Summary
Eine Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zugrunde liegt, embryonale Zellschicksal Entscheidung. Hier beschreiben wir Immunpräzipitationstests Chromatin verwendet epigenetischen Regulation sowohl der Herz Differenzierung von Stammzellen und kardialen Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen.
Abstract
Spezifische Gen-Transkription ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Der biologische Prozess wird durch Transkriptionsfaktoren vermittelt, die genomischen regulatorischen Regionen einschließlich Enhancern und Promotoren von Herz konstitutiven Genen binden. DNA ist um Histone gewickelt, die zu chemischen Modifikationen unterzogen werden. Modifikationen von Histonen führen weiter zu verdrängten, aktiviert oder balanciert Gen-Transkription, also eine andere Ebene der Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zu bringen. Embryonale Stammzellen (ES - Zellen) rekapitulieren innerhalb Embryoidkörpern (dh Zellaggregate) oder in der 2D - Kultur der frühen Schritte der Herzentwicklung. Sie bieten im Prinzip genügend Material für Chromatinimmunpräzipitation (CHIP), eine Technologie, im Großen und Ganzen verwendet Gen regulatorischen Regionen zu identifizieren. Darüber hinaus repräsentieren humane ES-Zellen, die eine humane Zellmodell Kardiogenese. In späteren Stadien der Entwicklung, ermöglichen embryonalen Mausgeweben fürUntersuchung spezifische epigenetische Landschaften zur Bestimmung der Zellidentität erforderlich. Hier beschreiben wir Protokolle von CHIP, sequentielle ChIP gefolgt von PCR oder Chip-Sequenzierung unter Verwendung von ES-Zellen, Embryoidkörpern und kardialspezifisch embryonale Regionen. Diese Protokolle ermöglichen die epigenetische Regulation der Herz Gen-Transkription zu untersuchen.
Introduction
Das Herz ist das erste Organ gebildet wird und in dem Embryo funktionalen zu werden. Das Herz wird aus vielen Zelllinien aufgebaut , die von den ersten und zweiten embryonalen Herzfelder 1 entstehen. Von der nach der Befruchtung Blastozyste zu dem geformten Herz bis zu inszenieren, haben embryonale Zellen so viele Zellschicksal Entscheidungen zu treffen. Gen-Transkription wird in einem zeit- und ortsabhängig geregelt und ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Ein derartiges Verfahren ist durch spezifische Transkriptionsfaktoren vermittelt, die innerhalb des Genoms einschließlich Enhancern und Promotoren von Herz konstitutiven Genen Regulationsregionen binden. DNA ist um Histone gewickelt, die Modifikationen wie Acetylierung unterworfen sind, Methylierung, Ubiquitinierung und / oder Phosphorylierung. Histonmodifikation führt zu verdrängten, aktiviert oder balanciert Gen - Transkription in Abhängigkeit von dem Lysin - Rest von Histon 2 modifiziert.
jove_content "> Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde Jahre angelegt 3 vor und ist derzeit das am weitesten verbreitete Technologie, um Ziele von entweder modifizierten Histone oder Transkriptionsfaktoren zu identifizieren , 4. Nach Immunpräzipitation von Histonen oder Transkriptionsfaktoren können gebundene DNA sein entweder amplifiziert durch Polymerasekettenreaktion (PCR) oder sequenziert. ChIP ist technisch herausfordernder Gelretardationsassays 5 überwinden. jedoch ChIP keine direkte bedeutet die Bindung eines Transkriptionsfaktors an DNA, ein Vorteil Gelretardation Assays. auf der anderen Seite, ChIP kombiniert, um die DNA-Sequenzierung hat eine neue genomweite Perspektive auf die Genregulation geöffnet.ES - Zellen (ES - Zellen) rekapitulieren innerhalb Embryoidkörpern (dh., Zellaggregate) oder in der 2D - Kultur die frühen Schritte der Herzentwicklung 6 und bieten im Prinzip genügend Material für ChIP. Darüber hinaus repräsentieren humane ES-Zellen, die eine menschliche Zellmodell von cardiogenesis obwohl ihr kardiogenen Potential hängt von ihrer epigenetischen Signatur 7. In späteren Stadien der Entwicklung, ermöglichen embryonale Mausgeweben für spezifische epigenetische Landschaften zur Bestimmung der Zellidentität erforderlich zu untersuchen. Jedoch wird das Genom in einer zeit- und zelltypspezifisch 8 transkribiert. Epigenetische Regulation der Gen-Transkription hat in lokalisierten Regionen untersucht werden. Hier beschreiben wir Protokolle von CHIP, gefolgt sequentielle ChIP durch PCR oder Sequenzierung unter Verwendung von ES-Zellen, Embryoidkörpern und kardialspezifisch embryonale Regionen. Diese Protokolle ermöglichen die epigenetische Regulation der Herz Gen-Transkription zu untersuchen.
