Summary
لائحة ضبط من النسخ الجيني راء الجنينية قرار مصير الخلية. هنا، نحن تصف فحوصات مناعي لونين تستخدم لتحقيق التنظيم جينية من كل من التمايز القلب من الخلايا الجذعية والتنمية القلب من أجنة الفئران.
Abstract
نسخ جين معين هو عملية بيولوجية الرئيسية التي تكمن وراء خلية قرار مصير أثناء التطور الجنيني. وتوسط في عملية بيولوجية من عوامل النسخ التي تربط المناطق التنظيمية الجينومية بما في ذلك القدرة والمروجين من الجينات المكونة القلب. يتم تغليف الحمض النووي حول الهستونات التي تخضع لتعديلات الكيميائية. يؤدي إدخال تعديلات على الهستونات أيضا على المكبوت، المنشط أو متوازنا النسخ الجيني، وبذلك مستوى آخر من تنظيم ضبط من النسخ الجيني. والخلايا الجذعية الجنينية (الخلايا ES) ألخص داخل هيئات مضغي (أي، وحدات الخلية) أو في الثقافة 2D الخطوات الأولى للتنمية في القلب. أنها توفر من حيث المبدأ ما يكفي من المواد لمناعي لونين (رقاقة)، وهي تقنية تستخدم على نطاق واسع لتحديد المناطق التنظيمية الجين. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا ES الإنسان تمثل نموذجا الخلية البشرية من تخلق القلب. في مراحل لاحقة من التطور، والماوس الأنسجة الجنينية تسمح لالتحقيق المناظر الطبيعية جينية معينة مطلوبة لتحديد هوية الخلية. هنا، نحن تصف بروتوكولات رقاقة، رقاقة متتابعة تليها PCR أو رقاقة التسلسل باستخدام خلايا ES والهيئات مضغي والمناطق الجنينية محددة القلب. تسمح هذه البروتوكولات في التحقيق في تنظيم جينية من النسخ الجيني القلب.
Introduction
والقلب هو الجهاز الأول إلى أن تتشكل وتصبح وظيفية في الجنين. هو مبني على القلب من العديد من الأنساب الخلايا التي تنشأ عن الأولى والثانية الحقول القلب الجنينية 1. من الكيسة بعد الإخصاب المرحلة حتى على شكل قلب، والخلايا الجنينية وبالتالي إلى جعل العديد من القرارات مصير الخلية. وينظم الجينات النسخ بطريقة زمنية والتي تعتمد على الفضاء وهو عملية بيولوجية الرئيسية التي تكمن وراء خلية قرار مصير أثناء التطور الجنيني. وتتوسط هذه العملية من قبل عوامل النسخ المحددة التي تربط المناطق التنظيمية داخل الجينوم بما في ذلك القدرة والمروجين من الجينات المكونة القلب. يتم تغليف الحمض النووي حول الهستونات التي تخضع لتعديلات مثل أستلة، مثيلة، ubiquitinylation، و / أو الفسفرة. هيستون التعديل يؤدي إلى المكبوت، المنشط أو متوازنا النسخ الجيني يتوقف عليها يسين بقايا هيستون يتم تعديل 2.
