Introduction
Brystkreft er den hyppigst diagnostisert kreft hos kvinner og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall 1. Brystkreft er høy dødelighet skyldes i hovedsak svikt i konvensjonell terapi for å redusere og eliminere metastatisk sykdom; ca 90% av kreftrelaterte dødsfall skyldes metastaser to. Forstå de underliggende molekylære mekanismer av metastatisk cascade er av vesentlig betydning for utvikling av legemiddel effektive i både tidlig og sent stadium brystkreft.
Tidligere forskning har bidratt til å belyse flertrinns arten av brystkreft metastase og det er en hypotese at resultatet av både progresjon av kreft og metastase er i stor grad avhengig av interaksjoner mellom kreftceller og vertsmiljøet 3. Kliniske observasjoner tyder på at mange kreftformer vise organ tropisme, altså., Tendensen til fortrinnsvis metastaserer til spesifikke organs.In den case av brystkreft, pasientens sykdom vanligvis sprer seg eller metastasizes til 5 viktigste severdigheter, inkludert bein, lunger, lymfeknute, lever og hjerne 4-6. Mange teorier har blitt utviklet for å forklare denne prosessen, men bare et fåtall har stått testen av tid. Ewing teori om metastaser, foreslo i 1920, hypotese thatthe fordeling av metastaser var strengt på grunn av mekaniske faktorer; hvorved tumorcellene blir gjennomført i hele kroppen ved normale definerte fysiologiske blodstrømningsmønster og slett arrestere i den første kapillære sengen de støter 7. I kontrast, Stephen Pagets 1889 "frø og jord" hypotesen antydet at flere molekylære interaksjoner var ansvarlige for overlevelse og vekst av metastaser, der kreftceller ( "frø") kan bare etablere seg og proliferatein organ microenvironments som produserer riktige molekylære faktorer ( "jord ") 8. Nesten et århundre senere, Leonard Weiss i henholdtok en meta-analyse av tidligere publiserte obduksjons data og bekreftet Ewing spådom at mange metastatiske svulster oppdages ved obduksjon ble funnet i de forventede proporsjoner som kan forventes hvis metastatisk organ tropisme ble bestemt av blodstrømningsmønster alene. Men i manyinstances var det færre eller flere metastaser dannet på visse områder så kan forventes av Ewing forslag mekaniske faktorer 9. Disse kontoene og teorier antyder at spesifikke organ microenvironments spille en avgjørende rolle i formidling mønstre og påfølgende vekst og overlevelse av mange kreftformer, herunder brystkreft.
Tidligere forskningsinnsatsen har i hovedsak fokusert på tumorceller avledet faktorer, og deres bidrag til orgelet tropisme observert i brystkreft metastaser 10-12, men lite forskning har utforsket faktorer som stammer fra det organ mikromiljøet som kan gi en gunstig nisje for etableringav brystkreftmetastaser. Dette skyldes i hovedsak de tekniske utfordringene med å studere deler av orgelet mikromiljøet in vitro.
Den nåværende artikkelen beskriver en omfattende ex vivo-modellsystem for å studere innflytelsen av løselige komponenter av lymfeknute, ben, lunger og hjerne på den metastatiske adferd av humane brystcancerceller. Tidligere studier har bekreftet dette modellsystemet ved å vise at forskjellige brystkreftcellelinjer vil vise cellelinjespesifikke og organspesifikk malign oppførsel som reaksjon på organ-kondisjonert medium som tilsvarer deres in vivo metastatiske potensiale 13. Dette modellsystem kan benyttes til å identifisere og evaluere spesifikke organ-avledede oppløselige faktorer som kan spille en rolle i den metastatiske adferd av bryst og andre typer kreftceller, inkludert påvirkning på vekst, migrering, stem-lignende oppførsel, og genekspresjon, samt identifisering avpotensielle nye terapeutiske mål for kreft. Dette er den første modellsystemet ex vivo som kan brukes til å studere organspesifikk metastatiske adferd i detalj, og for å vurdere rollen til organ-avledet løselige faktorer i å drive prosessen med kreft metastasering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrestudier ble utført i samsvar med anbefalingene fra den kanadiske Council on Animal Care under protokoller godkjent av Western University Animal Bruk underkomité.
