Introduction
Рак молочной железы является наиболее часто диагностируемых рака у женщин и второе место среди причин , связанных с раком смертей 1. высокий уровень смертности от рака молочной железы является, главным образом, из-за отказа от традиционной терапии для смягчения и ликвидации метастазами; приблизительно 90% случаев смерти от онкологических заболеваний обусловлены метастазирования 2. Понимание основных молекулярных механизмов метастатического каскада имеет первостепенное значение для разработки эффективных терапевтических средств, как в раннем и рака молочной железы на поздней стадии.
Прошлые исследования помогли выяснить многоступенчатый характер метастазирования рака молочной железы , и он выдвинул гипотезу о том , что исход как прогрессии рака и метастазов во многом зависит от взаимодействия между раковыми клетками и принимающей среды 3. Клинические наблюдения показывают , что многие виды рака органа отображения тропизм, то есть., Склонность к метастазированию преимущественно к конкретным organs.In КАНе рака молочной железы, болезни пациента , как правило , распространяется или метастазирует 5 основных сайтов, в том числе кости, легких, лимфатических узлов, печени и головного мозга 4-6. Многие теории были разработаны, чтобы объяснить этот процесс, но лишь немногие из них выдержали испытание временем. Теория Юинга метастазирования, предложенный в 1920-х годах, выдвинул гипотезу thatthe распространение метастаз строго из-за механических факторов; в результате чего опухолевые клетки разносятся по всему телу нормальных определенных закономерностей физиологического кровотока и просто арестовывают в первом капиллярного ложа они сталкиваются с 7. В отличие от 1889 года "семена и почва" гипотеза Стивена Педжета предположил, что дополнительные молекулярные взаимодействия были ответственны за выживание и рост метастазов, в результате чего раковые клетки ( "семена") могут только утвердиться и proliferatein микросреды органов, которые производят соответствующие молекулярные факторы ( "почвы ") 8. Почти столетие спустя, Леонард Вайсс подвзял мета-анализ ранее опубликованных данных аутопсии и подтвердили предсказание Юинга, что многие метастатические опухоли, обнаруженные во время вскрытия были найдены в ожидаемых пропорциях, которые можно было бы ожидать, если метастатической тропизм орган был определен узорами кровотока в одиночку. Тем не менее, в manyinstances были сформированы на определенных участках , то можно было бы ожидать от предложенных механических факторов Юинга 9 меньше или больше метастаз. Эти счета и теории говорят о том, что специфические микросреды органа играют решающую роль в моделях распространения и последующего роста и выживания многих видов рака, включая рак молочной железы.
Прошедшие исследовательские усилия в основном сосредоточены на опухолевых клеток , полученных факторов и их вклад в тропности органов наблюдается в метастазирования рака молочной железы 10-12, однако мало исследований изучены факторы , полученные из микросреды органа , который может обеспечить благоприятную нишу для созданияот метастазов рака молочной железы. Во многом это связано с техническими проблемами изучения компонентов микросреды органа в пробирке.
Настоящая статья описывает всеобъемлющую систему исключая виво модель для изучения влияния растворимых компонентов лимфатических узлов, костей, легких и головного мозга на метастатической поведение клеток рака молочной железы человека. Предыдущие исследования подтверждены этой модельной системе, продемонстрировав , что различные клеточные линии рака молочной железы отображать линии клеток и специфический органоспецифический злокачественную поведение в ответ на орган-кондиционированной среды , что соответствует их в естественных условиях метастатического потенциала 13. Эта система модель может быть использована для выявления и оценки конкретных органов, полученных растворимые факторы, которые могут играть определенную роль в метастатической поведении рака молочной железы и других видов раковых клеток, в том числе факторов, влияющих на рост, миграция, стволовой как поведение и экспрессию генов, а также идентификациипотенциальные новые терапевтические мишени для рака. Это первая система естественных условиях модель ех , которая может быть использована для изучения органоспецифической метастатическое поведение в деталях и оценить роль органов , полученных растворимых факторов в продвижении процесса метастазирования рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных были проведены в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными, в соответствии с протоколами, утвержденными Западного Университета использования животных подкомитета.
1. Выделение органов (легких, мозга, костей, лимфатических узлов)
- Подготавливают четыре стерильных 50 мл конические пробирки (по одному для каждого органа должны быть изолированы), содержащий приблизительно 30 мл стерильного фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Предварительно взвешивают каждую пробирку PBS с помощью электронного баланса.
