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.
- Aliquot de GS 6 pi PCR Master Mix in putjes van een 96-wells plaat. Voeg 4 pi van elk nucleïnezuur monster in afzonderlijke putjes. Voor andere putjes, voeg 4 pi van de FFPE controle (tabel 1), 4 ui van de multivariate controle (tabel 1), en 4 pl nuclease-vrij water voor procedurele NTC. Voor elke toevoeging, meng door pipetteren en neer 5 keer.
- Seal de plaat, vortex gedurende 10 seconden en centrifuge op maximale snelheid gedurende 10 seconden om de inhoud te verzamelen.
- Plaats de plaat in de thermocycler voor de volgende PCR cyclus: 5 min bij 95 ° C,2 cycli (15 sec bij 95 ° C, 4 minuten bij 60 ° C), 23 cycli (15 sec bij 95 ° C, 4 minuten bij 72 ° C), en een laatste verlenging van 10 min bij 72 ° C. Houden op 4 ° C.
Opmerking: Na het voltooien van stap 2,4, zal de plaat de GS PCR-plaat genoemd.
3. Bibliotheek Voorbereiding: Tag PCR
- Dooi reagentia: 2x Index Master Mix (tabel 1) en Index Codes (tabel 1). Vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.
Let op: Index codes worden vooraf gemengd om een unieke set van paarsgewijs indices (barcodes) voor elk monster. - In een 96-well plaat, voeg 7,5 pl van 2x Index Master Mix en 5,5 pl van een Index Code een goed gespecificeerde en meng door pipetteren op en neer 5 keer.
- Open voorzichtig de GS PCR-plaat, en voeg 2 pl GS PCR-product aan de nieuwe plaat met de master mix. Meng door pipetteren up-and-down 5 tijden. Voor elk monster, noteer de monster-ID en de bijbehorende paarsgewijze Index Codes. Seal de plaat, vortex gedurende 10 seconden en centrifuge op maximale snelheid gedurende 10 seconden om de inhoud te verzamelen.
- Plaats de plaat in de thermocycler en PCR voor 5 min bij 95 ° C, 10 cycli (30 sec bij 95 ° C, 30 sec bij 55 ° C, 1 min bij 72 ° C), en een laatste verlenging van 10 min bij 72 ° C. Houden op 4 ° C.
Opmerking: Na het voltooien van stap 3.4, wordt de plaat als de Tag PCR-plaat genoemd.
4. Bibliotheek Zuivering en Size Selection
- Verwijder de bibliotheek Pure Prep magnetische korrels (Tabel 1) en Elution Buffer (Tabel 1) 2-8 ° C om de temperatuur tot kamertemperatuur gedurende 30 min. Voeg 9,6 ml 100% ethanol aan de Wash Buffer (Tabel 1) houder, deksel en meng door de fles meermaals.
- Vortex de magnetische partikels voor 10 seconden en voeg 11 ul in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat.
- Open de Tag PCR-plaat en voeg 10 ul van Tag PCR-product aan de parels en pipet mix 5 keer. Incubeer het mengsel gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de 96-well plaat op de magnetische standaard (Tabel 1) gedurende 4 min. De 96-well plaat nog op de standaard, Verwijder de supernatant met een pipet.
- Verwijder de 96-well plaat uit de magnetische standaard en voeg 100 ul ethanol bevattende wasbuffer aan elk putje en meng door pipetteren op en neer 5 keer. Incubeer gedurende 2 min.
- Plaats de 96-well plaat op de magnetische standaard voor 2 minuten, verwijder Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet.
- Herhaal stap 4,5, een totaal van 2 ethanol wassen, verwijderen van zo veel mogelijk wasoplossing na de tweede maal spoelen.
- Met de 96-well plaat op de magnetische stand, drogen de kralen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de plaat uit de stand.
- Resuspendeer de kralen door het toevoegen van 20 ui elutiebuffer aan elke well en pipet op en neer 5 keer.
- Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de 96-well plaat terug op de magnetische standaard voor 4 minuten en verwijder voorzichtig en breng 18 pl van de heldere supernatant naar een nieuwe put.
