Introduction
Metastasierung entfallen mehr als 90% der Todesfälle durch soliden Tumoren verursacht. Bone ist die häufigste Orgel von Metastasen verschiedener Krebsarten betroffen, vor allem Brust- und Prostatakrebs. Wenn in der Klinik diagnostiziert, in der Regel Knochenmetastasen bereits fortgeschrittenen Stadien entweder mit osteolytischen oder Osteoblasten-Veränderungen in Knochen getreten ist, oft mit neurologischen Symptomen begleitet.
Vorherige Studien konzentrierten sich überwiegend auf die offenkundige osteolytischen Knochenmetastasen 1-3, aber wir derzeit haben begrenzte Verständnis von Mikrometastasen in Knochen vor dem Beginn des osteolytischen Prozess. Dies ist zumindest teilweise aufgrund des Fehlens von geeigneten experimentellen Modellen und Ansätzen. Gentechnisch hergestellten Mausmodelle von Brustkrebs metastasiert oft an die Lungen, aber viel weniger effizient Knochen 4. Ebenso entwickeln sich die orthotop transplantierten Tumoren selten spontane Knochenmetastasen, mit einigen Knochentropischen 4T1 Brust Karzinomein Sub-Klone und MSP überexprimiert PyMT transgenes Mausmodell als Ausnahmen 5-7. Intra-Tibia - Bohrungen können Krebszellen bis auf die Knochen 8-10, aber es entstehen auch Schäden und Entzündungen zu lokalen Gewebe liefern. Derzeit intrakardiale Injektion von Brustkrebs - Zelllinien wurde die Haupt Ansatz gewesen 11-13 Knochen Kolonisation zu untersuchen. Doch nach Krebszellen in den linken Ventrikel eingeführt werden, nur ein begrenzter Anteil erreichen schließlich Knochen und Knochenmark, was es schwierig macht mikroskopische Metastasen in einer quantifizierbaren Weise zu verfolgen.
In dieser Studie stellen wir eine Technik, nämlich intra Hüftarterie (IIA) Injektion 14, selektiv Krebszellen in der hinteren Gliedmaßen Gewebe liefern, wodurch die Krebszellen in Knochen und Knochenmark Anreichern ohne Beschädigung lokale Gewebe zu verursachen. Aufgrund der Knochen Spezifität, ermöglicht dieser Ansatz auch genügend Zeit für die indolenten Krebszellen, um schließlich vor ein kolonisierenimals erliegen primären Tumoren oder Metastasen in anderen lebenswichtigen Organen. Wenn sie mit einer Vielzahl von anderen Techniken kombiniert, wie Biolumineszenz-Bildgebung, Immunfluoreszenzanfärbung und Knochenhistomorphometrie ist IIA Injektion potenziell nützlich für einen weiten Anwendungsbereich von Forschungszwecke zu Knochenmetastasen im Zusammenhang, vor allem aus der Progression zu verfolgen einzelne Krebszellen zu mehrzelligen micrometastases. Insbesondere haben wir gezeigt, dass IIA Injektion uns ermöglicht, die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und verschiedene Arten von umgebenden Zellen im Knochenmikroumgebung zu visualisieren.
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Protocol
Alle tierischen Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Tierpflege Richtlinien des Baylor College of Medicine durchgeführt.
1. Zellpräparation
Hinweis: Verschiedene Krebszelllinien können für die Injektion IIA verwendet werden, je nach Forschungszwecken. Wir haben Brustkrebs-Zelllinien MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 und Prostatakrebs-Zelllinie C4-2 in unserer Forschung. Wir verwenden in der Regel sowohl GFP- und Glühwürmchen-Luciferase-markierten Krebszellen für unsere Studie und zeigen einige Daten hier aus der GFP-Luziferase-markierten MCF7 Zelllinie.
- Pflegen Zellen in DMEM , enthaltend 10% FBS und 0,1 mg / ml Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C in 5% CO 2.