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Protocol
1. DNA-Protein-Quervernetzung
- Fix in 15 - ml - Röhrchen geerntet-ES - Zellen (2 × 10 6 Zellen für regelmäßige ChIP, 2 x 10 5 Zellen für Mikrochip), Embryoidkörpern (EVG) erzeugt aus ES - Zellen und embryonalen Herzgewebe seziert von E9.5 Mausembryonen (atrioventricular Kanal, Ausflusstraktes und Ventrikel) mit 1% Formaldehyd in PBS für Zellen oder in Permeabilisierung PB2 Puffer für embryonalem Gewebe. Die Röhrchen auf Orbitalschüttler bei einer Geschwindigkeit von 60 rpm bei Raumtemperatur für genau 10 min.
- Beenden Sie die Vernetzungsreaktion durch Glycin bis zu einer Endkonzentration von 125 mM Zugabe und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur auf dem Orbitalschüttler bei einer Geschwindigkeit von 60 Umdrehungen pro Minute.
2. Zellyse und Chromatin Fragmentation
- Zweimal waschen vernetzte resuspendierten Zellen in 10 ml PBS 1x oder embryonale in 1 ml PB2 resuspendiert Gewebe. Zentrifuge bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Die Überstände verwerfen. </ Li>
- Hinzufügen , Proteaseinhibitoren PB1 oder PB2 zu puffern (2 ug / ml Leupeptin, 1 & mgr; g / ml Aprotinin und 0,1 mM PMSF) (Tabelle 1). Zellpellet oder embryonalem Gewebe aus Schritt 2.1 in 1 ml Puffer PB1 bzw. PB2. Pipettieren auf und ab und die Zellen oder Gewebe resuspendieren. Verwenden, um eine 1 ml Spritze mit einer 21-Gauge-Nadel Zellen oder Gewebe zu homogenisieren. Inkubieren bei 4 ° C (auf ein Rad) für 10 min.
- Spin down bei 3000 × g für 5 Minuten bei 4 ° C und den Überstand verwerfen.
- Das Pellet in 300 ul jeweiligen SB - Puffer (Tabelle 1) in ein sauberes Röhrchen mit Protease - Inhibitoren ergänzt (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei) jede DNA - Abbau zu verhindern. Inkubieren für 15 bis 30 Minuten auf Eis.
- Beschallen die Proben bei 4 ° C , um das Chromatin mit einem Beschallungsgerät gemäß Programmen in Tabelle 2 für jedes Material aufgeführt abzuscheren. Stellen Sie Beschallungsdauer in Abhängigkeit von der nächsten Anwendung (<em> dh PCR oder Sequenzierung). Geschoren DNA Größe sollte für die PCR und 300 bp für die Sequenzierung etwa 500 bp.
- Zentrifuge beschallt für 10 min Zelllysat bei 6.000 × g bei 4 ° C, den Überstand (chromatin) in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen und das Pellet verworfen.
