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Bioengineering

एक का विकास Published: April 6, 2016 doi: 10.3791/53907
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1School of Optometry and Vision Science, University of Waterloo, 2Medella Health

Summary

कॉन्टेक्ट लेंस (सीएलएस) और अन्य नेत्र संबंधी आवेदनों का मूल्यांकन करने के लिए वर्तमान में इन विट्रो मॉडल गंभीर रूप से सीमित हैं। प्रस्तुत आंख का मंच शारीरिक आंसू प्रवाह, आंसू मात्रा हवा जोखिम और यांत्रिक पहनते simulates। इस प्रणाली के अत्यधिक बहुमुखी है और विभिन्न इन विट्रो CLs साथ विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

संपर्क लेंस (सीएल) के मैदान के भीतर ब्याज की दो महत्वपूर्ण क्षेत्रों बेचैनी और उपन्यास सीएल अनुप्रयोगों के विकास में शामिल हैं। तंत्र सीएल असुविधा अंतर्निहित elucidating एक मुद्दा है कि दशकों के लिए मैदान नहीं मिल पाई गई है। 8 उपन्यास के विकास, ऐसी दवा वितरण उपकरणों 1,3,9 और biosensors के रूप में कार्य सीएलएस, 10-12 बढ़ती रुचि का एक क्षेत्र है, पर्याप्त संभावित बाजारों के साथ। दोनों परिस्थितियों में, इन विट्रो मॉडल में एक परिष्कृत विकास के चरण के दौरान उचित लेंस सामग्री या डिजाइन विशेषताओं का चयन करने के साथ सहायता के लिए प्रासंगिक जानकारी प्रदान करेगा। दुर्भाग्य से, सीएलएस और अन्य नेत्र से संबंधित आवेदनों का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में वर्तमान अपेक्षाकृत कच्चे और अपरिष्कृत हैं। परंपरागत रूप से, इन विट्रो सीएल आंसू फिल्म बयान या दवा वितरण के मूल्यांकन के अध्ययन के लिए एक निश्चित द्रव मात्रा युक्त स्थिर, बड़ी मात्रा में शीशियों में प्रदर्शन कर रहे हैं जो greatly शारीरिक मात्रा अधिक हो जाती है। इसके अलावा, इस साधारण मॉडल प्राकृतिक आंसू प्रवाह घटक और निमिष पलटा, जो दोनों के नेत्र पर्यावरण के कारकों को परिभाषित कर रहे अभाव है।

एक परिष्कृत, physiologically प्रासंगिक आंख "मॉडल" के विकास के लिए एक बहु अनुशासनिक दृष्टिकोण की जरूरत है और इन विवो सत्यापन में काफी आवश्यकता होगी। इन कारणों के लिए, हमारे लिए इन विट्रो आंख मॉडल के लिए मूलभूत ढांचा बहुत बहुमुखी, कि इस तरह के मॉडल लगातार भविष्य के उन्नयन और modulations के माध्यम से सुधार किया जा सकता है। तिथि करने के लिए, मॉडल आंसू मात्रा, आंसू प्रवाह, यांत्रिक पहनते हैं और हवा के लिए जोखिम का अनुकरण करने में सक्षम है। उद्देश्य इन विट्रो मॉडल है, जो भविष्य कहनेवाला और vivo और पूर्व vivo टिप्पणियों में करने के लिए मानार्थ है कि सार्थक परिणाम प्रदान करेगा बनाने के लिए है।

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Protocol

सभी प्रयोगों अनुसार और विश्वविद्यालय वाटरलू के पशु अनुसंधान आचार समिति द्वारा उल्लिखित सभी प्रासंगिक दिशा निर्देशों के अनुपालन में पूरा किया गया। गोजातीय आंखों उदारता से एक स्थानीय वधशाला से दान कर रहे हैं।