- Эвтаназии 6-12 недель старая мышь с помощью CO 2 ингаляции. Мыши должны быть оставлены в камере СО 2 в течение приблизительно 1 - 2 мин или пока мышь перестает двигаться и дышать. Успешное эвтаназии может быть дополнительно подтверждено отсутствие пульса при проверке вручную с помощью пальца. Избегайте шейки дислокации, как этот метод может привести к разрыву кровеносных сосудов шеи, приводящей к сложности удаления подмышечных лимфатических узлов.
Примечание: Предыдущая работа специально используетсяздоровых самок голых мышей, Hsd: бестимусной Nude- Foxn1 ню 13. - В стерильной капот культуры ткани, поместите курсор на его спине на поролоновую подкладку полистирола, распространение конечности и использовать булавки, чтобы держать их на месте.
- С помощью стерильного пинцета и ножниц, перерезал кожи живота на срединной линии на гениталии и разрезают вверх по направлению ко рту. Аккуратно оттяните кожи живота от мышц живота и пин-код на своем месте на пенополистирола площадку.
- Найдите подмышечные, плечевой и паховые лимфатические узлы.
Примечание: Лимфатические узлы обычно окружены жировой тканью. Паховых лимфатических узлов легче всего обнаружить, поскольку они встречаются поверхностно на стыке двух кровеносных сосудов на отстранился кожу живота. Подмышечные и плечевая лимфатические узлы расположены глубже в ткани и требуют нежную маневрирование ткани.- После того как вы расположены лимфатические узлы, не используйте ножницы, чтобы мягко и осторожно разрезал лимфы нетдез от кожи, жира и сосудов и удалить их с помощью мыши. Для того, чтобы подтвердить правильность рассечение, раскатать пинцетом над удаленной ткани. Если жесткий комок существует при прокатке пинцетом над тканью, то лимфоузел, скорее всего, был успешно удален.
- Поместите удаленные лимфатические узлы в охлажденный льдом PBS.
- С помощью пинцета и ножниц, откройте брюшной полости путем разрезания через открытую брюшную стенку в движении вверх по направлению к грудной клетке. Осторожно прорезать грудины, обнажая грудную полость.
- Найдите диафрагму ниже легкие и разрезают диафрагму. Она должна оттянуть ребер из-за напряженности.
- Поднимите легкие снизу и перерезали основной ткани в сторону трахеи. Это позволяет легкие быть свободно удалены из грудной полости. Удалить сердце и легкие единым блоком и место в охлажденный льдом PBS. Сердце может быть удалена из легких здесь или как раз перед взвешиванием на шаге 2.
- Удалитьбулавки, держа мышь в месте на пенополистирола площадку. Переверните мышь и разрезают кожу нижней части спины на всем пути через дорогу от фланга на фланг.
- Используя стерильный кусок марли, чтобы держать туловище мыши, очистить кожу спины мыши над ног и ступней мыши.
- Используя тот же кусок стерильной марли, держать нижнюю часть ноги на месте, тщательно сломать голеностопный сустав стопы мыши и очистить кожу над суставом проксимально в сторону коленного сустава.
- Используя ножницы, удалите берцовую кость, свободную от коленного сустава и место в охлажденный льдом PBS.
- Повторите шаги 1.11) до 1.12) с противоположной конечности.
- Использование щипцов, удерживая бедренной кости в месте, срежьте окружающих мышечной ткани с помощью ножниц и удаления бедренной кости, помещая его в охлажденном льдом PBS.
- Повторите шаг 1.14) с противоположной конечности.
- Используя новый кусок стерильной марли, держать голову мыши на месте. С помощью пинцета и ножниц, аккуратно снять кожу, чтобы выставить SКулл. С помощью ножниц, аккуратно вырезать затылочной череп от верхней центральной в прямой и нисходящей линии, чтобы выставить задний мозг.
- Использование щипцов, совка под мозгом по отношению к передней и удалить весь мозг. Поместите мозг в охлажденный льдом PBS.
- Повторите 1.1) до 1.17) шагов, по крайней мере, четырех мышей.
2. Орган взвешивания
- После выделения органа, взвешивать каждую пробирку, содержащую PBS легких и мозговой ткани с помощью электронного баланса.
- Вычислить разность веса путем вычитания веса предварительной изоляции (только PBS), от веса трубы PBS + органов (легких и головного мозга).
- Определить количество медиакритериев для ресуспендирования фрагментов тканей из вычисленной разности веса.
Примечание: легких и ткани головного мозга являются вес нормализуется ресуспендирования в 4: 1 СМИ: соотношение ткани (объем / вес).
3. Генерация Lung- и кондиционированной среды мозгового
- В стерильную тпроблема культуры капот, инвертировать PBS пробирки, содержащие легкие или мозг в три раза, чтобы удалить остатки крови из органов и аспирата PBS, содержащих кровь. Повторите со свежим холодным PBS, пока раствор не становится ясно, без признаков крови.
