Abstract
Обнаружение экспрессии генов в различных типах клеток головного мозга , например, нейроны, астроциты, олигодендроциты, олигодендроцитов и микроглии предшественников, может быть затруднено из - за отсутствия конкретных первичных или вторичных антител для иммунологического окрашивания. Здесь мы опишем протокол для определения экспрессии трех различных генов в той же секции головного мозга с использованием двойной флуоресценции в гибридизация с двумя геноспецифических зондов с последующим иммунным окрашиванием с антителом высокой специфичностью , направленной против белка , кодируемого геном третьего. Aspartoacyclase (ООРА) генов, мутации которых могут привести к редкой человеческой болезни белой материи - болезнь Канавана - Считается , что выражается в олигодендроцитов и микроглии , но не в астроциты и нейроны. Тем не менее, до сих пор не установлена точная картина экспрессии ASPA в головном мозге. Этот протокол позволил нам определить, что ООРА выражается в субпопуляции зрелых олигодендроцитов ае он может быть как правило, применяется к широкому спектру исследований характера экспрессии генов.
Introduction
Глиальные клетки, которые являются наиболее распространенными клеток в центральной нервной системе (ЦНС), включают в себя олигодендроцитов (в myelinating клетки центральной нервной системы), олигодендроциты предшественники (OPS, также известные как "NG2 клетки"), астроциты и микроглии. Существует растущий интерес к функции глиальных клеток и их потенциальной роли в неврологических заболеваний 1. Например, болезнь Канавана (CD) является наследственным нейродегенеративным заболеванием начиная с раннего детства с губчатой Leukodystrophy и прогрессирующей потерей нейронов, что приводит к смерти , как правило , до 10 лет , 2,3. Мутации в гене Aspartoacyclase (ООРА) , которые приводят к значительно сниженную активность ASPA 4 в КР были идентифицированы. ООРА представляет собой фермент , катализирующий деацетилирование N-ацетиласпартата (НАА), молекула высоко концентрированным в головном мозге, генерируя ацетат и аспартат 5-7. Многие пациенты CD показывают более высокие уровни NAA из-за отсутствия ООРА переменного токательность. Некоторые исследования предполагают , что НАА полученный ацетат может быть основным источником жирных кислот / липидов в головном мозге в процессе разработки и CD могут возникнуть в результате снижения синтеза миелина в процессе развития , вызванного отказом НАА быть разбиты 3,5,6.
ООРА встречается преимущественно в почках, печени и белого вещества головного мозга, а также учитывая важную роль в ООРА CD, сотовая экспрессия этого фермента в мозге было изучено несколько лабораторий. Глядя на ферментативную активность ООРА в головном мозге, более ранние исследования показали , что увеличение активности ООРА во время развития мозга параллельно временной ход миелинизации 8-10. На клеточном уровне, анализы для ферментативной активности, а также в гибридизация (МОГ) и иммуногистохимии (IHC) , в анализ позволяет предположить , что ООРА в основном экспрессируется в олигодендроциты в головном мозге , но не в нейронах или астроцитов 11-16. Несколько исследований показали, что ООРА может такжевыражается в микроглии в центральной нервной системе 12,14. До сих пор данные по экспрессии ООРА в ФОС ограничены. Согласно данным недавнего исследования , где Транскриптом различных типов клеток в коре головного мозга мыши , включая нейроны, астроциты, ФОС, новообразованных олигодендроцитов, myelinating олигодендроцитов, микроглии, эндотелиальные клетки, и перицитами анализировали с помощью РНК секвенирования 17, экспрессируется исключительно ООРА в олигодендроциты , в частности, в myelinating олигодендроциты (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Несмотря на эти исследования по ООРА паттерна экспрессии в головном мозге, ряд неопределенностей, остаются.
