Summary
遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。
Abstract
特定の遺伝子の転写は、胚発生の間の細胞運命決定の基礎となる重要な生物学的プロセスです。生物学的プロセスは、心臓、構成遺伝子のエンハンサー及びプロモーターを含むゲノムの調節領域に結合する転写因子によって媒介されます。 DNAは、化学修飾に供されるヒストンの周りに巻かれています。ヒストンの修飾は、さらにこのように、遺伝子転写の微調整調節の別のレベルをもたらし、抑圧、アクティブまたは構え遺伝子転写につながります。胚性幹細胞（ES細胞）は、心臓発生の初期段階の胚様体（ すなわち 、細胞凝集体）内または2D培養で再現します。それらは、クロマチン免疫沈降（チップ）のための原則に十分な材料、広く遺伝子調節領域を同定するために使用される技術の提供します。また、ヒトES細胞は、心臓のヒト細胞モデルを表します。開発の後期段階では、マウス胚組織はを可能にセルIDを決意するために必要な具体的なエピジェネティックな風景を調べます。ここで、我々は、チップ、ES細胞、胚様体および心臓特異的胚性領域を用いたPCRまたはチップ・シーケンシングに続いて、順次、チップのプロトコルを記述しています。これらのプロトコルは、心臓遺伝子転写のエピジェネティック制御を調査することができます。
Introduction
心臓は最初の器官が形成されると、胚における機能的になることです。心臓は、第1および第2の胚性心臓フィールド1から発生する多くの細胞系譜から構築されています。受精後の胚盤胞は、成形心まで段階から、胚細胞は、多くの細胞の運命決定を行うためにこのようにしてあります。遺伝子の転写は、時間と空間依存的に調節され、胚発生の間の細胞運命の決定の基礎となる重要な生物学的プロセスです。このような方法は、心臓構成遺伝子のエンハンサー及びプロモーターを含むゲノム内の調節領域に結合する特異的転写因子によって媒介されます。 DNAは、例えば、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、および/またはリン酸化などの修飾に供されたヒストンの周りに巻かれています。ヒストン修飾は、ヒストンのリジン残基が2に変更されているに応じて活性化し、抑圧や構え遺伝子転写につながります。
jove_content ">クロマチン免疫沈降アッセイ（チップ）年前に3を設定し、4。ヒストンや転写因子の免疫沈降後に変更されたヒストンや転写因子のいずれかの標的を同定するために、現在最も広く使用されている技術であるされてきた、結合したDNAをすることができますいずれかのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅または配列決定した。チップは、技術的挑戦ゲル遅延アッセイ5を克服している。しかし、チップはDNA、ゲル遅延アッセイの利点の転写因子の結合を直接意味するものではない。一方、チップ上DNAシークエンシングに合わせた遺伝子調節に関する新たなゲノムワイドな視点をオープンしました。ES細胞（ES細胞）を6胚様体（ すなわち 、細胞凝集体）内または2D培養において心臓の開発の初期段階を再現し、チップのための原則に十分な材料に提供します。また、ヒトES細胞は、CAのヒト細胞モデルを表しますその心原性の潜在的なもののrdiogenesisはそのエピジェネティックな署名7に依存します。開発の後期段階では、マウス胚組織は、セル識別の決意に必要な特定のエピジェネティックな景観を調査することを可能にします。しかし、ゲノムは時間と細胞型に特異的な様式8に転写されます。遺伝子転写のエピジェネティック制御は、局所領域内で検討されなければなりません。ここで、我々は、チップ、ES細胞、胚様体および心臓特異的胚領域を使用して、PCRまたは配列決定に続いて、順次、チップのプロトコルを記述しています。これらのプロトコルは、心臓遺伝子転写のエピジェネティック制御を調査することができます。
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Protocol
1. DNA-タンパク質架橋
- ES細胞と胚の心臓組織から発生した15ミリリットルチューブに修正収穫-ES細胞（レギュラーチップ用の2×10 6細胞、マイクロチップのための2×10 5細胞）、胚様体（EB）はE9.5のマウス胚から切開（房室細胞または胚組織のために透過処理PB2バッファにPBS中の1％ホルムアルデヒドを用いて運河、流出路及び心室）。正確に10分間、室温で60回転の速度でオービタルシェーカー上でチューブを入れます。
- 125 mMの最終濃度のグリシンを添加することによって架橋反応を停止させ、60回転の速度でオービタルシェーカー上で室温で5分間インキュベートします。
2.細胞溶解とクロマチン断片化
