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Medicine

कम गुणवत्ता और कम मात्रा में ट्यूमर बायोप्सी के गीले और सूखे खंडपीठ प्रक्रियाओं का एकीकरण लक्षित अनुकूलन अगली पीढ़ी के अनुक्रमण

Published: April 11, 2016 doi: 10.3791/53836
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Asuragen, Inc.

Abstract

सभी अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) प्रक्रियाओं प्रयोगशाला बेंच पर प्रदर्शन assays ( "गीला बेंच") और डेटा जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइनों ( "सूखी बेंच") का उपयोग आयोजन विश्लेषण शामिल हैं। दोनों तत्वों को सही और विश्वसनीय परिणाम है, जो नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं उत्पादन के लिए आवश्यक हैं। लक्षित NGS प्रौद्योगिकियों तेजी से ऑन्कोलॉजी अनुप्रयोगों में अनुग्रह पाया है अग्रिम सटीक दवा उद्देश्यों को मदद करने के लिए, अभी तक तरीकों अक्सर काट दिया और चर गीले और सूखे बेंच workflows और बेबुनियाद अभिकर्मक सेट शामिल है। इस रिपोर्ट में, हम अनुक्रमण के लिए एक व्यापक लक्षित NGS प्रणाली का एक उदाहरण के रूप में एक 21 जीन पैनल के साथ कैंसर के नमूनों को चुनौती देने के लिए एक विधि का वर्णन है। प्रणाली कार्यात्मक डीएनए मात्रा का ठहराव और योग्यता, एकल-ट्यूब मल्टिप्लेक्स पीसीआर संवर्धन, और पुस्तकालय शुद्धि और सामान्य बनाने के लिए एक स्टैंडअलोन जैव सूचना विज्ञान सूट के साथ विश्लेषणात्मक-सत्यापित, एकल स्रोत अभिकर्मकों का उपयोग एकीकृत करता है।नतीजतन, सटीक संस्करण से कहता कम गुणवत्ता और कम मात्रा formalin तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) और एफ एन ए सी (FNA) ट्यूमर बायोप्सी से प्राप्त किया जा सकता है। विधि नियमित तौर पर 400 amplifiable डीएनए प्रतियों की एक इनपुट से कैंसर से जुड़े वेरिएंट आकलन कर सकते हैं, और डिजाइन में मॉड्यूलर नए जीन सामग्री को समायोजित करने के लिए है। विश्लेषणात्मक से परिभाषित नियंत्रण के दो अलग अलग प्रकार की चिकित्सकीय प्रासंगिक नमूनों के साथ गुणवत्ता आश्वासन और मदद की रक्षा कॉल सटीकता प्रदान करते हैं। एक लचीला "टैग" पीसीआर कदम मंच विशेष एडेप्टर और सूचकांक कोड embeds नमूना बारकोडिंग और आम benchtop NGS उपकरणों के साथ संगतता की अनुमति है। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटोकॉल सुव्यवस्थित है और एक ही दिन में 24 अनुक्रम तैयार पुस्तकालयों का उत्पादन कर सकते हैं। अंत में, दृष्टिकोण एल्गोरिदम बुला उत्परिवर्तन का पता लगाने सटीकता में सुधार और अंतर झूठी नकारात्मक और indeterm के लिए संस्करण में सीधे पूर्व विश्लेषणात्मक नमूना गुणवत्ता नियंत्रण परिणामों को शामिल करके गीले और सूखे बेंच प्रक्रियाओं लिंकinate कॉल। यह लक्षित NGS विधि दोनों wetware और सॉफ्टवेयर उच्च गहराई, मल्टिप्लेक्स अनुक्रमण और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए विषम कैंसर के नमूनों का विश्लेषण प्राप्त करने के लिए संवेदनशील क्षेत्र में प्रगति का उपयोग करता है।

Introduction

प्रेसिजन दवा रोगियों के लिए नैदानिक ​​और चिकित्सीय विकल्पों में से वैयक्तिकरण पर निर्भर करता है। रुझान उपचार का वादा रोग मार्ग है कि आणविक निदान और लक्षित चिकित्सा विज्ञान के संबंध में सूचित कर सकते हैं की एक बेहतर समझ का एक सीधा परिणाम है। उदाहरण के लिए, molecularly-लक्षित चिकित्सा के उपयोग के 2013 1 के लिए 2003 से 46% करने के लिए 11% से वृद्धि हुई है, और vemurafenib और crizotinib के रूप में इस तरह के कैंसर रोधी दवाओं साथी नैदानिक ​​परीक्षण के साथ एफडीए को मंजूरी दे दी है। सही अत्यधिक मल्टिप्लेक्स नमूना सेट में कम बहुतायत अनुक्रम लक्ष्यों को ठीक करने के लिए अपनी क्षमता के साथ, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) कैंसर के साथ जुड़े आनुवंशिक aberrations के मूल्यांकन और सटीक दवा के लिए आणविक लक्ष्य की पहचान करने के लिए पसंद की एक विधि के रूप में उभरा है।

आणविक परीक्षण के लिए सबसे आम ठोस ट्यूमर बायोप्सी formalin तय शामिल हैं, आयल एम्बेडेड (FFPE) और एफ एन ए सी (FNA) specimसत्ता। इन नमूनों कम मात्रा और / या कम गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड होता है जो चुनौती देने के सटीक आकलन NGS 2-5 से भरा है। इन नमूनों के विश्लेषण के लिए वर्तमान वाणिज्यिक NGS तरीकों अलग अभिकर्मकों, प्रोटोकॉल, और सूचना विज्ञान उपकरण है कि लगातार सुधार की चलती लक्ष्य प्रतिनिधित्व का घपला पर आधारित हैं। उदाहरण के लिए, परख chemistries और / या सॉफ्टवेयर में परिवर्तन के सबसे अधिक इस्तेमाल किया लक्षित NGS किट 6 के लिए हर 1-2 महीने हुई। इस अस्थिरता के निर्माण और चुनौतीपूर्ण नमूना प्रकार के लिए एक एकीकृत प्रणाली NGS की पुष्टि करने, विशेष रूप से कैंसर के परीक्षण के लिए में जुटना की कमी को दर्शाता है, और प्रयोगशालाओं पर एक अनुचित बोझ डालता एकजुट प्रोटोकॉल है कि नमूना परिणामों से अनुकूलित कर रहे हैं विकसित करने के लिए। दरअसल, NGS उपयोगकर्ताओं में से एक ताजा सर्वेक्षण में इन प्रौद्योगिकियों "तेजी से बदलते" की कठिनाइयों पर प्रकाश डाला, की स्थापना की, चिकित्सकीय कार्रवाई सामग्री, आरोपित जैव सूचना विज्ञान विशेषज्ञता, एक solidifi के लिए आवश्यकताओं के साथ-साथएड और एकीकृत प्रक्रिया है कि तेजी से लागू किया जा सकता है, और सुव्यवस्थित workflows और सरलीकृत प्रोटोकॉल है कि नौकरी पर प्रशिक्षण 7 की सुविधा। इस अनुच्छेद में, लक्षित NGS के लिए एक व्यापक प्रणाली में वर्णित है कि इन कमियों को संबोधित किया जाता है।