تم تعيين jove_content "> لونين مناعي فحص (رقاقة) حتى قبل 3 سنوات ويعمل حاليا في التكنولوجيا الأكثر استخداما على نطاق واسع من أجل تحديد أهداف إما الهستونات تعديل أو عوامل النسخ (4). وبعد مناعي من الهستونات أو عوامل النسخ، يمكن أن الحمض النووي ملزمة أن يكون إما تضخيمها من قبل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) أو التسلسل. قد تغلب على رقاقة من الناحية الفنية أكثر تحديا المقايسات جل تخلف 5. ومع ذلك الشذرة لا تعني المباشر ملزمة للعامل النسخ على الحمض النووي، والاستفادة من فحص هلام التخلف. من ناحية أخرى، رقاقة جنبا إلى جنب لتسلسل الحمض النووي قد فتح منظور جديد على نطاق الجينوم في تنظيم الجينات.خلايا ES (خلايا ES) ألخص داخل هيئات مضغي (أي.، وحدات الخلية) أو في الثقافة 2D الخطوات الأولى من التنمية القلب (6) وتقدم من حيث المبدأ ما يكفي من المواد لرقاقة. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا ES الإنسان تمثل نموذجا الخلية البشرية من كاليفورنياrdiogenesis على الرغم من إمكاناتها قلبية يعتمد على توقيع جينية من 7. في مراحل لاحقة من التطور، والماوس الأنسجة الجنينية تسمح للتحقيق في المناظر الطبيعية جينية معينة مطلوبة لتحديد هوية الخلية. ومع ذلك، يتم نسخها الجينوم في وقت واحد، وخلية نوع محدد بطريقة 8. تنظيم جينية من النسخ الجيني لابد من دراستها داخل المناطق المحلية. هنا، نحن تصف بروتوكولات رقاقة، رقاقة متتابعة تليها PCR أو التسلسل باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية، والهيئات مضغي والمناطق الجنينية محددة القلب. تسمح هذه البروتوكولات في التحقيق في تنظيم جينية من النسخ الجيني القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الحمض النووي والبروتينات عبر ربط
- إصلاح في 15 مل أنابيب تحصد-ES الخلايا (2 × 10 6 خلايا لرقاقة منتظم، 2 × 10 5 خلايا للرقاقة)، والهيئات مضغي (EBS) التي تم إنشاؤها من خلايا ES وأنسجة القلب الجنينية تشريح من أجنة E9.5 الماوس (الأذينية البطينية القناة، تدفق المسالك والبطين) باستخدام 1٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني للخلايا أو في المخزن PB2 permeabilization عن الأنسجة الجنينية. وضع أنابيب على شاكر المداري بسرعة 60 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة بالضبط.
- وقف ردود الفعل عبر ربط بإضافة الجلايسين إلى التركيز النهائي من 125 ملم واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري بسرعة 60 دورة في الدقيقة.
2. تحلل الخلايا والكروماتين تجزئة
- غسل مرتين الخلايا عبر ربط معلق في 10 مل PBS 1X أو الأنسجة الجنينية معلق في 1 مل PB2. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل supernatants. </ لى>
- إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني للتخفيف PB1 أو PB2 (2 ميكروغرام / مل Leupeptin، 1 ميكروغرام / مل أبروتينين، و 0.1 ملي PMSF) (الجدول 1). Resuspend بيليه في الخلايا او الانسجة الجنينية من الخطوة 2.1 في 1 مل من الاحتياطي PB1 أو PB2 على التوالي. الماصة صعودا وهبوطا وresuspend الخلايا أو الأنسجة. استخدام حقنة 1 مل مع إبرة 21 مقياس لتجانس الخلايا أو الأنسجة. احتضان عند 4 درجات مئوية (على عجلة) لمدة 10 دقيقة.
- تدور باستمرار في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
- Resuspend وبيليه في 300 ميكرولتر من مخازن SB منها (الجدول 1) تستكمل مع مثبطات الأنزيم البروتيني في أنبوب نظيفة (شهادة RNase-، DNase-، وخالية من مولد الحمى) لمنع أي تدهور الحمض النووي. احتضان لمدة 15 إلى 30 دقيقة على الجليد.
- يصوتن العينات عند 4 درجات مئوية ليجز لونين باستخدام sonicator وفقا لبرامج المدرجة في الجدول 2 لكل مادة. ضبط مدة صوتنة تبعا للتطبيق المقبل (<م> أي PCR أو التسلسل). وينبغي أن تكون المنفصمة حجم الحمض النووي حوالي 500 شركة بريتيش بتروليوم لPCR و 300 نقطة أساس في التسلسل.
- sonicated الطرد المركزي المحللة خلية لمدة 10 دقيقة في 6000 x ج في 4 درجات مئوية، ونقل طاف (لونين) في أنبوب 1.5 مل نظيف وتجاهل بيليه.