- 10mlのPBS 1Xまたは1ミリリットルPB2に再懸濁胚組織に再懸濁回架橋された細胞を洗浄します。 4℃で5分間1,000×gで遠心分離します。上清を捨てます。</李>
- PB1またはPB2（2 / mlのロイペプチン、1 / mlのアプロチニン、および0.1mM PMSF）（ 表1）をバッファリングするためにプロテアーゼ阻害剤を追加します。それぞれバッファPB1またはPB2の1ミリリットルのステップ2.1から細胞ペレットまたは胚組織を再懸濁します。ピペットで上下および細胞または組織を再懸濁します。細胞または組織を均質化するために21ゲージ針で1ミリリットル注射器を使用してください。 10分間4℃（ホイール上）でインキュベートします。
- 4℃で5分間、3000×gでスピンダウンし、上清を捨てます。
- きれいなチューブにプロテアーゼ阻害剤を補充したそれぞれのSBバッファ（ 表1）300μlの中にペレットを再懸濁（のRNase、DNase-認定、および発熱物質を含まない）は、任意のDNA分解を防ぐために。氷上で15〜30分間インキュベートします。
- 各材料について、表2に記載されたプログラムに従って超音波処理器を用いてクロマチンを剪断するために4℃で試料を超音波処理します。 <（次の用途に応じて超音波処理時間を調整しますem>のすなわち、PCRまたは配列決定）。剪断されたDNAの大きさは、PCRおよび配列決定のための300bpのための約500塩基対でなければなりません。
- 遠心分離機は、新しい1.5 mlチューブに上清（クロマチン）を転送し、ペレットを廃棄し、4℃、6,000×gで10分間、細胞溶解物を超音波処理しました。
- 水で10倍のため、溶液中のクロマチン（上清緩衝液B）を希釈し、ナノ分光光度計で1.5μLを使用して光学密度を評価します。 0.76のx OD 260から1.55のx OD 280：次の式を使用して、μgの/μlの中のタンパク質の濃度を得ます。
| バッファ | 利用 | 組成 | 材料 | |||
| A | 透過化 | PB1：5 mMのパイプpHが8; 85メートルMのKCl; 0.5％NP40 | すべて | |||
| PB2：15mMのHEPES pH7.6の、15mMの塩化ナトリウム、4のMgCl 2 60mMの塩化カリウム、0.5％TRITON X-100 | 胚組織 | |||||
| B | 溶解/超音波処理 | SB1：1％SDS。 10mMのEDTA; 50mMトリス - 塩酸pHが8 | ESC | |||
| SB2：50mMのHEPES-KOH pH7.9; 140 mMの。 1mMのEDTA; 0.1％デオキシコール酸塩、 0.1％SDS | EB | |||||
| SB3：15mMのHEPES pH7.6、15mMのNaClを。 60のKCl、1mMのEDTA、0.5mMのEGTA; 1％TRITON-X100、0.1％SDS、0.5％ラウリルサルコシン | 胚組織 | |||||
| C言語 | チップバッファ | 150mMのNaCl; 50mMのトリス塩酸pH7.5で、 5 mMのEDTA; 0.5％NP40。 1％TRITON-X100。 | すべて | |||
| D | DNA /タンパク質の溶出 | D1：1％SDS。 100mMの炭酸水素ナトリウム D2：50 mMトリスpHが7.6 / 5 mMのEDTA、15mMのDTT、2％SDS | ||||
| E | DNA結合ビーズの準備 | E：20％PEG 8000; 2.5 MのNaCl; 10mMトリス - 塩酸pHが8と1mMのEDTA | ||||
表1のChIPバッファー 。
| 材料 | 超音波処理プログラム |
| 胚性幹細胞 | ON 30秒と30秒OFFの15サイクル |
| 胚様体 | ON 30秒と30秒OFFの30サイクル |
| 胚組織 | ON 30秒と30秒OFFの21サイクル |
表2.超音波処理プログラム。
3.免疫沈降および洗い上げ
- バッファーCで3回のプロテインA結合ビーズを洗ってください。新しい1.5 mlチューブにビーズを100μlを取り、緩衝液C（ 表1）の1ミリリットルを追加します。次に、チューブを磁石上に転写されます。 1分間待ち、上清を吸引除去します。二回洗浄工程を繰り返します。
- バッファCの20洗浄蛋白μlの結合ビーズを1 mlの修飾ヒストンまたは転写因子に対する抗体（ 表3に示す濃度）インキュベート新しい1.5 mlのチューブにプロテアーゼ阻害剤を補充しました。 4℃で少なくとも2時間、40 rpmで回転体のサンプルを設定します。
- 洗浄抗体ビーズを、緩衝液Cを1ml（3.1に記載の操作）で3回錯体。
- 2チューブ、クロマチンと抗体 - ビーズ複合体およびクロマチン150μgのを含む他のチューブと洗浄したビーズを20μlの150μgのを含む1を準備し;各チューブにプロテアーゼ阻害剤を補充した緩衝液Cを1ml加えますそして4℃で一晩40 rpmで回転ホイール上でサンプルをインキュベートします。