प्रस्तुत कार्यप्रणाली चिकित्सकीय प्रासंगिक कैंसर जीन loci के NGS के लिए सटीकता, संवेदनशीलता, और लक्ष्य मात्रा का ठहराव और पता लगाने की विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए दोनों गीले और सूखे बेंच पर पूर्व विश्लेषणात्मक करने के लिए पोस्ट-विश्लेषणात्मक से सभी प्रक्रियात्मक कदम एकीकृत करता है। यह दृष्टिकोण डीएनए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, झूठी सकारात्मक कहता है कि बहुत कम टेम्पलेट प्रतियों की पूछताछ से उत्पन्न कर सकते खिलाफ पीसीआर संवर्धन कदम में इनपुट, और गार्ड मार्गदर्शन "कार्यात्मक" डीएनए 4 की मात्रा का ठहराव के साथ शुरू होता है। एक एकल-ट्यूब मल्टीप्लेक्स पीसीआर तो केवल 400 amplifiable डीएनए प्रतियों का उपयोग कर 46 से 21 में लोकी कैंसर के जीन के लिए समृद्ध करती, NGS usin के लिए मंच विशेष दृश्यों का समावेश के द्वारा पीछाजी आम डेस्कटॉप अनुक्रमण उपकरणों। पुस्तकालय एक साधारण चुंबकीय मनका प्रक्रिया का उपयोग कर शुद्ध और एक उपन्यास, अंशांकन मुक्त qPCR परख के साथ मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। एक स्टैंडअलोन जैव सूचना विज्ञान सुइट, द्वारा नमूना डीएनए क्यूसी परिणाम सूचित कॉल के प्रदर्शन में सुधार करने के लिए, NGS निम्नलिखित अनुक्रम विश्लेषण प्रदान करता है। हम लक्षित NGS के लिए इस सिस्टम के दृष्टिकोण का उपयोग कर डेटा मौजूद आधार प्रतिस्थापन म्यूटेशन, सम्मिलन / विलोपन (indels) प्रकट करने के लिए, और कॉपी नंबर वेरिएंट (CNVs) ऐसे FFPE और FNA नमूने, और चलाने के रूप में कम गुणवत्ता वाले और कम मात्रा में ट्यूमर बायोप्सी में नियंत्रित करता है।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल एक MiSeq NGS प्रणाली का उपयोग कर नमूने के एक साथ प्रसंस्करण का वर्णन करता है लेकिन व्यक्तिगत जीनोम मशीन (PGM) साधन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। 400 amplifiable टेम्पलेट प्रतियों की सिफारिश की न्यूनतम डीएनए इनपुट के लिए, परख 24 एक 318 चिप पर PGM का उपयोग कर नमूने के लिए NGS रन प्रति 96 नमूनों में से प्रत्येक के लिए कम से कम 3,000x मंझला कवरेज, और बराबर कवरेज गहराई उत्पादन में सक्षम है। विधि को भी एक वास्तविक समय पीसीआर साधन के उपयोग की आवश्यकता है।

1. डीएनए कार्यात्मक मात्रा और गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी)

  1. पिघलना अभिकर्मकों: 2x मास्टर मिक्स, प्राइमर जांच मिक्स, निषेध प्राइमर जांच मिक्स, 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), मंदक, और चार मानव जीनोमिक डीएनए अंशांकन वक्र मानक (स्टैंडर्ड डीएनए (50 एनजी / μl), डीएनए स्टैंडर्ड (10 एनजी / μl), डीएनए स्टैंडर्ड (2 एनजी / μl), और डीएनए स्टैंडर्ड (0.4 एनजी / μl)) (1 टेबल)। भंवर 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर 10 सेकंड और सेंट्रीफ्यूज के लिए सभी अभिकर्मकों सामग्री इकट्ठा करने के लिए।बर्फ पर 2x मास्टर मिश्रण रखें।
  2. नमूनों की कुल संख्या परीक्षण किया जा करने के लिए मास्टर मिश्रण के लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार है और 10% अधिक मात्रा pipetting के कारण कमी से बचने के लिए शामिल हैं। नमूना प्रति निम्न संस्करणों का उपयोग कर एक microcentrifuge ट्यूब में मास्टर मिश्रण तैयार: 5 μl 2x मास्टर मिक्स, 0.5 μl प्राइमर जांच मिक्स, 0.5 μl निषेध प्राइमर जांच मिक्स, 0.05 μl ROX और 2.95 μl मंदक। 10 सेकंड सामग्री इकट्ठा करने के लिए अधिकतम गति पर 10 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए भंवर।
  3. एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में 9 μl मास्टर मिश्रण जोड़ें।
  4. एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिए दो प्रतियों में डीएनए मानकों के 1 μl जोड़ें। ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा मिक्स।
  5. सुनिश्चित करें न्यूक्लिक एसिड नमूना अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले मिश्रित है। मास्टर मिश्रण करने के लिए 1 μl नमूना जोड़ें और ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा मिश्रण।
  6. 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर 10 सेकंड और सेंट्रीफ्यूज के लिए थाली, भंवर सील सामग्री इकट्ठा करने के लिए।
  7. पीसीआर सिस्टम में थाली रखें। दोनों परिवार (कार्यात्मक मात्रा का ठहराव) और विक (कार्यात्मक निषेध) निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रत्येक नमूना के लिए डिटेक्टरों निरुपित। (95 डिग्री सेल्सियस, 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट में 15 सेकंड) 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट की पीसीआर चक्र को पूरा करें, और 40 चक्र।
  8. सॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल का उपयोग डुप्लिकेट डीएनए मानकों से प्रत्येक के लिए एक रेखीय प्रतिगमन साजिश उत्पन्न करके qPCR डेटा का विश्लेषण।
  9. एक्स-अक्ष पर प्रत्येक डीएनए मानक और y अक्ष पर इसी परिवार सी क्यू मूल्य के लिए प्रतिलिपि संख्या के प्रवेश 10 प्लॉट।
  10. पुष्टि करें कि डीएनए मानक अंशांकन वक्र के गतिशील रेंज के भीतर न्यूक्लिक एसिड नमूना गिरने से परिणाम है, और फिर संदर्भ मानक वक्र पर अपनी इसी स्थिति से μl प्रति "कार्यात्मक" या amplifiable प्रतिलिपि संख्या में अज्ञात डीएनए की एकाग्रता की गणना। चित्रा 1 अंशांकन घटता है कि पारित कर दिया और विफल रहा है के उदाहरण से पता चलता है। </ Li>
  11. निर्धारित करती है कि प्रवर्धन विक चैनल में गैर मानव लक्ष्य amplicon की उपस्थिति के लिए जाँच के द्वारा प्रत्येक प्रतिक्रिया में हुई।
    नोट: एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, निषेध प्राइमर जांच मिक्स एक गैर मानव बहिर्जात लक्ष्य है और इसी टेम्पलेट के लिए विशिष्ट प्राइमरों शामिल हैं। निषेध प्राइमर जांच मिक्स मास्टर मिश्रण है जो प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा है कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) भी शामिल है, का एक घटक है। एक अवरोध के अभाव में, गैर मानव लक्ष्य के लिए पीसीआर उत्पाद हमेशा विक चैनल में पता लगाया जाना चाहिए। एक "नहीं चल पाता" विक चैनल में एक नमूना के लिए सी क्यू पीसीआर अवरोधकों कि आगे की प्रक्रिया के लिए पहले नमूने के बाद साफ हुआ से लाभ हो सकता है की उपस्थिति इंगित करता है।

