Summary
Her er en protokoll for å høste, vedlikeholde og behandle mus tynntarms organoids med patogen forbindelse molekylmønstre (PAMPs) og Listeria monocytogenes er beskrevet, så vel som vekt på genekspresjon og riktig normaliserings teknikker for protein.
Abstract
Primære intestinal organoids er en verdifull modellsystem som har potensial til å betydelig påvirke feltet av slimhinne immunologi. Men kompleksiteten i de organoid vekstegenskaper bære betydelige begrensninger for etterforsker. Spesifikt vekstmønster for hver individuell organoid er svært variabel og skape en heterogen populasjon av epitel-celler i kultur. Med slike betingelser, felles vevskultur praksis, kan ikke bare brukes på organoid systemet på grunn av kompleksiteten av cellestrukturen. Opptelling og Plating basert utelukkende på cellenummer, som er felles for individuelt separerte celler, slik som cellelinjer, er ikke en pålitelig metode for organoids med mindre noe normalisering teknikk er anvendt. Normalisering til totalt proteininnhold er gjort komplekse på grunn av den fastboende proteinmatriks. Disse egenskapene når det gjelder cellenummer, form og celletype bør tas i betraktning ved vurdering av utskilt contelt fra organoid masse. Denne protokollen er blitt generert for å skissere en enkel prosedyre til kultur og behandle tynntarms organoids med mikrobielle patogener og patogen assosiert molekylære mønstre (PAMPs). Det understreker også normaliserings teknikker som skal brukes når protein analyse gjennomføres etter en slik utfordring.
Introduction
Evnen til å høste og kultur primære organoids er blitt beskrevet for tynntarm, tykktarm, bukspyttkjertel, lever og hjerne og er spennende fremskritt relevante for forståelsen en mer fysiologisk fenomen representative for vev biologi 1-5. Den første fremgangsmåter som beskriver kulturen og vedlikehold av tynntarms organoids ble rapportert av Sato et al., Ut av laboratoriet til Hans Clevers 1. Forut for denne metoden, høsting og kultur av primære intestinale epitelceller viste seg å være begrenset og ineffektiv i å opprettholde epitelial cellevekst. Fremgangsmåter følger dissosiasjon av vev via inkubering med enzymer, så som kollagenase og dispase, som til slutt ville føre til utveksten av blandede primære fibroblastceller 6. Disse forholdene vil også bli tid begrenset i å opprettholde den epiteliale cellekultur. Minimal til ingen epitelcelle nisje vil danne, som epitelcellene ville komme inn på grunn av apoptoseav mangel på egnede vekstfaktorer eller tap av kontakt integritet, betegnet anokis 7. Ankomsten av den 3D-organoid kultursystem er tilveiebrakt en fremgangsmåte for å dyrknings primære tarmceller som inneholder et spektrum av tarmcelletyper i kultur vedvarende 1. Disse epiteliale organoids ha fordeler i forhold til cellelinjer er at de er sammensatt av flere differensierte celler, og bedre etterligner organet de er avledet fra in vivo 8. Prosessen til slutt "vokse en mini gut i en skål" har vist seg å være et verdifullt verktøy for å vurdere responsen tarmepitelet under forskjellige stimuli. Gransker samspillet mellom primærtarmceller med mikrobielle patogener forbundet molekylære mønstre (PAMPs) er relevant til feltet av immunologi som disse molekylære mønstre kan regulere ulike svar fra både vert og mikrobe 9. Ikke bare kan etterforskerne nå utforske disse interaksjoner med muse organoids, men dekan dyrkes fra mennesker som vel to. Denne teknologien har potensial til å dramatisk endre personlig medisin, og det er fristende å spekulere om fremskritt at denne teknikken vil gjøre mulig i nær fremtid.
