Introduction
Aangeboren immuuncellen een essentieel deel van de cellen in de tumor micro-omgeving en zijn geassocieerd met tumor maligniteit bij patiënten en diermodellen van kanker 1. Onlangs is het uitgegroeid tot meer alom gewaardeerd dat chronische immuunrespons spelen cruciale rol bij het bevorderen van progressie van de tumor, metastase en weerstand tegen chemokuren 2. Macrofagen zijn belangrijke aangeboren immuuncellen die zijn aangetoond om rechtstreeks de tumorcel respons op chemotherapie 3,4. Echter, de rol van neutrofielen, belangrijke spelers in het aangeboren immuunsysteem bij de regulering van tumor-respons op de behandeling tegen kanker niet bekend. Het doel van deze protocollen is een snelle en betrouwbare methode om neutrofielen uit bloedmonsters CLL patiënt scheiden en HL60 cellen differentiëren langs de granulocyten route om de rol te bestuderen in het reguleren van de gevoeligheid van de lymfoomcellen anti-lymfoom middelen.
5 en fungeren als een eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen 6. Neutrofielen een essentiële rol bij stijgende aangeboren immuun responsen naast variabele effectorfuncties in verschillende pathologische aandoeningen 7. Daarom is een snelle en betrouwbare methode om neutrofielen van andere bloedcellen zoals dichtheidsgradiënt scheidingsmethode isoleren vereist voor in vitro studies. Deze methode voor neutrofielen isolatie verder onderzoek neutrofiel-gemedieerde immunologische functies in vivo en ex vivo vergemakkelijken.
Het vermogen om zuivere populaties van neutrofielen te verkrijgen is een belangrijke eerste stap bij het onderzoek naar patiënten met immuunziekten 8. Dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze een ideale techniek waarbij een hoge opbrengst aan cellen is verkregen. de method bij de bereiding dichtheidsgradiënt oplossing in de bodem van een buis met verdunde humaan bloed gevolgd door centrifugatie bij 300 g gedurende 35 min zonder onderbreking. De ring van de mononucleaire cellen wordt in de interface en de neutrofielen bevinden onder het eerste. Deze werkwijze heeft grote voordelen ten opzichte van andere beschikbare werkwijzen zoals neutrofielen isolatie kits die veel duurder zijn 9. Bovendien isoleren neutrofielen uit menselijk bloed door commerciële kits behulp van antilichamen gericht op een oppervlak marker specifiek is voor humane neutrofielen, het risico van celactivering en differentiatie. Dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze maakt de isolatie van neutrofielen binnen een korte tijd. In dezelfde stap worden mononucleaire cellen ook afgescheiden en gewonnen. Het is een fundamentele techniek waarbij een hoge opbrengst aan zuivere cellen verkregen om functiebehoud bereiken.
Om de tumor nabootsen microenvironment, 3D experimenten uitgevoerd. Gezien de korte halfwaardetijd van neutrofielen in vitro, 3D experimenten met verse menselijke neutrofielen niet overtuigend. Daarom worden promyelocytische (HL60) cellen geïnduceerd om te differentiëren tot neutrofiel-achtige cellen met de differentiatie inducerende dimethylsulfoxide (DMSO) en retinoïnezuur (RA). Gebruik gedifferentieerde HL60 cellen (HL60 diff) voorkomt met verschillende responsen van neutrofielen door isolatie van verschillende donoren.
