Abstract
뇌 세포 등 뉴런, 아스트로 사이트, 올리고 덴드로 사이트, 희소 돌기 아교 세포 전구체와 미세 아교 세포의 종류에 유전자 발현의 검출은, 면역 특이 일차 또는 이차 항체의 부족에 의해 방해 될 수있다. 여기에서는 제 유전자에 의해 코드되는 단백질에 대해 지시 높은 특이성 항체로 면역 염색 한 다음 두 개의 유전자 특이 적 프로브 계내 혼성화 더블 형광을 사용하여 같은 뇌 섹션 세 가지 유전자의 발현을 검출하는 프로토콜을 기술한다. Aspartoacyclase (ASPA) 유전자의 돌연변이가 드문 인간의 백질 질환으로 이어질 수 - Canavan 질환은 - 희소 돌기 아교 세포 및 미세 아교 세포에 있지만 성상 세포 및 신경 세포에서 발현되는 것으로 생각된다. 그러나, 뇌에서 ASPA의 정확한 발현 패턴이 확립되어야한다. 이 프로토콜은 ASPA 성숙 희소 돌기 아교 세포 (a)의 부분 집합으로 표현되어 있는지 결정하기 위해 우리를 허용 한ND는 일반적으로 유전자 발현 연구 패턴의 넓은 범위에 적용될 수있다.
Introduction
중추 신경계 (CNS)에서 가장 풍부한 세포 인 아교 세포, 희소 돌기 아교 세포 (CNS의 myelinating 세포), 올리고 덴드로 사이트 전구체 (또한, "NG2 세포"라고도 OPS), 성상 세포 및 미세 아교 세포를 포함한다. 신경 질환 1 아교 세포의 잠재적 역할의 기능에 관심이 증가하고있다. 예를 들어, Canavan 질환 (CD)는 일반적으로 나이 2,3 10 년 전에 사망에 이르는 초기 해면상 leukodystrophy과 뉴런의 진보적 인 손실과 초기 단계에서 시작하는 유전 신경 퇴행성 질환이다. 리드 Aspartoacyclase (ASPA) 유전자의 돌연변이가 크게 CD에 ASPA 활동 (4)를 감소하기 위해이 확인되었다. ASPA는 N-acetylaspartate (NAA)의 탈 아세틸 화를 촉매 작용하는 효소, 높은 뇌에서 농축 분자 생성 아세테이트 및 아스파 5-7이다. 많은 CD 환자 인해 ASPA 교류 부족 NAA 높은 수준을 보여tivity. 일부 연구 NAA 파생 아세테이트 개발 과정에서 지방산 / 뇌 지질의 주요 원인이 될 수 있고 -3,5,6- 세분화 할 NAA의 실패로 인한 개발 기간 동안 수초 합성을 감소에서 CD가 발생할 수 있음을 추측.
ASPA는 주로 뇌의 신장, 간, 흰색 만에 발견하고, CD에 ASPA의 중요한 역할을 주어 뇌에서이 효소의 세포 발현은 여러 실험실에 의해 연구되고있다. 뇌의 ASPA의 효소 활성을 조사하여 이전 연구는 두뇌 개발하는 동안 ASPA 활동의 증가가 수초 8 ~ 10 시간 과정 평행 한 것으로 나타났습니다. 세포 수준에서 효소 활동뿐만 아니라 현장 하이브리드 (ISH) 및 면역 조직 화학 (IHC)의 분석은 ASPA는 주로 뇌에 있지만 뉴런 또는 성상 세포 11-16에서 희소 돌기 아교 세포로 표현하는 것이 좋습니다 분석. 몇몇 연구는 발견 ASPA는 수도중추 신경계 (12, 14)의 미세 아교 세포에서 발현 될 수있다. OPS에서 ASPA 식에 지금까지 데이터는 제한되어 있습니다. 신경 세포, 성상 세포, OPS, 새로 형성된 희소 돌기 아교 세포, myelinating 희소 돌기 아교 세포, 미세 아교 세포, 내피 세포 및 혈관 주위 세포를 포함하는 마우스 대뇌 피질의 다른 세포 유형의 전 사체는 RNA 시퀀싱 (17)에 의해 분석 하였다 최근의 연구에 따르면, ASPA는 독점적으로 희소 돌기 아교 세포로 표현된다 , 희소 돌기 아교 세포를 myelinating에서 특히 (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). 뇌의 ASPA 발현 패턴이 연구에도 불구하고, 불확실성이 남아있다.