Det overordnede målet med denne metoden er å tilveiebringe en protokoll for kulturen, ekspansjon, og behandling av tarm organoids med en rekke stimuli. Slike stimuli kan til slutt være alt fra vaksiner, bakterielle PAMPs, live patogener, gastrointestinal (GI) og kreftbehandling. Isoleringen og kultur av mus tarm organoids har blitt tilpasset fra Sato et al. Selv om det er mindre avvik fra den opprinnelige metoden, at sluttproduktet blir organoid kulturen er fremdeles oppnås ved å følge denne protokoll. Denne metoden er fokusert på å beskrive en tilstrekkelig teknikk for riktig normalisering når du arbeider med ikke-homogene cellestrukturer, som må tas i betraktning når man gjennomfører en analyse basert på celle numbra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning ble godkjent og gjennomført under Virginia Tech IACUC retningslinjer
1. Forbered R-Spondin1 Betinget Media Fra HEK293T-Rspo1 cellelinje
- Generering av HEK293T-Rspondin1 celler er blitt beskrevet tidligere 10. Seed HEK293T-Rspondin1 utsondrende celler ved 5-10% konfluens, ca 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 celler, i en T-175-kolbe med 40 ml 1 x Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) + 10% føtalt bovint serum ( FBS) i vekstmediet, og inkuber ved 37 ° C + 5% CO2.
MERK: vekstmedier for HEK293T-Rspondin1 sekresjonsceller vil tjene som R-spondin1 kondisjonerte medier. R-spondin1 kan alternativt kjøpes som et rekombinant vekstfaktor som ble brukt ved en sluttkonsentrasjon på 500 ng / ml. - Grow de HEK293T-Rspondin1 celler i syv dager eller til du kommer til 95% konfluens bestemmes av lyse felt mikroskopi. Høste 40 ml kondisjonert medium og overføring til en 50ml konisk tube. Kast T-175 kolbe HEK293T-Rspondin1 sekresjonsceller.
- Sentrifuger røret som inneholder kondisjonerte medium ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C for å pelletere cellerester. Samle supernatanten, betegnet R-spondin1 kondisjonert medium, og alikvoter inn i 15 ml rør. Oppbevar alikvoter ved -20 ° C for kortsiktig eller -80 ° C for langsiktig lagring.
MERK: Når tint, R-Spondin1 klimaanlegg medier kan lagres i opptil en uke en 4 ° C.
2. Utarbeidelse av Organoid Vekst Media og reagenser for innhøsting Small Intestinal krypter
- En dag før høsting, plasserer den frosne protein matrise på is og tine over natten ved 4 ° C. Autoklav dissekere saks, pinsett og glassplater som skal brukes til krypten innhøsting.
- Dagen etter, begynne med å forberede 40 ml organoid vekstmedier som inneholder kosttilskudd og vekstfaktorer ved å legge aksje konsentrasjoner 40 ml 1x DMEM / F-12. Media kosttilskudd inneholder: 10 mM 2- [4- (2-hydroksyetyl) piperazin-1-yl] etansulfonsyre (HEPES) - 400 ul, 1x glutamin supplement - 400 ul, 1x B27 uten vitamin A - 400 ul, 1x N2 - 200 ul, 1 mM N-acetyl-cystein - 40 ul, 100 ng / ml m-Noggin - 40 ul, 50 ng / ml m-EGF - 4 pl og sted i et 37 ° C vannbad inntil bruk. Varm en 15 ml porsjon av R-spondin1 til 37 ° C i et vannbad.
- Varme tre sterile 24-brønners plater til 37 ° C i minst 30 min ved å plassere i en inkubator. Fremstille 50 ml pr mus 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) + 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og avkjøles til 4 ° C. Fremstille 100 ml pr mus 1 x PBS inneholdende 10% FBS og avkjøles til 4 ° C.
3. Høsting Mus musculus Small Intestinal krypter for Organoid Culture 1
- Ofre en mannlig C57B6 / J mus alder 6-12 uker gamle oppvokst på standard gnager chow og vann tilgjengeligad libitum i henhold til institusjonelle retningslinjer. Avlive via CO 2 kvelning fulgt ved halshugging.
MERK: Hold kadaver på is inntil vev avling og utføre vevet innhøstingen i et biologisk sikkerhetskabinett for å minimere risikoen for forurensning.
Merk: En mannlig eller kvinnelig mus kan brukes til å generere organoids. - (Valgfritt) Shave musa for å fjerne pelsen før oppslukt i 70% etanol. Dyppes musen i 70% etanol i 2 min og pin lemmer for å feste brettet med ryggsiden av musen berøre styret.
- Bruk pre-sterilisert dissekere saks og pinsett for å gjøre et midtlinjesnitt på ventral del av musen. Gjør snittet på genitalia utgår kranie til bunnen av nakken. Åpne huden snittet sidelengs med pinsett og pin huden til å feste styret å utsette bukhinnen.