In vitro 3D cultuurmodellen vormen een tussenstap tussen in vitro 2D modellen en in vivo modellen. In 2D-cultuur, de cellen uitgespreid op plastic oppervlak vormen onnatuurlijk cel bijlagen bij afgezette eiwitten die gedenatureerd op deze synthetische ondergrond. Omgekeerd, de cellen in kweek 3D vorm natuurlijke cel- attachments omdat de cellen en de extracellulaire matrix ze synthetiseren zijn het natuurlijke materiaal waaraan zij gehecht.Daarom 3D co-cultuur modellen, met name tussen kankercellen en andere celtypes, zijn zeer nuttig voor het aanduiden van hun bijdrage aan tumorgroei, angiogenese en metastase is. Hierdoor 3D culturen maken de celkweek bootsen de fysiologische omstandigheden die bestaan in vivo 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. neutrofielen Isolatie en co-cultuur met primaire leukemische cellen
OPMERKING: Procedures werden uitgevoerd in het kader van de goedkeuring van Lyon Hospital ethische commissie met alle patiënten ondertekenen informed consent.
- Isolatie van primaire leukemische cellen en neutrofielen
- Verzamel buizen perifeer bloed op EDTA (1,8 mg EDTA per milliliter bloed) uit patiënten met chronische lymfatische leukemie (CLL).
- Voeg elk 15 ml bloed naar een steriele 50 ml buis en verdun met 15 ml RPMI (verdunning 1: 1), vervolgens voorzichtig en langzaam voeg 15 ml dichtheidsgradiënt oplossing naar de bodem van de buis zonder mengen van de fasen. Waarborgen dat de dichtheidsgradiënt oplossing bij kamertemperatuur voor het bereiden.
- Centrifugeren bij 300 g gedurende 35 min bij kamertemperatuur en zonder rem. Laat het bloed te scheiden in vier afzonderlijke fasen zoals getoond in figuur 1A, van boven naar beneden: bloedplaatjes en plasma, mononucleaire cellen (white ring), dichtheidsgradiënt oplossing, granulocyten en erytrocyten.
- Verzamel de witte ring die de primaire leukemische cellen met een plastic Pasteur pipet overgebracht naar een nieuwe 50 ml buis vertegenwoordigt.
- De buis met PBS (bevat calcium en magnesium) tot 50 ml in totaal en centrifugeer bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de pellet met 5 ml PBS PBS vervolgens oplopen tot 50 ml in totaal en centrifugeer bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de pellet met volledig RPMI medium (RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine) voor het tellen gebruik cellevensvatbaarheid teller.
- Zuig het bovenste fasen laat de granulocyten en erytrocyten fase en oplopen tot 25 ml PBS voeg 3% dextraan in 0,9% NaClup tot 50 ml in totaal. Meng de buizen 10 keer en houd ze gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder mengen.
- Verzamel de bovenste RBC-arme neutrofielen laag eend ze te plaatsen in een schone steriele 50 ml buis en centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer elk pellet met 5 ml PBS voeg red cell lysis buffer tot 50 ml in totaal.
- Houd de buizen in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 500 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de pellets met PBS (PBS oplopen tot 50 ml in totaal) en centrifugeer bij 500 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de pellets met volledig RPMI medium voor het tellen van het gebruik van levensvatbaarheid van de cellen teller. Blijf 3 x 10 5 van elk celtype in 50 pi PBS-FBS (4%) in 5 ml plastic buizen om de zuiverheid van de isolatie met flowcytometrie bepaald.
- Analyseer de morfologische Optredens van de geïsoleerde cel Populaties
- Hiertoe resuspendeer elk 3 x 10 4 neutrofielen en 3 x 10 4 mononucleaire cellen in 150 ul volledig RPMI medium. Monteer de glasplaatjes, filter kaarten en monster kamers in de cytospin centrifuge, ervoor te zorgen dat tHij centrifuge is goed in balans.
- Plaats elk celtype monsterkamer en cyto-centrifuge bij 750 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur Verwijder de glijbanen, filterkaarten en monsterkamers uit de centrifuge. Demonteren voorzichtig om te voorkomen dat de cellen beschadigen de dia. Gooi filter kaarten en monster kamers.
- Vlekken op de cellen met behulp van Giemsa kleuring kit en houd de dia's voor 1 uur drogen. Onderzoek de cellen door microscoop met 100X vergroting.