다른 기술은 유전자 발현 패턴을 연구하는데 사용될 수있다. IHC는 조직 절편의 유전자 발현 기능성 제품 (즉, 단백질)을 검출하기위한 일반적으로 사용되는 방법이다. 해당 응용 프로그램과 특이성이 될 t만큼의 큰 유틸리티에도 불구하고,이 기술은 한계가있다필요한 항체의 가용성 특이 O. 대조적으로, ISH는 mRNA의 수준에서 어떤 유전자의 발현을 표시 할 수 있다는 이점을 갖는다. 그러나, 특정한 세포 유형으로 유전자 발현을 지역화 위하여 동시에 여러 개의 프로브를 사용하는 것이 기술적으로 어려울 수있다. 이 글에서, 우리는 단백질의 형광 immunolabelling와 현장 하이브리드 이중 형광 RNA를 결합하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 마우스 뇌 ASPA의 발현 패턴을 조사하는 기술이 세트를 사용 해왔다. 이 방법은 공 촛점 현미경을 사용하여 유전자 발현의 정확한 연구를 허용한다.
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Protocol
윤리 정책 :
마우스 사육 및 처리는 동물 (과학적인 절차) 영국 및 그 개정 규정 2012 년 법 1986 준수, 영국 홈 오피스 규정 및 UCL 윤리위원회의 지침에 따라 있습니다.
참고 : 모든 솔루션은 디 에틸 피로 카보네이트 (DEPC)로해야한다 - 잔류의 RNase를 파괴 처리 된 물. 모든 DEPC의 구체 후 사라진 DEPC를 저하 오토 클레이브 때까지 DEPC 처리의 경우, DEPC (리터 당 1 ml)에 추가 격렬하게 흔들어.
1. RNA 프로브 합성
- 주의 : 포름 아미드를 취급 할 때, 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하고 안전 캐비닛을 사용합니다. 혼성화 버퍼를 준비 : DEPC 처리 한 50 % (v / v)의 탈 포름 mM 트리스 - 염산 pH를 7.5 200 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA, 10과 탈 이온수를 5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 5 mM의 나 2 HPO 4 0.01 ㎎ / ㎖ 효모의 tRNA, 1 × 덴 하르트의 soluti에서 10 % / V 덱스 트란 설페이트 w
- RNA 폴리머 라제 프로모터를 가진 플라스미드 관심의 유전자의 cDNA 서열을 포함하는 DNA 클론을 선택한다. 이 예를 들어, ASPA을위한 T7 및 SP6 RNA 중합 효소 프로모터 (보충 그림 1)과을 pCMV-SPORT6 클론, IRAVp968C0654D (젠 뱅크 accessionBC024934)를 사용합니다.
- 템플릿으로 선형화 된 플라스미드 DNA를 준비합니다.
- 는 DNA의 복제를 성장 T7 및 SP6 범용 프라이머와 제조 업체의 프로토콜과 순서에 따라 소규모 플라스미드 정제 키트와 플라스미드를 추출합니다.
- cDNA에의 센스 가닥의 5 '말단에서 절단하는 제한 효소로 1,020 μg의 플라스미드 DNA를 소화. 이 예를 들어,을 pCMV-SPORT6- ASPA 플라스미드를 소화 100 단위 샐 I를 사용합니다. 37 오 ℃에서 1.5 시간 동안 품어
- 플라스미드가 완전히 선형화되어 있는지 확인하는 아가 로스 젤에 작은 나누어지는을 실행합니다.
- 정화페놀 - 클로로포름을 사용하여 선형화 된 플라스미드.