2. पुस्तकालय तैयारी: जीन विशिष्ट (जीएस) पीसीआर

  1. नमूनों का परीक्षण किया जा करने के लिए की कुल संख्या के लिए मास्टर मिश्रण के लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार है और 10% अधिक मात्रा pipett के कारण की कमी से बचने के लिए शामिलआईएनजी। नमूना प्रति निम्न संस्करणों का उपयोग कर एक microcentrifuge ट्यूब में जी एस पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार: 5 μl 2x प्रवर्धन मास्टर मिक्स (तालिका 1) और 1 μl पान कर्क प्राइमर पैनल (1 टेबल)। 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति से ऊपर और नीचे, 10 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए भंवर pipetting सामग्री इकट्ठा करने के लिए से मिलाएं।
  2. एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में 6 μl जीएस पीसीआर मास्टर मिश्रण विभाज्य। व्यक्तिगत कुओं में प्रत्येक न्यूक्लिक एसिड नमूना के 4 μl जोड़ें। अन्य कुओं के लिए, FFPE नियंत्रण के 4 μl (तालिका 1), मल्टी-संस्करण नियंत्रण (तालिका 1) के 4 μl, और एक प्रक्रियात्मक एनटीसी के लिए nuclease मुक्त पानी के 4 μl जोड़ें। इसके अतिरिक्त प्रत्येक के लिए, 5 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
  3. 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर 10 सेकंड और सेंट्रीफ्यूज के लिए थाली, भंवर सील सामग्री इकट्ठा करने के लिए।
  4. निम्नलिखित पीसीआर चक्र के लिए thermocycler में प्लेट की जगह: 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट,2 चक्र (95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड, 60 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट), 23 चक्र (95 डिग्री सेल्सियस, 72 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट 15 सेकंड), और 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट की एक अंतिम विस्तार। 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    नोट: 2.4 चरण के पूरा होने के बाद, थाली जीएस पीसीआर थाली के रूप में करने के लिए भेजा जाएगा।

3. पुस्तकालय तैयारी: टैग पीसीआर

  1. पिघलना अभिकर्मकों: 2x सूचकांक मास्टर मिक्स (तालिका 1) और सूचकांक कोड (1 टेबल)। 10 सेकंड सामग्री इकट्ठा करने के लिए अधिकतम गति पर 10 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए भंवर।
    नोट: सूचकांक संहिताओं प्रत्येक नमूना के लिए जोड़ो में सूचकांक (बारकोड) की एक अद्वितीय सेट प्रदान करने के लिए premixed रहे हैं।
  2. एक 96 अच्छी तरह से थाली में, एक अच्छी तरह से निर्दिष्ट करने के लिए 2x सूचकांक मास्टर मिक्स के 7.5 μl और एक सूचकांक संहिता की 5.5 μl जोड़ें और ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा मिश्रण।
  3. ध्यान से जी एस पीसीआर प्लेट खुला, और मास्टर मिश्रण के साथ नई प्लेट के लिए 2 μL जीएस पीसीआर उत्पाद जोड़ें। ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा मिक्स। प्रत्येक नमूना के लिए, नमूना आईडी और इसी जोड़ो में सूचकांक संहिताओं रिकॉर्ड है। 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर 10 सेकंड और सेंट्रीफ्यूज के लिए थाली, भंवर सील सामग्री इकट्ठा करने के लिए।
  4. , और 72 पर 10 मिनट की एक अंतिम विस्तार (95 डिग्री सेल्सियस, 55 डिग्री सेल्सियस, 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट पर 30 सेकंड में 30 सेकंड) 95 डिग्री सेल्सियस, 10 चक्र पर thermocycler और पीसीआर 5 मिनट के लिए में थाली प्लेस सी। 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    नोट: 3.4 कदम के पूरा होने के बाद, थाली टैग पीसीआर थाली के रूप में करने के लिए भेजा जाएगा।

4. पुस्तकालय शोधन और आकार चयन

  1. 2-8 डिग्री सेल्सियस से लाइब्रेरी शुद्ध तैयारी चुंबकीय मोती (1 टेबल) और क्षालन बफर (तालिका 1) निकालें और 30 मिनट के लिए आरटी को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं। धो बफर (तालिका 1) कंटेनर, टोपी के लिए 9.6 एमएल 100% इथेनॉल जोड़ें और बोतल में कई बार inverting द्वारा मिश्रण।
  2. भंवर 10 सेकंड के लिए चुंबकीय माला और एक 9 के अलग-अलग कुओं में 11 μl जोड़ने6 अच्छी तरह से थाली।
  3. टैग पीसीआर थाली खोलें और 5 बार माला और pipet मिश्रण करने के लिए टैग पीसीआर उत्पाद के 10 μl जोड़ें। आरटी पर 4 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
  4. चुंबकीय स्टैंड (1 टेबल) पर 96 अच्छी तरह से थाली 4 मिनट के लिए रखें। 96 अच्छी तरह से थाली अभी भी स्टैंड पर के साथ, हटाने और एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  5. चुंबकीय स्टैंड से 96 अच्छी तरह से थाली निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100 μl इथेनॉल युक्त धो बफर जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण ऊपर और नीचे 5 बार। 2 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस, तो हटाने और एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  7. दोहराएँ कदम 4.5, 2 इथेनॉल washes के एक कुल के लिए, के रूप में ज्यादा धोने समाधान संभव हटाने दूसरे धोने के बाद।
  8. चुंबकीय स्टैंड पर 96 अच्छी तरह से थाली के साथ, आरटी पर 2 मिनट के लिए मोती सूखी तो स्टैंड से प्लेट हटा दें।
  9. प्रत्येक wel के लिए 20 μl क्षालन बफर जोड़कर मोती Resuspendएल और pipet ऊपर और नीचे 5 बार।
  10. आरटी पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
  11. 96 अच्छी तरह से थाली 4 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर वापस प्लेस, और ध्यान हटाने के लिए और अच्छी तरह से एक नया करने के लिए स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला के 18 μl हस्तांतरण।
    नोट: प्रक्रिया को सुरक्षित रूप से किया इस कदम और नमूने -15 से -30 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत पर रोका जा सकता है। पुनः आरंभ आगे बढ़ने से पहले बर्फ पर जमे हुए नमूने पिघलना करने के लिए।