- Man verdünnt das Chromatin in Lösung (Überstand Puffer B) für 10-mal mit Wasser und zu beurteilen, um die optische Dichte unter Verwendung von 1,5 & mgr; l in einem Nano-Spektralphotometer. Besorgen Sie sich die Konzentration von Proteinen in ug / ul der folgenden Formel berechnet: 1,55 x OD 280 bis 0,76 x OD 260.
| Puffer | Nutzung | Zusammensetzung | Materialien | |||
| EIN | Permeabilisierungs | PB1: 5 mM PIPES pH 8; 85 mM KCl; 0,5% NP40 | Alle | |||
| PB2: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 60 mM KCl, 0,5% TRITON X-100 | Embryonale Gewebe | |||||
| B | Lysis / Beschallen | SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8 | ESC | |||
| SB2: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,9; 140 mM; 1 mM EDTA; 0,1% Desoxycholat; 0,1% SDS | EBs | |||||
| SB3: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl; 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA; 1% TRITON-X100, 0 0,1% SDS, 0,5% Laurylsarcosin | Embryonale Gewebe | |||||
| C | ChIP-Puffer | 150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 5 mM EDTA; 0,5% NP40; 1% TRITON-X100. | Alle | |||
| D | DNA / Protein-Elution | D1: 1% SDS; 100mM NaHCO3 D2: 50 mM Tris pH 7,6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT, 2% SDS | ||||
| E | DNA-Bindungs Perlen Vorbereitung | E: 20% PEG 8000; 2,5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM EDTA | ||||
Tabelle 1. ChIP - Puffer.
| Stoff | Ultraschall - Behandlung Programm |
| Embryonische Stammzellen | 15 Zyklen von 30 sec und 30 sec OFF |
| Embryoidkörpern | 30 Zyklen von 30 sec und 30 sec OFF |
| embryonalem Gewebe | 21 Zyklen von 30 sec und 30 sec OFF |
Tabelle 2. Ultraschall - Behandlung Programme.
3. Immunpräzipitation undWäscht
- 3 x waschen Protein A-konjugierten Perlen mit Puffer C. Nehmen Sie 100 ul Kügelchen in ein sauberes 1,5 - ml - Röhrchen und 1 ml Puffer C (Tabelle 1). Das Rohr wird dann auf einen Magneten übertragen; mindestens 1 Minute warten und den Überstand aspirieren. Zweimal wiederholen den Waschschritt.
- Inkubieren Antikörper , der gegen modifizierte Histone oder Transkriptionsfaktors (Konzentrationen in Tabelle 3) mit 20 & mgr; l gewaschener Protein - A - konjugierten Perlen und 1 ml Puffer C mit Protease - Inhibitoren in ein sauberes 1,5 - ml - Röhrchen ergänzt. Stellen Sie die Proben auf einem Rotator bei 40 Upm für mindestens 2 h bei 4 ° C.
- Wash-Antikörper-Kügelchen-Komplexen 3-mal mit 1 ml Puffer C (manipulation in 3.1 beschrieben).
- Bereiten Sie zwei Röhren, ein Gehalt von 150 ug Chromatin und Antikörper-Perlen-Komplexe und das andere Röhrchen mit 150 ug des Chromatins und 20 ul gewaschenen Perlen; 1 ml Puffer C, ergänzt mit Proteaseinhibitoren zu jedem Röhrchenund inkubiere die Proben auf einem rotierenden Rad bei 40 rpm über Nacht bei 4 ° C.
HINWEIS: Die Konzentration des Chromatins mindestens 300 & mgr; g sein müssen, ein Transkriptionsfaktor oder für sequentielle ChIP immunpräzipitieren.
| Standard | Konzentration (ng / ul) | Volumen (ul) | Die Gesamt - DNA - Konzentration (ng) |
| EIN | 10.0 | 1 | 10.0 |
| B | 5.00 | 1 | 5.00 |
| C | 2,50 | 1 | 2,50 |
| D | 1,25 | 1 | 1,25 |
| E | 0,625 | 1 | 0,625 |
| F | 0,3125 | 1 | 00,3125 |
| G | 0,156 | 1 | 0,156 |
| H | 0.0 | 1 | 0.0 |
Tabelle 3. Standards Konzentrationen.