- 3 M 아세트산 나트륨 1/10 부피, 10 mM 트리스 염산 (PH 8.0)의 하나의 볼륨 추가 - 평형화 페놀 및 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (IAA)의 하나의 볼륨 (24 : 1).
- (- 25 ° C, RT 20) 및 추출 상 수상을 실온에서 1 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기.
- 1 분 동안 16,000 XG에 클로로포름 / IAA, 원심 분리기의 하나의 볼륨을 추가하고 위 수상의 압축을 풉니 다.
- 단계를 반복 1.4.3.
- 에탄올 2 볼륨을 추가하고 1 시간 또는 O / N -20 ℃로 둡니다.
- 10 분 동안 4 ° C에서 16,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
- 70 % 차가운 에탄올로 펠렛을 씻고 TE 2.5 μL 당 approximatively 1 μg의 cDNA를 (10 mM 트리스 - 염산, 1 mM의 EDTA의 pH 7.5)에 다시 일시 중지합니다.
- 두 개의 프로브, 디곡시 제닌 (DIG) 표지 하나 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC)와 다른 합성.
- 안티 SE 있도록 적절한 RNA 폴리머 라제를 선택(대상의 mRNA와 상보) NSE 프로브. 이 예 ASPA 프로브를 만들기 위해 T7의 RNA 폴리머 라제를 사용한다.
- 시험 관내 전사 반응을 준비 : 1 선형화 된 DNA의 μg의 4.0 μl를 5 × 전사 버퍼, 100 mM의 DTT의 6.0 μL, 10 배 DIG 또는 FITC RNA 라벨 믹스 포함 된 dNTP 2.0 μL, 1 μL RNA 분해 효소 억제제, 20 추가 - (40) RNA 중합 단위; DEPC 처리 된 물 20 μL에 최종 볼륨을 구성합니다.
- 1.5 시간 동안 37 ℃로 품어.
- 1.0 % 아가로 오스 겔상에서 전사 반응 Run1로 μL 반응이 작동되었는지를 확인한다. 겔은 선형 템플릿과 프로브의 밝은 밴드를 표시해야합니다.
- 하이브리드 버퍼 100 μL에 볼륨을 확인하고 -80 ° C에서 10 μL 씩 저장합니다.
2. 관류, 고정 및 조직 컬렉션
- 주의 : (PFA) 파라 포름 알데히드를 처리 할 때 모두 고체 및수성은, PPE를 착용하고 안전 캐비닛을 사용합니다. 열 (55 ° C)를 이용하여 PFA로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 용액 (V / W) 4 % 포름 알데히드를 용해시켜 용액을 제조 하였다. 여과지와 포름 알데히드 용액을 필터.
- 증류수에 자당 (/ V W) 20 %를 용해하여 자당 솔루션을 준비하고 0.1 % (v / v)의 DEPC 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 느슨한 뚜껑 후 오토 클레이브에 실온에서 O / N를 남겨주세요.
- 펜토 바비 말단의 복강 내 주사 (50 ㎎ / ㎏)하여 마우스를 마취시키다. 발가락 핀치함으로써 마취 깊이를 평가하고 움츠림 반사가없는 깊은 마취를 나타낸다.
- 마우스가 깊은 마취되면, 흉곽 아래에 절개를하고 양쪽의 갈비뼈를 절단, 심장을 노출 들어 올립니다.
- 심장의 좌심실로 25 G 바늘을 삽입합니다. 심장의 우심방에있는 작은 절개를합니다.
- 20 ml의 PBS로 동물 다음 40 ml의 포름 알데히드 용액을 관류. P30 세 이상마우스, 12 ㎖ / 분의 재관류 속도를 사용하지만 어린 동물 낮은 비율 용도 (7 - 10 ㎖ / 분).
- 뇌를 해부하다.
- 귀에서 컷 후방을하여 수술 가위로 마우스 머리를 절단. 피부에 꼬리 정중선 절개를하고 두개골에서 피부를 제거 rostrally 작동합니다.