- Lag en midtlinjen snitt i peritoneum av magen med dissekere saks og brett the peritoneum med tang sidelengs og pin til låsing styret for å avdekke abdominal organer.
MERK: Pass på å unngå å kutte abdominal organer. - Fjern det tynntarmen fra bukhulen med å dissekere tenger og sakser ved å kutte den proksimale krysset av tynntarmen som er koblet til magen og den distale knutepunkt koblet til blindtarmen. Plasser tynntarmen i en steril petriskål inneholdende 10 ml iskald 1 x PBS.
- Spyle ut innholdet som finnes i hulrommet i tynntarmen med iskald 1 x PBS ved anvendelse av en 1 ml pipette. Gjenta dette trinnet til rusk inne i hulrommet i tynntarmen er fjernet.
- Skjær tynntarmen med dissekere saks inn 3-4 omtrent like lange strimler og legg strimlene i lengderetningen på en ny steril petriskål. For hver stripe, setter forkant av dissekere saks inne i lumen av tynntarmen for å gjøre et snitt hele lengden of stripen. Bruk pinsett til sideveis åpen flipp snittet for å avdekke lumen i tynntarmen.
- Bruke en steril glassplate til forsiktig skrape bort villi på den luminale overflaten av tynntarmen. Skjær tynntarmen til 1-2 cm lengde strimler med disseksjonssaksen og overføre disse strimler til en 50 ml konisk rør inneholdende 10 ml iskald 1 x PBS.
- Blande innholdet forsiktig ved å snu 50 ml konisk rør og tillate vevet innholdet fikk sette seg på bunnen av 50 ml konisk rør. Aspirer 1 x PBS og gjenta dette tre ganger ved vasking av vevet med 10 ml iskald 1 x PBS. På den siste vaske forlater det koniske rør på is i 10 min inneholdende 10 ml 1 x PBS og tynntarmen vev segmenter.
- Aspirer 1x PBS og tilsett 25 ml 1x PBS + 2 mM EDTA. Sett på en gynge plattform ved 4 ° C eller i en isen bøtte i 45 min. Mens vevet ruger, merke seks 15 ml koniske rør "brøkdel # 1-6."
- Tillat vevet innholdet fikk sette seg på bunnen av røret. Fjerne og overføre supernatanten til røret 15 ml konisk merket "fraksjon 1". Gjenta 1x PBS + 10% FBS risting trinn (3.11) fem ganger og Overfør supernatanten innhold, for å det passende merkede fraksjon rør.
- Sentrifuger ved 125 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender pellets i 5 ml forvarmet 1x DMEM / F-12, uten vekstfaktorer lagt.
- Sentrifuger ved 78 x g i 2 min. Sug av 4 ml av supernatanten og resuspender pelleten i hver en ml av resterende media.
- Fjern 20 ml fra hver fraksjon og legge til et glass lysbilde. Visualiser krypter og rusk under et lysmikroskop og bestemme hvilke fraksjoner å kombinere og basseng tilsvarende for å oppnå størst Percentage av krypter til rusk ratio.
MERK: Fraksjoner 2-6 ga den største prosentandelen av kryptene som skal pletteres. Fraksjonene til bassenget er oftest brøkdel 3 med brøk 4, og fraksjonen 5 med brøk 6. - Sentrifuger fraksjonene som skal bli belagt ved 125 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten forlater 50-100 ul gjenværende ovenfor pelleten.
- Hold rørene på is og tilsett 1 ml protein matrise til de sammenslåtte fraksjoner. Pipet opp og ned sakte for å hindre tilførsel av luftbobler.
- Fjern forvarmet 24 brønners plater fra 37 ° C inkubatoren og tilsett 50 ul proteinmatrise / krypten suspensjon i midten av hver brønn. Overfør seeded-plate til en 37 ° C inkubator i 10 min for å muliggjøre at proteinet matrise slippe å stivne.
- Legg 450 mL av tidligere utarbeidet organoid vekstmedier + 50 mL av R-spondin1 kondisjonert medium per brønn. Inkuber platene ved 37 ° C + 5% CO 2 over natten.