- Test de zuiverheid van de geïsoleerde cellen door FACS
- Label de geïsoleerde primaire leukemische cellen met anti-humaan CD19 antilichaam geconjugeerd aan APC (5 ul / 10 6 cellen). Label de gezuiverde neutrofielen met mengsel van anti-humane antilichamen in tabel 1 (5 ul / 10 6 cellen) genoemd. Incubeer de cellen in het donker gedurende 30 minuten bij 4 ° C
- Was de cellen met 500 pi PBS-FBS (4%) van de centrifuge de buizen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer elk pellet in 200 pl PBS-FBS (4%).
- Analyseren op een flowcytometer met behulp van de volgende optische configuratie: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (BP 575/26); 633 nm laser: APC (BP 660/20), APC-Cy7 (BP 780/60). Zorg ervoor dat de kleur compensatie.
- Co-kweek van primaire leukemische cellen met autologe neutrofielen
- Zaad 2 x 10 5 cellen / ml alleen of met autologe neutrofielen tot 1:10 in volledig RPMI medium primaire leukemische cellen. Hiervoor celaantallen aanpassen door verdunnen celsuspensies en voeg 2 x 10 5 cellen / ml primair leukemische cellen tot 2 x 10 6 cellen / ml neutrofielen. Meng voorzichtig.
- Voeg 25 uM Bruton's tyrosinekinase (Btk) remmer (ibrutinib) aan de cellen. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
- Cell Harvest en FACS-analyse
- Collect de cellen in 5 ml plastic buizen voor FACS-analyse en centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de korrels met 1 ml PBS-FBS (4%) en centrifugeer bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer pellets in Annexine V en PI behulp van commerciële kit en incubeer de cellen in donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Analyseren op een flowcytometer met de gating strategie van figuur 2A en de hieronder weergegeven optische configuratie: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PI (610 / 20 BP). Zorg ervoor dat de kleur compensatie.
2. Differentiatie van HL60 cellen langs de granulocytaire Pathway en hun Coculture met RL lymfoom B-cellen in 3D Model
- Differentiatie van Human Promyelocytic (HL60) cellen in neutrofielen-achtige cellen
- Pas HL60 celaantal tot 3 x 10 5 cellen / ml voeg 1 uM retinoïnezuur (RA) en 1,25% DMSO hun differentiatie induceren. Zaad elk 3 x 10 5 CO2.
- Later, het verzamelen van de cellen en centrifugeer bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen met volledige RPMI-medium voor het tellen van het gebruik van levensvatbaarheid van de cellen teller.
- Verdun cel suspensie in volledig RPMI medium om HL60 aantal cellen aan te passen aan 3 x 10 5 cellen / ml en induceren weer hun differentiatie door toevoeging van 1 uM retinoïnezuur (RA) en 1,25% DMSO. Zaad elk 3 x 10 5 HL60 cellen per putje in 48-well plaat en incubeer nog 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
- Analyse van HL60 differentiatie (HL60 diff)
- Verzamel de cellen en centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet met volledig RPMI medium voor het tellen van het gebruik van levensvatbaarheid van de cellen teller.
- De veranderingen in celoppervlak markers expressie door flow cytometry analyse. Plaats elke 3 x 10 5 5 diff HL60 cellen in 5 ml plastic buizen voor FACS-analyse en centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de pellets in 50 ul PBS-FBS (4%). Label de cellen met anti-humaan CD 11 geconjugeerd aan AF700 of anti-humaan CD38 geconjugeerd aan APC (5 ul / 10 6 cellen). Incubeer de cellen in het donker gedurende 30 minuten bij 4 ° C
- Wassen met 500 pi PBS-FBS (4%) en centrifugeer bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellets in 200 gl PBS-FBS (4%).
- Analyseren op flowcytometer met de gating strategie van figuur 3A en de hieronder weergegeven optische configuratie: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm laser: APC (BP 660/20), Alexa Fluor 700 (BP 730/45).