- تمييع لونين في حل (طاف B العازلة) لمدة 10 مرات بالماء وتقييم الكثافة البصرية باستخدام 1.5 ميكرولتر في النانو معمل. الحصول على تركيز البروتينات في ميكروغرام / ميكرولتر باستخدام الصيغة التالية: 1.55 س OD 280-0،76 س OD 260.
| عازلة | استخدام | تركيب | المواد | |||
| ا | Permeabilization | PB1: 5 ملم أنابيب درجة الحموضة 8؛ 85 مM بوكل. 0.5٪ NP40 | جميع | |||
| PB2: 15 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.6، 15 ملي كلوريد الصوديوم، 4 مم MgCl2 60 ملي بوكل، 0.5٪ تريتون X-100 | الأنسجة الجنينية | |||||
| ب | تحلل / صوتنة | SB1: 1٪ SDS، 10 ملي EDTA. 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 | زر ESC فى الكيبورد | |||
| SB2: 50 ملي HEPES-كوه pH7.9. 140 مم. 1MM EDTA. 0.1٪ deoxycholate. 0.1٪ SDS | EBS | |||||
| SB3: 15 ملي HEPES pH7.6، 15 مم كلوريد الصوديوم. 60 ملي بوكل، 1MM EDTA، 0.5 ملي EGTA. 1٪ تريتون-X100، 0 0.1٪ SDS، 0.5٪ laurylsarcosine | الأنسجة الجنينية | |||||
| C | العازلة الشذرة | 150 ملي مول كلوريد الصوديوم. 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة. 5 ملي EDTA. 0.5٪ NP40. 1٪ تريتون-X100. | جميع | |||
| د | DNA / البروتين شطف | D1: 1٪ SDS، 100مم NaHCO 3 D2: 50 ملي تريس درجة الحموضة 7.6 / 5 ملي EDTA، 15 ملي DTT و 2٪ SDS | ||||
| ه | الحمض النووي إعداد حبات ملزمة | E: 20٪ PEG 8000. 2.5 M كلوريد الصوديوم. 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8؛ 1MM EDTA | ||||
الجدول 1. مخازن رقاقة.
| مادة | برنامج صوتنة |
| الخلايا الجذعية الجنينية | 15 دورات من 30 ثانية ON و OFF 30 ثانية |
| الهيئات مضغي | 30 دورات من 30 ثانية ON و OFF 30 ثانية |
| الأنسجة الجنينية | 21 دورات من 30 ثانية ON و OFF 30 ثانية |
الجدول 2. برامج صوتنة.
3. مناعي ويغسل
- يغسل-A مترافق حبات 3 مرات البروتين مع العازلة مئوية. أخذ 100 ميكرولتر من الخرز في أنبوب 1.5 مل نظيف وإضافة 1 مل من العازلة ج (الجدول رقم 1). ثم يتم نقل أنبوب على المغناطيس. الانتظار لمدة 1 دقيقة، ونضح طاف. كرر مرتين في خطوة الغسيل.
- احتضان الأجسام المضادة التي أثيرت ضد الهستونات تعديل أو عامل النسخ (تركيزات المدرجة في الجدول رقم 3) مع 20 ميكرولتر من البروتين غسلها والخرز مترافق و 1 مل من العازلة C تستكمل مع مثبطات الأنزيم البروتيني في أنبوب 1.5 مل نظيف. ضبط العينات على محور دوار في 40 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة على الأقل في 4 درجات مئوية.
- غسل الأجسام المضادة الخرز المجمعات 3 مرات مع 1 مل من العازلة C (التلاعب وصفها في 3.1).
- إعداد 2 الأنابيب، واحدة تحتوي على 150 ميكروغرام من المجمعات لونين والخرز الأجسام المضادة والأنبوب الآخر تحتوي على 150 ميكروغرام من لونين و 20 ميكرولتر من الخرز غسلها. إضافة 1 مل من العازلة C تستكمل مع مثبطات الأنزيم البروتيني إلى كل أنبوبواحتضان العينات على عجلة دوارة في 40 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يجب أن يكون تركيز لونين 300 ميكروغرام على الأقل لimmunoprecipitate عامل النسخ أو رقاقة متسلسل.
| معيار | تركيز (نانوغرام / ميكرولتر) | الحجم (ميكرولتر) | مجموع تركيز الحمض النووي (نغ) |
| ا | 10.0 | 1 | 10.0 |
| ب | 5.00 | 1 | 5.00 |
| C | 2.50 | 1 | 2.50 |
| د | 1.25 | 1 | 1.25 |
| ه | 0.625 | 1 | 0.625 |
| F | 0.3125 | 1 | 00.3125 |
| G | 0.156 | 1 | 0.156 |
| H | 0.0 | 1 | 0.0 |
الجدول تركيزات 3. المعايير.