4. DNA-Elution, Querlenker-Reversal und Proteinase K Digestion
- Stellen Sie die Proben in der magnetischen Rack. Gewinnen Sie den Überstand ungebundenen Antikörper Chromatin enthält.
HINWEIS: Die Proben können rasch in diesem Schritt und gelagert bei -80 ° C in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Chromatin kann in anderen Immunpräzipitationstests mit anderen Antikörpern verwendet werden. Waschen jeder Probe 3 mal mit 1 ml Puffer C (manipulation zuvor beschrieben). - Eluieren des Antikörper-gebundenen Proteins durch Zugabe von 150 ul Puffer D1 oder D2 , falls sequentieller ChIP (Tabelle 1) gewaschen ChIP Materialien und Inkubation für 20 min die Proben bei 50 ° C in einem Heizblock durchgeführt werden muss.
- Entfernen Sie Rohre ausder Heizblock und setzen Proben in der Magnetträger, erholen Sie den Überstand in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei) und die Perlen zu verwerfen.
- Verwenden Überstand für eine sequentielle ChIP Zugabe von 1 bis 3 ug des zweiten Antikörpers in 2 Volumina Puffer C oder Rückwärtsvernetzungs durch Zugabe von 5 M NaCl auf eine Endkonzentration von 200 mM zu erhalten.
- Vorbereiten eines Eingangsabtastwert von Chromatin in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei) die gleiche Menge an Chromatin wie die der IP-Probe (150 ug) in einem Endvolumen von 150 & mgr; l Wasser unter Berücksichtigung (RNase DNase freies Wasser). Hinzufügen 5M NaCl bis zu einer Endkonzentration von 200 mM. Inkubieren Proben über Nacht bei 65 ° C.
- Am nächsten Tag entfernen Proben aus dem Heizblock, fügen 250 mM EDTA zu einer Endkonzentration von 12,5 mM und Proteinase K zu erhalten, um eine Endkonzentration von 250 ug / ml in dem Chip-Material zu erhalten und für 2 Stunden in die auf 55 ° C verdauen Heizblock.
- Herstellung von Perlen
- Starten Sie die Perlen bei Raumtemperatur zu bringen, für mindestens 30 Minuten, Wirbel die Kügelchen sehr gründlich. Perlen sesshaft, so schnell arbeiten beim Pipettieren. 1 ml der Perlen in sauberes 1,5-ml-Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei).
- Auf Magnet, warten Sie 2 - 3 min für die Lösung zu klären, Überstand verwerfen. Entfernen von Magneten, 1 ml 0,5 M EDTA und mischen durch kurzes Vortexen.
- Wiederholen Sie Schritt 5.1.2 zweimal und Überstand verwerfen am Ende.
- Entfernen von Magneten, 1 ml Puffer E und resuspendieren langsam die Perlen. Übertragen Sie die ganze Mischung (Perlen in Puffer E) in 50 ml Puffer E. Platz auf einem Schüttler und lassen Sie es für 1 Stunde bei Raumtemperatur langsam mischen.
- Test-DNA-bindenden Perlen nach dem Reinigungsprotokoll unter Verwendung von 3 beschriebenen experimentellen Bedingungen: 50 ul Perlen / 50 ul DNA (1 Volumen / 1 Volumen) wurden 100 ul Perlen/ 50 & mgr; l DNA (2 Bände / 1 Volumen) und 125 & mgr; l Perlen / 50 ul DNA (2,5 Volumen / 1 Volumen). Lassen migrieren gereinigter DNA auf einem 1,5% Agarosegel der Größe der Bruchstücke (1A) zu überprüfen.
- DNA Purification
- In 425 ul (2,5 Volumen) von DNA-bindenden magnetischen Kügelchen zu jeder DNA-Probe (etwa 170 ul). Resuspendieren langsam durch Pipettieren auf und ab (ca. 10 mal) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.