1. नेत्र मॉडल

  1. डिजाइन और molds 13 का उत्पादन
    1. मानव वयस्क आँखों की औसत शारीरिक आयाम के अनुसार आंख मॉडल डिजाइन। 13
    2. नेत्रगोलक और आंख की पलक मॉडल टुकड़ों के बीच 250 माइक्रोन के अंतराल छोड़ दें। कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर संबंधित molds डिजाइन।
    3. ऑटोकैड या Solidworks साथ नए .cad फ़ाइल या .sldprt फ़ाइल बनाएँ। मानव नेत्रगोलक / पलक की 3 डी मॉडल बनाने के लिए। मॉडलों के नए नए साँचे बनाएँ और .stl फ़ाइलों के रूप में नए नए साँचे बचाने के लिए।
    4. 3 डी प्रिंटर सॉफ्टवेयर में आयात .stl फ़ाइलें (जैसे, replicator2 के लिए makeware)। स्थान, sparseness, पैमाने, ओरिएंटेशन, चिकनाई, आदि प्रिंट के मापदंडों (निर्दिष्ट करें 13।
    5. 3 डी प्रिंटर पढ़ने के लिए जी-कोड फ़ाइल के रूप में फ़ाइल सहेजें। ऐसे पीएलए (Polylactic एसिड), एबीएस (acrylonitrile butadiene styrene), पीसी (polycarbonate), या इनका मिश्रण के रूप में सामग्री, चयन के नए नए साँचे 13 मुद्रित करने के लिए।
    6. पसंद की सामग्री के वांछित रेशा स्थापित करें। 3 डी प्रिंटर में जी-कोड फ़ाइल आयात पढ़ने के लिए। मोल्ड प्रिंट।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, अगर आंख मॉडल पर एक चिकनी सतह वांछित है एक कंप्यूटर संख्यात्मक (सीएनसी) मशीन का उपयोग कर नियंत्रित आंख नए नए साँचे का उत्पादन। सीएनसी मोल्ड उत्पादन के लिए नए नए साँचे के लिए सामग्री नहीं रह थर्मल प्लास्टिक तक ही सीमित है, लेकिन धातु, मिट्टी के बरतन, और इस तरह के रूप में रासायनिक Polytetrafluoroethylene प्रतिरोधक पॉलिमर का विस्तार कर रहे हैं।
    7. सीएनसी सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस है कि एक काटने ड्रिल से जुड़ा है खोलें। सामने, ऊपर, पक्ष, और नियंत्रण सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस में पहले से निर्माण नेत्रगोलक / पलक मॉडल नए नए साँचे के परिप्रेक्ष्य विचारों के अनुसार 3 डी नए नए साँचे का निर्माण। के लिए उपयुक्त मानकों का चयन करेंमशीनिंग (बिट आकार, सब्सट्रेट सामग्री, सामग्री मोटाई) और मोल्ड कटौती करने के लिए आगे बढ़ें।
  2. PDMS का प्रयोग Eyepieces के संश्लेषण
    1. एक सिरिंज का प्रयोग, PDMS (polydimethylsiloxane) आधार के 10 मिलीलीटर की मात्रा मापने के लिए और एक 15-50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में भरें। 10% w / PDMS की कुल वजन से इलास्टोमेर समाधान के वी जोड़ें। एक भावप्रवण रॉड का प्रयोग, समाधान अच्छी तरह मिला लें।
    2. नेत्रगोलक और पलक सांचों में PDMS समाधान डालो। PDMS आर टी ओ / एन पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें (या कम से कम 12 घंटे के लिए) polymerization शुरू करने के लिए और बुलबुले बहुलक से बाहर भंग करने के लिए अनुमति देने के लिए।
      नोट: यह सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले PDMS वृद्धि या विस्तार हो सकता है में छोड़ रहे हैं।
    3. इसके बाद 1 घंटा, या 5 मिनट के लिए 150 डिग्री सेल्सियस (302 ° एफ) के लिए एक 75 डिग्री सेल्सियस (167 ° F) ओवन में नए नए साँचे में डाल दिया। एक नरम जेल के लिए, PDMS में कम से कम 48 घंटा पूरी तरह से भाजन करने के लिए आरटी पर बैठते हैं।
    4. कुछ मिनट के लिए एक फ्रीजर में नमूने रखो; इस PDMS छोटा और सरल होगानए नए साँचे से नमूने को हटाने की। एक पतली रंग का उपयोग कर नए नए साँचे से आईपीस निकालें।