- Om de morfologische veranderingen in HL60 diff te testen, te immobiliseren van de cellen op glas dia's voor microscopisch onderzoek.
- Om dit te doen, resuspendeer elk 3 x 10
- Plaats elk celtype monsterkamer en cyto-centrifuge bij 1500 rpm gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de dia's, filter kaarten en monster kamers uit de centrifuge. Demonteren voorzichtig om te voorkomen dat de cellen beschadigen de dia. Gooi filter kaarten en monster kamers.
- Vlekken op de cellen met behulp van Giemsa kleuring kit en houd de dia's voor 1 uur drogen. Onderzoek de cellen door microscoop met 100X vergroting.
- Om dit te doen, resuspendeer elk 3 x 10
- 3-dimensionale (3D) cultuur
LET OP: Zorg ervoor dat de in dit experiment gebruikte materialen zijn koud en het experiment vindt plaats op ijs.- Resuspendeer elk 5 x 10 4 cellen RL, hetzij alleen of gemengd met HL60 diff diff 01:10, met 300 gl basaalmembraan matrix middels 1 ml pipetpunt gesneden met een steriele schaar om de opening 2 tot 3 mm verbreden. Vermijd bellen tijdens deze stap.
- Zaad elk 300 pi celsuspensie / putje in 24-well plaat. Vermijd bellen tijdens deze stap. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C met 5% CO 2 voeg 1 ml compleet RPMI-medium per putje en incubeer gedurende 7 dagen bij 37 ° C met 5% CO2. Verander het medium elke twee dagen. Voeg 10 nM vincristine op dag 5.
- FACS-analyse
- Na 7 dagen van de cultuur, zuig het medium en was elk putje met 1 ml ijskoude PBS twee keer. Voeg 3 ml / putje ijskoude PBS-EDTA (5 mM). Maak de gel uit de bodem van de put door schrapen met de bodem van 200 ul pipetpunt. Schud de plaat voorzichtig op ijs gedurende 30 min.
- Transfer celsuspensie in steriele 15 ml buis en schud de buizen zachtjes op ice nog eens 30 min. Controleer voor het verschijnen van homogene celsuspensie. (Als het niet het geval is, dan schud de cellen voor langere tijd of voeg meer PBS-EDTA).
- Centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de pellets met PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer met PBS-FBS (4%) en label met anti-humaan CD19 antilichaam geconjugeerd aan PE-Cy7 en anti-humaan CD38 antilichaam geconjugeerd aan APC (5 ul / 10 6 cellen). Incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij 4 ° C
- Wassen met 500 pi PBS-FBS (4%) dan centrifugebuizen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen met annexine V en PI via commerciële kit.
- Analyseer op flowcytometer met behulp van de gating strategie van figuur 4A en de volgende optische configuratie: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (BP 780/60); 633 nm laser: APC (BP 660/20). Zorg ervoor dat de kleur compensatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dichtheidsgradiënt scheidingswerkwijze hier beschreven is, primaire leukemische cellen en ongestimuleerde neutrofielen geïsoleerd uit het bloed van CLL patiënten Figuur 1A geeft de bloedgroepen lagen verkregen na dichtheidsgradiënt centrifugatie (van boven naar beneden. Bloedplaatjes en plasma, witte ring vertegenwoordigt de mononucleaire cellen, dichtheidsgradiënt oplossing, granulocyten en erytrocyten). Figuur 1B en 1C tonen de verschillen in morfologische verschijnselen tussen respectievelijk neutrofielen (multi-lobbig kernen cellen) en mononucleaire cellen.