4. DNA شطف، الارتباط عبر عكس وبروتين كاف الهضم
- تعيين العينات في الرف المغناطيسي. استرداد طاف تحتوي على لونين غير منضم الأجسام المضادة.
ملاحظة: عينات يمكن تجميد بسرعة في النيتروجين السائل في هذه الخطوة وتخزينها في -80 درجة مئوية. لونين يمكن استخدامها في فحوصات مناعي أخرى مع الضد الآخر. يغسل كل عينة 3 مرات مع 1 مل من العازلة C (التلاعب وصفها من قبل). - أزل البروتين محددة الأجسام المضادة من خلال إضافة 150 ميكرولتر من العازلة D1 أو D2 إذا الشذرة المتسلسل الذي ينبغي القيام به (الجدول 1) إلى مواد الشذرة غسلها واحتضان العينات لمدة 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية في كتلة التدفئة.
- إزالة الأنابيب من كتلة التدفئة ووضع العينات في الرف المغناطيسي، واسترداد طاف في أنبوب 1.5 مل نظيف (شهادة RNase-، DNase-، وخالية من مولد الحمى) والتخلص من الخرز.
- استخدام طاف لرقاقة متتابعة مضيفا 1-3 ميكروغرام من الأجسام المضادة الثاني في 2 مجلدات من العازلة C أو عكس تشعبي بإضافة 5 M كلوريد الصوديوم للحصول على التركيز النهائي من 200 ملم.
- إعداد إدخال عينة من لونين في أنبوب 1.5 مل نظيف (شهادة RNase-، DNase-، وخالية من مولد الحمى)، مع نفس الكمية من لونين كما ان من عينة IP (150 ميكروغرام) في الحجم النهائي من 150 ميكرولتر من المياه (ريبونوكلياز الدناز المياه مجانا). إضافة كلوريد الصوديوم 5M إلى التركيز النهائي من 200 ملم. احتضان عينات بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية.
- وفي اليوم التالي، وإزالة عينات من كتلة التدفئة، إضافة 250 ملي EDTA للحصول على التركيز النهائي من 12.5 ملم وبروتين كاف للحصول على التركيز النهائي من 250 ميكروغرام / مل في المواد الشذرة وهضم عند 55 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في كتلة التدفئة.
SS = "jove_title"> 5. عزل الحمض النووي عن طريق الخرز ملزم الحمض النووي
- إعداد حبات
- بدء تقديم حبات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل، دوامة حبات دقيق جدا. حبات يستقر، لذلك تعمل بسرعة عندما pipetting ل. نقل 1 مل من الخرز في أنبوب 1.5 مل نظيف (شهادة RNase-، DNase-، وخالية من مولد الحمى).
- تعيين على المغناطيس، انتظر 2-3 دقيقة لإيجاد حل لتوضيح، طاف تجاهل. إزالة من المغناطيس، إضافة 1 مل من 0.5 M EDTA ومزيج من قبل vortexing وجيزة.
- كرر الخطوة 5.1.2 مرتين، وتجاهل طاف في نهاية المطاف.
- إزالة من المغناطيس، إضافة 1 مل من العازلة E و resuspend ببطء الخرز. نقل المزيج كله (الخرز في المخزن E) في 50 مل من العازلة E. مكان على شاكر، والسماح لها مزيج ببطء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- حبات اختبار الحمض النووي ملزم بعد بروتوكول تنقية هو موضح أدناه باستخدام 3 ظروف تجريبية: 50 ميكرولتر من الخرز / 50 ميكرولتر من الحمض النووي (1 حجم / حجم 1)، و 100 ميكرولتر من الخرز/ 50 ميكرولتر من الحمض النووي (2 مجلدات / حجم 1) و 125 ميكرولتر من الخرز / 50 ميكرولتر من الحمض النووي (2.5 أحجام / 1 الحجم). السماح الهجرة الحمض النووي المنقى على هلام الاغاروز 1.5٪ للتحقق من حجم الشظايا (الشكل 1A).