Различные методы могут быть использованы для изучения паттернов экспрессии генов. IHC является широко используемый метод для определения функционального продукта (т.е. белок) генной экспрессии в срезах ткани. Несмотря на большую полезность, этот метод имеет свои ограничения, как его применение и специфичность могут быть тО наличии и специфичности антитела необходимо. Для сравнения, ISH имеет то преимущество, которое позволяет выявить экспрессию любого гена на уровне мРНК. Тем не менее, это может быть технически сложно использовать несколько зондов в то же время для того, чтобы локализовать экспрессию генов в специфических типах клеток. В этой статье мы опишем протокол сочетающую двойной РНК флуоресцентной гибридизации in - situ с флуоресцентной immunolabelling белка. Мы использовали этот набор методов для изучения характера экспрессии Aspa в мозге мыши. Этот метод позволяет точно Изучение экспрессии генов с использованием конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике:
Мышь нива и регулировать в соответствии с правилами Министерства внутренних дел Великобритании и руководств UCL комитет по этике, с соблюдением животных (научные процедуры) Закон 1986 Соединенного Королевства и ее изменение регламента 2012 года.
Примечание: Все решения должны быть сделаны с диэтилпирокарбонат (DEPC) - обрабатывают водой, чтобы уничтожить любые остаточные РНКазы. Для лечения DEPC, добавьте DEPC (1 мл на литр), энергично встряхивают, пока все DEPC глобулы не исчезли затем автоклав ухудшить DEPC.
1. РНК зонд Синтез
- ОСТОРОЖНО: При обращении формамид, носить средства индивидуальной защиты (СИЗ) и использовать камеру безопасности. Подготовка буфера гибридизации: ДЭФЦ обработанной деионизированной воды с 50% (об / об) деионизированная формамид, 200 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 5 мМ NaH 2 PO 4, 5 мМ Na 2 HPO 4, 0,01 мг / мл дрожжевой тРНК, 1 × Soluti Денхардтана, и 10% вес / объем сульфата декстрана.
- Выберите клон ДНК, который содержит последовательности кДНК представляющего интерес гена в плазмиде с РНК-полимеразы промоторов. Для этого примера, используйте клон PCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), с Т7 и SP6 РНК - полимеразы промоутеров для Aspa (Дополнительный рисунок 1).
- Приготовьте линеаризованной плазмиды ДНК в качестве матрицы.
- Grow клон ДНК, экстракт плазмиды с помощью набора для очистки плазмидной малого в соответствии с протоколом производителя и последовательность с Т7 и SP6 универсальных праймеров.
- Дайджест +1020 мкг плазмидной ДНК с помощью фермента рестрикции, который разрезает на 5'-конце смысловой цепи кДНК. Для этого примера, используйте 100 единиц Sal I переваривается плазмиды PCMV-SPORT6- Aspa. Инкубируют в течение 1,5 ч при 37 о С.
- Выполнить небольшой аликвоты на агарозном геле, чтобы проверить, что плазмиду полностью линеаризуется.
- очищаютлинеаризованные плазмида с использованием фенол-хлороформ.
- Добавьте 1/10 объема 3 М ацетата натрия, один объем 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) - уравновешенной фенол и один объем хлороформа / изоамилового спирта (IAA) (24: 1).
- Центрифуга при 16000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре (20 - 25 ° С, РТ) и извлекать верхнюю водную фазу.
- Добавьте один объем хлороформа / IAA, центрифуге при 16000 х г в течение 1 мин и извлечь верхнюю водную фазу.
- Повторите шаг 1.4.3.
- Добавляют 2 объемов этанола и оставляют при -20 ° С в течение 1 ч или O / N.
- Центрифуга при 16000 х г при 4 ° С в течение 10 мин. Удалите супернатант.
- Промывают осадок с 70% -ным холодным этанолом и вновь приостановить на аппроксимативно 1 мкг кДНК в 2,5 мкл в ТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5).
- Синтезируют два зонда, помеченный дигоксигенином (DIG), а другой с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC).
- Выберите подходящую РНК-полимеразы, чтобы сделать анти-SENSE зонд (комплементарны мРНК-мишени). Для этого примера, используют Т7 РНК - полимеразы , чтобы сделать Aspa зонд.
- Готовят реакции в пробирке транскрипции: добавить 1 мкг линеаризованной ДНК, 4,0 мкл 5 х буфера транскрипции, 6,0 мкл 100 мМ DTT, 2,0 мкл 10х DIG или ФИТЦ РНК маркировки смеси , содержащей дНТФ, 1 ингибитор РНКазы мкл, и 20 - 40 единиц РНК-полимеразы; конечного объема до 20 мкл с помощью DEPC-обработанной воды.