- Поместите легкие и мозг в отдельных 60 мм 2 стеклянные чашки Петри. С помощью двух стерильным скальпелем лезвия, фарша легкие или мозги, неоднократно нарезка взад и вперед до тех пор , пока фрагменты ткани примерно ~ 1 мм 3 размера.
- фрагменты Ресуспендируют ткани в соответствующем объеме (определено ранее на шаге 2.3) Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM): F12, дополненной 1х концентрированный митоген добавку и пенициллином (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл).
- Добавить ресуспендировали в легких или ткани головного мозга фрагментов в одну лунку 6-луночного планшета.
- Инкубируйте фрагментов тканей в средствах массовой информации в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2. После инкубации собирают кондиционированная среда для каждой ткани и Further разбавить, добавив три эквивалентные объемы свежей среды в 50 мл коническую трубку.
- Центрифуга при 1000 х г в разбавленном кондиционированной среды для каждого органа при температуре 4 ° С в течение 15 мин для удаления крупного мусора ткани. Сбор средств массовой супернатант и фильтруют через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
- Бассейн кондиционером средств массовой информации из каждого органа (то есть., Легких с легких и головного мозга с мозгом) из нескольких мышей для учета мыши к мыши изменчивости. Аликвоты и хранят кондиционированная среда при температуре -80 ° С до использования.
4. Генерация костного мозга кондиционированной среды
- В стерильной культуре ткани капот, обрезать лишнюю ткань от кости и удалить эпифизов (концевые части) из костей с помощью ножниц.
- С помощью 27 ½ G иглы заподлицо костномозговой полости кости, нажав 1 мл PBS, через центр каждой кости. Это позволит вам собрать стромальных клеток костного мозга (СККМ) в свежую пробирку, содержащую PBS.
- Центрифуга на 1,000 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С и промыть BMSC дважды PBS. Ресуспендируют костного мозга стромальные клетки в 20 мл среды роста костей стромальных клеток (DMEM: F12, дополненной 1х концентрированный митоген добавку, пенициллин (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл) и 10% фетальной Бовену сыворотки (FBS) ).
- Пластина 10 мл ресуспендировали стромальных клеток костного мозга в одной колбе Т75.
Примечание: Комбинирование и клетки пластины из каждых 2-х мышей в каждой колбе T75; для четырех мышей, два T75 колбах необходимы (приблизительно 1 × 10 7 клеток / колбу). - Выдержите кости стромальные клетки костного мозга в костном стромы средах роста клеток в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% СО 2. После инкубации удалить жидкость с обеих колбах Т75 и положить в новую колбу Т75, маркировать эту колбу, как "Летун Термос". Добавить свежую кость стромы СМИ роста клеток с предыдущими 2 колбах и инкубировать все 3 колбы при 37 ° С и 5% CO 2.
- После того, как клетки достигают примерно 70% сплошности (приблизительно 5 - 7дней) прохождение клетки. Чтобы сделать это, удалить средних и мыть клетки дважды PBS (3 мл каждого мытья). Удалить PBS и добавляют 3 мл трипсина / EDTA раствора, гарантируя, что трипсин покрывает всю поверхность колбы. После того, как клетки отрываться колбу (~ 2 - 3 мин), прекратить трипсином реакцию добавлением 3 мл костного стромальных клеток питательной среды). Центрифуга 900 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С, отказаться от средств массовой информации и ресуспендирования клеток в 10 мл свежей костной стромы сред роста клеток.
- Бассейн клетки из всех колб и проход 1: 5 в трех новых Т75 колбы и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО 2. После того, как клетки вновь достигнет 70%, повторите шаг 4,6 и бассейн и прохождения все прилипшие клетки во второй раз. Re-пластины все ячейки к четырем T75 колбах и инкубировать 37 ° C и 5% CO 2. Среды для выращивания стромальных клеток костного следует использовать для всех ступеней.
- Разрешить клетки достичь слияния, мыть клетки три раза PBS и добавьте кости стромы сбора клеток СМИ (DMEM: F12 СМИ + 1x сосредоточены митоген суpplement + пенициллин (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл); 10 мл / T75), убедившись, что этот носитель свободен от FBS. Сбор костного мозга кондиционированная среда 72 ч позже, фильтруют через фильтр 0,22 мкм, бассейн, аликвоты и хранят при -80 ° С до использования.
- При желании подтвердить фенотип изолированных клеток стромы костного мозга (BMSC) с использованием антител против мышиного ССС-1, CD105, CD29, CD73 и CD44, с использованием стандартных методов проточной цитометрии , как описано ранее 13.