- الحمض النووي تنقية
- إضافة 425 ميكرولتر (2.5 مجلدات) من الحمض النووي ملزمة حبات مغناطيسية لكل عينة الحمض النووي (حوالي 170 ميكرولتر). و resuspend ببطء عن طريق pipetting صعودا وهبوطا (حوالي 10 مرات)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- وضع على المغناطيس لمدة 5 دقائق، ثم نضح طاف وتجاهل (على المغناطيس).
- إضافة 600 ميكرولتر من تقدم طازجة 80٪ من الإيثانول لأنبوب على المغناطيس، الانتظار لمدة 1 دقيقة، طاف نضح وتجاهل ثم كرر الخطوة السابقة مرة أخرى.
- إعطاء دوران سريع، لمدة 5 ثانية (microfuge)، ووضع أنبوب على المغناطيس وإزالة آخر قطرات من الإيثانول. اسمحوا الجافة لمدة 1 دقيقة في RT
- أزل الحمض النووي عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من الدناز ريبونوكلياز المياه مجانا. إزالة من المغناطيس ودوامة العينة.
- احتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم وضع العينات على المغناطيس. نضح مزال الحمض النووي في أنبوب جديد (شهادة RNase-، DNase-، وخالية من مولد الحمى).
- تشغيل الحمض النووي من جزء المدخلات على هلام الاغاروز 1.5٪ للتحقق من حجم شظايا الحمض النووي (الشكل 1B).
6. الحمض النووي الكمي باستخدام كشف الإسفار صك
- تمييع متسلسل في الماء 1 ميكروغرام الحمض النووي (1 كيلوبايت سلم) لإعطاء ما مجموعه 7 التخفيفات بالإضافة إلى نقطة عدم الحمض النووي (التخفيفات التي تم جمعها في الجدول 3).
- يعد حل PCR الخضراء أنا صبغ، وتكون كافية لجميع العينات (تنقية الحمض النووي والتخفيفات القياسية ه): تمييع 10،000x الصبغة الخضراء في المخزن 1X TE.
- إضافة 1 ميكرولتر من كل عينة من الحمض النووي (DNA تنقية والتخفيفات القياسية ه) إلى 10 مزيج الصبغة الخضراء 1X ميكرولتر في الشعيرات الدموية cuvettes أن تقرأ في مقياس التألق في 488 نانومتر الطول الموجي. لفحص أي الحمض النووي، استخدم 1 ميكرولتر من العازلة 1X TE.
- بناءمنحنى المعايرة باستخدام برامج الرسم وتحديد التركيزات النسبية لمجموعة من عينات من الحمض النووي في نانوغرام / ميكرولتر. الحمض النووي ومن ثم على استعداد لPCR أو لجعل مكتبات التسلسل.
7. PCR
- اختيار الاشعال
- الاشعال تصميم الفائدة باستجواب المناطق الجينومية من الفائدة. الاشعال تصميم لتضخيم المناطق محسن الجينات باستخدام متصفح الجينوم UCSC. وكذلك توقع القدرة على استخدام H3K4me1 أو P300 رقاقة وما يليها 9 البيانات المتاحة في مجموعة بيانات توقعات البيئة العالمية.
- PCR
- ردود الفعل تشغيل PCR لمدة 45 دورات (8 ثانية 95 درجة مئوية، 8 ثانية 60 درجة مئوية، 8 ثانية 72 درجة مئوية) باستخدام PCR الوقت الحقيقي thermocycler في 25 ميكرولتر مزيج الصبغة الخضراء، DNA 2 نانوغرام، ومزيج التمهيدي 0.5 ميكرولتر (20 حل سهم ميكرومتر) 10.
- تحليل تخصيب
- حساب تخصيب المطلق على افتراض أن أكثر من 1٪ من جسيم نووي تم immunoprecipitated 11.
- Consideص والجينومية كما المخصب إذا أظهرت 10 عينات IP نانوغرام إثراء أكبر بالمقارنة مع 0.1 نانوغرام من الحمض النووي الإدخال.
- التعبير عن النتائج حيث أن الزيادة أضعاف في تخصيب اليورانيوم على منطقة غير المخصب بعد تطبيع للمدخلات والتكيف مع عينة السيطرة غير محددة.
- النظر في الحمض النووي المدخلات إلى أن تضعف من 100 (عامل التخفيف أو DF).