Opmerking: De procedure kan veilig worden gestopt bij deze stap en monsters bewaard bij -15 tot -30 ° C. Opnieuw op te starten, te ontdooien bevroren monsters op het ijs voordat u verder gaat.
5. Bibliotheek kwantificering
- Dooi Library Quant (LQ) reagentia: 2x LQ Master Mix, LQ Primer / Probe Mix, LQ Standaard, LQ Positive Control, LQ Diluent en LQ ROX (tabel 1). Vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.
- Het gebruik van gezuiverd bibliotheek producten, het uitvoeren van een seriële verdunning van elk individueel monster in LQ Diluent.
- Voeg 2 pi (bibliotheek gezuiverd product) aan 198 gl LQ Diluent en meng op en neer met een pipet 10 keer.
- Voeg 2 pl (1: 100 verdunning) naar 198 ul LQ Diluent en meng up-and-down met een pipet 10 keer.
- Bereid een voldoende hoeveelheid LQ master mix het totale aantal te testen monsters en bevatten 10% meer volume tekorten door pipetteren voorkomen. Bereid de LQ Master Mix in een microcentrifugebuis met behulp van de volgende volumes per sample: 5 pl 2X LQ Master Mix, 2 pl LQ Primer / Probe Mix, 0,5 ul LQ Standard en 0,5 pi LQ ROX. Meng door pipetteren en neer, vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen.
- Voeg 8 ul LQ master mix tot een goed van een optische 96-well plaat.
- In afzonderlijke putten, voeg 2 ul verdunde bibliotheek, 2 pl LQ Positive Control en 2 pl LQ Diluent (NTC) en meng door pipetteren up-and-down 5 keer. Seal de plaat met optische zelfklevende folie, vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 seconden om de inhoud te verzamelen.
- Wijs zowel FAM en VIC DETECTOrs voor elk monster. Voer PCR amplificatie onder gebruikmaking cyclingcondities van 5 min bij 95 ° C en 40 cycli (15 sec bij 95 ° C, 1 min bij 60 ° C).
- Bepaal de concentratie van elk monster (nM) met de vergelijkende methode Cq. Bereken het verschil van de bekende LQ Standard (Cq VIC) om de onbekende bibliotheek (Cq FAM). De concentratie van het verdunde monster (PM) wordt berekend met de volgende vergelijking:
[Conc lib] nM = 12.5 x 2 Δ Cq
Bij gebruik van een verdunningsfactor uitzondering 10.000 Bereken de verhouding van de beoogde verdunningsfactor 10.000 en vermenigvuldigt deze factor door het resultaat van de vergelijking van 5,7.
6. Bibliotheek Normalisatie en Sample Pooling
- Bepaal de mediane concentratie (nM) over alle monsters (elk met een unieke paarsgewijs index) te bundelen.
- Bepaal de individuele monster volume (pi) te bundelen door het vermenigvuldigen van de mediane concentratie in alle monsters met 5, dan delen door de individuele concentratie (nM). Rond de resulterende waarde naar het dichtstbijzijnde gehele getal. Ronde volumes waarden van <2 pi aan 2 ui en volumes> 15 pl tot 15 pl.
- Voeg de genormaliseerde volume (ul) voor elk monster een microcentrifugebuis aan het monsterpoel maken.
- Bereken de nieuwe concentratie voor elk monster met behulp afgeronde gehele waarden en noteer de resultaten.
- Om de concentratie van de monsterpoel vaststelling, de som van alle afzonderlijke concentraties en het hieruit resulterende waarde (nM).
- Verdun het monster zwembad om 1.25 nm met behulp van Sequencing Diluent (tabel 1).
Opmerking: De procedure kan veilig worden gestopt bij deze stap en monsters bewaard bij -15 tot -30 ° C. Opnieuw op te starten, te ontdooien bevroren monsters op het ijs voordat u verder gaat.