5. लाइब्रेरी मात्रा

  1. पिघलना लाइब्रेरी क्वांट (LQ) अभिकर्मकों: 2x LQ मास्टर मिक्स, LQ प्राइमर / जांच मिक्स, LQ स्टैंडर्ड, LQ सकारात्मक नियंत्रण, LQ मंदक, और LQ Rox (1 टेबल)। 10 सेकंड सामग्री इकट्ठा करने के लिए अधिकतम गति पर 10 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए भंवर।
  2. शुद्ध पुस्तकालय उत्पादों का प्रयोग, LQ मंदक में प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं।
    1. 198 μl LQ मंदक के लिए 2 μl (पुस्तकालय शुद्ध उत्पाद) जोड़ें और ऊपर और नीचे एक pipet के साथ 10 बार मिश्रण।
    2. 1: (100 कमजोर पड़ने 1) 2 μl जोड़े98 μl LQ मंदक और मिश्रण एक pipet 10 बार के साथ ऊपर और नीचे।
  3. नमूनों की कुल संख्या परीक्षण किया जा करने के लिए LQ मास्टर मिश्रण के लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार है और 10% अधिक मात्रा pipetting के कारण कमी से बचने के लिए शामिल हैं। नमूना प्रति निम्न संस्करणों का उपयोग कर एक microcentrifuge ट्यूब में LQ मास्टर मिश्रण तैयार: 5 μl 2X LQ मास्टर मिक्स, 2 μl LQ प्राइमर / जांच मिक्स, 0.5 μl LQ स्टैंडर्ड और 0.5 μl LQ ROX। 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति से ऊपर और नीचे, 10 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए भंवर pipetting सामग्री इकट्ठा करने के लिए से मिलाएं।
  4. एक ऑप्टिकल 96 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए 8 μl LQ मास्टर मिश्रण जोड़ें।
  5. अलग कुओं में, 2 μl पतला पुस्तकालय, 2 μl LQ सकारात्मक नियंत्रण और 2 μl LQ मंदक (एनटीसी) जोड़ सकते हैं और ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा मिश्रण। 10 सेकंड के लिए 400 XG पर 10 सेकंड और सेंट्रीफ्यूज के लिए ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म, भंवर के साथ थाली सील सामग्री इकट्ठा करने के लिए।
  6. निरुपित दोनों परिवार और विक Detectoप्रत्येक नमूना के लिए रु। (95 डिग्री सेल्सियस, 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट में 15 सेकंड) 95 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर प्रवर्धन 5 मिनट की साइकिल शर्तों का उपयोग करते हैं, और 40 चक्र।
  7. प्रत्येक नमूना (एनएम) तुलनात्मक सी क्यू विधि का उपयोग की एकाग्रता का निर्धारण। ज्ञात LQ स्टैंडर्ड (सी क्यू विक) अज्ञात पुस्तकालय (सी क्यू परिवार) के अंतर की गणना। पतला नमूना (प्रधानमंत्री) की एकाग्रता निम्न समीकरण का उपयोग गणना की है:
    [सान्द्र उदारीकरण] एनएम = 12.5 x 2 Δ Cq
    10,000 के अलावा किसी अन्य कमजोर पड़ने कारक का उपयोग करते हैं, तो 10,000 लक्ष्य कमजोर पड़ने कारक के अनुपात की गणना, और 5.7 में समीकरण का नतीजा द्वारा इस पहलू गुणा।

6. लाइब्रेरी सामान्यीकरण और नमूना पूलिंग

  1. मंझला एकाग्रता (एनएम) सभी नमूनों भर में (प्रत्येक एक अद्वितीय जोड़ो में सूचकांक युक्त) जमा किया जा करने के लिए निर्धारित करते हैं।
  2. व्यक्तिगत नमूना volum निर्धारित बनाने के लिए5 से सभी नमूनों भर में मंझला एकाग्रता गुणा, तो अपने व्यक्तिगत एकाग्रता (एनएम) से विभाजित करके पूल करने के लिए ई (μl)। निकटतम पूर्णांक के लिए जिसके परिणामस्वरूप मूल्य दौर। के मूल्यों के साथ गोल की मात्रा <2 μl के लिए 2 μl, और मात्रा> 15 μl 15 μl।
  3. प्रत्येक नमूना के लिए सामान्यीकृत मात्रा (μl) एक microcentrifuge ट्यूब में जोड़े नमूना पूल बनाने के लिए।
  4. गोल पूर्णांक मान का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए नए एकाग्रता की गणना और परिणाम रिकॉर्ड।
  5. नमूना पूल की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, सभी अलग-अलग सांद्रता के योग की गणना और जिसके परिणामस्वरूप मूल्य (एनएम) रिकॉर्ड है।
  6. 1.25 अनुक्रमण मंदक (तालिका 1) का उपयोग करने के लिए एनएम नमूना पूल पतला।
    नोट: प्रक्रिया को सुरक्षित रूप से किया इस कदम और नमूने -15 से -30 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत पर रोका जा सकता है। पुनः आरंभ आगे बढ़ने से पहले बर्फ पर जमे हुए नमूने पिघलना करने के लिए।

7. अनुक्रमण

  1. Denat1.25 एनएम नमूना पूल, 0.5 एनएम PhiX के 3 μl और 1 एन NaOH के 2 μl के 15 μl: निम्नलिखित जोड़कर PhiX नियंत्रण v3 (1 टेबल) की उपस्थिति में नमूना पूल Ure। भंवर संक्षेप में एक संक्षिप्त centrifugation द्वारा पीछा किया और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. बर्फ पर विकृत नमूना पूल रखें।
  3. एक microcentrifuge ट्यूब पूर्व ठंडा HT1-Hyb बफर के 992 μl को विकृत पुस्तकालय के 8 μl जोड़ें। भंवर संक्षिप्त मिश्रण करने के लिए, सामग्री इकट्ठा करने के लिए एक संक्षिप्त centrifugation द्वारा पीछा किया। बर्फ पर रखें।
  4. अभिकर्मक कारतूस की # 17 की स्थिति के लिए विकृत और पतला पुस्तकालय के 600 μl जोड़ें।
  5. पिघलना पढ़ें 1 अनुक्रमण प्राइमरों (तालिका 1), सूचकांक पढ़ें अनुक्रमण प्राइमरों (तालिका 1), और पढ़ें 2 अनुक्रमण प्राइमरों (तालिका 1)। microcentrifuge ट्यूबों में, अलग से 636 μl HT1-Hyb बफर के साथ 4 μl अनुक्रमण प्राइमरों पतला। नोट: HT1-Hyb बफर प्रदान की बुद्धि हैज अनुक्रमण अभिकर्मक किट (1 टेबल)।
  6. 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर 10 सेकंड और सेंट्रीफ्यूज के लिए vortexing सामग्री इकट्ठा करने के लिए से मिलाएं। अनुक्रमण अभिकर्मक कारतूस की # 18 की स्थिति के लिए पतला पढ़ें 1 अनुक्रमण प्राइमरों के 600 μl जोड़ें, पतला सूचकांक पढ़ें प्राइमर के 600 μl # 20 की स्थिति के लिए # 19, और पतला 2 पढ़ें अनुक्रमण प्राइमरों के 600 μl की स्थिति है।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार NGS साधन (1 टेबल) और क्रम पर अभिकर्मकों लोड। एक बनती अंत 2 x 150 चक्र अनुक्रमण रन प्रदर्शन करना।

8. डेटा विश्लेषण

नोट: NGS साधन सॉफ्टवेयर प्रत्येक नमूना के लिए आधार कॉल्स और गुणवत्ता स्कोर के लिए क्लस्टर छवियों धर्मान्तरित, और जोड़ो में सूचकांकों demultiplexes व्यक्ति gzip संकुचित FASTQ उत्पन्न करने के लिए (* .fastq.gz) फ़ाइलें। Demultiplexed फ़ाइलों का विश्लेषण करने से पहले, पाठक डाउनलोड करने और जैव सूचना विज्ञान जुड़े सॉफ्टवेयर को स्थापित करना होगा (तालिका1)। सॉफ्टवेयर एक उपभोक्ता ग्रेड विंडोज पीसी पर स्थापित किया जा सकता है और विशेष कंप्यूटिंग हार्डवेयर या डेटा विश्लेषण करने के लिए एक इंटरनेट कनेक्शन की आवश्यकता नहीं है।