    5. नेत्रगोलक और पलक टुकड़ों के बीच अंतरिक्ष में समाधान की डिलीवरी के लिए, एक 1/16 "बराबर पैर युग्मक ट्यूब कनेक्टर के साथ एक 1/16" x 1/8 "polytetrafluoroethylene ट्यूब कनेक्ट और पलक टुकड़ा करने के लिए यह ट्यूबिंग छेद में संलग्न ।
  3. नेत्रगोलक टुकड़ा के संश्लेषण का उपयोग Agarose
    ध्यान दें: नेत्रगोलक टुकड़ा ऐसे agarose के रूप में अन्य पॉलिमर का उपयोग संश्लेषित किया जा सकता है। निम्नलिखित प्रक्रिया भी ऐसी पीडीए (आलू डेक्सट्रोज अगर) या एसडीए (Sabouraud डेक्सट्रोज अगर) के रूप में अगर प्रकार की एक किस्म से आंख टुकड़े का उत्पादन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
    1. एक 2% (2 जी / 100 मिलीलीटर) जेल, उपाय के agarose के 2 जी उत्पादन और ultrapure पानी की 100 मिलीलीटर के साथ मिश्रण करने के लिए। एक फोड़ा (100 डिग्री सेल्सियस) ऐसी है कि agarose पूरी तरह घुल का हल लाओ। समाधान 5 मिनट के लिए ठंडा होने दें।
    2. नेत्रगोलक मोल्ड में समाधान डालो और समाधान 3 के लिए शांत करने की अनुमतिआरटी पर 0 मिनट। एक रंग के साथ नेत्रगोलक टुकड़े निकालें। एक में नेत्रगोलक अगर दुकान -20 बाद में उपयोग के लिए डिग्री सेल्सियस फ्रीजर। सूक्ष्म जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए, autoclaving और / या पराबैंगनी विकिरण से नेत्रगोलक नए नए साँचे बाँझ।
  4. PDMS नेत्रगोलक पर गोजातीय कॉर्निया की निगमन
    नोट:। इस प्रोटोकॉल पारेख एट अल से अनुकूलित किया गया है 14
    1. एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत विच्छेदन और बाँझ परिस्थितियों में गोजातीय कॉर्निया के समावेश को पूरा करें। आंखों के मोल और उसी दिन उन्हें काटना।
    2. 10 मिनट पहले का उपयोग करने के लिए पर प्रवाह हुड मुड़ें और 70% इथेनॉल शराब के साथ साफ करता। सुनिश्चित करें कि सभी सामग्री और उपकरणों 273 ° एफ / 45 मिनट के लिए 133 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving द्वारा बाँझ कर रहे हैं, और प्रवाह हुड के प्रवेश द्वार से कोई कम से कम 4 इंच तैनात हैं।
    3. एक बीकर 2 मिनट के लिए एक पतला povidone आयोडीन युक्त समाधान में गोजातीय आंख विसर्जित कर दिया। फॉस्फेट बफर खारा युक्त एक बीकर में आंख कुल्ला (पीबीएस) पीएच 7.4। संदंश का प्रयोग धीरे एक गिलास पेट्री डिश, कार्निया चेहरे पर नजर रखें।
    4. कुंद अंत विच्छेदन कैंची के साथ scleral लगाव अंक पर काटने से अतिरिक्त मांसपेशियों और वसा ऊतकों निकालें। पशु अपशिष्ट के लिए नामित एक बाँझ बीकर में अतिरिक्त ऊतक के निपटान के।
    5. सूक्ष्म कैंची का उपयोग करना, आंख से कंजाक्तिवा को हटा दें। बाँझ धुंध के साथ नजर लपेटें, किनारी से कम से कम 1 सेमी की दूरी बनाए रखने।
    6. एक छुरी का प्रयोग, किनारी क्षेत्र से लगभग 2 मिमी श्वेतपटल काटकर अलग कर देना और अल्पज्ञता इतनी के रूप में अंतर्निहित रंजित और कांच का शरीर के प्रवेश से बचने के लिए। ध्यान से अपने प्राकृतिक वक्रता से कॉर्निया विरूपण के बिना एक छुरी या विच्छेदन कैंची का उपयोग कर 360 डिग्री से चीरा विस्तार।
    7. ठीक संदंश के साथ, आंखों का कॉर्निया से हटा दें। संदंश का प्रयोग, ध्यान से किसी भी पालन uveal ऊतकों को हटाने और पीबीएस के साथ कॉर्निया कुल्ला।
    8. संस्कृति के साथ एक बाँझ कंटेनर में 31ºC पर कॉर्निया स्टोरमध्यम (मध्यम 199 के रूप में इस तरह के) 3% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त ऊतक नमी और सेल पोषण बनाए रखने के लिए।
    9. प्रयोग करने से पहले, PDMS नेत्रगोलक पर excised कॉर्निया बाकी है, और एक विशेष क्लिप पर के साथ एक साथ दो टुकड़े दबाना।