5. Формирование лимфоузла-кондиционированной среды
- В стерильной капот культуры ткани, инвертировать PBS пробирки, содержащей лимфатические узлы три раза, чтобы удалить остатки крови из лимфатических узлов и аспирата кровавый PBS. Повторите со свежим холодным PBS, пока раствор не становится ясно, без признаков крови.
- Поместите лимфатические узлы в 60 мм 2 стеклянных чашках Петри. С помощью двух стерильным скальпелем лезвий, фарша лимфатических узлов, неоднократно не нарезая взад и вперед, пока Tissuе фрагменты приблизительно на 1 мм 3 в размере.
- В конической трубе, фрагменты ресуспендируют ткани в 10 мл Roswell Park Memorial института 1640 (RPMI 1640) , дополненной пенициллином (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл), 5 х 10 -5 М стерильного -меркаптоэтанол ( 1,75 мкл / 500 мл среды) и 10% FBS.
- Центрифуга при 900 х г в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют все клетки в 30 мл среды. Добавьте 5 мл среды / лунку в 6-луночные планшеты и инкубировали в течение 7 дней при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- После 7 дней инкубации, выбросьте носители, мыть прилипшие клетки с 5 мл теплой PBS и добавляют 5 мл свежей средой в каждую лунку. Разрешить клеткам расти до слияния (примерно 5 - 7 дней), Trypsinize, объединить все ячейки, и канал, как описано в шаге 4.6. Re-пластины ячейки на 6-луночный планшет. Повторите этот шаг три раза.
- После трех проходов, позволяют клеткам расти до слияния, мыть лунки три раза PBS и добавьте 2 мл / лунку DMEM: F12 + 1xконцентрированная добавка митоген и пенициллин (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл), гарантируя, что этот носитель свободен от FBS. Сбор лимфатических узлов с кондиционером СМИ после того, как 72 часа, бассейн, аликвоты и хранить при температуре -80 ° С до использования.
- При желании подтвердить фенотип изолированных клеток лимфатических узлов стромальных (LNSC) с использованием антител против CD45 мыши и gp38, с использованием стандартных методов проточной цитометрии , как описано ранее 13.
6. Использование Organ-кондиционированной среды ниже по течению Assays связанных с метастатическое поведение раковых клеток
- После того, как орган-кондиционированной среды было сформировано как описано в пунктах 1 - 5, использовать его для выполнения различных вниз по течению клетки и анализы молекулярной биологии с целью определения влияния растворимых органов, полученных факторов на метастатической поведение раковых клеток. Примеры стандартных анализов (описанных в другом месте в литературе) , включают белковые массивы 13, клеточные Анализы роста <SUP> 13, клеточной миграции анализах 13, tumorsphere образование 14 и RT-PCR 15. Исходные базовые средства массовой информации используются для создания Органосохраняющие кондиционированная среда (то есть, безусловная DMEM:. F12 , дополненной 1х концентрированный митоген добавку и пенициллин (50 мкг / мл) / стрептомицин (50 мкг / мл) следует использовать в качестве отрицательного контроля ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поколение органной кондиционером СМИ
Обзор схема / схема процесса выделения органов и генерации кондиционированной среды представлен на рисунке 1, с представительными фотоизображений процедуры , показанной на рисунке 2. Следует отметить , что , когда этот протокол был первым в стадии разработки, печень была включена в нашем анализе, потому что это общий сайт метастазов рака молочной железы. Тем не менее, из-за большого количества протеаз продуцируются и секретируются печенью, очень трудно держать печень жизнеспособный достаточно долго, чтобы произвести хорошее качество медиа обусловлены. Печень-кондиционированной среды также не является стабильным, как только изолированы, и там, как правило, много осадка белка, вероятно, по той же причине. Поэтому печень не была включена в какой-либо дальнейшего анализа.
(рис 3А) и BMSCs демонстрирует меньший внешний вид (рис 3C). Анализ проточной цитометрии подтверждает , что LNSCs в значительной степени CD45 - и gp38 +, с ~ 60% клеток , обладающих CD45 - gp38 + фенотип указывает LNSCs 16 (фигура 3В). В BMSCs должен быть положительным для CD44 и CD29, слабо положительной для CD105 и Sca-1, а также отрицательным для CD73 (рис 3D - H), что свидетельствует о BMSCs 17,18.