- Vor IIA Injektion, trypsinize Zellen bei 80-90% Konfluenz mit 0,25% Trypsin / EDTA-Lösung. Mit kaltem PBS Zellen zweimal zu waschen und resuspendieren Zellen in 10 ml PBS zur Zellzählung. PBS, zentrifugieren Zellen bei 800 xg für 5 min zu entfernen.
- Re-suspend-Zellenbei einer Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml in eiskaltem PBS.
- Verwenden Sie 100 ul GFP- und Glühwürmchen-Luciferase-markierten Krebszellen für IIA Injektion einer Maus.
Anmerkung:. Daher ist die Anzahl der von jedem Tier erhielt Zellen 5 x 10 5 kann diese Anzahl muss basierend auf der Aggressivität von Zelllinien verändert werden. - Halten Zellsuspensionen auf Eis.
Hinweis: Vibrationen können erforderlich sein, die Zellaggregation alle paar Minuten, um zu verhindern, bis sie für die Injektion bereit ist. Bei einigen Zelllinien (zB MDA-MB-231), strengere Verfahren (zB durch 45 & mgr; m Zellsieb vorbei) kann zur Verhinderung der Aggregation benötigt werden. Bitte beachten Sie, dass die Verstopfung von Gefäßen Gewebsnekrose verursachen und daher die Versuche Verwechselung.
2. Vorbereitung der Tiere
- Für Tierschmerztherapie, geben 5 mg / kg / Tag Carprofen (oder ein anderes Analgetikum) mit Nahrungsergänzungsmittel für die Mäuse nicht weniger als 24 Stunden vor der Operation. Verwalteneine Dosis von 0,1 mg / ml Buprenorphin subkutan 60 min vor der Operation. Hinweis: Ein optionales Verfahren ist estradiol Palette in den Rücken der Tiere zu implantieren zusätzliche estradiol bereitzustellen. Dadurch wird die wachsen von ER + Krebszellen (zB MCF-7 - Zellen) 9 beschleunigen.
- Anästhesieren einen 4 - 6 Wochen alten Maus (ca. 20 g) mit Ketamin (80 - 100 mg / kg) und Xylazin (10 -12,5 mg / ml) durch intraperitoneale Injektion.
- Bestätigen Sie die entsprechende Ebene der Sedierung einer 20 g Maus durch Zehe Prise und die Beobachtung einer 50% igen Reduktion der Atemfrequenz und rosa Schleimhäute (zB Mausohrhaut und Pfote Haut). Bewahren Sie diese Vitalfunktionen überwachen alle 15 Minuten während der Operation. Anmerkung: keine Bewegung des Tieres anzeigt, dass das Tier für eine Operation ausreichend anästhesiert und bereit ist.
- Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit zu verhindern.
- Rasieren Sie mit der Maus auf den unteren Bauch, vor allem die rechte Leistengegend, wo die Operation und Einspritzungstattfinden.
Anmerkung: Dies ist nicht notwendig, wenn athymische Nacktmäuse verwendet. - Setzen Sie die Maus auf den Rücken, breitete die Beine in ihrer natürlichen Position und halten Sie die Zehen auf mobile Dissektion Karton mit Klebeband.
- Wischen Sie den rechten Leistengegend mit 70% Isopropyl Ethanol getränkten sterilen Wattestäbchen, gefolgt mit betadine chirurgischen Peeling mehrmals.
3. Die Gemeinsame Hüftvene und Artery Lage und Trennung
- Machen Sie einen Hautschnitt von 1,0 bis 1,2 cm lang zwischen dem 4. und 5. Brustwarzen in der rechten unteren Abdomen mit sterilen, # 10 C - Klingen Stahl Skalpell in einem No. 3 Griff gehalten. Dann mit einem sterilen Operationstuch den tierischen Körper mit Ausnahme der Einschnittstelle zu decken.
- Bewegen Sie das Tier zu Standardtisch Präpariermikroskop. Verwenden Sie eine Vergrößerung von 4X zur Injektion.