7. Sequencing
- Denature de monsterpoel in aanwezigheid van PhiX v3 controle (tabel 1) en daarin het volgende: 15 ui 1,25 nM monsterpoel, 3 pi 0,5 nM PhiX en 2 ui 1 N NaOH. Kort vortexen, gevolgd door een korte centrifugatie en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Leg het gedenatureerde monster zwembad op het ijs.
- Voeg 8 pi gedenatureerd bibliotheek 992 gl voorgekoeld HT1-Hyb buffer naar een microcentrifugebuis. Vortex kort te mengen, gevolgd door een korte centrifugeren om de inhoud te verzamelen. Houd op het ijs.
- Voeg 600 pi van het gedenatureerde en verdund bibliotheek op positie # 17 van het reagens cartridge.
- Dooi Lees 1 bepalende primers (Tabel 1), Index Lees Sequencing primers (Tabel 1) en 2 Lees Sequencing primers (Tabel 1). In microcentrifugebuizen, apart verdunnen 4 ui bepalende primers met 636 ul HT1-Hyb buffer. Opmerking: HT1-Hyb buffer is voorzien van with de sequentie reagenskit (tabel 1).
- Meng door vortexen gedurende 10 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid 10 sec inhoud verzamelen. Voeg 600 ul van verdund Lees 1 Sequencing Primers op stand # 18 van de sequencing reagens cartridge, 600 pi van verdunde Index lezen Primers op stand # 19, en 600 pi van verdunde Lees 2 Sequencing Primers op stand # 20.
- Laad de reagentia op de NGS instrument (Tabel 1) en sequentie volgens de instructies van de fabrikant. Voer een gepaarde-end 2 x 150 cyclus sequencing run.
8. Data Analysis
Let op: De NGS instrument software converteert cluster beelden naar de basis gesprekken en de kwaliteit scores, en demultiplext paarsgewijs indices voor de individuele gzip gecomprimeerde FASTQ genereren (* .fastq.gz) bestanden voor elk monster. Voorafgaand aan de analyse van de gedemultiplexte bestanden, moet de lezer downloaden en installeren van de bijbehorende bioinformatica software (Tabel1). De software kan worden geïnstalleerd op een consument-grade Windows PC en vereist geen gespecialiseerde computerhardware of een internetverbinding nodig om de data-analyse uit te voeren.
- Dubbelklik op het pictogram software bureaublad.
- Inloggen op het systeem met de gebruikersnaam en het wachtwoord in de software handleiding.
- Open het dashboard project, en klik op "New Project".
- Noem het project en zorgen voor een optionele beschrijving van het project. Selecteer de beoogde NGS soort paneel en NGS het type instrument. Klik op 'Opslaan en doorgaan ".
- Upload de gecomprimeerde FASTQ bestanden voor de vooruit en achteruit leest. Laat de "niet-toegewezen" FASTQs, die bevat leest dat niet demultiplexen niet uploaden. Klik op 'Opslaan en doorgaan ".
- Het nummer van functionele kopieën ingang gebruikt om elke bibliotheek bereiden bepaald door het DNA kwantificatie functionele assay (zie stap 1 hierboven). Handmatig waarden of kopiëren en plakken waarden toevoegt uit een spreadvel in de annotatie tafel. Klik op 'Opslaan en doorgaan. "
- Geef je mening over de geannoteerde bibliotheken geüpload voor analyse en klik op 'Verzenden analyse "om de analyse te starten.
- De voortgang van de analyse wordt weergegeven door middel van het dashboard project.
Opmerking: Een analyse volledige status indicatie wordt gepresenteerd wanneer de resultaten zijn klaar voor beoordeling. - Geef je mening over de geanalyseerde resultaten voor het monster QC metrics inclusief totale dekking per bibliotheek, het percentage leest het passeren van filters, amplicon dekking diepte en uniformiteit. Geef je mening over de variant vraagt om elk gesequenced bibliotheek met dbSNP, kosmisch, 1000 genomen en andere bronnen van functionele en populatieniveau annotatie.
- Exporteer de ruwe resultaten als samenvatting spreadsheet tabellen * .bam bestanden en * VCF-bestanden voor langdurige opslag of downstream-analyse met complementaire informaticatools.