- 꼬리 부분에서 시작, 중간 선을 따라 두개골의 상단을 통해 아이리스 가위로 눈 사이에 잘라. 뼈 플레이트의 한면마다 기울 족집게로를 끼워 두정엽과 전두엽 뼈 플레이트를 제거합니다.
- 조심스럽게 핀셋 앞쪽 부분에서 위쪽으로 머리를 기울 시신경 및 기타 두개골 신경을 잘라. 부드럽게 두개골에서 뇌를 들어 올립니다.
- 마우스 관상 뇌 매트릭스에 두뇌를 놓습니다. 깃털 면도날 3 약 4mm 조각으로 뇌를 슬라이스.
- 4 % PFA 솔루션에 슬라이스를 전송하고 4 ° C에서 O / N을 품어.
- 전송 뇌조각-DEPC 처리 20 %에게 자당 용액을 4 ℃에서 O / N을 배양하기
- 마른 cryomould에 각각의 뇌 조각을 배치, 최적의 절삭 온도 OCT () 매체를 둘러싸고 드라이 아이스에 고정. -80 ° C에서 보관하십시오.
3. 냉동 절편
- 그라 이오 스탯에 냉동 조직의 15 μm의 섹션을 잘라 현미경 슬라이드에 섹션을 수집합니다. 필요한 경우, DEPC 처리 된 PBS로 섹션을 적시고 미세 페인트 브러시로 평평.
- 조직 슬라이드에 부착되도록 약 1 시간 동안 건조 슬라이드를 둡니다.
4. 하이브리드
- 65 ° C의 세척 완충액 준비 : 150 mM의 염화나트륨을, 15 mM의 나트륨 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1X 식염수 시트르산 나트륨), 50 % (V / V) 포름 아마이드, 0.1 % (v / v)의 Tween- 20.
- 100 mM의 말레 산, 150 mM의 NaCl을, 0.1 % (v / v)의 트윈 20, pH가 7.5 : MABT 버퍼를 준비합니다.
- DIG 표지 및 FITC - 라벨 씨 (두 개의 프로브를 희석d)에 하이브리드 버퍼에 1 / 1,000 65 ° C로 미리 예열 잘 섞는다.
- 각 슬라이드, coverslipwith 오븐에서 구운 (200 O를 C) 커버 슬립에 하이브리드 혼합물의 약 300 μl를 적용하고 가습 챔버에서 65 ° C에서 O / N을 품어.
- 미리 예열 세척 버퍼를 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 전송합니다. 세척 버퍼와 65 ° C에서 두 번 30 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
- RT에서 10 분 동안 MABT로 3 회 슬라이드를 씻으십시오.
FITC 프로브의 5 시각화
- ISH 블로킹 버퍼를 준비한다 MABT을 2 % 차단 시약, 10 % 열 - 불 활성화 된 혈청 양.
- 옵션 : 필요한 항체 용액의 부피를 감소하기 위해 슬라이드의 조직 섹션 주위 원을 그리 소수성 펜을 사용한다.
- ISH는 가습 챔버에서 버퍼를 차단하여 실온에서 1 시간 동안 슬라이드를 품어.
- 고추 냉이 퍼 옥시 다제 4 ° C (POD)에서 슬라이드 O / N을 품어 - 공액D 항 FITC 항체는 1/500 (v / v)로 ISH에 차단 버퍼를 희석.
- 0.1 % (v / v)의 트윈 20 (PBST)와 PBS를 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 놓습니다. 때마다 PBST에서 10 분간 3 회 세척하고 신선한 PBST로 교체합니다.
- 즉시 사용하기 전에 증폭 희석제로 100 배 희석하여 형광 tyramide을 준비합니다. 이 예를 들어, FITC-tyramide를 사용합니다.
- 슬라이드에이를 추가하고 실온에서 10 분 동안 둡니다.
- 코 플린 항아리에 슬라이드를 놓고 10 분 동안 PBST로 3 회 씻는다.
발굴 프로브 6. 시각화
- 0.1 M 트리스 염산의 pH 8.2을 준비합니다.
- 실온에서 1 시간 동안 ISH 차단 버퍼와 슬라이드를 품어.