- Unter 4-fache Vergrößerung des Präpariermikroskop, legen stumpfe Trennung Zange zwischen Fettgewebe und dem peritoneum, und drücken Sie die nach außen Gewebe auf beiden Seiten der Beckengefäße und Nerven freigelegt (siehe Abbildung 1).
Anmerkung: Die Arterie zwischen Aorta von der Mittellinie und dem unteren Teil der Arterienzweige wird Arteria iliaca communis genannt. Dies ist, wo die Injektion stattfindet. - Verwenden Sie ein Paar gerade feinen Pinzette durch das Bindegewebe zu brechen (wie eine Membran) zwischen Gefäßen und Nerven, näher an den Gefäßen.
- Schalten Sie die gerade feinen Pinzette an der linken Hand. Schnappen Sie sich ein Paar abgewinkelter feinen Pinzette mit der rechten Hand. Legen Sie die rechte Hand Zange in derselben Position, wo das Bindegewebe gebrochen wurden. Und dann halten Sie die rechte Hand Zange durch, unter den Gefäßen.
- Zur gleichen Zeit, legen Sie die linke Hand Pinzette in das Bindegewebe auf der linken Seite der Gefäße, die rechte Hand Zange gehen durch zu führen.
- Sobald die rechte Hand Zange unter den Gefäßen wird, versuchen die Gefäße vom umgebenden ti zu trennenUSGABE ein wenig mehr, und sie dann immer an der Spitze der rechten Hand Pinzette.
- Verwenden Sie die linke Hand Zange die Spitze einer 4-0 Seidennaht auf die rechte Hand Zange zu liefern, und ziehen Sie dann den Faden sanft und langsam durch unter den Gefäßen. Hinweis: Nun sind beide gemeinsame Vene und Arterie Gefäße werden durch die Naht (siehe Abbildung 2) angehoben.
4. Injection und Post-Injektion Pflege
- Bereiten Sie die Zellen für die Injektion in einer 31 G Insulinspritze. Verwenden von 100 & mgr; l der Zellsuspension in PBS pro Injektion. Achten Sie darauf, zu pipettieren nach oben und unten mehrere Male um die Zellen zu trennen und die Aggregation zu vermeiden, so dass die injizierten Zellen nicht den Blutfluss verstopfen und blockieren.
- Mit den abgewinkelten Zange in der linken Hand, legte die Zange unter den Gefäßen entlang der Führung des Fadens, und öffnen Sie dann die beiden Arme der Zange, die Gefäße sanft an der Zange gehalten hat.
Hinweis: Der Abstand zwischen den beiden Armen der Zange wird die injection Ort. - Halten Sie die 31 G-Nadel mit 100 & mgr; l Zellsuspensionen in der rechten Hand, mit der Abschrägung der Nadel nach oben, bereit für die Injektion.
- Führen Sie die Nadel in die Arterie Lumen (Blut wird die Nadelspitze eingeben). Drücken Sie dann langsam in die Zellen Zellsuspension zu injizieren. Die Zellsuspension wird drücken Sie den roten Blut in dem Gefäß entfernt. Versuchen Sie nicht, die Gefäße zu brechen oder die Zellsuspension austreten.
- Wenn die Einspritzung beendet ist, ziehen Sie vorsichtig die Nadel zurück und halten die Schiffe bis auf der linken Zange hält die Blutung zu stoppen. Ziehen Sie dann den Faden weg.
- Ziehen Sie die linke Hand Pinzette entfernt und schnell mit einem Wattestäbchen verwenden, um die Arterie Schnittbereich zu drücken, die Blutung zu stoppen.
Hinweis: In der Regel von 5 bis 10 min Dauerdruck ausreicht, um die Blutung zu stoppen. - Wenn stoppt Blutungen, verwenden Hautkleber die Hautränder des OP-Bereich zu schließen. Machen Sie eine Ohrmarke, und überprüfen Sie die Biolumineszenz signalisiert die Verteilung der injizierten Zellen zu untersuchen. <br /> Hinweis: Eine erfolgreiche Injektion wird in einem Bild führen , ähnlich Abbildung 3.