Representative Results
Een totaal van 90 monsters (74 unieke) vertegenwoordigen positieve en negatieve controles, eerder gekarakteriseerde cellijnen, en de resterende klinische FFPE tumor biopsies werden beoordeeld op amplificeerbaar DNA, inbreng in multiplex PCR verrijking, gelabeld met opeenvolging adapters, streepjescode, en in een enkel geanalyseerd benchtop NGS instrument run (figuur 2), die 19,1 M geproduceerd leest passeren filter. Equimolaire monster pooling resulteerde in hoge scherptediepte sequencing (3,692x gelezen) en een uniforme dekking (97,8% van de amplicons gedekt binnen 5-voudige van de mediaan gelezen diepte). Uitschieters bestaat geen template controle, een cellijn DNA met een groot aantal kopieën amplificatie, en één FFPE DNA dat PCR remming werd gemarkeerd door de pre-analytische QC-test (figuur 3). Dekking uniformiteit over de 46 amplicons werd gehandhaafd met behulp van drie verschillende operatoren (Figuur 4A), en voor verschillende lage kwaliteit FFPE DNA-monsters (
De gevoeligheid en positief voorspellende waarde voor de test werd bepaald op basis van een analyse van de 97 monsters, met inbegrip van FFPE, FNA, vers ingevroren, en cellijn DNA, en een totaal van 195 sequencing resultaten. De resultaten bleek 365 echte positieve variant gesprekken, 4 vals negatieve gesprekken en 1 vals-positieve oproep tot een gevoeligheid van 98,9% (95% CI: 97,1-99,7%) en een positief voorspellende waarde (PPV) van 99,7% (95% CI : 98,2-99,99%). Analyses van indels werden uitgevoerd voor twee gemeenschappelijke EGFR varianten (p.E746_A750delELREA en p.V769_D770insASV) in 33 sample-runs, waaruit blijkt een gevoeligheid van 93,9% (95% CI: 78,4-98,9%) en een PPV van 100% (95% Cl: 86,3-100%) met varianten waargenomen over een bereik van 2,4-84,8%.
Figuur 1: Een voorbeeld van DNA Kwantificering Calibration Curves dat Pass en Fail QC Criteria (A) Een passerende standaard curve.. (B) Een falende standaard curve. In dit geval werd de storing veroorzaakt door duplicate pipetteren van de laagste ingang DNA-norm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van een algehele gerichte NGS System for Oncology Toepassingen die integreert Pre-analytischeal, analytische en post-analytische workflows. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Lees Dekking en Uniformiteit voor gerichte NGS van genen Cancer in Lage-kwaliteit FFPE DNA vergelijking met intacte cel-lijn DNA en Controls in totaal 90 monsters die resterende klinische FFPE (gesloten cirkels), cellijn inbegrepen (open cirkels. ) en synthetische matrijs DNA (plustekens) werden verwerkt met een buis, 21-gen multiplex PCR verrijking. Elke amplicon bibliotheek werd gelabeld met adaptersequenties voor NGS instrument barcode met een duidelijke dubbele indexcode, gezuiverd, gekwantificeerd en genormaliseerd tot een concentratie van 2,5 nM. De DNA-bibliotheek werd gesequenced en geanalyseerd door de begeleidende bio-informatica software. sample devities bevatte een verdunningsreeks van MDA-MB-468 cellijn DNA voorzien van een groot EGFR kopieaantal amplificatie (bovenkant open rechthoeken binnen gestippelde cirkel) die dekking uniformiteit en een melanoom FFPE monster vervormd dat niet een aanzienlijk aantal genereren leest wijten om overdracht van PCR-remmers van de DNA-extractie. Het melanoom monster falen (bodem, gestippelde cirkel) werd voorspeld door de pre-analytische qPCR DNA-test QC. NTC, no-template controle (x symbolen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Amplicon-by-amplicon lezen Dekking, Uniformiteit en Variant Detection in Overblijvende Clinical FFPE Tumor DNA. (A) Lees de dekking in alle verrijkte loci in een representatieve FFPE DNA-monster gemetenover drie verschillende operators. Operator 1, Op1 (blauwe balken); Operator 2, Op2 (groene balken); Operator 3, OP3 (zwarte balken). (B) Dekking uniformiteit en variant gesprekken geëvalueerd met behulp van drie FFPE tumor samples, met inbegrip van een controle-mengsel (FFPE3, grijze balken en tekst) bestaat uit een bekende 5% BRAF c.1799T> A mutatie. FFPE1 (blauwe balken en tekst), FFPE2 (oranje bars en tekst). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Dosisafhankelijke Detectie van Copy Number varianten in Cell-line FFPE DNA MDA-MB-468 cellijn DNA met een goed gekarakteriseerde EGFR kopieaantal amplificatie werd progressief verdund in een achtergrond van een referentie niet-gemuteerde cel -lijn DNA aan de daling van het aantal kopieën verandering als een illustratiefunctie van de verdunning. Het percentage van elke cellijn DNA monster wordt getoond met een duidelijke lijn (0, 12,5, 25, 50 en 100%). Verdunning van een ovariële FFPE tumor monster met een bekende KRAS amplificatie toonde een vergelijkbaar profiel met dezelfde titratie serie, maar met replica's van 100% FFPE DNA voor de bovenste twee lijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Accurate Mutatie Detectie en kwantificatie naar 50 amplificeerbaar FFPE DNA kopieën of 1,2 ng Bulk DNA Het amplificeerbare kopieaantal van darmkanker FFPE DNA werd bepaald door de qPCR-gebaseerde QC assay en verdund 400-25 exemplaren als. input multiplex PCR verrijking voorafgaand aan sequencing. De bioinformatica pijpleiding correct genoemd zowel van de bekende Variants tot 50 kopieën, of het equivalent van ~ 10 mutant templates. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam van de Material / Materiaal | Bedrijf | Catalogus nummer |
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 |
| Remming Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 |
| ROX | Asuragen | 145.346 |
| oplosmiddel | Asuragen | 145.339 |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145.341 |
| DNA Standaard (2) | Asuragen | 145342 |
| DNA standaard (0,4) | Asuragen | 145.343 |
| 2x Amplification Master Mix | Asuragen | 145.348 |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145.347 |
| Pan Cancer FFPE Controle | Asuragen | 145.349 |
| Pan Cancer Multi-Variant Controle | Asuragen | 145350 |
| Bibliotheek Pure Prep Beads | Asuragen | 145.351 |
| wash Buffer | Asuragen | 145352 |
| Elution Buffer | Asuragen | 145.353 |
| 2x LQ Master Mix | Asuragen | 145.358 |
| LQ Diluent | Asuragen | 145.354 |
| LQ PositieveControle | Asuragen | 145.355 |
| LQ Standard | Asuragen | 145.356 |
| LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 |
| LQ ROX | Asuragen | 145.359 |
| Index Codes (ILMN) - Set A | Asuragen | 150.004 |
| AIL001 - AIL048 (48) | ||
| Index Codes (ILMN) - Set B | Asuragen | 150.005 |
| AIL049 - AIL096 (48) | ||
| 2x Index Master Mix | Asuragen | 145.361 |
| Lees 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 |
| Index lezen Sequencing Primers | Asuragen | 150.002 |
| Lees 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150.003 |
| sequencing Diluent | Asuragen | 145.365 |
| Illumina MiSeq | Illumina | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cyclus) | Illumina | MS-102-3003 |
| MiSeq reagens Nano Kit v2 (300-cyclus) | Illumina | MS-103-1001 |
| PhiX Controle v3 | Illumina | FC-110-3001 |
| Magnetic Stand-96 (of soortgelijke inrichting) | Ambion | AM10027 |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
Tabel 1:. Reagentia en Kits Bij eerste gebruik van de ROX, bewaar het flesje bij 2-8 ° C. Niet opnieuw invriezen. De software kan worden gedownload op www.asuragen.com.