- Инкубируют при 37 ° С в течение 1,5 ч.
- RUN1 мкл реакции транскрипции на агарозном геле 1,0%, чтобы проверить, что реакция сработала. Гель должен показывать линейный шаблон и яркую полосу зонда.
- Сделать объем до 100 мкл с помощью буфера гибридизации и хранить 10 мкл аликвоты при -80 ° С.
2. Перфузия, Фиксирование и тканей Коллекция
- ОСТОРОЖНО: При обращении параформальдегида (PFA), как твердых, так иводный, носить средства индивидуальной защиты и использовать камеру безопасности. Подготовка раствора формальдегида растворением 4% (вес / объем) ПФА в 1х растворе фосфатно-буферный раствор (PBS) с использованием тепла (55 ° C). Фильтрация раствора формальдегида с фильтровальной бумагой.
- Готовят раствор сахарозы путем растворения 20% (вес / объем) сахарозы в дистиллированной воде и добавляют 0,1% (об / об) раствор DEPC. Оставьте O / N при комнатной температуре с рыхлой крышкой, а затем автоклав.
- Терминально анестезию мыши внутрибрюшинно инъекции пентобарбитона (50 мг / кг). Оценка глубины анестезии с помощью пальца щепоткой и отсутствие абстинентного рефлекса указывает на глубокую анестезию.
- После того, как мышь находится под глубоким наркозом, сделать надрез под грудной клеткой и прорезать грудной клетки с обеих сторон, поднимите ее, чтобы обнажить сердце.
- Вставьте 25-G иглу в левый желудочек сердца. Сделайте небольшой надрез в правое предсердие сердца.
- Заливать животное с 20 мл PBS, а затем 40 мл раствора формальдегида. Для P30 и старшемыши, использовать скорость перфузии 12 мл / мин, а для более молодых животных используют более низкую скорость (7 - 10 мл / мин).
- Рассеките мозг.
- Отрежьте голову мыши с хирургическими ножницами, делая вырезать заднюю из ушей. Сделать хвостового срединный разрез в коже и работать ростральным, чтобы удалить кожу от черепа.
- Начиная с каудальной части, прорезают в верхней части черепа вдоль средней линии и между глазами с диафрагмой ножницами. Удалить теменной и лобной кости пластины путем наклона одной стороны костной пластины каждый раз и щелкая его с помощью пинцета.
- Осторожно наклоните мозг вверх от передней части с помощью пинцета и отрежьте зрительных нервов и других черепно-мозговых нервов. Аккуратно поднимите мозг из черепа.
- Поместите мозг в корональной мыши матрицы мозга. Нарезать мозг в 3 примерно 4 мм штук с перо лезвием бритвы.
- Перенесите ломтики в 4% раствора PFA и инкубировать O / N при температуре 4 ° С.
- Передача мозгаЛомтики к DEPC обработанных 20% раствора сахарозы и инкубировать o / n при температуре 4 ° С
- Поместите каждый кусочек мозга в сухую cryomould, окружит Оптимальная температура резания (ОКТ) среды и заморозить на сухом льду. Хранить при температуре -80 ° С.
3. Cryosectioning
- Вырезать участки замороженной ткани 15 мкм в криостате и собирать секции на предметные стекла микроскопа. При необходимости смачивать участки с DEPC обработанных PBS и придавить их с тонкой кистью.
- Оставьте слайды высохнуть в течение приблизительно 1 часа, чтобы гарантировать, что ткань прилипает к каретке.
4. Гибридизация
- Готовят 65 ° С Промывочный буфер 150 мМ NaCl, 15 мМ Na 3 C 3 H 5 O (СОО) 3 (= 1х солевой раствор цитрата натрия), 50% (об / об) формамида и 0,1% (об / об) Tween- 20.
- Подготовьте MABT буфер: 100 мМ малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, 0,1% (об / об) твина-20, рН 7,5.
- Разведите два датчика (DIG-меченых и FITC-Лабельг) 1/1000 в буфере для гибридизации предварительно нагревают до 65 ° C и хорошо перемешать.