- Überprüfen Biolumineszenz Signalisierung durch Injektion von 100 ul 15 mg / ml Luciferin in PBS bei 75 mg / kg Maus-Konzentration über den intraorbitalen Sinus.
- Für den inner orbitalen Injektion setzen Finger auf beiden Seiten der Maus Auge, mit Druck Auge Ball leicht herausspringen aus dem Auge Rahmen machen, legen Sie 28 G Insulinspritze Nadeln zwischen Augapfels und Nase, und dann Spritze langsam drücken, um Luciferin injizieren .
Hinweis: Bei der richtigen Position, sollte die Nadel der Lage sein, eine Tiefe von 2 zu erreichen - 3 mm vor hartem Gewebe (Knochen) zu schlagen. - Platzieren Sie die Maus in die Abbildungssystem für in vivo ganze Tierbildgebung für 10 bis 60 Sekunden innerhalb von 5 min (siehe Abbildung 3).
Hinweis: Ein optionales Verfahren ist estradiol Pellet in den Rücken der Tiere zu implantieren zusätzliche estradiol bereitzustellen. Dadurch wird das Wachstum von ER + Krebszellen (beispielsweise MCF-7 beschleunigenZellen) 15.
- Für den inner orbitalen Injektion setzen Finger auf beiden Seiten der Maus Auge, mit Druck Auge Ball leicht herausspringen aus dem Auge Rahmen machen, legen Sie 28 G Insulinspritze Nadeln zwischen Augapfels und Nase, und dann Spritze langsam drücken, um Luciferin injizieren .
- Überprüfen Biolumineszenz Signalisierung durch Injektion von 100 ul 15 mg / ml Luciferin in PBS bei 75 mg / kg Maus-Konzentration über den intraorbitalen Sinus.
- Lassen Sie die Maus an einem warmen Heizkissen, bis er aufwacht. Überwachen Sie die Blutungen, Schwellungen, Anzeichen von Aufplatzen und Schmerzen während der postoperativen Periode. Setzen Sie die Mäuse wieder in den Käfig mit analgetischen Abdeckung (carprofin Nahrungsergänzungsmittel empfohlen) für die Schmerztherapie, bis keine Anzeichen von Schmerzen gegeben. Achten Sie Aufmerksamkeit und Pflege der Tiere während 7 Tage nach der Operation.
5. Überwachung metastatischen Wachstums
- histomorphometrisch:
- Ernte Tumor Knochengewebe tragen, fixieren die Knochen in 4% Paraformaldehyd für 24 Stunden, so dass sie dann entkalken in pH 7,0 14% EDTA - Lösung für 3 - 5 Tage, und unterwerfen sie beschrieben , wie zuvor 14 bis Paraffineinbettung.
- Abschnitt die in Paraffin eingebettet werden Knochengewebe mit einer Dicke von 3 & mgr; m und führen histologischen Standardverfahren von Hämatoxylin / Eosin - Färbung , wie zuvor 14 beschrieben.
- ImmunohistochemisVersuchen:
- Gegenstand Paraffin eingebetteten Tumorlager Knochen gleitet Anfärben für verschiedene Zwecke Immunhistochemie wie zuvor beschrieben 14. Kurz gesagt, immunostain MCF7 Krebszellen durch anti-GFP-Antikörper und immunostain osteogenen Zellen (Präosteoblasten und Osteoblasten) durch anti-Osterix Antikörpern und anti-alkalischer Phosphatase (ALP) Antikörper, respectively.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die anatomische Lage und Beziehung von A. iliaca communis (rot) und Vene (blau).