注：クロマチンの濃度は、転写因子またはシーケンシャルチップ用を免疫沈降するために、少なくとも300μgのでなければなりません。
| 標準 | 濃度（ngの/μL） | 容量（μL） | 全DNA濃度（NG） |
| A | 10.0 | 1 | 10.0 |
| B | 5.00 | 1 | 5.00 |
| C言語 | 2.50 | 1 | 2.50 |
| D | 1.25 | 1 | 1.25 |
| E | 0.625 | 1 | 0.625 |
| F | 0.3125 | 1 | 00.3125 |
| G | 0.156 | 1 | 0.156 |
| H | 0.0 | 1 | 0.0 |
表3基準濃度。
4. DNA溶出、クロスリンクの逆転とプロテイナーゼK消化
- 磁気ラック内のサンプルを設定します。非結合抗体のクロマチンを含む上清を回収。
注：サンプルは、すぐにその段階で、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存することができます。クロマチンは、他の抗体と他の免疫沈降アッセイに使用することができます。バッファCの1ミリリットル（前述の操作）で各サンプルを3回洗浄。 - シーケンシャルチップが洗浄のChIP材料を（ 表1）を行わなければならない場合、バッファD1またはD2の150μLを添加することによって、抗体結合タンパク質を溶出し、加熱ブロック中で50℃で20分間、サンプルをインキュベートします。
- からチューブを外します加熱ブロックとは、磁気ラックにサンプルを入れて、（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定）新しい1.5 mlチューブに上清を回収し、ビーズを捨てます。
- バッファCの2倍量の第二の抗体の3μgのに1を加え、順次チップ用の上清を使用するか、または200 mMのの最終濃度を得るために、5 MのNaClを添加することにより架橋逆転。
- 新しい1.5 mlチューブにクロマチンの入力サンプルを準備する（のRNase、DNase-認定、および発熱物質を含まない）水を150μlの最終容量でIPサンプル（150μgの）のようなクロマチンの同じ量を取ります（RNアーゼDNアーゼを含まない水）。 200 mMの最終濃度が5MのNaClを追加します。 65℃で一晩サンプルをインキュベートします。
- 翌日、加熱ブロックからサンプルを除去するのChIP材料中に250μg/ mlの最終濃度を得て、2時間55℃で消化し12.5ミリモルおよびプロテイナーゼKの最終濃度を得るために、250 mMのEDTAを加えます加熱ブロック。
- ビーズの作製
- 少なくとも30分間室温でビーズを持って開始し、非常に徹底的にビーズをボルテックス。ビーズは落ち着くので、ピペッティング時に高速に動作します。転送（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定）きれいな1.5ミリリットルチューブ中のビーズの1ミリリットル。
- 、明確上清を廃棄するソリューションの3分 - 磁石に設定し、2を待ちます。 、磁石から削除0.5 M EDTAの1ミリリットルを追加し、短時間のボルテックスで混和します。
- 二回ステップ5.1.2を繰り返し、最後に上清を捨てます。
- 、磁石から削除バッファEの1ミリリットルを追加し、ゆっくりとビーズを再懸濁します。シェーカー上にバッファE.プレイス50mlに全体のミックス（緩衝液E中のビーズ）を転送し、それを1時間室温でゆっくりと混ぜてみましょう。
- 3実験条件を用いて説明精製プロトコールを以下の試験DNA結合ビーズ：ビーズを50μl/ DNAを50μl（1ボリューム/ 1容量）、ビーズを100μl/ DNA50μlの（2ボリューム/ 1容量）とビーズの125μlのDNA /50μlの（2.5容量/ 1容量）。フラグメント（ 図1A）の大きさを確認するために、1.5％アガロースゲル上で精製されたDNAを移行しましょう。
- DNA精製
- 各DNAサンプル（約170μl）をした磁気ビーズを結合するDNAの425μL（2.5容量）を追加します。ダウン（約10倍）、ピペッティングによりゆっくりと再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。
- その後、上清を吸引し、（磁石に）捨て、5分間磁石上に置きます。
- 、1分間待機し、磁石上にチューブに新たに作製した80％エタノール600μlを添加し上清を吸引して廃棄した後、もう一度、前の手順を繰り返します。
- 5秒（マイクロフュージ）のために、迅速なスピンを与える、磁石上にチューブを置き、エタノールの最後の滴を除去します。室温で1分間乾燥させ
- DNアーゼRNaseを含まない水20μlを加えることによって、DNAを溶出します。磁石から取り外し、サンプルをボルテックス。