| GENE | COSMIC variant | COSMIC aminozuur | % Variant |
| NRAS | c.182A> G | p.Q61R | 13.3 |
| NRAS | c.35G> A | p.G12D | 15.2 |
| HRAS | c.182A> G | p.Q61R | 17.8 |
| HRAS | c.35G> A | p.G12D | 9.2 |
| KRAS | c.182A> G | p.Q61R | 13.5 |
| KRAS | c.35G> A | p.G12D | 19.1 |
| PIK3CA | c.1633G> A | p.E545K | 9.3 |
| PIK3CA | c.3140A> G | p.H1047R | 9.1 |
| KIT | c.2447A> T | p.D816V | 14.6 | EGFR | c.2369C> T | p.T790M | 11.3 |
| EGFR | c.2573T> G | p.L858R | 14.9 |
| BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 17.3 |
Tabel 2: een gepoolde Synthetische controle bestaat uit 12 "Driver" Kanker genvarianten die worden geraamd op 9-17% Overvloed Een mengsel van 12 verschillende dubbelstrengs synthetische templates waarop 12 verschillende mutaties werd geëvalueerd na sequencing.. Alle varianten werden correct aangeroepen zonder false positives.
| sample ID | functioneel cps | Gen | COSMIC variant | COSMIC aminozuur | Median read diepte | % Binnen 5x van het mediane | |
| BCPAP | 400 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99.5 | 3289 | 96% |
| BCPAP | 10.000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99.7 | 4040 | 98% |
| BCPAP | 25.000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99.4 | 3687 | 96% |
| BCPAP | 50.000 | BRAF | c.1799T> A | p.V600E | 99.7 | 4611 | 93% |
Tabel 3: Dekking en Variant Calling worden bewaard dan een> 100-voudig Bereik van DNA-ingang.
Tabel 4: Variant Calls in 22 FFPE en 20 FNA Tumor biopten Eens met resultaten van Independent mutatieassays Een set van 22 FFPE-tumor DNA met mutatie-status eerder bepaald door orthogonale gerichte NGS assays werd ingevoerd bij 400 tot 2928 amplificeerbaar kopieën in de PCR verrijking. stap en gesequenced met behulp van de 21-gen panel Pan Cancer. Bovendien, een cohort van 20 FNA DNA monsters eerder gekarakteriseerd onder toepassing van een vloeibare bead matrix mutation assay 8 werd met PCR geamplificeerd met 156 tot 36.080 ingang amplificeerbaar kopieën en gesequenced. Alle overlappende gesprekken tussen het paneel Pan Cancer NGS en de referentieNVU methoden waren in overleg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
NGS technologieën zijn verwachtingen voor het ondervragen van de moleculaire profielen van de tumor biopten in klinische settings 9 geherdefinieerd. Een aantal gerichte NGS panelen zijn ontwikkeld als onderzoekstechnologieën, laboratorium ontwikkelde testen, en in de handel verkrijgbare producten en aangepaste panelen voor het beoordelen van meerdere typen klinische monsters 3,5,10-15. Verslagen van meerdere onderzoeken is de waarde van NGS aangetoond dat een gevoelige en specifieke klinische instrument voor de detectie van genomische veranderingen 3,10-12,14. Toch blijkt overigens het risico van artefacten die vals positieve resultaten uit uitdagende kanker biopsies zoals FFPE specimens 2-5,12,14 kunnen veroorzaken. Daarnaast hebben recente publicaties hoge uitvalpercentages gemarkeerd voor NGS gebruik oncologie exemplaren 16 en vals-positieve gesprekken met commercieel gerichte NGS panelen die worden verergerd door het gebruik van low-input DNA-12. Daardoor sommige LaboraTories zijn ofwel aangepast of extra checks and balances toegevoegd aan in de handel verkrijgbare gerichte NGS technologieën om de prestaties te verbeteren, vaak om de nauwkeurigheid te waarborgen of te bevestigen de bevindingen uit de bioinformatica analyses 5,10,11.