- Legg 50-100 mL av R-spondin1 klimaanlegg medien per brønn daglig. Hver 3. dag erstatte hele organoid vekstmedier med nylagde organoid vekstmedier 450 ul / brønn er beskrevet i trinn 2.2. I tillegg legger 50-100 mL av R-spondin1 klimaanlegg media per brønn.
MERK: protein matrix fall opprettholder sin integritet i en uke, men etter 7 dager videre til aging organoids.
4. aging Organoids hver 7. dag
- Tine proteinet matrise på is over natten ved 4 ° C dagen før aging. Varm en steril 24-brønners plate til 37 ° C i minst 30 min. Forbered organoid vekstmedier som er beskrevet i trinn 2.2 og holde ved 37 ° C inntil bruk.
- Fjern organoid plate fra inkubatoren og starte aging av plate på is. Sug vekstmedier med en 10 ml pipette fra 3-4 brønner for å starte.
MERK: Hold den aspirerte materialet i 10 ml pipette, da dette vil bli brukt til å løsne proteinmatriks fallet i neste trinn. - I såpiratkopierte-brønner, pipette opp og ned for å løsne protein matrix slipp fra platen. Lett skraping med spissen av en 10 ml pipette er nyttig i dislodging proteinet matrix slipp. Overfør innholdet til et 15 ml konisk rør.
- Inkuber 15 ml koniske rør på is i 10 minutter og sentrifuger ved 125 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Observere en hvit pellet på bunnen av det koniske rør. Forsiktig aspirer og kast de fleste av supernatanten / gamle organoid vekstmedier over organoid pellet forlater 100-200 mL over pelleten.
- Bryte opp organoid kryptene ved anvendelse av en 23 gauge nål festet til en 1 ml sprøyte. Aspirer og ta ut 10-15 ganger for å distansere krypter. Minimer luftbobledannelse på grunn av overdreven pipettering.
- Suspender organoids i 500 mL av protein matrix og tilsett 50 mL per brønn i et nytt forvarmet 24 brønners plate. Legg 450 mL av tidligere utarbeidet organoid vekstmedier + 50 ul av R-spondin1kondisjonerte media per brønn. Inkuber platene ved 37 ° C over natten.
5. Plating Organoids på dag 14 for mønstergjenkjenning Receptor Stimulering med PAMPs og Listeria monocytogenes for Gene Expression Analysis
- To dager før utfordring, strek ut L. monocytogenes på en BHI agar plate.
- Dagen etter plukke en L. monocytogenes koloni og vokse i 10 ml BHI-buljong ved 37 ° C over natten risting ved 200 rpm.
- Tine proteinet matrise på is over natten ved 4 ° C dagen før utfordring organoid. Varm en steril 24-brønners plate til 37 ° C i minst 30 min. Forbered organoid vekstmedier som er beskrevet i trinn 2.2 og holde ved 37 ° C inntil bruk.
- Fjern organoid kultur fra inkubator og starte aging av organoids.
- Sug media fra 3-4 brønner og holde den aspirerte materialet i 10 ml pipete da dette vil bli brukt til å løsne proteinmatriks slipp. Pipetter opp ogned for å løsne proteinmatriks fallet fra platen. Lett skraping med spissen av en 10 ml pipette er nyttig i dislodging proteinet matrix slipp. Overfør innholdet til et 15 ml konisk rør.
- Inkuber 15 ml koniske rør på is i 10 min. Sentrifuger ved 125 xg i 10 min ved 4 ° C. Observere en hvit pellet på bunnen av det koniske rør. Forsiktig aspirer supernatanten som går ca. 100 ul av gjenværende supernatant bak.
- Resuspender pellet organoid i 5 ml iskald 1 x PBS og fjerne en 10 pl prøve for telling. Tilsett 10 ul alikvot til midten av et hemocytometer uten glassdekkglass. Forsiktig overlappe dekkglass på toppen av fallet.
MERK: hemocytometer vil tette med organoids hvis glasset lysbildet ikke fjernes først. - Telle det totale antallet organoids via et lysmikroskop i hvert gitter / hele kammeret i hemocytometer og bestemme organoid konsentrasjon: number av totale organoids telles per 10 mL.
- Fjerne et passende volum fra 15 ml konisk rør som vil tillate tilstrekkelig antall organoids å bli sådd for analysen og sentrifuger av denne suspensjonen ved 125 xg i 10 min.