Рак молочной железы Cell Респonse в Органосохраняющие необходимости миграции паттерны и изменения экспрессии генов
С помощью этого ех естественных условиях модельной системы, ранее было показано , что клетки рака молочной железы человека с различной генетического происхождения демонстрируют дифференциальную миграцию и модели роста по отношению к конкретным условиям органа. Следует отметить, что эти модели отражают известные метастатических закономерности распространения этих клеточных линий в естественных условиях 13. В текущем исследовании, кости (231-BOM) - и легкого (231-LM2) -seeking варианты вариантов клеток рака молочной железы MDA-MB-231 человека (своего рода подарок от доктора Джоан Массаге 11,12) также были используется в Transwell анализа миграции для подтверждения органосохраняющие необходимости направления миграции. Результаты показывают , что остеотропный 231-бом вариант преимущественно мигрирует в костный мозг-кондиционированной среды над и lung- мозговой кондиционированной среды (рис 4A, слева). по аналогии, Легкое ищущим 231-LM2 вариант преимущественно мигрирует в легких кондиционерами СМИ более костного мозга кондиционером средств массовой информации и мозгом кондиционированной среды (рис 4A, справа). Кроме того, анализ RT-КПЦР показывает, что воздействие родительских MDA-MB-231 клеток рака молочной железы в костно или легкого-кондиционированной среды вызывает положительную регуляцию генов, ассоциированных с костным специфических метастаз (CXCR4, ИЛ-11, TGFß1) или lung- специфический метастазирование (VCAM-1) клеток рака молочной железы в естественных условиях 11,12 (фиг.4В). Эти результаты демонстрируют обоснованность системы ех естественных условиях в отношении ожидаемого органа тропности клеток рака молочной железы в естественных условиях, и указывает на то, что растворимые факторы , присутствующие в органе-кондиционированной среды могут влиять на метастатического фенотипа клеток в дополнение к содействию миграции.
Орган кондиционером Медиа Содержит Потенциальные растворимых медиаторов метастатического поведения
Массив антитела мыши биотин этикетка на основе была использована для оценки присутствия и идентификации общих растворимых факторов в органе-кондиционированной среды от различных органов. Этот массив включает в себя антитела против 308 наиболее распространенных растворимых proteins.This мыши массив белка ранее использовался для выявления растворимых факторов , представляющих интерес , связанный с метастатическим каскадного присутствует в легких и костного мозга кондиционированной среды , как показано в Чу и др (2014) и Пио и др (2015) соответственно 13,14. В текущем исследовании, результаты массива белка показаны для основных сред (рис 5А) по сравнению с лимфатической node- (рис 5B) и мозгом кондиционированной среды (рис 5в). Подчеркнула рядом с каждым из массива являются растворимые факторы , присутствующие в средствах массовой информации , которые были найдены , чтобы быть связаны с шагами в метастатической каскада в литературе 19-29. Эти растворимые FACторы могут быть стоит исследовать в качестве потенциальных медиаторов вторичных метастазов в пределах этих сайтов органов.
Рисунок 1. Обзор Схема процесса Изоляции органной и генерация кондиционированной среды. ТКАНЕЙ (легкие, мозг, бедра, голени и лимфатические узлы) собирают с помощью мыши. Лёгкие, мозг и лимфатические узлы измельчали скальпелем. Костный мозг собирают из костномозговой полости кости, нажав PBS через полость с иглой 27 ½ G. Легочные и ткани мозга фрагменты инкубируют в течение 24 часов перед разбавлением трех эквивалентных объемов свежей базальной среде и собирали для lung- и головным мозгом кондиционированная среда. Костный мозг и лимфатических узлов стромальные клетки пассируют 2 - 3 раза перед инкубацией с базальных СМИ, чтобы сделать кости и лимфатических узлов с кондиционером СМИ. Заготовленные носители могут быть рooled и хранили при -80 ° С до готовности для использования в последующих анализах , таких как белковых массивов, клеточных анализов роста, клеточных анализах миграции, tumorsphere формирования и RT-PCR. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Представитель фотоизображений процедуры для изоляции органной и генерация кондиционированной среды. В день 0, легкие, мозг, бедренной, большеберцовой кости и лимфатические узлы собирают с помощью мыши. Легких, головного мозга и лимфатических узлов помещали в 60 мм 2 стеклянной чашке Петри и измельчали с двумя лопастями скальпелей до приблизительно 1 мм 3 в размере. Костный мозг собирают из костномозговой полости кости, нажав PBS через полость с 27 ½ G иглы в свежую пробиркуФБС. Фрагменты ткани легких и мозга инкубируют в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% СО 2 перед разбавлением трех эквивалентных объемов свежей среды , и собирали для lung- и головным мозгом кондиционированная среда через 24 часа. Костного мозга и лимфатических узлов стромальные клетки инкубируют при температуре 37 ° С и 5% CO 2 и пассировать 2 - 3 раза (~ 3 недели всего) перед заменой среды с бессывороточной базальных средах , чтобы сделать кости и лимфатического узла с кондиционером СМИ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Характеристика изолированных лимфатического узла и костного мозга стромальных клеток. (А) Ярко-поле микроскопа изображение , показывающее морфологии лимфатических узлов стромальных клеток (LNSCs). (Б) представитель потокацитометрии анализа LNSCs с использованием фикоэритрин (РЕ) -conjugated gp38 антитело и флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) -conjugated CD45 антитела. (С) Яркое поле микроскопа изображение , показывающее морфологию стромальных клеток костного мозга (BMSCs). (DH) представителя потока цитометрии анализа BMSCs с использованием PE конъюгированных (черные профили) антител против (D) CD44, (E) CD106, (F) Sca-1, (G) CD29, (H) CD73 антитела по отношению к контрольной изотипным (белые профили). Минимум 10000 жизнеспособных событий было собрано на выборку. Эта цифра была изменена с 13. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Илиган-необходимости миграции паттерны и изменения экспрессии генов в ответ на Organ-кондиционированной среды. (A) остеотропный 231-бом варианты (слева, полосатые столбики) или легочные ищущим варианты 231-lm2 (справа, полосатые бары) от 231-MDA-MB линии клеток рака молочной железы человека, а также родительский MDA-MB - 231 клетки (обе панели, сплошные бары) высевали на покрытые желатином вставками (с 8 мкм порами) до размещения в базальной среде (DMEM: F12 + концентрированный митоген добавка) или органа-CM. Чашки инкубировали при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 18 ч. (В) Все население родительских клеток MDA-MB-231 подвергались воздействию либо кости-CM (слева) или легкого-CM (справа) в течение 48 часов. РНК выделяли и количественно с использованием RT-КПЦР. Экспрессии генов изменяется в ответ на орган-CM (черные полосы) были нормированы на GAPDH и выраженное относительно базового уровня экспрессии в базальной СМИ (серые столбики). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM (N = 3; Fold-изменение от соответствующего отрицательного контроля базальной СМИ). * = Значительно отличается от основных сред; δ = значительно отличается от родительской линии клеток, обработанных одних и тех же условиях СМИ; P <0,05, ANOVA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Орган-кондиционированной среды Содержит Потенциальные растворимых медиаторов метастатического поведения. Массив антитела мыши биотин этикетка на основе была использована для определения растворимых факторов , присутствующих в лимфатических узлов CM и брейн-CM. Мембраны инкубировали с биотинилированным образцов (А) базальный носители (DMEM: F12 + концентрированный митоген добавка), (В) лимфатический узел-CM или (С) мозгового см при 4 ° CO / N и визуализируют с использованием chemiluminescence. Голубые овалы показывают внутренние положительные контроли, выровненные ячейки указывают на внутренние отрицательные контроли и твердые коробки указывают растворимые факторы , представляющие интерес, которые потенциально вовлечены в метастатической поведение клеток рака молочной железы в лимфатических узлах или головного мозга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого цифра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метастазы представляет собой сложный процесс, в котором ряд клеточных событий , в конечном счете ответственны за вторжение ткани и отдаленным опухоли учреждения 4,30,31. Модель системы ех естественных условиях , представленные здесь могут быть использованы для изучения два важных аспекта метастатической прогрессии: рак самонаводящиеся клетки или миграции к конкретному органу ( "попасть туда") и роста в этом органе ( "растущей там"). Многие исследования ранее сосредоточены на выявлении ключевых молекулярных характеристик, связанных с собой раковые клетки, которые вносят вклад в процесс метастазирования. Например, работа , выполняемая группой Джоан Массаге выявила различные подписи генов , связанных с Лун-специфической, специфической для кости, и мозгоспецифических закономерности распространения 10-12,32. В то время как эта работа дает важную информацию в отношении вклада раковых клеток в этот процесс, гораздо меньше известно о роли органов специфических факторов, вносимой тон вторичным микросреда, которая остается относительно сложным для изучения 13.