De resultaten in figuur 1D vertegenwoordigen de forward-verstrooiing (FSC) versus side-verstrooiing (SSC) plot van primaire leukemische cellen (mononucleaire cellen). Het labelen van deze populatie met anti-humane CD19 geconjugeerd aan APC toont een volledige verschuiving naar rechts van het histogram (figuur 1E) met slechts éénpiek die aangeeft dat deze populatie is positief voor CD19 en puur. Neutrofielen zijn eveneens ≥90% zuiver is bevestigd door stromingscytometrie na labelen van de geïsoleerde neutrofielen met een mengsel van fluorochroom-geconjugeerd in Tabel 1 opgesomde monoklonale antilichamen. Figuur 1F geeft FSC vs SSC spreidingsdiagram van de geïsoleerde neutrofielen die positief zijn voor CD45 (Figuur 1G), positief voor CD15 en negatief voor CD14 (Figuur 1H), positief voor zowel CD15 en CD16 (Figuur 1I), positief voor CD16 en negatief voor CD56 (Figuur 1J).
Figuur 1. Analyse van morfologische Optredens en zuiverheid van primaire leukemische cellen en neutrofielen geïsoleerd uit het bloed van patiënten. (A) Schematische weergave vertegenwoordigt verschillende bloed lagen na dichtheid Gradient centrifugeren. (BC) Giemsa kleuring geeft de morfologische verschillen tussen (B) en neutrofielen (C) primaire leukemische cellen (mononucleaire cellen). Foto's werden genomen door microscoop met 100X vergroting. (D) Forward-verstrooiing (FSC) en side-verstrooiing (SSC) plot vertegenwoordigt de geïsoleerde primaire leukemische cellen bevolking. (E) Geïsoleerde primaire leukemische cellen werden gemerkt met anti-CD19-APC en geanalyseerd op de expressie van CD19. De rode lijn geeft de ongelabelde cellen en de blauwe lijn geeft aan cellen gelabeld met anti-CD19-APC. (F) FSC vs SSC scatter plot vertegenwoordigt de geïsoleerde neutrofielen bevolking. (GJ) Geïsoleerde neutrofielen werden gemerkt met een mengsel van antilichamen in tabel vermeld 1 en geanalyseerd op de expressie van (G) CD45, (H) CD14 en CD15, (I) CD15 en CD16, (J) een CD16d CD56. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| antigenen | fluorochroom | Clone |
| CD14 | APC-Vio770 (Cy-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | PE | AF12-7H3 |
Tabel 1. fluorochroom-geconjugeerd Gezuiverde monoklonale antilichamen gebruikt om de zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen Test. Alle antilichamen werden verkregen van Miltenyi Biotech.
figuur 2A geeft de poorten van neutrofielen en primaire leukemische cellen. Neutrofielen zijn veel gedetailleerder dan de primaire leukemische cellen zodat ze verschijnen bij hogere SSC. Gating op de primaire leukemische cellen samen gekweekt met neutrofielen in aanwezigheid van ibrutinib, resultaten tonen hoger percentage levende cellen (Figuur 2C, 84,8%) vergeleken met cellen alleen gekweekt (Figuur 2B, 53,1%). De box grafiek in Figuur 2D laat zien dat de decrease cellevensvatbaarheid geïnduceerd door ibrutinib werd significant geremd door de aanwezigheid van neutrofielen (40,1 ± 3,1 vs 60,1 ± 3,5, p <0,001, 19 patiënten).