MERK: Området mellom 40-100 organoids per brønn i en 24 brønners plate er tilstrekkelig for RNA-analyse. Den typiske organoid størrelse kan variere fra 300 um til 1000 um i diameter. - Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 500 ml protein matriksen uten å skape luftbobler. Tilsett 50 ml organoid / protein-matriks suspensjon per brønn i en 24-brønners plate.
MERK: Mengden protein matrise brukes til å suspendere organoids vil variere for antall behandlingsforhold og tekniske replikater. - Legg 500 mL av organoid vekstmedium (uten N-acetyl-cystein) til hver brønn og inkuber ved 37 ° C + 5% CO2 i 1 time.
- Forbered 2x konsentrasjoner av PAMPs (dvs. flagellin,lipopolysakkarid) og lever L. monocytogenes. Mål OD av levende L. monocytogenes og biff på en BHI plate for telling. Unn organoids 1 x 10 6 kolonidannende enheter (CFU) / ml.
MERK: OD til CFU vilje vil variere fra bakterier skriver og bør vurderes før organoid stimulering. For eksempel, en OD på 0,6 ≈ 1 x 10 9 CFU / ml for L. monocytogenes, men bør også vurderes uavhengig før eksperimentet. - Strek ut en seriell fortynning av behandlingen lager av L. monocytogenes å nøyaktig bestemme behandling CFU / ml. Forfatterne synes som en 1 x 10 8 fortynning på 100 ul på en BHI-agarplate er tilstrekkelig til å telle koloniene for å bestemme en nøyaktig CFU / ml.
- Forbered en varme drept løsning av L. monocytogenes ved å ta en 1 ml porsjon av levende L. monocytogenes oppløsning og sentrifuger ved 5000 xg i 10 min. Aspirer supernatanten og vaskden bakterielle pellet med 1 ml av 1 x PBS.
- Sentrifuger L. monocytogenes ved 5000 xg i 10 min og resuspender pelleten i 1 ml av 1 x PBS. Varm drepe L. monocytogenes i et 1,7 ml polypropylenrør ved oppvarming ved 80-90 ° C i 1 time. Kultur en 100 ul alikvot av varme drept L. monocytogenes på en BHI agar plate for å bekrefte ingen levende bakterier forbli.
- Legg 500 mL av den aktuelle 2x PAMP og / eller mikrobe behandling til 500 mL bosatt media i utpekte brønner bestemmes av brukeren. Inkuber ved 37 ° C + 5% CO 2 i 24 timer.
MERK: Legge til en 500 mL delmengde av en 2x PAMP / mikrobe behandling til 500 mL av fastboende media vil bringe behandlingen konsentrasjon til 1x i et totalt volum på 1 ml.
- Dagen etter, manuelt telle L. monocytogenes kolonier for en nøyaktig bestemmelse av behandling CFU / ml. Sug media fra plate av behandlede organoids og vaske brønner three ganger med 1x PBS.
- Fortsett til RNA ekstraksjon via fenol / kloroform 11 eller RNA ekstraksjon kit i henhold til produsentens instruksjoner. Evaluer genuttrykk ved bruk av standard QRT-PCR 12.
6. plating Organoids på dag 14 for PAMP og L. monocytogenes Challenge for Protein Analysis i Overstående
- To dager før utfordring, starte en cellekultur av Caco-2 celler, seeding tetthet ≈1 x 10 6 celler i en T-75 kolbe med 1x DMEM + 20% FBS og inkuber Caco-2 celler ved 37 ° C + 5 % CO 2. Begynn en bakteriekultur av L. monocytogenes på BHI platen og inkuber platen i en bakteriell inkubator ved 37 ° C.
- Dagen etter plukke en L. monocytogenes koloni og vokse i 10 ml BHI-buljong ved 37 ° C over natten. Tine proteinet matrise på is over natten ved 4 ° C dagen før utfordring organoid.
- Dagen etter varme en steril 96 vel svart veggerplate til 37 ° C i minst 30 min. Forbered organoid vekstmedier uten N-acetyl-cystein som er beskrevet i trinn 2.2 og holde ved 37 ° C inntil bruk. Fjern organoid kultur fra inkubator og starte aging av organoids.