1. Organ Isolation (lunge, hjerne, Bone, Lymph Node)
- Fremstille fire sterile 50 ml koniske rør (en for hvert organ som skal isoleres) inneholdende omtrent 30 ml steril fosfatbufret saltløsning (PBS). Pre-veie hvert rør PBS ved hjelp av en elektronisk balanse.
- Avlive 6-12 uker gamle mus ved CO 2 innånding. Mus bør bli stående i CO 2 kammer for ca 1-2 min eller til musa slutter å bevege seg og puste. Vellykket eutanasi kan videre bekreftes ved en mangel på hjerteslag når kontrolleres manuelt med en finger. Unngå cervikal dislokasjon da denne metoden kan briste blodkar av halsen som fører til problemer med å fjerne aksillær lymfeknuter.
Merk: Tidligere arbeid har spesielt bruktsunne kvinnelige naken mus HSD: atymiske Nude- Foxn1 nu 13. - I et sterilt vev kultur hette, plasserer du muse på ryggen på en polystyren skum pad, spre bena og bruke pinner til å holde dem på plass.
- Ved hjelp av steril pinsett og saks, klippe magehuden på midtlinjen på genitalia og kutt oppover mot munnen. Trekk forsiktig tilbake magehuden fra magemusklene og pin på plass på polystyren skum pad.
- Finn armhulen, brachialis, og inguinal lymfeknuter.
Merk: Lymfeknuter er vanligvis omgitt av fettvev. Lyske lymfeknuter er lettest å finne som de er funnet overfladisk i krysset mellom to blodårer på trukket tilbake abdominal hud. Aksillære og brachialis lymfeknuter ligger dypere i vevet og krever skånsom manøvrering av vev.- Etter at du har funnet lymfeknutene, bruke saks for å forsiktig og nøye kutte lymfe nodes vekk fra huden, fett og fartøyer og fjerne dem fra musen. For å bekrefte riktig disseksjon, rulle tang over fjernede vev. Hvis det finnes en hard klump når rulle tang over vev, deretter en lymfeknute har trolig blitt fjernet.
- Plasser fjernet lymfeknutene i iskald PBS.
- Ved hjelp av pinsett og saks, åpne bukhulen ved å skjære gjennom eksponert bukveggen i en oppadgående bevegelse mot brystet. Nøye skjære gjennom brystbenet, utsette brysthulen.
- Finn membranen under lungene og kutte mellomgulvet. Det bør trekke mot ribbeina på grunn av spenning.
- Løft lungene fra undersiden og skjær den underliggende vev mot luftrøret. Dette gjør at lungene kan fjernes fritt fra brysthulen. Ta hjertet og lungene en bloc og plasser i iskald PBS. Hjertet kan fjernes fra lungene her eller rett før veiing i trinn 2.
- Fjernpins, holder musen på plass på polystyren skum pad. Snu musen og kutt i huden i korsryggen hele veien over fra flanke til flanke.
- Ved hjelp av en steril stykke gasbind for å holde overkroppen av musen, skrelle tilbake huden av musen over ben og føtter av musen.
- Ved bruk av samme stykke steril kompress, hold leggen på plass, nøye bryte ankelleddet av musen foten og skrelle huden over skjøten proximally mot kneleddet.
- Ved hjelp av saks, fjerne tibia fri fra kneleddet og plasser i iskald PBS.
- Gjenta trinn 1,11) til 1,12) med motsatt lem.
- Bruk pinsett, hold femur på plass, klippe bort rundt muskelvev ved hjelp av saks og fjern femur, plassere den i iskald PBS.
- Gjenta trinn 1.14) med motsatt lem.
- Ved hjelp av en ny bit av steril kompress, holde hodet av musen på plass. Bruk pinsett og saks, forsiktig fjerne huden å eksponere skull. Ved hjelp av saks, må du kutte occipital hodeskallen fra høyt midt i en rett og nedover linje for å avsløre posterior hjernen.
- Bruk pinsett, scoop under hjernen mot fremre og fjerne hele hjernen. Plasser hjernen i iskald PBS.
- Gjenta trinn 1.1) til 1,17) i minst fire mus.
2. Organ Veiing
- Etter organ isolasjon, veie hver PBS inneholdende lunge og hjerne vev ved hjelp av en elektronisk balanse.
- Beregn vekten forskjellen ved å subtrahere de pre-isolasjon vekt (PBS) fra vekten av røret PBS + organer (lunge og hjerne).