- 알칼리 포스파타제 (AP)와 4 ° C에서 슬라이드 O / N을 품어 희석 1 / 1,500 (v / v)로 ISH에 차단 버퍼 항 DIG 항체를 π 공역 계.
- 10 분 3 회 MABT로 씻으십시오.
- RT에서 5 분 동안 0.1 M 트리스 - 염산 pH를 8.2로 두 번 씻으십시오.
- 즉시 사용하기 전에, 0.1 M 트리스 산도 8.2의 정제를 용해하여 빠른 레드 용액을 제조. 0.22 μm의 필터를 통해 솔루션을 필터링합니다.
- 가습 실에서 빠른 레드 용액으로 37 ° C에서 슬라이드를 품어. 최적의 발전을위한 시간 변화에 따라, 침전물의 형성을 모니터링하는 형광 현미경 슬라이드를 정기적으로 확인한다. 3 시간 - 예를 들어,이 후, 반응을 중지.
- 10 분 3 회 PBST로 세척.
7. 면역 조직 화학
- IHC 차단 버퍼를 준비 : 10 % PBST에 (차 항체 호스트에 다른 종의) (v / v)의 혈청을.
- IHC는 습한 챔버에서 RT에서 1 시간 동안 블로킹 완충액으로 슬라이드 부화.
- 차 항체를 준비 : (주 항체 호스트에 다른 종의) 5 % 혈청 PBST에 적절한 희석에 차 항체를 희석. 예를 들어, 1/400 (v / v)로 희석의 토끼 항 - Olig2 항체를 사용한다.
- 4 ° CO / N의 차 항체 용액에 품어.
- 10 분 3 회 PBST로 세척.
- 차 항체를 준비 :이 예를 들어 0.1 % (v / v)의 훽스트 33258. (다른 차 항체 호스트 종) 5 % PBST에 적절한 희석 (v / v)의 혈청을 형광 접합 된 이차 항체를 희석 1 / 1,000 (v / v)로 희석 차 항체 Alexa647 당나귀 항 - 토끼를 사용합니다.
- 1 시간 동안 RT에서 이차 항체 용액에서 인큐베이션.
- 10 분 3 회 PBST로 세척.
8. 실장
- 부분적으로 실온에서 슬라이드를 건조하고, 형광 설치 매체를 탑재합니다. 빠른 레드 570 nm의, FITC에 대한 488 nm의, Olig2의 immunolabelling에 대한 647 nm의 훽스트 350 나노 미터 : 10 배에서 공 초점 현미경 다음, 20X 다음 여기 파장과 4 개의 채널을 사용하여 63X 목표를 이미지를 건조하고 슬라이드를 남겨주세요 .
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Representative Results
이 문서에서는 마우스의 뇌 부분에서 immunolabelling 다음에 이중 형광 ISH하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 간단한 설명은 첫 번째 단계는 ASPA 및 MBP (마이 엘린 기초 단백질)에 대한 특이 프로브를 합성 하였다도 1에 도시되어있다. 프로브가 합성되었다는 것을 확인하려면, 각 반응의 작은 나누어은 아가로 오스 겔에서 실행되었다. 희미한 선형 주형 및 RNA 프로브 다량 (도 2)을 볼 수있다. Olig2의 immunolabelling 및 훽스트 (Hoechst) 핵 염색 한 다음 ASPA와 MBP에 대한 이중 형광 ISH는, 마우스의 뇌 부분에서 수행되었다. 우리는 공 초점 레이저 주사 현미경 뇌 섹션을 스캔하고, 뇌에서의 유전자 발현 신호의 분포를 나타 내기 위해 함께 이미지를 스티칭. ASPA 식을 MBP의 양성에서 MBP (+) 세포 브래지어 걸쳐 관찰 (그림 3)에서. 우리는 또한 더 높은 배율을 사용하여 서로 다른 뇌 구조에 ASPA 발현을 조사 하였다. 피질과 코퍼스의 callosum에서 희소 돌기 아교 세포의 ASPA 식. 그림 4 MBP, Olig2의 공동 현지화를 표시하고, ASPA는 ASPA는 피질과 뇌량 (그림 4)에서 성숙 희소 돌기 아교 세포의 부분 집합으로 표현되어 있음을 나타냅니다. 이러한 결과는이 프로토콜 동시에 뇌 부분에서 세 가지 유전자의 발현을 검출 할 수 있음을 보여준다.