Figuur 2. Autologe neutrofielen Bescherm Primary leukemiecellen tegen Ibrutinib. Bloed werd verzameld van patiënten met chronische lymfatische leukemie (CLL). Primaire leukemische cellen werden geïsoleerd en gekweekt alleen of samen met autologe neutrofielen (N) en primaire leukemische cellen: Nratio 1:10 gedurende 24 uur in aanwezigheid of afwezigheid van 25 uM ibrutinib. Het percentage levend primaire leukemische cellen (Bijlage IV V negatief / PI negatief) werd gemeten door dubbele kleuring met annexine V-FITC en PI, gevolgd door flowcytometrische analyse. (A) Forward-verstrooiing (FSC) en side-verstrooiing (SSC) plot vertegenwoordigt de poorten van neutrofielen en primaire leukemische cellen. (B) Bi-dimensionale dot-blot toont het percentage levend en apoptotische primaire leukemische cellen alleen gekweekt en behandeld met 25 uM ibrutinib. (C) Bi-dimensionale dot-blot toont het percentage levend en apoptotische primaire leukemische cellen co- gekweekt met neutrofielen en behandeld met 25 uM ibrutinib. (D) Box plot vertegenwoordigt het percentage levend primaire leukemische cellen van 19 patiënten. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. *** p <0,001 Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De korte halfwaardetijd van neutrofielen in vitro hun gebruik in 3D cultuur ineffectief. Differentiatie van HL60 cellen langs de granulocytaire route werd geïnduceerd door differentiatie induceren. Twee verschillende parameters (celoppervlak markers expressie en morfologische Changes) werden gebruikt om de differentiatie van HL60 meten. FSC vs SSC spreidingsdiagram in figuur 3A laten zien dat HL60 cellen zijn groter in omvang ten opzichte van HL60 diff cellen met hogere FSC. Labelen van de cellen (of HL60 HL60 diff) met anti-humaan CD 11 antilichaam geconjugeerd aan AF700 en anti-humaan CD38antibody geconjugeerd aan APC toont een toename van CD11b en CD38 expressie (Figuur 3B) na differentiatie die een indicatie van myeloïde differentiatie. Diff HL60 cellen vertonen ook morfologische veranderingen gedetecteerd door het verschijnen van multi-gelobde kernen (figuur 3C).
Figuur 3. structurele parameters van gedifferentieerde HL60 Cells. (A) Forward-verstrooiing (FSC) en side-verstrooiing (SSC) plots vertegenwoordigen HL60 en gedifferentieerde HL60 cellen (HL60 diff). (B) HL60 en HL60 diff cellen werden gemerkt met anti-CD 11 b-AF700 of anti-CD38-APC gevolgd door flowcytometrie analyse. Na gating op elke celpopulatie in de FSC-A vs. SSC-A scatterplot (A) werden de cellen geanalyseerd op de uitingen van CD11b en CD38. (C) HL60 cellen vertonen morfologische veranderingen overeen met differentiatie richting granulocyten. Foto's werden genomen door microscoop met 100X vergroting. Gewaagde zwarte pijl richt de multi-gelobde kern. Grafieken zijn representatief voor vijf onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om het effect van HL60 cellen op diff reguleren RL celrespons op vincristine in 3D-model te testen, werden cellen RL alleen of met HL60 diff basaalmembraan matrix in de aanwezigheid of afwezigheid van vincristine in 10 n gekweektM. Met behulp van de gating strategie weergegeven in figuur 4A, worden beide populaties gediscrimineerd op basis van CD19 en CD38 expressie; RL cellen positief voor CD19 en HL60 diff cellen positief voor CD38. Gating op RL cellen samen gekweekt met HL60 diff cellen in aanwezigheid van vincristine, resultaten tonen hoger percentage levende cellen (Figuur 4C, 35,9%) in vergelijking met RL cellen alleen gekweekt (Figuur 4B, 19,7%). De staafgrafiek in figuur 4D toont een significante toename van het percentage levende cellen RL (CD19 positieve Annexine V negatief / PI negatief) in de aanwezigheid van HL60 cellen diff (19,5 ± 0,2 vs 33,1 ± 1,0, p <0,001).