2. पलक-मंच

  1. डिजाइन और पलक-मंच का उत्पादन
    ध्यान दें: पलक-प्लेटफॉर्म तीन कार्यात्मक भागों से बना है: आंख मॉडल (खंड 1 में वर्णित), गियर प्रणाली, और इलेक्ट्रॉनिक प्रणाली।
    1. डिजाइन और सीएडी और 3 डी प्रिंटिंग, आंख मॉडल (धारा 1.1) के लिए वर्णित है कि इसी तरह का उपयोग कर झपकी मंच का निर्माण। डिजाइन गियर प्रणाली ऐसी है कि यह eyepieces के पार्श्व और बारी-बारी से गतियों में मोटर्स की साधारण रोटेशन अनुवाद। 15
    2. पंख काटना और गियर तंत्र का उपयोग करना, एक पंख काटना है, जो पलक टुकड़े से जुड़ा है के पार्श्व गति में एक stepper मोटर के घूर्णी गति अनुवाद करते हैं।
    3. का उपयोग करते हुएसाधना गियर प्रणाली, तीन अलग अलग नेत्रगोलक टुकड़े के लिए तीन (या अधिक) घूर्णी गतियों में एक stepper मोटर से एक घूर्णी गति बढ़ाना।
    4. दो गियर सिस्टम, पलक के लिए एक और नेत्रगोलक के लिए एक संरेखित है, ताकि दोनों के बीच दूरी लगातार कर रहे हैं। एक microcontroller, मोटर ढाल, और दो मोटर्स के साथ इलेक्ट्रॉनिक प्रणाली को इकट्ठा।
      नोट: घूर्णी मोटर्स, जो एक निमिष प्रस्ताव में गियर प्रणाली द्वारा अनुवाद किया है प्रदान करने के लिए दो stepper मोटर्स का प्रयोग करें।
    5. एक मोटर ढाल microcontroller पर खड़ी से मिलकर एक प्रणाली के साथ दो stepper मोटर्स कनेक्ट करें। कनेक्ट और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर उत्पादों के साथ काम करने के लिए कॉन्फ़िगर इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों।
    6. इस तरह के दौर प्रति मिनट (आरपीएम), आगे राउंड की संख्या, पिछड़े राउंड की संख्या, और निर्णायक शैली के रूप में सिस्टम मोटर मानकों को नियंत्रित करने के लिए कार्यक्रम।
      नोट: जानकारी के लिए अनुपूरक "Arduino कोड फ़ाइल" का संदर्भ लें।
    7. माँ से सिस्टम सॉफ्टवेयर डाउनलोडnufacturers 'वेबसाइट।
    8. सॉफ्टवेयर स्थापित करें और यह खुला। वांछित विन्यास में stepper मोटर्स नियंत्रित करने के लिए कोड लिखें। इतना है कि मोटर्स वांछित तरीके से कदम के रूप में शोधकर्ता द्वारा परिभाषित इलेक्ट्रॉनिक प्रणाली के सत्ता में एक स्रोत के साथ सिस्टम से कनेक्ट।
      नोट: अनुपूरक "Arduino कोड फ़ाइल" का संदर्भ लें।
  2. Microfluidics साथ विधानसभा (आर्टिफिशियल आंसू समाधान)
    1. संश्लेषित नेत्रगोलक और पलक टुकड़े लो और उन्हें आंख मॉडल के लिए उनके इसी क्लिप-ऑन पर पर्ची। ट्यूबिंग कि एक सिरिंज के साथ शामिल हो गए और पलक टुकड़ा (धारा 1.2.5) के साथ microfluidic पंप पर तैनात है कनेक्ट करें। परीक्षण मंच चलाने के लिए और लगातार आंदोलन के लिए जाँच करें।
    2. प्रधानमंत्री ट्यूबिंग और कृत्रिम आंसू समाधान (एटीएस) की एक सतत प्रवाह के लिए जाँच करें। एटीएस के लिए नुस्खा पहले से सूचित कर दिया गया है। 16
    3. मैन्युअल रूप से एक स्तर विमान पर एक साथ आंख मॉडल भागों ले जाते हैं, कि इस तरह के नेत्रगोलक और आंखढक्कन के संपर्क में हैं। वांछित मूल्यों को microfluidic पंप के प्रवाह की दर निर्धारित करें। 1-1.5 μl / मिनट के लिए शारीरिक प्रवाह की दर निर्धारित किया है। 17
    4. पंप और actuators शुरू प्रयोग शुरू करने के लिए। दवा वितरण प्रयोगों के लिए, नेत्रगोलक टुकड़े पर दवा युक्त संपर्क लेंस जगह है।
    5. प्रवाह के माध्यम से तरल पदार्थ एक 12 अच्छी तरह से थाली में ड्रिप करने की अनुमति दें। वांछित निर्धारित समय अंतराल पर, ऐसे यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी या प्रतिदीप्ति के रूप में आम तरीकों का पता लगाने का उपयोग कर analyte या दवा एकाग्रता यों। 1,4,18
    6. कॉन्टेक्ट लेंस पर आंसू घटकों के बयान के मूल्यांकन के अध्ययन के लिए, "नेत्रगोलक" टुकड़े पर संपर्क लेंस जगह है। प्रवाह के माध्यम से तरल पदार्थ है, जो खारिज किया जा सकता लीजिए।
    7. वांछित समय के अंतराल के बाद, नेत्रगोलक टुकड़े से संपर्क लेंस को हटा दें और ऐसे confocal माइक्रोस्कोपी के रूप में आगे के विश्लेषण के लिए लेंस तैयार करते हैं।