- 室温で3分間インキュベートし、その後、磁石上にサンプルを置きます。新しいチューブに吸引し溶出したDNAは（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定します）。
- DNAフラグメント（ 図1B）の大きさを確認するために、1.5％アガロースゲル上で入力画分からDNAを実行します。
6. DNA定量は、蛍光検出機器の使用します
- シリアル7希釈液を加えた無DNA点（ 表3に集まった希釈液）の合計を与えるために水に1μgのDNA（1キロバイトラダー）で希釈します。
- PCRグリーンI色素の溶液を準備し、すべてのサンプル（精製DNA及び標準希釈液AH）のための十分な：1×TE緩衝液中グリーン色素を10,000倍希釈します。
- 毛細血管のキュベット中で10μlの1×緑の色素ミックスに各DNAサンプル（精製DNA及び標準希釈液AH）の1μLを加えるには、488 nmの波長での蛍光光度計で読み取ることができます。無DNAアッセイのために、1×TE緩衝液1μLを使用しています。
- ビルドグラフィックソフトを使用して検量線とNG /μlの中のDNAサンプルの範囲に相対濃度を決定します。次いで、DNAをPCRのために準備ができているか、シーケンシングライブラリを作成します。
7. PCR
- プライマーの選択
- 関心の設計プライマーは、関心のあるゲノム領域を調べることができます。設計プライマーは、UCSCゲノムブラウザを使用して遺伝子のエンハンサー領域を増幅します。エンハンサーはさらにGEOデータセット内の9データ利用可能H3K4me1またはP300のChIP-seqのを用いて予測しています。
- PCR
- 45サイクル（8秒95℃、8秒、60℃、8秒72°C）25μlの緑の色素ミックス、2 ngのDNAを、および0.5μlのプライマーミックスでリアルタイムPCRサーマルサイクラーを使用するためのファイル名を指定して実行のPCR反応（20 μMストック溶液）10。
- 濃縮の分析
- ヌクレオソームのせいぜい1％が11を免疫沈降したと仮定して絶対濃縮を計算します。
- ConsideRゲノム投入DNAの0.1 ngのと比較すると10 ngののIPサンプルが大きい濃縮を示す場合に富むように。
- 非特異的対照試料と入力し、調整の正規化後の非濃縮領域にわたって濃縮度の増加倍数として結果を表現します。
- 入力DNAは100（希釈係数またはDF）によって希釈されるように考えてみましょう。
- Ct [DF X入力] - X 100％以下の式2-ΔCt、-ΔCt= Ctを[IP]を使用して入力を正規化します。
- NSは、非特定のサンプル（抗体なしIP、またはIgG IP）であるとして、次の式（ΔCtを[IP]-ΔCt[NS]）を使用してコントロールを調整します。
- 2-ΔΔCTとしてサンプルの倍の濃縮を計算します。唯一各PCRサンプルは、結果の分析を容易に入力することができる式で計算のすべてのステップを含むファイル。
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Representative Results
図1Aは、まず、異なるサイズ（1kbのラダー）のDNAを用いたDNA結合ビーズおよび品質管理の調製を示します。 0ne、ビーズの2および2.5体積（1〜3）は、高および低分子サイズのDNA断片を精製する試料の量に添加しました。
図1 B、C、Dは、マウスES細胞、胚様体または心臓胚領域から抽出された全超音波処理DNAのDNAゲルの典型的な例では、それぞれ、（25 E9.5心室をプールしました）。
最初の中内胚葉、その後、中胚葉状態を経てES細胞が心筋細胞の運命に向かって分化し、それらのトランジット。このような発達の旅は上皮細胞がepithelio間葉移行を受けなければなられる工程を含み、
図2
分化遺伝子は、ES細胞12に二価のドメインを備えています。それらのプロモーターに近い彼らの5 'UTR領域は、実際に両方のH3K4me3とクロマチン活性化マークとH3K27me3、抑圧されたマークで占有されています。細胞はBMP2 7などのモルフォゲンによって挑戦されたときにこれらのマークは変更されます。これらのマークは、しかし、変数は、ヒトES細胞ラインに依存していますなぜなら、彼らは場合でも、未分化から派生元の胚盤胞（ 図3）の可能性が高いのです。
上記のプロトコルがあっても、材料の少量から開始したChIP配列決定のために適しています。 ChIP実験は、これらの特定の心臓領域のアイデンティティを定義する役割を果たしている新規遺伝子およびエンハンサーを明らかにするために、AVC、OFTとE9.5マウス胚の脳室から抽出されたクロマチンから実施した。 図4における心筋遺伝子の2ゲノム領域図アセチル化H3K27によって一ペースメーカー固有の濃縮E9.5マウス心室は、遺伝子は、アセチル化H3K27によって濃縮されない（ すなわち 、心室ではありません）。