Эта бывшая модель системы естественных условиях ранее была утверждена в качестве точного представления вторичного органа микросреды, продемонстрировав , что клеточный рак молочной железы линии конкретной миграции и роста в органе-КМ отражает эти клетки линии "в естественных условиях картины метастазирования. Исследование, проведенное Чу и его коллеги использовали четыре различных человеческих клеточных линий рака молочной железы с различными метастатического потенциала в естественных условиях, в том числе MDA-MB-231 и SUM-159 (сильно метастатических, метастазировать в лимфатические узлы, легкие, печень, кости и мозга в естественных условиях ) и Сумму-149 и MDA-MB-468 (умеренно метастатический, метастазируют в лимфатических узлах и легких в естественных условиях) в. Оба Сумму-159 клеточные линии MDA-MB-231 и отображаются усиливается миграция к кости marrow-, лимфатического node- и легких-СМ в то время как клеточные линии СУМ-149 и MDA-MB-468, предпочтительно мигрировали в направлении легкого-cm 13. Настоящее исследование показывает, что костные и легких ищущих MDA-MB-231 вариантов и предпочитают мигрировать в кости marrow- и легких-CM соответственно, и что воздействие органа-CM может способствовать экспрессии генов костные и метастатических легочных ассоциированных ранее были определены Массаге и коллегами 11,12. Взятые вместе, эти результаты показывают , что орган-CM обеспечивает экс виво платформы представителя органа специфических растворимых факторов , обнаруженных в естественных условиях , которые влияют на фенотип и поведение клеток рака молочной железы.
Определение растворимых факторов, присутствующих в определенных органах и их относительных уровней экспрессии служит отправной точкой для определения их потенциальное влияние на поведение раковых клеток. Кроме того, с использованием таких методов , как immunodepletion может позволить пользователю эффективно истощать белок , представляющий интерес со стороны органов-CM для определения его влияния на клеточный поведения в лабораторных условиях . Например, Многие растворимые факторы, присутствующие в конкретных микросреды органа функционируют как хемоаттрактанты и имеют потенциал, чтобы вызвать клеточную миграцию и пролиферацию. Предыдущая работа с использованием легких-CM привело к идентификации многих растворимых факторов , присутствующих в легких-КМ , которые могут выступать в качестве хемоаттрактанты для клеток рака молочной железы, в том числе остеопонтина (OPN) и L-селектина (Sell) 13. К immunodepleting эти факторы из легкого-CM, Чу и его коллеги смогли продемонстрировать пониженную миграцию клеток и / или роста высокой метастатической активностью MDA-MB-231 клетки рака молочной железы 13. Эти результаты показывают , что кондиционированной среды , полученные от целые органы представляют собой ценный ресурс для изучения влияния конкретных растворимых факторов на поведение раковых клеток, за счет использования традиционных методов в пробирке.
Несмотря на то, что это довольно простая модель системы, есть некоторые шаги в протоколе, которые являются критическими для successfuл поколение органов кондиционером СМИ. Во-первых, использование мышей между определенными в возрасте 6-12 недель для извлечения органов имеет важное значение для того, чтобы контролировать для эффектов, связанных с возрастом, либо связаны с развитием (до 6 недель) или связанных со старением у пожилых мышей. Во-вторых, стерильность имеет первостепенное значение на протяжении всего протокола и может быть лучше всего обеспечивается за счет применения строгой асептики и работы в стерильных капот культуры ткани, используя стерилизованные ткани расходных материалов культуры и реагентов, а также легкие антибиотики во всех культурных средах и пищевых добавок ( то есть., пенициллин / стрептомицин). Одна из проблем , с использованием в естественных условиях или бывших естественных условиях модельных систем является свойственная изменчивость животного к животному. Если это наблюдается, шаги по устранению неполадок включают в себя объединение кондиционированной среды, полученных из нескольких партий мышей перед использованием в последующих экспериментах, а также обеспечение того, чтобы lung- и мозг кондиционерами Medias точно вес нормализуется в каждом мнедиам коллекция эксперимент ресуспендируя в 4: 1 СМИ: отношение ткани (объем / вес). Кроме того, клетки стромы первичной лимфатических узлов и костного мозга не следует допускать, чтобы превысить 70% сплошности в любой момент прохождения или быть выращен за 5 полных пассажей, в противном случае они будут терминально дифференцироваться.
Изменения в протоколе, представленном в этой статье, можно было бы предусмотреть, чтобы разрешить применение в различных областях исследований. Хотя эта модель до сих пор используется исключительно для исследования рака груди, она потенциально может быть использована для изучения роли органов, полученных растворимых факторов, в других типах рака, а также дополнительные нормальные физиологические и болезненных состояний. Кроме того, в то время как этот метод был использован здесь с иммунодефицитом обнаженными моделями мыши, этот метод теоретически не ограничен этим видов мышей и даже потенциально могут быть использованы с другими типами моделей на животных.