De 21-gen (zie figuur 2) werd ontwikkeld als gerichte content voor een uitgebreid NGS systeem om evidence-based, bruikbare mutaties ondervragen in moeilijke types monster zoals FFPE en FNA tumor biopten. De workflow heeft een aantal voordelen: 1) de samenhang door het verstrekken van een uniforme amplicon dekking (figuren 3 en 4, tabel 3); 2) het gemak van het gebruik door het verstrekken van pre-geformuleerde, geoptimaliseerde reagens sets, en vereenvoudiging van de bioinformatica eisen; 3) de efficiency door het stroomlijnen van de workflow en het verminderen van het aantal pipetteren stappen in vergelijking met andere commerciële NGS methoden; en 4) de nauwkeurigheid door het opnemen van een DNA-QC-test voor het beoordelen van de versterkerkunnen DNA copy number om ervoor te zorgen aanvaardbare template diversiteit en vermijd stochastische fluctuaties in variant detectie 4. De integratie van de pre-analytische QC data met de bioinformatica analyse maakt lage ingangen van FFPE DNA. Dit werd bereikt door het trainen van een beslissing-tree algoritme met behulp van verschillende functionele kopieën van DNA-ingang over 400 FFPE monsters met onafhankelijke maatregelen van de waarheid, en de integratie van dit algoritme in de bio-informatica-software. Daardoor is de aanbevolen inbreng van 400 amplificeerbare exemplaren, meestal gelijk aan ~ 5-20 ng FFPE DNA, steekt gunstig af bij andere methoden 10-12, waaronder hybridisatie gebaseerde Verrijking ~ 250 ng DNA aanbevolen FFPE 17,18 . Hoewel de techniek is beschreven voor gebruik op een MiSeq platform kan worden gemodificeerd door Tag PCR primers met instrument-specifieke adapters sequentieanalyse andere NGS platforms mogelijk.
Verschillende stappen zijn van cruciaal belang om succes te garanderenvan de procedure. De pre-analytische QC assay bepaalt het amplificeerbare aantal kopieën van DNA en rapporten functionele remming. Indien echter minder dan 400 amplificeerbaar DNA kopieën worden in de PCR verrijkingsstap, er een verhoogd risico op vals-negatieve telefoontje van monsters met een lage abundantie mutaties (figuur 6). Bovendien moet zorg gedurende bibliotheek zuivering worden genomen lang drogen van de magnetische korrels tijdens de was- of elutiestappen voorkomen. Bovendien succesvol bibliotheek kwantificering is sterk afhankelijk van de juiste verdunning van DNA bibliotheek. Voor het beste resultaat, het verschil van de qPCR resultaten voor samplebibliotheek (Cq FAM) vergeleken met de standaard LQ (Cq VIC) moet ≤3.3 Cq. Indien het verschil groter is dan 3,3 Cq, re-verdunning en testen van het monster wordt aanbevolen. Hoewel een uitstekende correlatie waargenomen tussen deze competitieve qPCR methode en commerciële kits die absolute kwantificatie met behulp van een standaardcurve biedenEen offset van de bibliotheekinvoer in de klonale amplificatie stap ten opzichte van andere werkwijzen noodzakelijk zijn om optimale zaaidichtheid bereiken.
Sommige kanker exemplaren zijn bijzonder uitdagend om te sequencen omdat remmers die blijven bestaan na DNA-isolatie. Om deze monsters voorafgaand aan de bibliotheek preparaat kunnen identificeren, de qPCR QC test detecteert ook versterking remming door het opnemen van een exogene template dat dient als zowel een interne controle en een schildwacht voor functionele remming. Een voorbeeld is weergegeven in figuur 3 waarin een melanoom DNA monster niet de QC remming gegeven voorafgaand aan sequencing passen en niet een library die kan worden gesequenced genereren. Het falen zou waarschijnlijk een gevolg van melanine vervuiling, een bekende remmer PCR, uit het FFPE DNA isolatiestap uitgevoerd. Monsters die worden geïdentificeerd door de QC-test te worden met het risico voor de amplificatie falen kan worden gered door middel van een extra clean-up stap to verwijderen potentiële remmers.