Abbildung 2 zeigt die relative Position der Beckengefäße und Nerven unter Dissektion Mikroskopie. Wie in 2A dargestellt, werden die Gefäße und Nerven unterhalb der Bauchwand der rechten und kann nach der Hautschnitt offenbart werden wird und das Peritoneum weg gedrückt wird. Die V. iliaca communis ist auf der linken Seite, und ist größer und dunkler im Vergleich zu der Arterie. Die Arterie ist in der Mitte und sieht rosa. Es ist dünner als die Vene hat aber dickere Muskelwand. Die Vene und Arterie sind parallel und eng miteinander verbunden sind. Etwas weiter auf der rechten Seite ist der weiße lumbosacral Nerv. 2B gemeinsame Iliakalgefäße von den umgebenden Bindegewebe, Muskeln und Nerven getrennt zeigt, und angehoben von einem 4-0 Seidennaht. Die gemeinsame Hüftvene, Arterie und lumbosakralen Nerven sind ebenfalls angegeben.
Abbildung 3 zeigt repräsentative in vivo und ex vivo Biolumineszenz Bilder von Tieren , die nach innerBeckenArterie Injektion. Fünf x 10 5 GFP-Luciferin-markiertem MCF7 - Zellen in 100 & mgr; l wurden durch intra Arteria iliaca Einspritzung in den rechten Hinterschenkel der Maus verabreicht. D-Luciferin wurde dann durch intra-orbit sinus Injektion verabreicht, gefolgt von der in vivo ganze Tier Biolumineszenz - Bildgebung. Die injizierten MCF7 - Zellen wurden in die rechte Hinterschenkel der Maus angereichert , wie durch die Biolumineszenz - Signale (3A) angedeutet ist . Die in vivo - Biolumineszenz - Signale des ganzen Tieres wurden alle 3 Tage oder wöchentlich verfolgt, und dann wurden die Maus - Knochengewebe am Tag 14 nach der Injektion geerntet , wenn das ganze Tier Biolumineszenz - Signal einen bestimmten Schwellenwert erreicht (Photonenfluss> 10 4). Nach dem D-Luciferin Verwaltung, aus dem Knochengewebe wurden intraBeckenArterie injiziert Maus schnell geerntet und in PBS für ex - vivo - Bildgebung eingetaucht. Das starke Biolumineszenz - Signal von der intraBeckenArterie injiziert rechten Hinter Knochen , aber nicht von der linken Steuer Knochen zeigte die spezifische Lokalisation von injizierten Zellen (3B).
Abbildung 4 zeigt repräsentative Bilder von histologischen und Immunfluoreszenzanfärbung. Wenn der Tumor Knochen Lager wurden geerntet, wurden sie in Paraformaldehyd Fixierung, Entkalkung EDTA unterzogen und dann in Paraffin Einbettung. Drei um Knochen Dias wurden hergestellt und Standard H & E-Färbung durchgeführt. Die kompakten pflastersteinähnliche Zellen mit größeren Kerne wurden mikroskopisch MCF7 Metastasen im Knochengewebe 14 Tage nach der intra Arteria iliaca Injektion, wie durch die roten Pfeile angedeutet. Knochenmark (BM) Und die großen rosa flache trabekulären Knochen (TB) mit spärlichen Kerne sind so markiert (4A). 4B zeigt-GFP - markierten MCF7 - Zellen (grün), im linken Bild Osteoblasten (rot-ALP markiert) und Osterix-markiertem Präosteoblasten (rot im rechten Bild) nach Immunfluoreszenzfärbung. Blau DAPI-Färbung zeigt den Kern.