- Setzen Sie auf Magnet für 5 Minuten, dann Überstand aspirieren und verwerfen (auf Magnet).
- In 600 ul frisch aus 80% Ethanol auf das Rohr auf dem Magneten, mindestens 1 Minute warten, absaugen Überstand und zu verwerfen und dann den vorherigen Schritt wiederholen noch einmal.
- Geben Sie eine schnelle Runde, für 5 Sekunden (Mikrofuge), legen Sie den Schlauch auf dem Magneten und entfernt die letzten Tropfen Ethanol. Trocknen lassen für 1 min bei RT
- Eluieren der DNA durch Zugabe von 20 & mgr; l DNase RNase freies Wasser. Entfernen von Magnet und die Probe vortexen.
- Inkubieren für 3 Minuten bei Raumtemperatur und dann legen Proben auf Magneten. Absaugen eluierte DNA in ein neues Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei).
- Führen Sie die DNA aus dem Eingangsfraktion auf einem 1,5% Agarosegel der Größe von DNA - Fragmenten (1B) zu überprüfen.
6. DNA-Quantifizierung mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektionsinstrument
- Serienmäßig in der DNA - Wasser 1 ug (1 kb Leiter) verdünnen insgesamt 7 Verdünnungen zu geben , sowie eine nicht-DNA - Punkt (Verdünnungen in der Tabelle gesammelt 3).
- Bereiten Sie eine Lösung von PCR-Green I-Farbstoff, ausreichend für alle Proben (gereinigte DNA und Standardverdünnungen AH): verdünnen Sie die Grüne Farbstoff in 1x TE-Puffer 10.000fach.
- 1 ul jeder DNA-Proben (gereinigte DNA und Standardverdünnungen AH) bis 10 & mgr; l 1x grünen Farbstoff-Mix in Kapillaren Küvetten in einem Fluorimeter bei 488 nm Wellenlänge gelesen werden. Für die nicht-DNA-Test, verwenden Sie 1 ul des 1x TE-Puffer.
- Baueneine Kalibrierungskurve eine Grafik-Software und die relativen Konzentrationen auf den Bereich von DNA-Proben in ng / & mgr; l bestimmen. Die DNA wird dann bereit für PCR oder Sequenzierung Bibliotheken zu machen.
7. PCR
- Die Auswahl der Primer
- Design-Primer von Interesse, die genomischen Regionen von Interesse abzufragen. Design-Primer Enhancer-Regionen von Genen unter Verwendung des UCSC Genom-Browser zu verstärken. Enhancers werden voraussichtlich auch H3K4me1 oder p300 ChIP-seq 9 Daten in GEO Datensatz.
- PCR
- Run-PCR-Reaktionen für 45 Zyklen (8 sec 95 ° C, 8 sec 60 ° C, 8 sec 72 ° C) unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Thermocycler in 25 ul grünen Farbstoff-Mix, 2 ng DNA und 0,5 & mgr; l Primer-Gemisch (20 uM Stammlösung) 10.
- Die Analyse der Anreicherung
- Berechnen Absolute Anreicherungs vorausgesetzt, wurden 11 höchstens 1% der Nukleosomen immunpräzipitiert.
- consider die genomische als angereichert, wenn 10 ng IP Proben eine größere Anreicherung zeigen, wenn auf 0,1 ng Input-DNA verglichen.
- Express-Ergebnisse als fache Erhöhung der Anreicherung über eine nicht angereicherten Bereich nach der Normalisierung mit dem Eingang und Einstellung mit einem unspezifischen Kontrollprobe.
- Betrachten wir die Eingangs DNA von 100 (Verdünnungsfaktor oder DF) verdünnt werden.
- Normalisieren der Eingang mit der folgenden Gleichung 2 -ΔCt x 100%, wobei -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Input x DF].
- Passen Sie Steuerung mit Hilfe der folgenden Gleichung (ACt [IP] -ΔCt [NS]), wobei NS die unspezifische Probe (keine Antikörper IP oder IgG IP).