図1. 電気泳動データ ：DNA結合ビーズチェックおよび超音波処理ヴァルidation。 （A）DNA DNA結合ビーズにより精製し、ビーズのDNA / 1体積の1体積（1）ビーズのDNA / 1体積の2倍量（2）ビーズの2.5体積のDNA / 1体積（3）。入力されたマウスES細胞（B）の画分を、胚様体（C）とは逆の架橋後に得られたDNA断片の大きさ、及び胚の心臓組織（D）。サンプルは、2％アガロース電気泳動ゲル上で実行されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. E-カドヘリンのエンハンサー/プロモーターにH3K27acエピジェネティックなマークのチップ・データ解析。（A）濃縮 （A - E領域）（B）H3K4me1、H3K36me3とH3K9me2をepigeの濃縮。ツイストエンハンサー/プロモーター上の磁マーク（AC領域）。ゲノム領域は、チップ次の入力対ヒストン濃縮を測定するために定量PCRによって増幅されます。結果は3回の実験からの平均±SEMである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.シーケンシャルのChIP。クロマチンは4ヒトES細胞株から抽出し、チップは、抗H3K4me3とした後、抗H3K27me3抗体を用いて、連続して行われました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4。
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Discussion
エピジェネティクスは、発生生物学の研究の重要な分野となっています。遺伝的プログラムは、胚系統内の特定のIDを取得するに細胞を可能にするために胚細胞で活性化されているどのくらいの時間のために、発生生物学者にとって重要な問題となっています。
チップは広く最後の年以内に使用し、シークエンシングの解像性の向上、次のDNA配列決定に組み合わされています。これは、ゲノムワイド依存的に細胞または特定の胚および成体組織のエピジェネティックな風景を調べるための強力な技術となっています。 ChIPアッセイ緩衝液および超音波処理条件が大幅に生物学的材料の少量のためのアッセイを可能にするために改善されました。これは、顕微解剖により、または蛍光レポータータンパク質を発現するFACS選別細胞によって得られた胚の心臓の特定の領域を含みます。実際にチップが不均一な細胞集団13 14缶上で実行しました解釈するのが困難な誤った結果につながります。エピジェネティックな署名は非常に正確に細胞集団をマーク。その署名は、それらへの分化の特定の可能性を与え、彼らの運命を決定します。精製された（ソート）の細胞集団または解剖胚組織と連携することが重要です。
我々は、これらの目標を達成するために、堅牢なプロトコル上に記載しています。我々はチップ7、10またはチップ・シーケンシング（ 図4、原稿準備中）でのChIP-PCR、ChIPのためのこれらのプロトコルを使用しています。堅牢性の理由は、完全な細胞と核溶解および効率的なクロマチン超音波処理を確保するために最適化された透過性および細胞溶解バッファに産みます。プロトコルは、このようにして胚組織の少量のために使用することができます。
これらのプロトコルの制限事項は、チップに固有のものです。より具体的には、空間分解能は500 bpの周りにDNAサイズと非常に高くありません。どうやって今まで、それは、私たちは7 ES細胞を分化に二価のドメインのダイナミクスを調査し、野生型または遺伝子変異細胞でEMT遺伝子調節領域に変更されたヒストンの濃縮の違いを明らかにすることができます。 （ 図2）。免疫沈降したDNA（ 図4）のディープシークエンシングは、部分的に、この制限を克服します。
転写因子の免疫沈降以下の特定のゲノム領域の濃縮は、要因が直接DNAに結合することを確実に示すものではありません。それが唯一のDNAに結合した複雑な工場の一部とすることができます。これは、約知っておくべき重要なポイントです。対照的に、ゲル遅延アッセイは、問題に対処するために使用することができます。
ディープシーケンシングと組み合わせる手に技術を持つことは、ゲノムワイドな転写因子または特定のヒストンマークで占有ゲノム領域を監視することができます。技術が向上し、唯一のSMAに質問することができますされていますLL細胞集団15。したがって、胚発生中に特定のエピジェネティックな風景のダイナミクスにおける新しい道を開きます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1x | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
References
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