  1. सॉफ्टवेयर डेस्कटॉप आइकन पर डबल क्लिक करें।
  2. यूज़रनेम और पासवर्ड सॉफ्टवेयर मैनुअल में प्रदान का उपयोग कर प्रणाली में लॉगिन करें।
  3. परियोजना डैशबोर्ड खोलें, और "नई परियोजना" पर क्लिक करें।
    1. परियोजना का नाम और एक वैकल्पिक परियोजना विवरण प्रदान करते हैं। लक्षित NGS पैनल के प्रकार और NGS साधन प्रकार का चयन करें। क्लिक करें "सहेजें और जारी रखने के लिए"।
    2. आगे के लिए संकुचित FASTQ फ़ाइलें अपलोड करें और रिवर्स पढ़ता है। "असाइन नहीं की गई" FASTQs, जो होते हैं कि demultiplex करने में विफल रहा पढ़ता अपलोड न करें। क्लिक करें "सहेजें और जारी रखने के लिए"।
    3. इनपुट कार्यात्मक इनपुट के रूप में डीएनए कार्यात्मक मात्रा का ठहराव परख (ऊपर चरण 1 देखें) द्वारा निर्धारित प्रत्येक पुस्तकालय तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया प्रतियों की संख्या। मैन्युअल रूप से प्रसार से मूल्यों या कॉपी और पेस्ट मूल्यों को जोड़नेएनोटेशन तालिका में चादर। "सहेजें और जारी रखने के लिए क्लिक करें।"
    4. विश्लेषण के लिए अपलोड की एनोटेट पुस्तकालयों की समीक्षा करें और "विश्लेषण भेजें" विश्लेषण शुरू करने के लिए क्लिक करें।
  4. विश्लेषण परियोजना डैशबोर्ड के माध्यम से प्रदर्शित की प्रगति की निगरानी।
    नोट: एक विश्लेषण पूरा स्थिति संकेत प्रस्तुत किया जाता है जब परिणाम की समीक्षा के लिए तैयार हैं।
  5. पुस्तकालय प्रति कुल कवरेज सहित नमूना क्यूसी मैट्रिक्स के लिए विश्लेषण परिणामों की समीक्षा करें, का प्रतिशत गुजर फिल्टर, amplicon कवरेज गहराई और एकरूपता पढ़ता है। समीक्षा संस्करण dbSNP, लौकिक, 1,000 जीनोम और कार्यात्मक और जनसंख्या के स्तर एनोटेशन के अन्य स्रोतों के साथ प्रत्येक अनुक्रम पुस्तकालय के लिए कहता है।
  6. सारांश स्प्रेडशीट टेबल, * .bam फ़ाइलें और पूरक सूचना विज्ञान उपकरणों के साथ लंबी अवधि के भंडारण या नीचे की ओर विश्लेषण के लिए * .vcf फ़ाइलों के रूप में कच्चे परिणाम निर्यात करें।

Representative Results

90 नमूने (74 अद्वितीय) सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, पहले की विशेषता सेल लाइनों, और अवशिष्ट नैदानिक ​​FFPE ट्यूमर बायोप्सी का प्रतिनिधित्व करने के लिए कुल amplifiable डीएनए, मल्टीप्लेक्स पीसीआर संवर्धन में निवेश, अनुक्रम एडेप्टर, बारकोड के साथ टैग के लिए मूल्यांकन किया गया था, और एक एकल में विश्लेषण benchtop NGS साधन रन (चित्रा 2) कि 19.1 एम उत्पादित फिल्टर गुजर पढ़ता है। Equimolar नमूना पूलिंग उच्च गहराई अनुक्रमण (3,692x पढ़ता है) और वर्दी कवरेज (मंझला पढ़ें गहराई का 5 गुना भीतर कवर amplicons की 97.8%) में हुई। Outliers कोई टेम्पलेट नियंत्रण, एक बड़ी प्रतिलिपि संख्या प्रवर्धन के साथ एक सेल लाइन डीएनए, और एक FFPE डीएनए कि पूर्व विश्लेषणात्मक क्यूसी परख द्वारा पीसीआर निषेध के लिए झंडी दिखाकर रवाना किया गया था (चित्रा 3) शामिल थे। 46 amplicons भर में कवरेज एकरूपता (तीन अलग-अलग ऑपरेटरों (चित्रा -4 ए), और विभिन्न कम गुणवत्ता वाले FFPE डीएनए के नमूने के लिए उपयोग कर बनाए रखा गया था (चित्रा 4 बी और इनसेट तालिका के "FFPE3") का एक इनपुट। 17% मतलब एलील आवृत्ति (तालिका 2) - इसके अलावा, 12 सिंथेटिक डीएनए टेम्पलेट्स का एक मिश्रण है, प्रत्येक, एक ज्ञात "चालक" आधार प्रतिस्थापन उत्परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करने का इरादा 9 रेंज में उम्मीद म्यूटेशन का पता चला। सेल लाइन और प्रतिलिपि संख्या amplifications साथ FFPE डीएनए नमूनों के कमजोर पड़ने और EGFR KRAS, क्रमशः (चित्रा 5) में वेरिएंट के लिए खुराक-निर्भरता का प्रदर्शन किया। महत्वपूर्ण बात है, FFPE डीएनए इनपुट झूठी सकारात्मक बिना मात्र 50 amplifiable प्रतियां या थोक डीएनए के 1.2 एनजी जबकि जाना जाता उत्परिवर्तन का पता लगाने के संरक्षण के लिए कम किया जा सकता हैकॉल (चित्रा 6)। डीएनए आदानों कम से कम 50,000 amplifiable प्रतियां (3 टेबल) के लिए एक 100 गुना रेंज भर में जगह दी गई। इस और संबंधित प्रयोगों में, संस्करण 22 FFPE में कॉल और 20 FNA नमूनों साझा उत्परिवर्तन कवरेज (तालिका 4) के साथ स्वतंत्र तरीकों के साथ समझौते में सूचित किया गया।

संवेदनशीलता और परख के लिए सकारात्मक भविष्य कहनेवाला मूल्य FFPE, Fna, ताजा जमे हुए, और सेल लाइन डीएनए, और 195 अनुक्रमण परिणाम कुल सहित 97 नमूने, के एक विश्लेषण से निर्धारित किया गया था। 99.7% की और एक सकारात्मक भविष्य कहनेवाला मूल्य (पीपीवी) (95% सीआई: परिणाम 365 सच सकारात्मक संस्करण कॉल, 4 नकारात्मक झूठी कॉल, और एक 98.9% की संवेदनशीलता (97.1-99.7% से 95% सीआई) के लिए 1 झूठी सकारात्मक कॉल का पता चला : 98.2-99.99%)। indels का विश्लेषण, 33 नमूना रन में दो आम EGFR वेरिएंट (p.E746_A750delELREA और p.V769_D770insASV) के लिए प्रदर्शन किया गया 93.9% की संवेदनशीलता का प्रदर्शन (95% सीआई: 78.4-98.9%) और 100% (95% सीआई के एक पीपीवी: वेरिएंट के साथ 86.3-100%) 2.4-84.8% की एक सीमा से अधिक का पता चला।