- Berechne den fache Anreicherung der Probe als 2 -ΔΔCt. Eine Datei mit allen Schritten von Berechnungen mit den Formeln in denen nur jede PCR Probe eingegeben werden kann, wird die Analyse der Ergebnisse zu erleichtern.
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Representative Results
1A stellt zunächst die Herstellung von DNA-bindenden Perlen und Qualitätskontrolle unter Verwendung von DNA in verschiedenen Größen (1 kb Leiter). 0ne, 2 und 2,5 Volumina (1 bis 3) der Kügelchen wurde zu einem Volumen der Probe hinzugefügt hohem und niedrigem Molekulargröße DNA-Fragmente zu reinigen.
Figuren 1 B, C, D sind typische Beispiele für DNA - Gelen von Voll beschallter DNA extrahiert aus Maus - ES - Zellen, embryoid bodies oder einem Herz embryonalen Bereich (25 E9.5 Ventrikel gepoolt), respectively.
Wenn ES-Zellen differenzieren zu einer kardialen Zellschicksal, sie Transit zunächst durch einen mesendodermal und dann einen mesodermalen Zustand. Eine solche Entwicklungs Reise beinhaltet einen Schritt, durch die Epithelzellen haben eine epithelio-mesenchymale Transition zu unterziehen
Figur 2
Differentiation Gene sind mit bivalenten Domänen in ES - Zellen 12. Ihre 5'-UTR-Regionen in der Nähe ihren Promotoren sind in der Tat sowohl H3K4me3 ein Chromatin Aktivierungszeichen und H3K27me3, einer verdrängten Marke besetzt. Diese Markierungen werden modifiziert , wenn Zellen durch Morphogene wie BMP2 7 in Frage gestellt werden. Diese Markierungen sind jedoch variabel in Abhängigkeit von der humanen ES-Zellen Liniewegen der ursprünglichen Blastocysten wahrscheinlich s sie von selbst wenn undifferenzierten (Abbildung 3) abzuleiten.
Die Protokolle oben beschriebenen geeignet für ChIP-Sequenzierung auch aus einer geringen Menge von Ausgangsmaterial; ChIP - Experimente von Chromatin durchgeführt wurden aus AVC extrahiert, OFT und Ventrikel E9.5 Mäuseembryos , um eine Rolle zu spielen bei der Bestimmung der Identität dieser spezifischen Herzregionen neue Gene und Enhancer aufzudecken. 4 zeigt zwei genomischen Regionen von Genen in myocardial die Ventrikel E9.5 Maus durch ein acetyliertes H3K27 angereichert und von einem Schrittmacher-spezifischen (dh., ventrikuläre nicht) Gen nicht von acetylierten H3K27 angereichert.
Abbildung 1. Die Elektrophorese Daten: DNA-bindenden Perlen prüfen und Beschallen Valdierung. (A) DNA gereinigt durch DNA-bindenden Perlen, 1 Volumen Perlen / 1 Volumen DNA (1) und 2 Volumen Perlen / 1 Volumen DNA (2) und 2,5 Volumen von Perlen / 1 Volumen DNA (3). Größe der erhaltenen DNA - Fragmente nach der reversen Vernetzungs von Eingangsfraktionen von Maus - ES - Zellen (B), embryoid bodies (C) und embryonalen Herzgewebe (D). Die Proben wurden auf 2% Agaroseelektrophoresegele laufen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. ChIP Datenanalyse. (A) Anreicherung von H3K27ac epigenetische Markierung auf E-Cadherin - Enhancer / Promotor (A - E - Regionen) (B) Anreicherung von H3K4me1, H3K36me3 und H3K9me2 epige.tische Markierungen auf Twist - Enhancer / Promotor (AC - Regionen). Genomische Regionen werden durch qPCR verstärkt, um die Histon-Anreicherung gegen den Eingang folgenden ChIP zu messen. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM von 3 Experimenten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Sequenzielle ChIP. Chromatin extrahiert wurde aus 4 humanen ES - Zelllinien und ChIP wurde nacheinander anti H3K4me3 durchgeführt unter Verwendung und dann anti-H3K27me3 Antikörper. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4.