- Применить около 300 мкл гибридизации смеси на каждом слайде, coverslipwith печеным (C 200 о) покровные и инкубировать O / N при 65 ° C в увлажненной камере.
- Передача слайдов в банку, содержащую Коплин предварительно нагретом промывочный буфер. Промыть слайдов в течение 30 мин дважды при 65 & deg; C с промывочным буфером.
- Вымойте слайды в течение 10 мин три раза MABT при комнатной температуре.
5. Визуализация FITC зонда
- Готовят ISH блокирующий буфер: MABT с 2% блокирующего реагента и 10% инактивированной нагреванием сыворотки овцы.
- Дополнительно: использовать гидрофобный перо для рисования кругов вокруг срезов ткани на слайд, чтобы уменьшить объем растворов антител, необходимых.
- Инкубируйте слайды в течение 1 ч при комнатной температуре с ISH блокирующего буфера в увлажненной камере.
- Выдержите в слайдах o / n при 4 ° С с пероксидазой хрена (POD) - конъюгатг анти-ФИТЦ антитело, разведенное 1/500 (об / об) в ISH блокирующем буфере.
- Поместите слайды в банку, содержащую Коплин PBS с 0,1% (об / об) Tween-20 (PBST). Промыть 3 раза в течение 10 мин в PBST и заменить свежим PBST каждый раз.
- Непосредственно перед использованием готовят флуоресцентного tyramide разбавлением 100 раз в Amplification разбавителе. Для этого примера, используйте FITC-tyramide.
- Добавьте это к слайдам и оставьте на 10 минут при комнатной температуре.
- Поместите слайды в банку Коплин и промыть 3 раза в PBST в течение 10 мин.
6. Визуализация DIG Probe
- Приготовьте 0,1 М Трис- HCl рН 8,2.
- Инкубируйте слайды с блокирующим буфером ISH в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Выдержите в слайдах o / n при 4 ° С со щелочной фосфатазы (AP) -conjugated анти-DIG антитело, разведенное 1/1500 (об / об) в ISH блокирующий буфер.
- Мытье с MABT в течение 10 минут три раза.
- Промыть дважды с помощью 0,1 М Трис-HCl, рН 8,2 в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Непосредственно перед использованием готовят быстрого красный раствор путем растворения таблеток в 0,1 М Трис, рН 8,2. Фильтруют раствор через 0,22 мкм фильтр.
- Инкубируйте слайды при температуре 37 ° С с раствором Fast Red в увлажненной камере. По мере того как время для оптимального развития изменяется, проверить слайды регулярно с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы контролировать образование осадка. Для этого примера, остановить реакцию после 2 - 3 ч.
- Промыть PBST в течение 10 мин в три раза.
7. Иммуногистохимия
- Подготовьте IHC блокирующий буфер: 10% (об / об) сыворотки (другого вида к первичного хозяина антител) в PBST.
- Инкубируйте слайды с ВВК блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре в увлажненной камере.
- Подготовка первичных антител: разбавить первичное антитело при соответствующем разведении в PBST с 5% сыворотки (другого вида к первичного хозяина антител). Для этого примера, используют кроличье анти-Olig2 антитело при 1/400 (об / об) разбавлении.
- Инкубировать в растворе первичного антитела при 4 ° CO / N.
- Промыть PBST в течение 10 мин в три раза.
- Готовят вторичное антитело: разбавить флуорофор-конъюгированные вторичные антитела при соответствующем разведении в PBST с 5% (об / об) сыворотки (другого вида к первичного хозяина антител) и 0,1% (об / об) Hoechst 33258. Для этого примера используйте ослиного антитела против кроличьего Alexa647 вторичного антитела на 1/1000 (об / об) разбавлении.
- Инкубировать в растворе вторичного антитела при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Промыть PBST в течение 10 мин в три раза.