Abb . 1: Anatomie der A. iliaca communis (rot) und Vene (blau) in Maus - abdominalen Aorta, A. iliaca communis, A. iliaca externa und Arteria femoralis sind wie angegeben gezeigt. Die Einspritzung wird an den gemeinsamen Beckenarterie von der Aorta in Richtung Femoralarterie Richtung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Iliakalgefäße und Nerven unter Standard - Präpariermikroskop mit 4 - fache Vergrößerung (a) Bild der intakten Gefäße und Nerven. (B) Bild angehoben Gefäße. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Vertreter in vivo und ex vivo Biolumineszenz Bilder von Maus nach intraBeckenArterie Injektion. (A) Die in vivo - Biolumineszenz - Signal des ganzen Tieres unmittelbar nach der Injektion. (B) Die Ex - vivo - Biolumineszenz - Signalder linke Steuer Knochen und rechts injiziert Knochen von injizierten Tieren, die 14 Tage später geerntet wurden. Alle Biolumineszenz - Signale wurden gemessen , indem Sie die empfohlenen Verfahren des Herstellers und Einstellungen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder von histologischen und Immunfluoreszenzanfärbung. (A) Vertreter von H & E - Färbung Bild von MCF7 tumortragenden Knochengewebe nach intraBeckenArterie Injektion. Maßstabsbalken = 25 & mgr; m. Anmerkung: HE-Färbung nicht der effektivste Weg, um Tumoren zu erkennen. In geringer Vergrößerung ist HE-Färbung nicht empfindlich genug, Tumoren zu unterscheiden. In höherer Vergrößerung ist es nicht effizient alle ein zu scannenreas. (B) Immunfluoreszenzfärbung Bilder des MCF7 tumortragenden Knochengewebe. Grün: GFP-markierten MCF7-Zellen, Rot im linken Bild: ALP-markierte Osteoblasten, Rot im rechten Bild: Osterix-markierte Präosteoblasten. Blau DAPI-Färbung zeigt den Kern. Maßstabsbalken = 25 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Obwohl nur die Beckenarterie das Ziel der Injektion für Krebszellen ist, empfehlen wir die Trennung der beiden Hüftvene und Arterie aus den umliegenden Geweben und als Bündel, sie gemeinsam zu heben. Dies liegt daran, die Vene und Arterie ausgiebig miteinander in Kontakt, und die venöse Gefäßwand ist dünn und ist leicht zu brechen. Daher ist für eine erfolgreiche Injektion, es spart Zeit und Mühe, die beiden Schiffe zusammen zu halten, obwohl Krebszellen nur in die Arterie injiziert werden. Ein 4-0 Seidennaht wird verwendet , um diesen Prozess zu helfen , wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Naht kann auch Blutungen stoppen sollte es helfen , auftreten.
Die meisten Schritte der Injektion IIA müssen unter dem Dissektionsmikroskop durchgeführt werden. Die Maus Gefäße sind weich und klein, was die Verfahren herausfordernd macht. 100% in unserer Erfahrung - aber nach ausreichender Praxis kann die Erfolgsquote 90 erreichen.
Mit dieser Technik können Forscher sein einble Knochen Kolonisation Modelle ihrer Lieblingskrebszellmodelle zu etablieren, denen traditionell als "nicht-metastasierten" mit. MCF-7-Zellen stellen ein solches Beispiel. Wenn nämlich in dem Knochen Mikroumgebung kommen, unterziehen MCF-7-Zellen eine kurze Ruhephase vor kolonisieren auszuziehen. Nur sehr wenige spontane Knochenmetastasen wurden bei Tieren tragen orthotoper MCF-7-Xenotransplantaten nachgewiesen. Jedoch kann Ausfall gut von der Restmenge von disseminierten Tumorzellen, die langsame Einleitung der Kolonisierung führen, und die aggressiveren Wachstum von orthotopen Tumoren (das tötet Tiere vor Knochenläsionen herstellen können). So fehlende Nachweis kann nicht als Beweis gegen MCF-7-Zellen die Fähigkeit zur Metastasierung genommen werden. In der Tat kann indolent oder sogar ruhende Knochen micrometastases in der menschlichen Brustkrebspatienten häufiger sein, wie vorgeschlagen Jahren zu Jahrzehnte dormancy, die oft in der Klinik zu sehen ist.