आकृति 1
चित्रा 1:। डीएनए मात्रा कैलिब्रेशन घटता है कि दर्रा और असफल क्यूसी मानदंड (ए) एक गुजर मानक वक्र का एक उदाहरण। (बी) के एक असफल मानक वक्र। इस मामले में, विफलता सबसे कम इनपुट डीएनए मानक के डुप्लिकेट pipetting की वजह से हुई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: कैंसर विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए एक व्यापक लक्षित NGS प्रणाली का अवलोकन है कि पूर्व विश्लेषणात्मक एकीकृतअल, विश्लेषणात्मक, और पोस्ट-विश्लेषणात्मक workflows। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: पढ़ें कवरेज और एकरूपता बरकरार सेल लाइन डीएनए और नियंत्रण की तुलना में कम गुणवत्ता वाले FFPE डीएनए में कैंसर के जीन की लक्षित NGS के लिए 90 नमूने है कि अवशिष्ट नैदानिक ​​FFPE (बंद हलकों), सेल लाइन शामिल के कुल (खुला हलकों। ), और सिंथेटिक डीएनए टेम्पलेट (प्लस प्रतीकों) एकल-ट्यूब, 21-जीन मल्टीप्लेक्स पीसीआर संवर्धन का उपयोग संसाधित किया गया। प्रत्येक amplicon पुस्तकालय NGS साधन के लिए एडाप्टर दृश्यों, एक अलग दोहरे सूचकांक कोड, शुद्ध, मात्रा निर्धारित है, और 2.5 एनएम के एक एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत साथ barcoded साथ टैग किया गया। डीएनए अनुक्रम पुस्तकालय और साथी जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किया गया था। नमूना देवीations एमडीए MB-468 सेल लाइन डीएनए के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के एक बड़े EGFR प्रतिलिपि संख्या प्रवर्धन (ऊपर, डॉटेड सर्कल के भीतर खुले आयतों) कि कवरेज एकरूपता और एक मेलेनोमा FFPE नमूना विकृत की एक प्रशंसनीय संख्या उत्पन्न करने में विफल रहा है कि कारण पढ़ता असर शामिल डीएनए निष्कर्षण से पीसीआर अवरोधकों का भार है। मेलेनोमा नमूना विफलता (नीचे, डॉटेड सर्कल) पूर्व विश्लेषणात्मक qPCR डीएनए क्यूसी परख ने भविष्यवाणी की थी। एनटीसी, कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एक्स प्रतीकों)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: Amplicon-से-amplicon पढ़ें कवरेज, एकरूपता और अवशिष्ट नैदानिक ​​FFPE ट्यूमर डीएनए में संस्करण जांच। (ए) एक प्रतिनिधि FFPE डीएनए नमूने में सभी समृद्ध लोकी मापा भर में कवरेज पढ़ेंतीन अलग-अलग ऑपरेटरों के पार। ऑपरेटर 1, OP1 (नीले सलाखों); ऑपरेटर 2, Op2 (हरे रंग की सलाखों); ऑपरेटर 3, Op3 (काली सलाखों)। (बी) के कवरेज एकरूपता और संस्करण कॉल तीन FFPE ट्यूमर के नमूनों का उपयोग कर मूल्यांकन, एक नियंत्रण मिश्रण (FFPE3, ग्रे सलाखों और पाठ) सहित एक ज्ञात 5% BRAF c.1799T> एक उत्परिवर्तन के शामिल। FFPE1 (नीले सलाखों और पाठ), FFPE2 (नारंगी सलाखों और पाठ)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। सेल लाइन और एक अच्छी तरह से विशेषता EGFR प्रतिलिपि संख्या प्रवर्धन के साथ FFPE डीएनए एमडीए MB-468 सेल लाइन डीएनए में नकल संख्या वेरिएंट की खुराक पर निर्भर जांच उत्तरोत्तर एक संदर्भ गैर उत्परिवर्तित सेल की एक पृष्ठभूमि में पतला था लाइन डीएनए एक के रूप में नकल संख्या में कमी परिवर्तन वर्णन करने के लिएकमजोर पड़ने का कार्य करते हैं। प्रत्येक कोशिका लाइन डीएनए नमूने का प्रतिशत एक अलग लाइन (0, 12.5, 25, 50, और 100%) के साथ दिखाया गया है। एक ज्ञात KRAS प्रवर्धन के साथ एक डिम्बग्रंथि FFPE ट्यूमर नमूना के कमजोर पड़ने के लिए एक समान प्रोफ़ाइल ही अनुमापन श्रृंखला का उपयोग कर पता चला है, लेकिन दो शीर्ष लाइनों के लिए 100% FFPE डीएनए की प्रतिकृति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: सटीक उत्परिवर्तन का पता लगाने और मात्रा का ठहराव 50 Amplifiable FFPE डीएनए प्रतियां, या 1.2 एनजी थोक डीएनए के लिए एक पेट के कैंसर FFPE डीएनए qPCR आधारित क्यूसी परख द्वारा निर्धारित किया गया था की amplifiable प्रतिलिपि संख्या, और एक के रूप में 25 प्रतियां करने के लिए 400 से पतला था। मल्टीप्लेक्स पीसीआर संवर्धन अनुक्रमण के लिए पूर्व में इनपुट। जैव सूचना विज्ञान पाइप लाइन को सही ढंग से जाना जाता वरियन के दोनों बुलाया50 प्रतियां, या ~ 10 उत्परिवर्ती टेम्पलेट्स के बराबर करने के लिए नीचे टीएस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सामग्री / सामग्री का नाम कंपनी सूची की संख्या
2x Quantidex मास्टर मिक्स Asuragen 145,345
क्वांट प्राइमर जांच मिक्स Asuragen 145,336
निषेध प्राइमर जांच मिक्स Asuragen 145,344
ROX Asuragen 145,346
घुलानेवाला Asuragen 145,339
डीएनए मानक (50) Asuragen 145,340
डीएनए मानक (10) Asuragen 145,341
डीएनए मानक (2) Asuragen 145,342
डीएनए स्टैंडर्ड (0.4) Asuragen 145,343
2x प्रवर्धन मास्टर मिक्स Asuragen 145,348
पान कर्क प्राइमर पैनल Asuragen 145,347
पान कर्क FFPE नियंत्रण Asuragen 145,349
पान कर्क मल्टी-संस्करण नियंत्रण Asuragen 145,350
लाइब्रेरी शुद्ध प्रस्तुत करने का मोती Asuragen 145,351
धो बफर Asuragen 145,352
क्षालन बफर Asuragen 145,353
2x LQ मास्टर मिक्स Asuragen 145,358
LQ मंदक Asuragen 145,354
LQ सकारात्मकनियंत्रण Asuragen 145,355
LQ स्टैंडर्ड Asuragen 145,356
LQ प्राइमर / जांच मिक्स (ILMN) Asuragen 145,357
LQ ROX Asuragen 145,359
सूचकांक कोड (ILMN) - सेट एक Asuragen 150,004
AIL001 - AIL048 (48)
सूचकांक कोड (ILMN) - सेट बी Asuragen 150,005
AIL049 - AIL096 (48)
2x सूचकांक मास्टर मिक्स Asuragen 145,361
पढ़ें 1 अनुक्रमण प्राइमरों Asuragen 150,001
सूचकांक पढ़ें अनुक्रमण प्राइमरों Asuragen 150,002
पढ़ें 2 अनुक्रमण प्राइमरों Asuragen 150,003
अनुक्रमण मंदक Asuragen 145,365
illumina MiSeq illumina
MiSeq अभिकर्मक किट v3 (600-चक्र) illumina MS-102-3003
MiSeq अभिकर्मक नैनो किट V2 (300-चक्र) illumina MS-103-1001
PhiX नियंत्रण v3 illumina एफसी-110-3001
चुंबकीय स्टैंड-96 (या समतुल्य डिवाइस) Ambion AM10027
Quantidex रिपोर्टर सॉफ्टवेयर Asuragen