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Representative Results

संश्लेषित आंख मशीन की दुकान से और 3 डी प्रिंटिंग से प्राप्त नए नए साँचे चित्र 1 में दिखाया गया है। इन नए नए साँचे, ऐसे PDMS और agarose के रूप में पॉलिमर, की एक किस्म के साथ इस्तेमाल किया जा सकता वांछित गुणों के साथ eyepieces उत्पादन करने के लिए। एक microfluidic सिरिंज पंप के साथ नजर मॉडल मंच के motioned विधानसभा चित्रा 2 में दिखाया गया है। प्लेटफॉर्म में और बाहर पलक टुकड़ा की गति नेत्रगोलक टुकड़ा के रोटेशन, और पार्श्व के माध्यम से हवा के माध्यम से जोखिम यांत्रिक पहनते simulates। आंसू द्रव वांछित प्रवाह दर पर एक microfluidic पंप से पलक में संचार होता है, और प्रवाह के माध्यम से तरल पदार्थ एक 12 अच्छी तरह से थाली में एकत्र किया जा सकता है।

एक गोजातीय लेंस के विच्छेदन, और एक PDMS आईपीस पर बढ़ते के लिए प्रक्रिया में 3 चित्र में दिखाया गया है। अतिरिक्त ऊतकों आंख से अलग कर दिया और खारिज कर रहे हैं, हटाने के बादकंजाक्तिवा की। कॉर्निया को हटाने की किनारी के पास श्वेतपटल में एक चीरा के साथ शुरू होता है। चित्रा 4 है कि विभिन्न इन विट्रो विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता आईपीस की किस्म को दर्शाता है। घुड़सवार नेत्रगोलक दिखाए टुकड़े PDMS, अगर से संश्लेषित कर रहे हैं, और एक पूर्व विवो गोजातीय कॉर्निया एक PDMS नेत्रगोलक टुकड़े पर मुहिम शुरू की।