- تطبيع الإدخال باستخدام المعادلة التالية 2 -ΔCt × 100٪، حيث -ΔCt = ط [IP] - ط م [الإدخال س DF].
- ضبط التحكم باستخدام المعادلة التالية (ΔCt [IP] -ΔCt [NS]) حيث NS هو عينة غير محددة (أي الأجسام المضادة IP، أو مفتش IP).
- حساب تخصيب أضعاف من العينة إلى 2 -ΔΔCt. ملف بما في ذلك جميع الخطوات الحسابات مع الصيغ التي فقط كل عينة PCR يمكن إدخالها سيسهل تحليل النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويوضح الشكل 1A أولا إعداد حبات ملزم الحمض النووي ومراقبة الجودة باستخدام الحمض النووي من مختلف الأحجام (1 كيلوبايت سلم). 0ne، وأضيف 2 و 2.5 مجلدات (1-3) من الخرز إلى حجم واحد من عينة لتنقية شظايا الحمض النووي ارتفاع وانخفاض حجم الجزيئي.
الأرقام 1 B، C، D أمثلة نموذجية من المواد الهلامية الحمض النووي من الحمض النووي sonicated كله المستخرجة من الماوس خلايا ES والهيئات مضغي أو منطقة الجنينية القلب (المجمعة 25 E9.5 البطينين)، على التوالي.
عندما تفرق خلايا ES نحو مصير خلايا القلب، وعبور لأول مرة من خلال mesendodermal ثم دولة أرومية متوسطة. وتشمل هذه رحلة التنموية خطوة التي الخلايا الظهارية يجب أن تخضع لعملية انتقال-epithelio الوسيطة
الشكل 2
الجينات التمايز ميزة المجالات الثنائي التكافؤ في خلايا ES 12. ويشغل بها 5 "مناطق UTR قريبة من المروجين لها في الواقع من قبل كل من H3K4me3 لونين تفعيل علامة وH3K27me3، علامة المكبوتة. يتم تعديل هذه العلامات عندما تحدى الخلايا عن طريق morphogens مثل BMP2 7. هذه العلامات هي إلا متغير تبعا للبشرية ES خط خلاياق الأرجح بسبب الكيسة الأصلية التي تستمدها من حتى عندما غير متمايزة (الشكل 3).
البروتوكولات المذكورة أعلاه هي مناسبة لتسلسل رقاقة حتى بدءا من كمية قليلة من المواد. أجريت تجارب رقاقة من لونين المستخرجة من AVC، أفت والبطينين الأجنة E9.5 الماوس من أجل الكشف عن جينات جديدة والقدرة على لعب دور في تحديد هوية هذه المناطق القلب محددة. ويبين الشكل 4 2 المناطق الجينومية من الجينات عضلة القلب في البطين E9.5 الماوس المخصب من قبل H3K27 الأسيتيل واحد منظم ضربات القلب محددة (على سبيل المثال، لا البطين) الجين لا أثراها H3K27 الأسيتيل.
الشكل 1. الكهربائي البيانات: الخرز الحمض النووي ملزم تدقيق وصوتنة فالidation. (A) الحمض النووي تنقيته من الخرز ملزم الحمض النووي (1) حجم الخرز / 1 حجم الحمض النووي (1) و 2 مجلدات من الخرز / 1 حجم الحمض النووي (2) وحجم 2.5 من الخرز / 1 حجم الحمض النووي (3). حجم شظايا الحمض النووي التي تم الحصول عليها بعد تشعبي عكس الكسور مدخلات الماوس ES خلايا (ب)، والهيئات مضغي (C)، والأنسجة القلبية الجنينية (D). تم تشغيل عينات على 2٪ والمواد الهلامية الكهربائي الاغاروز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. رقاقة تحليل البيانات. (A) إثراء H3K27ac علامة جينية على البريد كادهيرين القدرة / المروج (أ - المناطق E) (ب) إثراء H3K4me1، H3K36me3 وH3K9me2 epige.علامات المغنطيسية على تطور القدرة / المروج (المناطق AC). وتتضخم مناطق الجينوم التي كتبها QPCR لقياس تخصيب هيستون مقابل المدخلات التالية رقاقة. النتائج هي وسائل ± SEM من 3 تجارب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم استخراج الرقم 3. متسلسل الشذرة. ونين من 4 خطوط الخلايا ES الإنسان وتم تنفيذ الشذرة بالتتابع استخدام الألغام المضادة H3K4me3 ثم أضداد H3K27me3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أصبح علم التخلق مجال هام للبحث في علم الأحياء التطوري. كيف يتم تنشيط البرنامج الجيني في الخلايا الجنينية للسماح للخلايا لاكتساب هوية محددة ضمن النسب الجنينية ظلت لفترة طويلة على السؤال الرئيسي لعلماء البيولوجيا التطورية.