원위치 하이브리드 화에서 더블 형광 그림 1. 프로토콜 면역 염색 하였다.이 프로토콜 5 일 동안 실행되며 세 가지 유전자의 발현을 검출한다./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 아가로 오스 젤. 선형 템플릿과 관찰 할 수있는 작은 분자량의 RNA 프로브의 많은 양에 ASPA RNA 프로브 2. 시험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마우스 뇌 섹션에서 ASPA와 MBP에 대한 현장 하이브리드 그림 3. 두 형광. ASPA (빨간색) 및 MBP (녹색)의 분포를 보여주기 위해 함께 물렸다했다. 스케일 바 :. 500 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
코어 텍스과 코퍼스의 callosum에서 희소 돌기 아교 세포의 ASPA 그림 4. 식입니다. 패널이 Olig2 (파란색)의 면역 염색 한 다음 ASPA (빨간색) 및 MBP (녹색)에 대한 ISH 대표 이미지를 표시 훽스트 염색. ASPA과 함께 몇 가지로 표현 하였다 MBP + / Olig2 + 세포 피질 (A와 B)과 뇌량의 (C와 D). M BP + / Olig2 + / ASPA + 화살표와 MBP + / Olig2 + / ASPA로 표시됩니다 세포 - 세포가 확대 패널 (B와 D)에 화살촉으로 표시됩니다. 스케일 바 : 100 μm의 (A 및 C); 20 μm의 (B와 D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1. 시퀀스와 ASPA 클론지도 (IRAVp968C0654D). ASPA 1.5KB의 cDNA의 서열을 pCMV-Sport6 플라스미드 (A) 내로 삽입 하였다. 을 pCMV-Sport6-ASPA 플라스미드 맵은 (B)에 도시한다.m / 파일 / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 면역 염색 한 다음 현장 하이브리드의 이중 RNA에 대한 단계별 절차를 제공합니다. 우리는 ASPA 여러 뇌 영역에서 성숙한 희소 돌기 아교 세포에서 발현되는 것을 확인하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다.
이러한 다단 과정은 감도 영향을 미칠 수 있으므로 피해야한다 함정 많은 가능성이있다. 먼저, 전사 반응을위한 모든 솔루션 및 저장 버퍼의 RNase 부담 할 필요가있다. 둘째, cDNA를 템플릿의 선택은 중요하며 우리는 길이 약 1킬로바이트 템플릿을 선호합니다. 그것은 페놀 / 클로로포름 추출과 cDNA를 템플릿 정리 할 필요가 시험 관내 전사 전에 재를 침전. 또한, 프로브의 전사를 최적화 할 필요; 프로브가 충분한 양으로 생성되지 않은 경우, ISH의 품질을 감소시킬 것이다. 프로브의 품질을 아가 로스 겔에 검사에 의해 확인 될 수 있고, 양질 것템플릿 대역 (도 2)와 비교하여 상기 프로브 대역의 강한 휘도 입증. 더블 ISH를 들어, 두 개의 다른 레이블이 프로브는 일반적으로 DIG로 표지 하나 FITC와 다른 사용된다. FITC 표지 된 프로브가 상기 검출 될 대상의 mRNA은 조직 내 최고 일 것으로 예상되는 위치를 선택해야 여겨진다. 이 프로브는 일반적으로 현상 제 및 DIG 표지 된 프로브는 두 번째 현상된다.