चित्रा 5 एक एंटीबायोटिक, moxifloxacin की रिहाई के मूल्यांकन के एक अध्ययन, सीएलएस से दर्शाया गया है। 18 जब पारंपरिक शीशी मॉडल में मापा जाता है, दवा रिहाई एक पठार को इनका अनुसरण पहले 2 घंटा के भीतर होता है। इसके विपरीत, उपन्यास आंख मॉडल से पता चलता है के लिए साइन अप करने के लिए 24 घंटा। 18 CLs पर कोलेस्ट्रॉल का जमाव के मूल्यांकन के एक अध्ययन में 6 चित्र में दिखाया गया है दवा रिहाई धीमी गति से और टिकाऊ होने के लिए। अध्ययन में कोलेस्ट्रॉल fluorescently NBD के रूप में टैग किया गया -cholesterol (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-YL-कोलेस्ट्रॉल), और deposition लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged किया गया था। परिणामों से संकेत मिलता है कि वहाँ काफी मतभेद हैं कि आंख मॉडल की तुलना में जब जमाव के अध्ययन के एक शीशी में प्रदर्शन कर रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. आईपीस नए नए साँचे। (ए) मशीन की दुकान से नेत्रगोलक टुकड़ा ढालना। (बी) 3 डी प्रिंटिंग से आँख ढक्कन ढालना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. इन विट्रो आंख का मंच। (ए) परिपत्र गति यांत्रिक पहनते simulates। (बी) के पार्श्व गति रुक-रुक कर हवा का उत्पादनअनावरण। (सी) पलक में आंसू द्रव अर्क। (डी) अच्छी तरह से थाली एकत्रित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. विच्छेदन और गोजातीय कॉर्निया का समावेश। (ए) अतिरिक्त ऊतक को हटाने के। (बी) कंजाक्तिवा का हटाया। (सी) किनारी क्षेत्र में चीरा। (डी) excised कॉर्निया संग्रहीत या एक PDMS आंख गेंद टुकड़े पर रखा जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. नमूना आईपीस। एक संपर्क लेंस, एक अगर आंख टुकड़ा है, और साथ PDMS आंख टुकड़ा का नमूना पूर्व vivo गोजातीय कॉर्निया मुहिम शुरू की आंख टुकड़ा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. दवा वितरण में इन विट्रो नेत्र मंच का उपयोग। से दैनिक डिस्पोजेबल कॉन्टेक्ट लेंस से moxifloxacin की रिहाई (ए) एक बड़ी मात्रा स्थिर शीशी और (बी) के आंख मॉडल विजन में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन से अनुमति के साथ (फिर से प्रिंट और नेत्र विज्ञान)। 18 सभी डेटा मतलब ± मानक विचलन के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 6 कोलेस्ट्रॉल बयान में इन विट्रो नेत्र मंच का उपयोग। Etafilcon ए, nelfilcon ए, nesofilcon ए, ocufilcon बी, ए delefilcon, somofilcon ए, narafilcon ए के एक पार अनुभाग दिखा Confocal छवियों में NBD कोलेस्ट्रॉल के साथ 4 घंटा ऊष्मायन के बाद शीशी और आंख मॉडल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर तीन महत्वपूर्ण कदम है कि विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है: डिजाइन और नए नए साँचे के उत्पादन (धारा 1.1), मंच विधानसभा (धारा 2.2.1-2.2.3), और प्रयोगात्मक रन की निगरानी (धारा 2.2.4-2.2.7 )। डिजाइन और नए नए साँचे (धारा 1.1) के उत्पादन के मामले में, नेत्रगोलक टुकड़ा एक मानव कॉर्निया के आयामों के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए। हालांकि, यह एक नेत्रगोलक टुकड़ा बनाया जा सकता है कि पूरी तरह से एक व्यावसायिक संपर्क लेंस (सीएल) फिट बैठता से पहले मोल्ड के कई प्रोटोटाइप आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, 250 माइक्रोन जरूरतों को बनाए रखा जा सकता है जब नेत्रगोलक और पलक टुकड़ा सुनिश्चित करने के लिए आंसू द्रव पूरे आंख मॉडल भर में सुचारू रूप से बहती है जब एक सीएल मौजूद है संपर्क में हैं। इस दूरी भविष्य पुनरावृत्तियों में बदला जा सकता है, लेकिन नहीं होना चाहिए कम से कम 150 माइक्रोन एक सीएल फिट करने के लिए पर्याप्त अंतर रखने के लिए अनुमति देने के लिए। मंच विधानसभा (धारा 2.2.1-2.2.3) सावधान ध्यान ऐसी है कि नेत्रगोलक और पलक टुकड़ा conta में आने की आवश्यकता हैझपकी प्रस्ताव के दौरान सीटी। आईपीस सही संपर्क में नहीं हैं, तो एक बंद पलक का अनुकरण और यांत्रिक मलाई विफल रहता है। ऑपरेटर कुछ चक्रों के लिए गति में मंच का पालन करना चाहिए कि यह सुनिश्चित करने के लिए दोनों नेत्रगोलक और पलक संपर्क में हैं, और के रूप में प्रोग्राम किया कि मलाई होता है। वर्तमान मंच एक महीने में लगातार चलाने के लिए तैयार है, लेकिन एक ऑपरेटर हमेशा हर 24 घंटा प्रणाली की स्थिरता पर जांच होनी चाहिए जब एक प्रयोग (धारा 2.2.4-2.2.7) चल रहा है। यह महत्वपूर्ण वर्तमान प्लेटफार्म एक के तापमान या नमी नियंत्रण अधिकारी नहीं है के रूप में, और इन मानकों में उतार चढ़ाव CLs सूख सकता है। यदि ऐसा होता है, एक नियंत्रित नमी और तापमान कक्ष के भीतर आंख मॉडल जगह है। इसके अलावा, दवा वितरण प्रयोगों के लिए, एकत्र प्रवाह के माध्यम से तरल पदार्थ का विश्लेषण या संग्रहीत कम से कम हर 2 घंटा नमूना के महत्वपूर्ण वाष्पीकरण से बचने के लिए किया जाना चाहिए।