De beoogde 21-gen panel richt zich op evidence-based-gen hotspots en biedt een compleet systeem met geoptimaliseerde reagentia en controles voor DNA QC, NGS en bioinformatica software die wordt geïnformeerd door pre-analytische "functioneel" DNA kwantificering resultaten. De werkwijze detecteert nauwkeurig base-substitutie mutaties en indels van extensieve DNA, en een voorbeeld van een NGS systeem de mogelijkheid inhoudskader breiden, om extra varianten zoals CNVs detecteren en aangepast voor gerichte RNA sequentie.
Disclosures
JH, AH, RZ, BCH en GJL zijn medewerkers en zijn aandelenbezit in Asuragen, Inc. RZ, BCH en GJL zijn mede-uitvinders op een octrooiaanvraag voor het verbeteren variant bellen met behulp van amplificeerbare copy number informatie bepaald voor elk monster.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Annette Schlageter voor de herziening van het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidie CP120017 van de Cancer Prevention and Research Institute of Texas (PI: GJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
| Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
| ROX | Asuragen | 145346 | |
| Diluent | Asuragen | 145339 | |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
| DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
| 2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
| Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
| Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
| Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
| Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
| Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
| 2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
| LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
| LQ Primer/Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
| Index Codes (ILMN) - Set A, AIL001 - AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
| Index Codes (ILMN) - Set B, AIL049 - AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
| 2x Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
| Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
| Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
| Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
| Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
References
- Medicines in Development for Cancer. , Available from: http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/2014-cancer-report.pdf 1-103 (2014).
- Chen, G., Mosier, S., Gocke, C. D., Lin, M. T., Eshleman, J. R. Cytosine deamination is a major cause of baseline noise in next-generation sequencing. Mol Diagn Ther. 18 (5), 587-593 (2014).
- Choudhary, A., et al. Evaluation of an integrated clinical workflow for targeted next-generation sequencing of low-quality tumor DNA using a 51-gene enrichment panel. BMC Med Genomics. 7, 62 (2014).
- Sah, S., et al. Functional DNA quantification guides accurate next-generation sequencing mutation detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies. Genome Med. 5 (8), 77 (2013).
- Zhang, L., et al. Profiling cancer gene mutations in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tumor specimens using targeted next-generation sequencing. Oncologist. 19 (4), 336-343 (2014).
- Latham, G. J. Next-generation sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies: navigating the perils of old and new technology to advance cancer diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 13 (8), 769-772 (2013).
- Crawford, J. M., et al. The business of genomic testing: a survey of early adopters. Genet Med. 16 (12), 954-961 (2014).
- Smith, D. L., et al. A multiplex technology platform for the rapid analysis of clinically actionable genetic alterations and validation for BRAF p.V600E detection in 1549 cytologic and histologic specimens. Arch Pathol Lab Med. 138 (3), 371-378 (2014).
- Thomas, F., Desmedt, C., Aftimos, P., Awada, A. Impact of tumor sequencing on the use of anticancer drugs. Curr Opin Oncol. 26 (3), 347-356 (2014).
- Singh, R. R., et al. Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes. J Mol Diagn. 15 (5), 607-622 (2013).
- Beadling, C., et al. Combining highly multiplexed PCR with semiconductor-based sequencing for rapid cancer genotyping. J Mol Diagn. 15 (2), 171-176 (2013).
- McCall, C. M., et al. False positives in multiplex PCR-based next-generation sequencing have unique signatures. J Mol Diagn. 16 (5), 541-549 (2014).
- Schleifman, E. B., et al. Next generation MUT-MAP, a high-sensitivity high-throughput microfluidics chip-based mutation analysis panel. PLoS One. 9 (3), e90761 (2014).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 7, 23 (2014).
- Narayan, A., et al. Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing. Cancer Res. 72 (14), 3492-3498 (2012).
- Hagemann, I. S., et al. Clinical next-generation sequencing in patients with non-small cell lung cancer. Cancer. 121 (4), 631-639 (2015).
- Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. Detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing. J Vis Exp. (80), e50710 (2013).
- Simen, B. B., et al. Validation of a next-generation-sequencing cancer panel for use in the clinical laboratory. Arch Pathol Lab Med. 139 (4), 508-517 (2015).