IIA Injektion kann lu nicht nur angewendet werden,minal oder basal Brustkrebszellen, sondern auch für andere Krebsarten wie Prostatakrebs. Wenn sie mit verschiedenen Möglichkeiten von Techniken Überwachung Knochenerkrankung kombiniert, kann einen wesentlichen Beitrag zu vielen Forschungszwecke machen Injektion intraBeckenArterie. Wir verwenden Biolumineszenz-Signalisierung häufig Knochenmetastasen Progression nach intraBeckenArterie Injektion zu verfolgen, und dann ernten tumortragenden Knochen für fluoreszierende Immunhistochemie-Färbung zu definieren Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und die umliegenden Nischen Knochen-Mikroumgebung. Knochenhistomorphometrie 16-17 und 18-20 μCT kann verwendet werden , um Knochenstruktur Veränderungen und andere anatomische Details von Knochen zu bewerten , die durch die Impfung von Krebszellen verursacht werden. Die richtige Überlegungen und Kombinationen sollten von jeder Gruppe für ihre spezifischen Forschungszweck bestimmt werden.
Ähnlich wie intra-Tibia 8-10 und intra-Herz-Impfung 11-13, eine Einschränkung des inner ilIAC Arterie Injektion ist, dass es nicht frühen Schritte bei metastasierendem Prozess Embolie und Eindringen von Tumorzellen in den Kreislauf vor nicht rekapitulieren. Idealerweise wäre notwendig, um eine spontane Metastasierung Prozess von orthotopen Tumoren beginnen, voll der Metastasierung Kaskade rekapitulieren. Jedoch ist dieses Verfahren sehr ineffizient in den meisten Modellen mit nur wenigen Ausnahmen , wie beispielsweise einige Knochentropen 4T1 Subklone 5-6 und MSP überexprimiert PyMT transgenes Mausmodell 7. Wir hoffen, dass die IIV Injektion neue Einblicke in die Knochen Kolonisierungsprozess bieten wird, was wiederum das Design und die Entwicklung von wirklich effizient spontanen Knochenmetastasen Modelle für präklinische Studien erleichtern kann.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Pen/Strep Amphatericin B | Lonza Biowhittaker | 17-745E | |
| PBS | Lonza Biowhittaker | 17-516F | |
| Trypsin/EDTA solution | HyClone | SH30042.01 | |
| 45 μM cell strainer | VWR International Laboratory | 195-2545 | |
| MediGel CPF with carprofen | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Buprenorphine | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Estradiol pellet | Innovative Research of America | SE-121 | |
| Ketamine and xylazine | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| Vet ointment | Controlled item from veterinary care in BCM | Avoid eye dryness | |
| Shaver | Oster | 78005-050 | For furred mice |
| Isopropyl ethanol | ACROS | 67-63-0 | |
| Betadine surgical scrub | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| #10 scalpel blades | Ted Pella, Inc | 549-3CS-10 | Multiple |
| No. 3 handle | Ted Pella, Inc | 541-31 | Need to be autoclaved |
| Sterile surgical drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | |
| Straight forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5132 | Need to be autoclaved |
| Straight fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | Need to be autoclaved |
| Edged fine forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | Need to be autoclaved |
| 4-0 Vicryl silk suture | Johnson & Johnson Health Care | J214H | |
| 31 G insuline syringes | BD | 328418 | Multiple |
| Q-tips cotton swabs (Sterile) | VWR International Laboratory | 89031-272 | |
| Skin glue | Henry Schein Animal Health | 31477 | For surgery site skin closure |
| Ear Tag Applicator | Fine Science Tools | 24220-00 | |
| Ear tags | Fine Science Tools | 24220-50 | |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK | Avoid light and put on ice |
| 28 G insulin syringes | BD | 329410 | For intra-orbital injection |
| Paraformadehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation |
| EDTA | OmniPur | 4050 | For bone tissue decalficication |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E stereo | |
| IVIS Lumina II imaging system | Advanced Molecular Vision | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP antibodies (JL-8) | Clontech | 632381 | |
| Anti-ALP antibodies | Abcam | ab108337 | |
| Anti-Osterix antibodies | Abcam | ab22552 |
References
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