वर्तमान में प्रस्तुत की दो सीमाएं हैंआंख मॉडल। पहले सीमा के आसपास के वातावरण के लिए जोखिम के संबंध में है। वर्तमान में, क्योंकि आंख टुकड़े एक नियंत्रित कक्ष में संलग्न नहीं कर रहे हैं, जैसे तापमान और कार्य क्षेत्र में नमी के रूप में परिवर्तन प्रयोगों के विभिन्न पहलुओं को प्रभावित करती है। उदाहरण के लिए, यदि पर्यावरण भी सूखा है, तो CLs को जल्दी सूखी और नेत्रगोलक टुकड़ा से अलग हो सकता है, या प्रवाह के माध्यम से तरल पदार्थ लुप्त हो सकता है। इस समस्या का समाधान करने के लिए, भविष्य पुनरावृत्तियों एक नियंत्रित तापमान और आर्द्रता चैम्बर में आंख मॉडल घर होगा। दूसरी सीमा जटिलता नेत्रगोलक टुकड़ा से संबंधित है। वर्तमान में, आईपीस, सरल कर रहे हैं या तो PDMS या agarose से मिलकर, जिनमें से न तो वास्तव में कार्निया सतह के गुणों का प्रतिनिधित्व करता है। भविष्य के काम आंख मॉडल जो करीब mimics कार्निया सतह संरचनाओं का निर्माण करने के लिए लक्ष्य होगा।

इन विट्रो में नेत्र अनुसंधान आम तौर पर इन विवो अनुसंधान करने के लिए पूर्ववर्ती परीक्षण के चरण के रूप में देखा जाता है। तथापि,यह महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि है कि अन्यथा vivo अध्ययन में अकेले से हासिल नहीं किया जा सकता है प्रदान करने को ध्यान में रखना है कि इन विट्रो शोध भी इन विवो आंकड़ों के पूरक हो सकता है महत्वपूर्ण है। अफसोस, वर्तमान परीक्षण CLs के लिए इन विट्रो मॉडल अल्पविकसित कर रहे हैं और कई प्रमुख घटक पर्याप्त रूप से इन विवो पर्यावरण की नकल करने की कमी है। उदाहरण के लिए, इन विट्रो सीएल अध्ययनों फॉस्फेट बफर खारा के 2-5 मिलीलीटर, 1-6 जो बहुत 7.0 ± 2 μl में शारीरिक आंसू की मात्रा अधिक हो जाती है युक्त शीशियों में प्रदर्शन कर रहे हैं। इसके अलावा 7, नेत्र पर्यावरण के दो महत्वपूर्ण कारकों, प्राकृतिक प्रवाह आंसू और निमिष पलटा, सरल स्थिर शीशी मॉडल से अनुपस्थित रहे हैं। पारंपरिक शीशी मॉडल की सीमाओं के शोधकर्ताओं द्वारा मान्यता दी गई है, और प्रयास नेत्र पर्यावरण अनुकरण विट्रो आंख मॉडल में अनूठा बनाने के लिए बनाया गया है, एक microfluidic आंसू आपूर्ति के घटक 2 सहित द्वारा0-24 और / या रुक-रुक कर हवा जोखिम। 25,26 आश्चर्य नहीं कि इन प्रयोगों से उत्पन्न परिणामों पारंपरिक शीशी मॉडल के साथ प्राप्त उन लोगों की तुलना में बहुत अलग हैं, और अधिक बारीकी से इस प्रकार विवो डेटा में समान हो सकता है। 20-25, एक विकासशील इन विट्रो आंख मॉडल में जटिल जांच करने के लिए CLs सतह नेत्र लेंस के साथ सामग्री की बातचीत पर नए अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और नई सामग्री और आने वाले दशकों में CLs के लिए नए अनुप्रयोगों के विकास की सुविधा में मदद मिलेगी।