В то время как эта модель обеспечивает IMPORTAнт понимание относительно вклада конкретных органов, полученных растворимых факторов на поведение раковых клеток, не обошлось и без ограничений. Во-первых эта модель ориентирована исключительно на растворимом компоненте микросреды органа, который пренебрегает важность внеклеточного матрикса (ECM). ECM является непористые присутствует компонент во всех типах тканей и функций , чтобы обеспечить как физическую эшафот для клеток, а также способность вызывать важные биохимические и биомеханические сигналы , необходимые для различных клеточных процессов, в том числе формообразования, дифференцировки клеток и гомеостаза 33 -35. Важно отметить, что физический и биохимический состав ЕСМ широко неоднородна и может сильно различаться между типами тканей. Таким образом, тканеспецифическая состав внеклеточного матрикса, может также оказывать влияние на орган тропизм во время метастазирования рака, которые можно не заметить с этой моделью. ECM может также действовать сконцентрировать конкретные растворимые факторы, таким образом, что appropriatelY представляет их к определенным клеткам, и без этой тонкой настройки ECM, индукция клеточной сигнализации может быть уменьшена или изменена 36. Хотя модель упоминается в этой статье отсутствует соответствующий компонент ECM, многие исследования могут быть усилены с помощью бесплатный подход с использованием как модели, упомянутой здесь наряду с соответствующим компонентом ECM. Например, коммерчески доступные первичные фибробласты орган, синтезирующие эндогенный ECM или рекомбинантные компоненты ECM могут быть использованы в дополнение к генерируемой органа-CM, чтобы определить, в полной мере всего микросреды органа на клеточном поведении.
Вполне возможно, что растворимая микросреда генерируется из органа-СМ не может надлежащим образом имитировать то, что присутствует физиологически в процессе метастазирования. Рак клеток выживания, роста и прогрессирования в значительной степени зависят от раковых клеток - хозяев взаимодействий 4,30,31. Генерация целого органа-СМ может привести к рresence растворимых факторов, как правило, не выражены типами клеток, которые взаимодействуют с клетками рака во время метастатического прогрессирования. Кроме того, ранее было показано , что наличие первичной опухоли может модулировать микроокружение отдаленных метастатических очагов, тем самым «затравкой» их метастазирование 37. Так как текущий протокол использует органы, полученные от здоровых, не имеющих опухоли мышей, было бы целесообразно сравнить растворимые факторы, полученные из органов у мышей, несущих первичной опухоли молочной железы.
Из-за механического разделения целых органов в процессе генерации различных органов-CM, внутриклеточные факторы могут быть выпущены в окружающие средства массовой информации, которые обычно не могут быть встречающихся физиологически раковыми клетками. Кроме того, костные и лимфатических узлов, полученных кондиционированной среды требует культивирования стромальных клеток, выделенных из этих органов до их сбора. Типы клеток , присутствующие во время ех естественных cultuкольцо не может точно отражать широту клеточных типов, встречающихся физиологически раковыми клетками. В то время как клетки стромы , главным образом секретируют многие факторы , связанные с различными микросреды органов, используя эти методы не могут учитывать влияние других типов клеток , присутствующих в тканях и органах 38. Наконец, мы включили митоген добавку в базовых средах, используемых для создания органов кондиционером СМИ, потому что мы нашли, что это требовалось для поддержания жизнеспособности обоих культивируемых органов (легких и головного мозга) и изолированной СККМ и LNSC. Тем не менее, мы признаем, что предостережение наличие этого митоген дополнения могли бы стимулировала органы искусственно вырабатывать растворимые факторы, которые они не могут нормально сделать,
Таким образом, многие исследования показали, что специфические микросреды орган может оказывать глубокое влияние опухолевых клеток биологии. Несмотря на то, обсуждавшихся ограничения, исключая виво модель системы , представленные здесь гepresents комплексную методику для изучения влияния растворимой микросреды многих солидных органов на клеточном поведении. В лаборатории авторов, эта модель системы была и по-прежнему используется как средство изучения многих клеточных событий, связанных с метастазами, в том числе вторжения, миграции, пролиферации стволовых типа поведения, а также изменения экспрессии генов. Данные, полученные из этих исследований, в свою очередь может информировать потенциального клинического применения этой модельной системы к клеткам первичной рака молочной железы, выделенных из опухолей пациентов, чтобы определить их реакцию на различные микросреды, представляющих потенциальные сайты метастатических. Взятые вместе, можно надеяться, что дальнейшее понимание взаимодействия между микроокружения и опухолевых клеток в процессе метастатического тропности органов приведет к улучшению лечения рака в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
- Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278 (1928).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
- Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
- Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
- Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
- Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
- Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
- Zlotnik, A.
- Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
- Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
- Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805 (2014).
- Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
- Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
- Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
- Chiang, A. C., Massague, J.
- Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
- Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).