8. Монтажное
- Частично сушить слайды при комнатной температуре, а также монтировать с монтажной средой флуоресценции. Оставьте слайды высохнуть, а затем изображение в конфокальной микроскопии под 10X, 20X и 63X целей с использованием 4-х различных каналов со следующими длинами волн возбуждения: 570 нм для быстрой красный, 488 нм для FITC, 647 нм для OLIG2 immunolabelling и 350 нм для Hoechst ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В данной статье описывается метод двойной ISH флуоресценции с последующим immunolabelling в разделах мозга мыши. Краткое описание этого протокола показан на рисунке 1. Первым шагом было синтезировать зонды , специфичные к Aspa и MBP (основной белок миелина). Для того, чтобы проверить, что зонды были синтезированы, небольшую аликвоту каждой реакции проводили на агарозном геле. Слабый линейный шаблон и большое количество РНК - зонда можно увидеть (рисунок 2). Двойной флуоресценции ISH для Aspa и МВР, а затем OLIG2 immunolabelling и Hoechst ядерного окрашивания, проводили на срезах мозга мыши. Мы сканировали срезы головного мозга в конфокальной микроскопии и скреплены изображения вместе , чтобы выявить распределение экспрессии генов сигналов в головном мозге. Экспрессию Aspa в MBP -положительным наблюдалось (MBP +) клеток по всему бюстгальтере в (Рисунок 3). Мы также исследовали экспрессию Aspa в различных структурах головного мозга , используя большее увеличение. Выражение Aspa в олигодендроциты в коре головного мозга и мозолистого тела показаны на рисунке 4. В совместной локализации МВР, OLIG2 и Aspa указывает на то, что Aspa выражается в субпопуляции зрелых олигодендроцитов в коре головного мозга и мозолистого тела (рисунок 4). Эти результаты показывают, что этот протокол может одновременно обнаруживать экспрессию трех различных генов в срезах мозга.
Рисунок 1. Протокол Double флуоресценцию в гибридизация Вслед за иммунным окрашиванием. Этот протокол работает в течение 5 дней и обнаруживает экспрессию трех генов./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Исследование Aspa РНК - зонда на агарозном геле. Линейное матрицы и большого количества РНК - зонда меньшей молекулярной массы можно наблюдать. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Двойной флуоресценция в situ гибридизация ООРА и MBP у мышей Срезы мозга. Aspa (красный) и MBP (зеленый) в головном мозге. Шкала бар:. 500 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Было выражено Рисунок 4. Выражение Aspa в олигодендроциты в коре головного мозга и мозолистого. Панели показывают репрезентативные изображения из ISH для Aspa (красный) и MBP (зеленый) с последующим иммунным OLIG2 (синий) в сочетании с Hoechst окрашивания. Aspa в некоторых Mbp + / Olig2 + клеток в коре головного мозга (а и в) и в мозолистого тела (C и D). M BP + / Olig2 + / Aspa + -клеток, указаны стрелками и MBP + / OLIG2 + / Aspa - клетки обозначены с наконечниками в расширяющейся панелей (В и D). Шкала баров: 100 мкм (А и С); 20 мкм (B и D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Дополнительное Рисунок 1. Последовательность и карта Aspa Clone (IRAVp968C0654D). 1.5kb последовательность кДНК Aspa встраивали в PCMV-Sport6 плазмиды (A). Карта PCMV-Sport6-Aspa плазмиды показана на (В).м / файлы / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол предусматривает процедуру шаг за шагом для двойной РНК гибридизация с последующим иммунным окрашиванием. Мы использовали этот протокол для подтверждения того, что Aspa выражается в зрелых олигодендроцитов в нескольких областях мозга.
Эта процедура многоступенчатая имеет много потенциальных ловушек, которые могут повлиять на чувствительность и его следует избегать. Во-первых, все решения и буферы для хранения реакции транскрипции должны быть РНКазы. Во-вторых, выбор шаблонов кДНК имеет важное значение, и мы предпочитаем шаблоны приблизительно 1 кб в длину. Необходимо очистить шаблоны кДНК с фенольной экстракции / хлороформом и повторно осадить их , прежде чем в пробирке транскрипции. Кроме того, транскрипционный зонда должно быть оптимальным; если зонд не производится в достаточном количестве, это приведет к снижению качества ISH. Качество зонда может быть проверена путем анализа его на агарозном геле и хорошее качество будетсвидетельствует сильной яркости полосы зонда по сравнению с матричной группой (рисунок 2). Для двойной ISH используются два по-разному меченых зондов, как правило, один ярлык с DIG, а другая с FITC. ФИТЦ-меченым зондом считается наименее обнаруживаемым и должен быть выбран, где мРНК-мишени, как ожидается, будет самым высоким в ткани. Этот зонд обычно разрабатывается первый и DIG-меченный зонд разработан второй.