MERK: typisk organoid størrelse kan variere fra 300 um til 1000 um i diameter. - Sug media fra 3-4 brønner og holde den aspirerte materialet i 10 ml pipete da dette vil bli brukt til å løsne proteinmatriks slipp. Resuspender med en pipette for å løsne proteinmatriks fallet fra platen. Lett skraping med en 10 ml pipette er nyttig i dislodging proteinet matrix slipp. Overfør innholdet til et 15 ml konisk rør.
- Inkuber 15 ml koniske rør på is i 10 min. Sentrifuger ved 125 xg i 10 min ved 4 ° C. Observere en hvit pellet på bunnen av det koniske rør. Forsiktig aspirer supernatanten etterlot 100 ul gjenværende supernatant bak.
- Resuspender organoid pellet i 5 ml iskald1 x PBS og fjerne en 10 pl prøve for telling. Tilsett 10 mL delmengde til midten av en hemocytometer og forsiktig overlappe dekkglass.
MERK: hemocytometer vil tette med organoids hvis glasset lysbildet ikke fjernes først. - Telle det totale antallet organoids via et lysmikroskop i hvert gitter av hemocytometer / hele kammeret og bestemme organoid konsentrasjon: totalt antall organoids telles per 10 ml.
- Fjerne et passende volum fra 15 ml konisk rør som vil tillate tilstrekkelig antall organoids å bli sådd for analysen og sentrifuger av denne suspensjonen ved 125 xg i 10 min.
MERK: Mengden protein matrise brukes til å suspendere organoids vil variere for mengden av behandlingsforhold og tekniske replikater. Forfatterne finner at 40-100 organoids er tilstrekkelig for utskilt protein analyse. - Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 500 mL av proteinmatrise / brønn uten å generereluftbobler.
MERK: Mengden protein matrise brukes til å suspendere organoids vil variere for mengden av behandlingsforhold og tekniske replikater. - La det være minst to kolonner tom på 96-brønners sorte vegger vevkulturplate, da disse vil fungere som brønner utsådd med Caco-2-celler for generering av en standardkurve. Tilsett 50 ul protein matrise + organoid suspensjon per brønn i et forvarmet 96-brønners sorte vegger vevkulturplate. Oppbevar plate ved 37 ° C i 10 minutter for å tillate protein matrise for å størkne.
- Tilsett 100 organoid vekstmedium (uten N-acetyl-cystein) til hver brønn og inkuber ved 37 ° C + 5% CO2 i 1 time.
- Forbered 2x konsentrasjoner av PAMPs og leve L. monocytogenes. Tilsett 100 ml av hver gitt behandling tilstand per brønn og inkuber i 24 timer.
- Den følgende dag plate Caco-2-celler i standard kurve brønnene. Begynn med å varme sterile 1x PBS, 0,25% trypsin og 1x DMEM + 20% FBS to 37 ° C.
- Fjern T-75 kolbe som inneholder Caco-2 celler og aspirer cellekulturmedier. Vask cellene med 10 ml 1 x PBS. Aspirer 1 x PBS, tilsett 2 ml 0,25% trypsin og stedet T-75 kolbe i 37 ° C inkubator i 15 min.
- Visual kolben under et lysmikroskop for å sikre at cellene har løsrevet deretter legge til 8 ml 1x DMEM + 20% FBS til de frittliggende Caco-2 celler og overføre til en 15 ml konisk tube. Fjerne en 10 pl alikvot og telle cellene ved lysmikroskopi ved hjelp av et hemocytometer.
MERK: En øvre celletall på 60.000 celler / brønn fungerer godt og fortynninger kan gjennomføres for å generere standardkurven ned til 2500 celler / brønn. - Resuspender Caco-2-celler i proteinmatriks og tilsett 50 ul per brønn til hensiktsmessige brønner. Muliggjøre at proteinet matrisen å stivne ved 37 ° C i Caco-2 celler.
MERK: Vekstmedier for de Caco-2 celler trenger ikke å bli lagt etter størkning av proteinmassen. - Følgende24-timers behandlingstiden for organoid analysen, aspirer og lagre organoid cellulære supernatanten media og holde på is. Vask brønnene tre ganger med 1 x PBS. Tilsett 100 ul av 100% metanol til hver brønn inkludert de Caco-2 standard kurve brønner og inkuber ved 4 ° C eller på is i 20-30 minutter for å løse organoids.