Figuur 4. neutrofielen-achtige HL60 diff cellen te beschermen RL lymfoomcellen tegen Vincristine in 3D cultuur. RL-cellen werden alleen of samen gekweekt met HL60 diff cellen bij RL: HL60 diff verhouding 01:10 gedurende 7 dagen in basaal membraan matrix. Op dag 5 werd vincristine (VCR) bij een concentratie van 10 nM toegevoegd. Sferoïden werden gescheiden op dag 7 en cellen werden gemerkt met anti-CD19-PECy7 en anti-CD38-APC vervolgens opnieuw gesuspendeerd met annexine V-FITC en PI gevolgd door flowcytometrische analyse. (A) Forward-verstrooiing (FSC) en side-scatter (SSC) plot vertegenwoordigt de poorten van RL cellen en HL60 diff cellen. (B) Bi-dimensionale dot-blot toont het percentage levend en apoptotische RL cellen alleen gekweekt en behandeld met 10 nM vincristine. (C) Bi-dimensionale dot vlek toont het percentage levend en apoptotische RL cellen co-gekweekt met HL60 diff en behandeld met 10 nM vincristine. (D) het staafdiagram geeft het percentage levend RL cellen. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven een effectieve, eenvoudige, snelle en goedkope protocol voor de isolatie van neutrofielen uit humaan bloed met hoge zuiverheid via dichtheidsgradiënt centrifugatie benadering en in dezelfde stap mononucleaire cellen worden ook afgescheiden en gewonnen. De geïsoleerde celpopulaties zijn ≥90% zuiver.
Verscheidene werkwijzen zijn beschikbaar voor neutrofielen isolatie uit humaan bloed. Deze omvatten dergelijke wijze met behulp van discontinue gradiënten 11,12 of via commerciële kits voor neutrofielen geïsoleerd door positieve immuno-magnetische selectie waarbij neutrofielen immuno-magnetische gelabeld met specifieke antilichamen zoals anti-humaan CD16 neutrofielen vervolgens verrijkt door binding van het CD16- positieve cellen op een magnetische kolom 13. Commerciële kits negatieve immuno-magnetische selectie zijn ook beschikbaar waarin de volbloed of granulocyt suspensie gemerkt met een cocktail van antilichamen die binden aan andere cellen than neutrofielen 9 (dwz antilichaam complexen die rode bloedcellen, bloedplaatjes en ongewenste cellen zoals CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, glycoforine A en dextran-beklede magnetische deeltjes label), daarna neutrofielen verrijkt met elutie als antilichaam negatieve fractie van cellen die niet bindt aan de magnetische kolom. Bovendien kan neutrofielen worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering 14.
Sommige technieken is aangetoond dat hoge opbrengsten aan zuiver neutrofielen, zoals positieve immuno-magnetische selectie verschaffen. Deze werkwijze heeft nadelen ten opzichte van dichtheidsgradiënt centrifugatie methoden door de merkmiddelen die binden aan het oppervlak van neutrofielen en dit zou mogelijk de functie te veranderen door het induceren de activering of differentiatie. Ook De positieve immuno-magnetische selectiemethode, de antilichaam gemerkte neutrofielen bindt op een magnetische kolom voor scheiding en kan ook de functie beïnvloeden.Fluorescence Activated Cell Sorting heeft een beperking voor zover deze methode langer duren voordat de cellen die een negatieve invloed kunnen neutrofiel overleving verzamelen vereist vanwege hun korte halfwaardetijd.
Dichtheidsgradiënt centrifugatie methode zeer vergelijkbaar en neutrofielen zuiverheid 90% overschrijden met beide procedures, maar de eerstgenoemde is een tweelaags gradiënt die technisch minder uitdagend opzichte lagen gradiënt oplossing bestaande uit 40%, 60% en 80% vol / vol in PBS. Het werd door Swamydas et al. 15 dat vermenging van de gradiënt oplossing interfaces vindt vaak plaats vanwege de kleine dichtheidsverschillen tussen de drie lagen. Wat de negatieve immuno-magnetische selectie benaderingen, zijn ze ook gerapporteerd effectief neutrofiel isolatie met hoge zuiverheid en levensvatbaarheid 9 zijn. Hun voordeel ten opzichte van een positieve immuno-magnetische selectie en fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting is dat neutrofielenniet voorzien van enige merkmiddelen, en niet binden aan magnetische kolom, waardoor celactivering te vermijden, maar deze methode is veel duurder en tijdrovender vergelijking met dichtheidsgradiënt methode.