बेशक, इन विट्रो आंख मॉडल की सबसे अधिक बहस पहलुओं में से एक आंख एक अनंत सिंक, जो विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जब यह CLs से दवा वितरण के लिए आता है जैसा दिखता है कि क्या है। अनंत सिंक शर्तों के तहत, आसपास के समाधान की मात्रा दवा संतृप्ति मात्रा की तुलना में काफी अधिक है, कि इस तरह की दवा जारी दवा की घुलनशीलता से प्रभावित नहीं है। एक acce रूप शीशी के लिए 27 अधिवक्ताओंptable आंख मॉडल का तर्क है कि कॉर्निया, कंजाक्तिवा, और एक अनंत सिंक के रूप में नेत्र ऊतकों को एक साथ समारोह के आसपास। सिद्धांत रूप में यह सच हो सकता है, दवा पहले आंसू द्रव में भंग करना चाहिए। यह दर सीमित कदम की संभावना एक सिंक स्थिति नहीं है, और दोनों आंसू मात्रा पर निर्भर हो सकता है और प्रवाह के रूप में हमारे मॉडल के आधार पर नकली होगा।

प्रस्तुत मॉडल की अनूठी पहचान आंसू फिल्म का अनुकरण करने की क्षमता में निहित है। एक दो टुकड़ा डिजाइन, एक "कार्निया / scleral" नेत्रगोलक खंड और एक "पलक" अपनाकर यह नेत्रगोलक टुकड़ा भर आंसू फिल्म के एक समान रूप से फैला पतली परत बनाने के लिए जब दोनों टुकड़ों संपर्क में आने के लिए संभव है। आगे सतह नेत्र अनुकरण करने के लिए, यांत्रिक पहनते हैं और हवा जोखिम दो यांत्रिक actuators के माध्यम से मॉडल में शामिल किया है। पलक टुकड़ा laterally बढ़ता रहता है, यह आंख और रुक-रुक कर हवा जोखिम के समापन simulates। नेत्रगोलक की रोटेशन यांत्रिक पहनते ड्यूरिन उत्पादित simulatesजी निमिष। प्रणाली एक microfluidic पंप, जो एक शारीरिक प्रवाह दर पर आंसू द्रव या किसी अन्य वांछित प्रवाह की दर के साथ नजर मॉडल रहता साथ युग्मित है। आंसू फिल्म हर बार दो टुकड़े संपर्क में आने का गठन किया है, और आंसू ब्रेक अप होता है जब दो टुकड़े अलग।

उद्देश्य विभिन्न इन विट्रो विश्लेषण के लिए CLs मूल्यांकन करने के लिए एक सार्वभौमिक परीक्षण मंच तैयार करना है। आदेश बहुमुखी होने के लिए, नेत्रगोलक टुकड़े ऐसे polydimethylsiloxane के रूप में विभिन्न पॉलिमर, (PDMS) या अगर से संश्लेषित किया जा सकता है। सरल नेत्र अध्ययन के लिए, इन पॉलिमर, जो क्रमश: हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक सतहों प्रतिनिधित्व करते हैं, पर्याप्त होगा। हालांकि, के रूप में और अधिक जटिल विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं, उदाहरण के नेत्र दवा पैठ या विषाक्तता के अध्ययन के लिए, आंख टुकड़े आगे संशोधित करने की आवश्यकता होगी। इस तरह के एक पूर्व vivo कॉर्निया के रूप में दिखाया के शामिल किए जाने के रूप में मॉडल के लिए इन अतिरिक्त संशोधनों, अपेक्षाकृत संभव है। हालांकि, आगे के अध्ययन के सत्यापनआवश्यक हैं, और भविष्य के काम में विवो मॉडल के साथ तुलना करके इस मॉडल की वैधता में सुधार करना होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों उन्नत नेत्र सामग्री के विकास के लिए हमारे धन स्रोत NSERC 20/20 नेटवर्क को स्वीकार करना होगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) Adafruit 50 Board
Stepper motor Adafruit 324 Motor and Motor shield
Equal Leg Coupler 1.6mm 1/16" VWR CA11009-280 50 pcs of tube connector
Tubing PT/SIL 1/16"x1/8" VWR 16211-316 Case of 50feet
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation
Agarose, Type 1-A, low EEO Sigma-Aldrich A0169-25G
PHD UltraTM Harvard Apparatus 703006 MicroFluidic Pump
Bovine cornea Cargill, Guelph/ON
Soldidworks Dassault Systemes Software
3-D printing University of Waterloo - 3D Print Centre
Dissection tools Fine Science Tools General dissection tools
Medium 199 Sigma-Aldrich Culture medium storage for cornea
Fetal bovine serum Thermo Fisher Add to culture medium, 3% total volume

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References

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Phan, C. M., Walther, H., Gao, H., Rossy, J., Subbaraman, L. N., Jones, L. Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses. J. Vis. Exp. (110), e53907, doi:10.3791/53907 (2016).

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