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Discussion
Epigenetik ist ein wichtiger Bereich der Forschung in der Entwicklungsbiologie geworden. Wie ein genetisches Programm in embryonalen Zellen aktiviert wird, um die Zellen zu erwerben eine bestimmte Identität innerhalb einer embryonalen Linie zu ermöglichen, hat eine Schlüsselfrage für Entwicklungsbiologen für lange Zeit gewesen.
ChIP wurde in den letzten Jahren und kombiniert, um die DNA-Sequenzierung folgende Verbesserung der Auflösung der Sequenzierung im Großen und Ganzen verwendet. Dies hat eine leistungsstarke Technik, um sich in einer genomweiten abhängigen Weise die epigenetischen Landschaft von Zellen oder spezifischen embryonalen und adulten Geweben zu untersuchen. Die Chip-Testpuffer und Beschallungsbedingungen wurden stark verbesserte Assays für kleine Menge biologischen Materials zu ermöglichen. Dazu gehören bestimmte Regionen von embryonalen Herzen durch Mikrodissektion erhalten oder durch FACS-sortierten Zellen ein fluoreszierendes Reporterprotein exprimiert. Tatsächlich durchgeführt ChIP auf heterogenen Zellpopulationen 13 14 kannführen zu falschen Ergebnissen, die schwer zu interpretieren. Die epigenetische Signatur Marken Zelle sehr genau Populationen. Diese Signatur verleiht ihnen ein bestimmtes Potential der Differenzierung und bestimmt ihr Schicksal. Es ist daher wichtig, die mit gereinigtem (sortiert) Zellpopulationen oder seziert embryonalen Geweben zu arbeiten.
Wir haben oben robuste Protokolle beschrieben, um diese Ziele zu erreichen. Wir haben diese Protokolle für ChIP-PCR, Chip-On-Chip 7, 10 oder ChIP-Sequenzierung (Abbildung 4, Manuskript in Vorbereitung) verwendet. Der Grund für die Robustheit legt auf die Permeabilisierung und Zell-Lyse-Puffer, der eine komplette Zelle und Kern Lyse und effiziente Chromatin Beschallung zu gewährleisten optimiert wurden. Die Protokolle können so für kleine Menge von embryonalen Geweben verwendet werden.
Einschränkungen dieser Protokolle sind inhärent ChIP. Genauer gesagt, wird die räumliche Auflösung 500 bp nicht sehr hoch mit DNA Größen herum. Wieje, ermöglicht es uns , die Dynamik von bivalenten Domänen bei der Differenzierung von ES - Zellen 7 und offenbaren Unterschiede in Anreicherung von modifizierten Histone auf EMT - Gen regulatorischen Regionen in Wildtyp oder genveränderten Zellen zu untersuchen. (Abbildung 2). Tief Sequenzierung von DNA immunpräzipitiert (Figur 4) teilweise überwindet diese Einschränkung.
Anreicherung einer spezifischen genomischen Region folgende Immunopräzipitation eines Transkriptionsfaktors zeigt nicht sicher, dass der Faktor DNA direkt bindet. Es konnte nur an die DNA gebunden Teil komplexer Fabrik sein. Dies ist ein wichtiger Punkt, um bewusst zu sein. Im Gegensatz dazu Assay Gelretardation könnte die Frage angesprochen werden.
die Technologie in den Händen zu haben mit tiefen Sequenzierung kombiniert ermöglicht genomweite die genomischen Regionen durch eine Transkriptionsfaktoren oder einem bestimmten Histon-Marke besetzt zu überwachen. Die Technologie verbessert und erlaubt dem Benutzer nur sma Abfragenll Zellpopulationen 15. Es eröffnet damit neue Wege in der Dynamik der spezifischen epigenetischen Landschaften während der embryonalen Entwicklung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1x | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
References
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