तालिका 1:। अभिकर्मकों और किट ROX का पहला प्रयोग करने पर, 2-8 डिग्री सेल्सियस पर शीशी की दुकान। refreeze मत करो। सॉफ्टवेयर www.asuragen.com पर डाउनलोड किया जा सकता है।

<टीआर>
जीएकदा लौकिक संस्करण लौकिक एमिनो एसिड % संस्करण
NRAS c.182A> जी p.Q61R 13.3
NRAS c.35G> एक p.G12D 15.2
HRAS c.182A> जी p.Q61R 17.8
HRAS c.35G> एक p.G12D 9.2
KRAS c.182A> जी p.Q61R 13.5
KRAS c.35G> एक p.G12D 19.1
PIK3CA c.1633G> एक p.E545K 9.3
PIK3CA c.3140A> जी p.H1047R 9.1
किट c.2447A> टी p.D816V 14.6
EGFR c.2369C> टी p.T790M 11.3
EGFR c.2573T> जी p.L858R 14.9
BRAF c.1799T> एक p.V600E 17.3

तालिका 2: एक जमा सिंथेटिक कंट्रोल 12 "चालक" कैंसर जीन वेरिएंट कि 9-17% बहुतायत में मात्रा निर्धारित कर रहे हैं के शामिल है 12 विभिन्न डबल असहाय सिंथेटिक असर 12 अलग म्यूटेशन टेम्पलेट्स का एक मिश्रण अनुक्रमण निम्नलिखित मूल्यांकन किया गया था।। सभी वेरिएंट को सही ढंग से कोई झूठी सकारात्मक के साथ बुलाया गया।

>% संस्करण
नमूना आईडी कार्यात्मक
सीपीएस 		जीन लौकिक संस्करण लौकिक एमिनो एसिड माध्य पढ़ें गहराई मंझला की 5x भीतर%
BCPAP 400 BRAF c.1799T> एक p.V600E 99.5 3289 96%
BCPAP 10,000 BRAF c.1799T> एक p.V600E 99.7 4040 98%
BCPAP 25,000 BRAF c.1799T> एक p.V600E 99.4 3687 96%
BCPAP 50,000 BRAF c.1799T> एक p.V600E 99.7 4611 93%

तालिका 3: कवरेज और संस्करण कॉलिंग ओवर डीएनए इनपुट के एक> 100 गुना रेंज संरक्षित कर रहे हैं।

तालिका 4
सारणी 4: संस्करण 22 FFPE और 20 FNA ट्यूमर बायोप्सी में कॉल स्वतंत्र उत्परिवर्तन assays से परिणाम के साथ सहमत हूँ कि पहले orthogonal लक्षित NGS assays द्वारा निर्धारित उत्परिवर्तन की स्थिति के साथ 22 FFPE ट्यूमर डीएनए का एक सेट पीसीआर संवर्धन में 400 से 2,928 को amplifiable प्रतियां पर इनपुट था। कदम और 21-जीन पान कर्क पैनल का उपयोग कर अनुक्रम। इसके अलावा, 20 FNA डीएनए नमूने की एक पलटन पहले एक तरल मनका सरणी उत्परिवर्तन परख 8 पीसीआर 156 36080 के लिए इनपुट amplifiable प्रतियां और अनुक्रम का उपयोग कर परिलक्षित किया गया था का उपयोग विशेषता। पान कर्क NGS पैनल और refere के बीच सभी ओवरलैपिंग कॉलnce तरीकों समझौते में थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

NGS प्रौद्योगिकियों नैदानिक ​​सेटिंग 9 में ट्यूमर बायोप्सी की आणविक प्रोफाइल पूछताछ के लिए उम्मीदों नए सिरे से परिभाषित किया है। लक्षित NGS पैनल के एक नंबर शोध प्रौद्योगिकी प्रयोगशाला विकसित परीक्षण, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों और कस्टम पैनलों नैदानिक ​​नमूनों 3,5,10-15 के कई प्रकार का आकलन करने के लिए के रूप में विकसित किया गया है। कई अध्ययनों से रिपोर्ट जीनोमिक परिवर्तन 3,10-12,14 का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट नैदानिक ​​उपकरण के रूप में NGS के मूल्य का प्रदर्शन किया है। फिर भी पढ़ाई भी कलाकृतियों जो इस तरह के FFPE नमूनों 2-5,12,14 के रूप में चुनौतीपूर्ण कैंसर बायोप्सी से झूठी सकारात्मक परिणाम हो सकता है के जोखिम का प्रदर्शन किया है। इसके अतिरिक्त, हाल के प्रकाशनों नमूनों ऑन्कोलॉजी का उपयोग कर NGS के लिए उच्च विफलता दर पर प्रकाश डाला है कि कम इनपुट डीएनए 12 के उपयोग से बढ़ रहे हैं वाणिज्यिक लक्षित NGS पैनल के साथ 16 और झूठी सकारात्मक कॉल है। नतीजतन, कुछ प्रयोगशालाटोरी या तो संशोधित या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लक्षित NGS प्रौद्योगिकियों के प्रदर्शन में सुधार करने के लिए, अक्सर सटीकता सुनिश्चित या निष्कर्षों की पुष्टि bioinformatic से विश्लेषण करती है 5,10,11 करने के लिए अतिरिक्त नियंत्रण और संतुलन को शामिल किया है।

21-जीन पैनल (चित्रा 2) ऐसे FFPE और FNA ट्यूमर बायोप्सी के रूप में चुनौतीपूर्ण नमूना प्रकार के सबूत के आधार पर कार्रवाई म्यूटेशन से पूछताछ करने के लिए एक व्यापक NGS प्रणाली के लिए लक्षित सामग्री के रूप में विकसित किया गया था। कार्यप्रवाह लाभ के एक नंबर है: 1) वर्दी amplicon कवरेज (आंकड़े 3 और 4, 3 टेबल) प्रदान करके स्थिरता; 2) आसानी से उपयोग प्रदान करके पूर्व तैयार की, अनुकूलित अभिकर्मक सेट, और जैव सूचना विज्ञान आवश्यकताओं को सरल बनाने के; 3) कार्यप्रवाह को व्यवस्थित बनाने और pipetting कदम की संख्या को कम करने के अन्य वाणिज्यिक NGS तरीकों की तुलना में से दक्षता; और 4) amplifi का आकलन करने के लिए एक डीएनए क्यूसी परख शामिल करके सटीकतासक्षम डीएनए नकल संख्या स्वीकार्य टेम्पलेट विविधता को सुनिश्चित करने और संस्करण का पता लगाने 4 में स्टोकेस्टिक उतार चढ़ाव से बचने के लिए। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के साथ पूर्व विश्लेषणात्मक क्यूसी डेटा के एकीकरण FFPE डीएनए के कम आदानों के लिए अनुमति देता है। इस सच्चाई का स्वतंत्र उपायों के साथ 400 FFPE नमूने भर में डीएनए इनपुट के विभिन्न कार्यात्मक प्रतियों का उपयोग कर एक निर्णय पेड़ एल्गोरिथ्म प्रशिक्षण, और bioinformatic सॉफ्टवेयर में इस एल्गोरिथ्म को शामिल करके हासिल की थी। नतीजतन, 400 amplifiable प्रतियां, आम तौर पर FFPE डीएनए के ~ 5-20 एनजी के बराबर की सिफारिश की इनपुट, अन्य तरीकों 10-12, संकरण आधारित संवर्धन सहित जहां FFPE डीएनए के ~ 250 एनजी 17,18 सिफारिश की है के लिए अनुकूल तुलना । तकनीक एक MiSeq मंच पर इस्तेमाल के लिए वर्णन किया गया है हालांकि, यह साधन-विशिष्ट एडाप्टर के साथ टैग पीसीआर प्राइमरों का उपयोग अन्य NGS प्लेटफार्मों पर अनुक्रम विश्लेषण सक्षम करने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है।