Neutrofielen ondergaan gewoonlijk snelle spontane apoptose in vitro en in vivo 16,17. HL60promyelocyticcells behouden veel kenmerken van menselijk leukocyt voorlopers, zoals het vermogen om differentiatie te ondergaan in neutrofielen 18. Unlike neutrofielen, diff HL60 cellen niet snel apoptose ondergaan en gebruiken van deze cellen lost het probleem van het hebben van verschillende responsen van neutrofielen door de isolatie van verschillende donoren.
Onlangs 3D culturen rijper en relevant zijn voor menselijke en dierlijke fysiologie en een aantrekkelijk model voor verschillende biologisch onderzoek vooral op het gebied van kanker. Het patroon verschuiving van 2D naar 3D cultuur vordert snel since laatstgenoemde opvallender tijdens het bestuderen van verschillende pathologische aandoeningen zoals kanker 19. Er is een toenemend bewustzijn van de nadelen van 2D-cultuur waar de toevoeging van een derde dimensie aan de omgeving van een cel is belangrijk om een kijkje op het belang van cellulaire interacties 20 te nemen en om de verschillen in cellulaire gedrag en eigenschappen te bestuderen. 3D cultuur creëert een omgeving die vergelijkbaar omstandigheden in een levend organisme (bijv., Mens) leidt tot meer relevant onderzoek. Echter, 3D-cultuur heeft betrekking op de complexe interactie tussen de verschillende partners, zoals cellen, extracellulaire matrices en interstitiële vloeistoffen die niet aanwezig in 2D cultuur te doen. Zo zal de inspanningen om de methode kalibratie vast te stellen en te rekenen op een goede laboratorium- praktijken en effectief levert vooral de commerciële merken die uitgebreid zijn getest en gecontroleerd worden verlangd.
De tumor microbestaat uit meerdere celtypes, waaronder veel immuuncelpopulaties die deelnemen en reguleren tumorigenese, metastase en reactie antikankermiddelen 21,22. Verschillende studies hebben aangetoond dat een toename van neutrofielen infiltratie in tumoren significant gecorreleerd met verworven resistentie tegen verscheidene antikanker middelen zoals anti-VEGF therapie 23,24. Verder verhoging in de voorbehandeling neutrofielen bij patiënten met metastatische niercelcarcinomen 25, evenals de aanwezigheid van een hoog intratumorale neutrofielen bij patiënten met diverse solide tumoren, zijn 26 voorgesteld als prognostische factoren voor overleving slecht. Onze studie suggereert dat neutrofielen een rol spelen bij het beschermen lymfoom B-cellen uit antikanker-middel geïnduceerde apoptose.
Samenvattend kan het betrouwbaar en reproduceerbaar hier beschreven methode worden toegepast door een laboratorium neutrofielen en mononucleaire cellen uit hum verzameleneen bloed. Bovendien is de differentiatie van HL60-cellen langs de route granulocytische aangebracht om bepaalde neurofiele problemen te voorkomen zoals de snelle spontane apoptose. Deze benaderingen zijn gebruikt om de rol van neutrofielen op gevoeligheid van lymfoomcellen anti-lymfoom subjecten te bestuderen wanneer neutrofielen tonen een beschermend effect op lymfoomcellen tegen deze agentia middels 2D en 3D kweeksystemen. Deze benaderingen kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van neutrofielen functionele studies die ons begrip van neutrofielen rol bij kanker biologie moeten verdiepen. In het bijzonder kan deze werkwijze worden gebruikt om beter de overspraak tussen neutrofielen en tumorcellen of tussen neutrofielen en andere componenten van de micro-omgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D.
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