MERK: Det er ikke nødvendig at Caco-2 standard kurve brønner vaskes med 1x PBS, som de kan ha metanol tilsatt direkte. - Etter metanol inkubasjonen vaskes brønnene tre ganger med iskald 1 x PBS. Oppbevar platen ved 4 ° C i opp til 1-2 uker.
- Legg nukleær farging fargestoff i en konsentrasjon på 1 ug / ml per brønn, dekke platen med aluminiumsfolie og inkuberes ved 4 ° C over natten.
- Bruker en 96-brønners plateleser til å måle nukleær farging fargestoff eksitasjon / emisjon (350nm / 461nm henholdsvis) og normalisere hver organoid tillegg til standardkurven av Caco-2-celler.
- Fortsett til nedstrøms analyser, for eksempel ELISA
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når du følger denne protokollen for å dyrke tarm organoids, vil karakteristiske sfære formet organoids være tilstede etter høsting. Tilsetting av R-spondin1 klimaanlegg media daglig vil starte vekst og spirende av organoids. Veksten av organoids er vist i Figur 1A - F, og er representative for tarm organoids på dagene 1, 2, 4, 5, 6 og dag 14. Figur 1F viser de ikke-homogene vekstkarakteristika av organoids på dag 14.
Når organoids er vokst til et tilstrekkelig antall, kan de bli sådd ut og utfordret med forskjellige PAMPs og / eller mikrober. Ekspresjon analyse kan bli utført via standard teknikker. Dette er representert i figur 2A-C som viser mRNA-ekspresjon av inflammatoriske cytokiner IL-18, IL-6 og TNFa som ble analysert etter en24 timers utfordring av organoids med varme drept L. monocytogenes og PAMP flagellin. Begrunnelsen for evaluering av mRNA-ekspresjon cytokinene IL-18, IL-6 og TNFa var at disse var gode kandidater for å bli modulert av epitel-celler i respons til patogene utfordring, og modulering av disse inflammatoriske cytokiner vil demonstrere effektiviteten av teknikken.
Figur 3A - C viser den relative atom farging av tarm organoids med nukleær farging fargestoff etter fiksering med minimal bakgrunnsfarging av rusk i bosatt protein matrix. Denne metoden for fiksering og farging kan brukes til å normalisere analyser, noe som vil står for forskjellige celletall i hver brønn. Dette er tydelig i figur 4 ved generering av en standardkurve av seriefortynninger av Caco-2-celler sådd ut i proteinmatriks, deretter fiksert og farget med atomfarging fargestoff. R 2 verdi på 0,89 indikerer et lineært forhold mellom cellenummer og bety fluorescerende intensitet, og den lineære ligning kan brukes til å normalisere organoids til celleantall. Standardkurven er vist i figur 4, begynner å nå metningsgrensen utover 30.000 celler per brønn. En titrering av celler ovenfor 30.000 celler per brønn er vist i figur 4 for å inkludere metnings utvalget av nukleær farging fargestoff. Økt nøyaktighet av normalisering vil bli oppnådd med en celle nummer som gjenspeiler den lineære området for nukleær farging fargestoff før metningsgrensen er nådd.