कई कदम सफलता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैंप्रक्रिया की। पूर्व विश्लेषणात्मक क्यूसी परख डीएनए और रिपोर्ट कार्यात्मक निषेध की amplifiable प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करता है। हालांकि, अगर कम से कम 400 amplifiable डीएनए पीसीआर प्रतियां संवर्धन कदम में उपयोग किया जाता है, वहाँ एक झूठी नकारात्मक (चित्रा 6) कम बहुतायत परिवर्तन के साथ नमूनों से कॉल का खतरा बढ़ गया है। इसके अतिरिक्त, देखभाल धोने या क्षालन चरणों के दौरान चुंबकीय मोतियों की ओवर-सुखाने को रोकने के लिए पुस्तकालय शुद्धि के दौरान लिया जाना चाहिए। इसके अलावा, सफल पुस्तकालय मात्रा का ठहराव पुस्तकालय डीएनए का सही कमजोर पड़ने पर अत्यधिक निर्भर है। सबसे अच्छा परिणाम के लिए, qPCR के अंतर नमूना पुस्तकालय (सीक्यू परिवार) LQ स्टैंडर्ड (सीक्यू विक) की तुलना के लिए परिणाम होना चाहिए ≤3.3 Cq। अंतर अधिक से अधिक 3.3 सीक्यू, फिर से कमजोर पड़ने और नमूने का परीक्षण कर रहा है तो सिफारिश की है। प्रस्ताव है कि एक उत्कृष्ट सहसंबंध इस प्रतिस्पर्धी qPCR विधि और वाणिज्यिक किट के बीच मनाया गया है हालांकि एक मानक वक्र का उपयोग पूर्ण मात्रा का ठहराव, एक अन्य तरीकों की प्रतिरूप प्रवर्धन कदम रिश्तेदार में पुस्तकालय इनपुट की भरपाई इष्टतम बोने घनत्व को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

कुछ कैंसर के नमूनों विशेषकर इसलिए क्योंकि अवरोधकों कि डीएनए अलगाव के बाद जारी रहती है के अनुक्रम के चुनौती दे रहे हैं। पुस्तकालय तैयारी के लिए इन नमूनों की पहचान करने से पहले, qPCR क्यूसी परख भी है कि दोनों एक आंतरिक नियंत्रण और कार्यात्मक निषेध के लिए एक प्रहरी के रूप में कार्य करता है एक exogenous टेम्पलेट शामिल करके प्रवर्धन निषेध का पता लगाता है। एक उदाहरण चित्रा 3 जिसमें एक मेलेनोमा डीएनए नमूने क्यूसी निषेध मीट्रिक अनुक्रमण करने से पहले पारित करने में विफल है और फिर एक पुस्तकालय है कि अनुक्रम किया जा सकता है उत्पन्न करने में विफल में प्रस्तुत किया है। असफलता की संभावना मेलेनिन संदूषण, एक ज्ञात पीसीआर अवरोध, FFPE डीएनए अलगाव कदम से खत्म किया का परिणाम था। नमूने है कि क्यूसी परख द्वारा पहचाने जाते हैं प्रवर्धन की विफलता के लिए खतरा हो सकता है के लिए एक अतिरिक्त साफ-अप कदम टी के माध्यम से बचाया जा सकता हैओ संभावित अवरोधकों को हटा दें।

लक्षित 21-जीन पैनल सबूत के आधार पर जीन के आकर्षण के केंद्र पर केंद्रित है और अनुकूलित अभिकर्मकों और डीएनए क्यूसी, NGS और जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर है कि द्वारा पूर्व विश्लेषणात्मक "कार्यात्मक" डीएनए मात्रा का ठहराव परिणाम सूचित किया जाता है के लिए नियंत्रण के साथ एक पूरी प्रणाली प्रदान करता है। विधि सही कम इनपुट डीएनए से आधार-प्रतिस्थापन म्यूटेशन और indels का पता लगाता है, और पैनल सामग्री का विस्तार करने के लिए, इस तरह के रूप में अतिरिक्त CNVs वेरिएंट पता लगाने के लिए और लक्षित आरएनए अनुक्रमण के लिए अनुकूलित किया जा विकल्प के साथ एक NGS प्रणाली का एक उदाहरण है।

Disclosures

झा, आह, RZ, BCH, और GJL कर्मचारी हैं और Asuragen, इंक RZ, BCH में शेयर स्वामित्व है, और GJL प्रत्येक नमूना के लिए चुना गया amplifiable प्रतिलिपि संख्या के बारे में जानकारी का उपयोग कर बुला संस्करण में सुधार के लिए एक पेटेंट आवेदन पर सह-आविष्कारक हैं।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि की समीक्षा के लिए डॉ एनेट Schlageter धन्यवाद। इस काम के कैंसर की रोकथाम और टेक्सास के अनुसंधान संस्थान (: GJL पीआई) से अनुदान CP120017 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x Quantidex Master Mix Asuragen 145345
Quant Primer Probe Mix Asuragen 145336
Inhibition Primer Probe Mix Asuragen 145344
ROX Asuragen 145346
Diluent Asuragen 145339
DNA Standard (50) Asuragen 145340
DNA Standard (10) Asuragen 145341
DNA Standard (2) Asuragen 145342
DNA Standard (0.4) Asuragen 145343
2X Amplification Master Mix Asuragen 145348
Pan Cancer Primer Panel Asuragen 145347
Pan Cancer FFPE Control Asuragen 145349
Pan Cancer Multi-Variant Control Asuragen 145350
Library Pure Prep Beads Asuragen 145351
Wash Buffer Asuragen 145352
Elution Buffer Asuragen 145353
2X LQ Master Mix Asuragen 145358
LQ Diluent Asuragen 145354
LQ Positive Control Asuragen 145355
LQ Standard Asuragen 145356
LQ Primer/Probe Mix (ILMN) Asuragen 145357
LQ ROX Asuragen 145359
Index Codes (ILMN) - Set A, AIL001 - AIL048 (48) Asuragen 150004
Index Codes (ILMN) - Set B, AIL049 - AIL096(48) Asuragen 150005
2x Index Master Mix Asuragen 145361
Read 1 Sequencing Primers Asuragen 150001
Index Read Sequencing Primers Asuragen 150002
Read 2 Sequencing Primers Asuragen 150003
Sequencing Diluent Asuragen 145365
Illumina MiSeq Illumina
MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) Illumina MS-102-3003
MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) Illumina MS-103-1001
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) Ambion AM10027
Quantidex Reporter Software Asuragen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Houghton, J., Hadd, A. G., Zeigler, R., Haynes, B. C., Latham, G. J. Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies. J. Vis. Exp. (110), e53836, doi:10.3791/53836 (2016).

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