다른 중요한 단계는 티슈 제조된다. 마우스가 4 % PFA 다음 DEPC 처리 된 PBS로 관류하는, 4 % PFA O / N에 고정 후 다음 잔류의 RNase를 파괴하는 DEPC 처리 된 20 %의 자당 솔루션 cryoprotected. 고정 시간은 매우 중요하다 과다 또는-고정 인해 mRNA의 (아래-고정)의 감소 프로브 (오버 고정) 침투 또는 성능 저하에 아마, 약한 신호로 이어질 수 있습니다. 조직은 다음 저온 절단하고,이 프로브는 N / O를 하이브리드된다. 포름 아미드혼성화 완충액에 사용되는 탈 이온화되어야한다. 이 감도를 손상시킬 수로 65 ℃에서 O / N에서 하이브리드 화 동안 매우 중요한 고려 사항은 혼성화 혼합물을 증발 및 농축을 방지하는 것이다. 실험에서는 65 CO / N에서 하이브리드 화를 수행 설명하지만, 대상의 mRNA를 검출하기 어려운 것으로 나타나는 경우에 다른 프로브 저온 시도 가치가있을 것이다.
혼성화 된 프로브를 검출하기위한 시약의 선택이있다. 빠른 레드 민감한 형광 시약하지만 빠른 레드의 모든 배치는 동일한 결과를 제공합니다. 그것은 개발을위한 AP를 필요로하고 로다 민 여기에 형광을 제공합니다. 우리의 경험에서, 0.1 M 트리스 - 염산 pH가 8.2이 신선하고 사용하기 전에 필터링하는 것이 중요합니다. 비 형광 옵션은 니트로 블루 테트라 졸륨 (NBT) 및 그 AP 공역 항체 일, 5- 브로 모 -4- 클로로 -3'- indolyphosphate (BCIP)으로 발색한다. 아노THER 옵션은 검출을위한 형광 tyramide를 사용합니다. 형광 tyramide 시스템은 가장 민감한 방법은 아니지만, 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제와 현상 반응이 매우 신속하고 적어도 세 가지 색 형광 사용될 수있다 (FITC, 시아닌 3 및 시아닌 5)이있다. 이 프로토콜의 제한은 일부 대상 항원 (또는 항원 결정기), 특히 낮은 풍부한 단백질의 ISH 처리 후 검출되지 따라서 ISH 후 IHC에 적합하지 않습니다 수 있다는 것이다. 우리의 면역 염색에서 Olig2의 항체 검출은 영향을받지 나타납니다. 사용자는 다음 ISH를 immunolabelling에 적합한 항체를 선택해야합니다.
IHC와 ISH는 일반적으로 유전자 발현 패턴 연구를위한 기술을 사용하고 있으며, 모두 장단점이있다. IHC는 뇌 부 유전자의 세포 발현을 검출하기위한 민감한 방법이지만 항체에 대한 의존도는 특이성에 영향을 주며 그 응용을 제한한다. 대조적으로, ISH 높은 사양을 가지고ificity 어떤 유전자의 프로브를 쉽게 템플릿으로 특정 유전자의 cDNA를 사용하여 시험 관내 전사에 의해 합성 할 수있다. 우리가 개발 한 프로토콜은 높은 특이성 유전자 발현의 삼중 검출을 달성하기 위해 IHC와 더블 ISH을 결합, 두 가지 방법을 이용합니다.
즉, 우리는 여기에 설명되는 프로토콜은 두개의 mRNA 및 단백질의 한 동시 염색이 가능하므로 공동 국부 유전자 발현을 설명하기위한 유용한 도구를 제공한다. mRNA 발현이 항상 단백질 발현과 연관되지 않는다는 사실에도 불구하고, ISH 우리가 높은 특이성으로 유전자 발현을 조사 할 수있는 강력한 기술이다. IHC 결합 이중 형광 ISH 우리 프로토콜 성체 마우스의 뇌 조직에서 희소 돌기 아교 세포의 서브 세트에 ASPA 발현 검출에 성공을 입증하였으며, 이는 쉽게 다른 기원 및 발달 단계의 다양한 조직에 적합 할 수있다. 또한,이 프로토콜또한 miRNA를 작게의 RNA의 발현을 검출하기 위해 사용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100 mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65 °C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1,500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22 µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1,000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
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