Figur 1:. Small Intestinal Organoid Vekst Tid løpet av vekst for murine tynntarm avledet organoids følgende isolasjon. (A) Dag 1. (B) Dag 2. (C) Dag 4. (D) Dag 5. (E) Dag 6. (F) Dag 14. Bildene er representative for organoid vekst for hver gitt dag. Skala barer lik 200 mikrometer i det venstre bildet for A, B, C, D og E. skala barer lik 100 mikrometer i det rette bildet for A, B, C, D og E. skala barer lik 1000 nm og 200 nm for venstre og høyre bilde for F, henholdsvis. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: mRNA-ekspresjon av inflammatoriske cytokiner Etter 24 timers PAMP Challenge Relative mRNA-ekspresjon av villtype-tarm organoids utfordret i 24 timer med PAMPs og varme drepte Listeria monocytogenes (A - C) representerer gangers endring av i.. nflammatory cytokinene IL-18, IL-6 og TNFa respektivt. Feilfelt representerer standardavvik (SD) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Relativ Fluorescent Farging av Organoids for Normalisering Nuclear farging av organoids med følgende fiksering.. (A) Bright felt av organoids. (B) Fluorescent farging av organoids med kjernefysiske farging fargestoff. (C) Sammenslåtte bilde av lyse felt og fluorescerende farging. Skala barer lik 400 mikrometer i alle bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: standardkurve ble generert fra Caco-2-celler Standard kurven som genereres fra triplikate brønner.. Cell seeding hadde en rekke starter på 60.000 celler per brønn med fortynninger ned til 2500 celler per brønn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Oversikt over Protocol Diagram 1-øvre delen av figuren viser høsting av R-spondin1 kondisjonerte medier. 2-Middle Panel av figuren illustrerer aspekter av protokollen til å høste og kultur mus tynntarms organoids. 3-baksidepanelet av figuren illustrerer: (A) plating av 14 dagers dyrkede organoids. (B) Challenge med PAMPs / L.monocytogenes, og forlater ledig brønner for å generere en standardkurve. (C) Ved å følge PAMP utfordring, plating av Caco-2-celler i de tidligere ledig brønnene for å generere en standardkurve. (D) Etter fiksering og tillegg av en kjernefysisk farging fargestoff, måle eksitasjon / emisjon av brønnene og normalisering mot en standardkurve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kulturen og vedlikehold av tarm organoids er en prosedyre som kan mestres av enhver person med tilstrekkelig vev kultur teknikk. Det er Raffinert i aging når sammenlignet med voksende celler i en mer konvensjonell monolag, men disse finesser er ikke vanskelig å overvinne. De kritiske trinnene i denne fremgangsmåten involverer å være i stand til å vokse organoids til en tilstrekkelig høy tetthet for optimal poding. Eksperimenter må skaleres ned med organoids som store seeding tettheter som kan vanligvis oppnås med cellelinjer er ikke praktisk. Dette blir spesielt tydelig når det er flere behandlingsgruppene.
Denne protokollen er ment å gi en trinn-for-trinn metode for å studere vert-patogen interaksjoner av tarmepitelet med en rekke forskjellige bakterie, virus, og sopp-patogener, samt adresse vanskeligheter ved hjelp av dette systemet med hensyn til normalisering. Rapporter er tilgjengelig som describe interaksjoner av tarm organoids med bakteriell patogen Salmonella, men ikke ta normaliserings metoder ved måling utskilles cytokiner 13.
Det er flere problemer som er oppstått når normalisering organoid kulturer med ulike metoder. Normalisering utskilt protein via bicinchoninic syre assay (BCA) er et alternativ; Veksten komponentene som kreves for organoid kultur (N2 og / eller vitamin B27) interferere med BCA-analyse Normalisering (data ikke vist) via cellulære levedyktighet, slik som en modifisert MTT-assay er blitt beskrevet 14.; imidlertid, er en behandling som vil forandre mitokondrie metabolske aktiviteten til de organoids vil innføre en unøyaktig metode for normalisering via denne teknikken basert på MTT-reduksjon ved innvirkning av mitokondrielle dehydrogenaser 15. Det er også nødvendig å fjerne N-acetyl-cystein (NAC) fra mediet, ikke viderely hvis normalisering til ved MTT teknikk er ønskelig, men hvis behandling med en bakteriell patogen som NAC kan hemme bakterievekst 16.
Fordeler med denne teknikken er at utskilling av cytokiner og proteinproduktene fra organoids kan nå være normalisert mot en standardkurve av Caco-2-celler. Begrensninger av denne teknikken er at normaliseringen er correlative fordi kjernefysiske farging av ikke-transform primære epitelceller organoids er normalisert mot atom farging av en tykktarmskreft cellelinje. Forfatterne finner at å fikse med metanol og farging kjerner med atom farging fargestoff er en effektiv teknikk for normalisering mot en standard kurve av Caco-2-celler. Selv om vekst egenskapene til denne tykktarmskreft cellelinje ikke akkurat ligne vekst egenskapene til tarm organoids, ved hjelp av en kjernefysisk flekken og måle gjennomsnittlig fluorescens intensitet er en god strategi for å normalisere mot total celle nummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Freshney, R. I., Freshney, M. G. Culture of epithelial cells. 2nd edn. , Wiley-Liss. (2002).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
- Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
- Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
- Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
- Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).