Другим важным шагом является подготовка ткани. Мыши перфузию ДЭФЦ обработанной PBS, а затем 4% PFA, фиксировали в 4% PFA O / N, а затем криопротекции в 20% -ных растворов сахарозы, которые были ДЭФЦ обработке, чтобы уничтожить любые остаточные РНКазы. время фиксации очень важно; избыточной или недостаточной фиксации может привести к ослаблению сигнала, возможно, из-за снижения проникновения зонда (чрезмерной фиксации) или деградации мРНК (в возрасте до фиксации). Затем ткань cryosectioned и два зонда гибридизуются O / N. формамидиспользуемый в буфере для гибридизации должна быть деионизация. Очень важным фактором в процессе O / N гибридизации при 65 ° С, чтобы избежать испарения и концентрации гибридизация смеси, поскольку это может поставить под угрозу чувствительность. В описанном эксперименте мы проводили гибридизацию при 65 прямоточной / N, но это может быть стоит попробовать более низкие температуры для различных зондов, если это, кажется, трудно обнаружить мРНК-мишени.
Существует выбор реагентов для обнаружения гибридизированных зондов. Быстрый красный является чувствительным флуоресцентный реагент, но не все партии Fast Red дают тот же результат. Она нуждается в AP для развития и дает флуоресценцию с возбуждением родамина. По нашему опыту, важно, чтобы сделать его свежим 0,1 М Трис-HCl рН 8,2 и фильтруют ее перед использованием. Опцион нефлуоресцирующего является разработка цвета с нитро-синего тетразолия (NBT) и 5-бром-4-хлор-3'-indolyphosphate (BCIP), которая работает с той же AP-конъюгированных антител. АноTher вариант с использованием флуоресцентного tyramide для обнаружения. Хотя флуоресцентные системы tyramide не являются самыми чувствительными методами, проявочный реакции с пероксидазой хрена, очень быстро и есть по крайней мере три флуоресцентные цвета (ФИТЦ, цианиновыми 3 и цианиновыми 5), которые могут быть использованы. Ограничение этого протокола является то, что некоторые целевые антигены (или эпитопов), особенно низкие белки обилие, не могут быть обнаружены после процесса ISH и, следовательно, не подходят для IHC после ISH. В нашем иммунное окрашивание, обнаружение антитела OLIG2 оказывается незатронутым. Пользователю нужно будет выбрать правильное антитело для immunolabelling следующего ISH.
IHC и ISH обычно используются методы для изучения экспрессии генов, и оба имеют свои плюсы и минусы. ВВК является очень чувствительным методом обнаружения клеточной экспрессии генов в срезах головного мозга, но его зависимость от антитела влияет на его специфичность и ограничивает его применение. В противоположность этому, ISH имеет высокую спецификациюificity и зонд любого гена могут быть легко синтезированы в пробирке транскрипции с использованием гена специфической кДНК в качестве матрицы. Протокол, который мы разработали использует преимущества обоих методов, сочетая двойной ISH с IHC для достижения тройной обнаружения экспрессии гена с высокой степенью специфичности.
Короче говоря, протокол мы опишем здесь возможность одновременного окрашивания двух мРНК и одного белка, поэтому он является полезным инструментом для иллюстрации экспрессии генов колокализуются. Несмотря на то, что экспрессия мРНК не всегда коррелирует с экспрессией белка, ISH представляет собой мощный метод, который позволяет исследовать экспрессию гена с высокой специфичностью. Наш протокол двойного флуоресцентного ISH в сочетании с IHC, оказалось успешным в детекции экспрессии Aspa в подмножестве олигодендроциты в ткани мозга взрослых мышей, и она может быть легко адаптирована для разнообразных тканей различного происхождения и стадии развития. Кроме того, этот протоколТакже может быть использован для определения экспрессии малых РНК, таких как микроРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100 mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65 °C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1,500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22 µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1,000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al.
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