وقد استخدم على نطاق واسع الشذرة خلال السنوات الماضية، والجمع بين لتسلسل الحمض النووي بعد التحسن في قرار التسلسل. وقد أصبح هذا الأسلوب قوية من أجل التحقيق في الجينوم بطريقة تعتمد اسعة المشهد جينية من خلايا أو الأنسجة الجنينية والكبار محددة. مخازن رقاقة فحص والشروط صوتنة قد تحسنت بشكل كبير للسماح للفحوصات لكمية صغيرة من المواد البيولوجية. وهذا يشمل مناطق معينة من قلوب الجنينية التي حصل عليها تسليخ مجهري أو عن طريق خلايا فرز FACS، معربا عن بروتين مراسل الفلورسنت. في الواقع يقوم الشذرة على السكان الخلية غير متجانسة 13 14 علبةيؤدي إلى نتائج مضللة التي يصعب تفسيرها. علامات جينية توقيع خلية السكان بشكل دقيق جدا. هذا التوقيع يمنح لهم إمكانية محددة للتمايز ويحدد مصيرهم. بالتالي فمن المهم العمل مع تنقيته السكان (مرتبة) الخلية أو الخلايا الجنينية تشريح.
وصفناها أعلاه بروتوكولات قوية من أجل تحقيق هذه الأهداف. وقد استخدمنا هذه البروتوكولات لالشذرة-PCR، الشذرة على رقاقة 7، 10 أو رقاقة التسلسل (الشكل 4، مخطوطة في الإعداد). والسبب في متانة يضع على مخازن permeabilization وتحلل الخلايا التي تم الأمثل لضمان وجود خلية كاملة وتحلل النووي وكفاءة صوتنة لونين. ومن ثم لا يمكن البروتوكولات يتم استخدامها لكمية صغيرة من الأنسجة الجنينية.
القيود المفروضة على هذه البروتوكولات هي ملازمة لرقاقة. وبشكل أكثر تحديدا، فإن القرار المكانية ليست عالية جدا مع أحجام الحمض النووي حوالي 500 سنة مضت. كيفمن أي وقت مضى، لأنها تتيح لنا تحقيق في ديناميات المجالات الثنائي التكافؤ في تمييز الخلايا ES 7 والكشف عن الفروق في إثراء الهستونات تعديل على المناطق التنظيمية EMT الجيني في النوع البري أو الخلايا تحور الجين. (الشكل 2). تسلسل عميق من الحمض النووي immunoprecipitated (الشكل 4) يتغلب جزئيا هذا القيد.
لا يشير إثراء منطقة الجينومية مناعي محدد التالية من عامل النسخ بالتأكيد أن العامل يرتبط مباشرة الحمض النووي. يمكن أن يكون سوى جزء من مصنع معقد بد أن الحمض النووي. هذه نقطة مهمة أن تكون على علم بها. في المقابل، هلام التخلف الفحص يمكن استخدامها لمعالجة هذه المسألة.
وجود التكنولوجيا في أيدي جنبا إلى جنب مع تسلسل عميق يسمح لمراقبة واسعة الجينوم المناطق الجينومية من قبل عوامل النسخ أو علامة هيستون محددة المحتلة. التكنولوجيا آخذة في التحسن، ويسمح لاستجواب المتوسط المتحرك فقطالسكان الخلية ليرة لبنانية (15). وبالتالي فإنه يفتح آفاقا جديدة في ديناميات المناظر الطبيعية جينية محددة أثناء التطور الجنيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1x | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
- Collas, P.
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K.
- Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
- Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
- Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
- Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
- Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
- Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
- Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
- Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).