- Bestemme mengden av media for å suspendere vev fragmenter fra den beregnede vektforskjellen.
Merk: Lung og hjernevev er vekten normalisert ved resuspensjon i en 4: 1 media: forholdet vev (vol / vekt).
3. generasjon av lunge- og hjerne Betinget Media
- I et sterilt tproblemet kultur hette, invertere PBS rør som inneholder lunge eller hjerne tre ganger for å fjerne rester av blod fra organer og aspirer PBS som inneholder blod. Gjenta med frisk kald PBS til løsning synes klart uten tegn til blod.
- Plasser lungene og hjernen i egne 60 mm 2 glass petriskåler. Ved hjelp av to sterile skalpellblader, kjøttdeig lungene eller hjernen ved gjentatte ganger å ha klippet frem og tilbake til vev fragmenter er ca ~ 1 mm 3 i størrelse.
- Resuspender vev fragmenter i passende volum (bestemt tidligere i trinn 2.3) i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM): F12 medium supplert med 1 x konsentrert mitogen supplement og penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml).
- Legg resuspenderte lunge eller hjerne vevfragmenter til en brønn i en 6-brønns plate.
- Inkuber vev fragmenter i mediene i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Etter inkubasjon, samle betinget media for hver vev og further fortynne ved å legge tre tilsvarende volum av fersk media i en 50 ml konisk tube.
- Sentrifuger ved 1000 xg i fortynnede kondisjonerte medium for hvert organ ved 4 ° C i 15 minutter for å fjerne store vev avfall. Samle media supernatanten og filtreres gjennom et 0,22 um sprøytefilter.
- Pool betinget media fra hvert organ (ie., Lunge med lunge og hjerne med hjernen) fra flere mus til å gjøre rede for mus til mus variabilitet. Delmengde og lagre betinget media ved -80 ° C inntil bruk.
4. generasjon av Bone Marrow kondisjonerte Media
- I et sterilt vev kultur hette, trim overflødig vev fra benet og fjerne epiphyses (endestykker) fra bein med saks.
- Ved å bruke en 27 G nål ½, skyll marghulen av ben ved å skyve 1 ml PBS gjennom sentrum av hvert ben. Dette vil tillate deg å samle benmarg stromale celler (BMSC) inn i et nytt rør som inneholder PBS.
- Sentrifuger ved 1,000 x g i 5 min ved 4 ° C og vaskes BMSC to ganger med PBS. Resuspender stromale benmargsceller i 20 ml av ben- stromal cellevekstmedium (DMEM: F12 medium supplert med 1 x konsentrert mitogen supplement, penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml) og 10% føtalt boven serum (FBS) ).
- Plate 10 ml resuspenderte stromale benmargsceller i en T75-kolbe.
Merk: Kombiner og plateceller fra hver 2 mus i hver T75 kolbe; for fire mus, er to T75 kolber nødvendig (ca. 1 x 10 7 celler / kolbe). - Inkuber stromale benmargsceller i bein stromal cellevekstmedium i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Etter inkubasjon, fjerne media fra både T75 kolber og sette inn nye T75 kolbe, merke dette kolbe som "Floater Flask". Legg friske bein stromal cellevekstmedier til tidligere 2 kolber og inkuber alle 3 kolber ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Etter celler nå ca 70% konfluens (ca. 5-7dager) passage celler. For å gjøre dette, fjerner medium og vaske cellene to ganger med PBS (3 ml hver vask). Fjern PBS og tilsett 3 ml trypsin / EDTA-oppløsning, noe som sikrer at trypsin dekker hele overflaten av kolben. Etter at cellene løft av kolben (~ 2 - 3 min), stoppe trypsinering reaksjonen ved tilsetning av 3 ml bein stromal cellevekstmedium). Sentrifuger 900 x g i 5 min ved 4 ° C, kastes media, og resuspender cellene i 10 ml friskt ben stromal cellevekstmedier.
- Pool celler fra alle kolber og passage 1: 5 i tre nye T75 kolber og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2. Etter celler igjen nå 70%, gjenta trinn 4,6 og basseng og passage alle festede celler en gang. Re-plate alle cellene til fire T75-kolber og inkuber 37 ° C og 5% CO2. Bone stromal celle vekstmedier bør brukes for alle trinn.
- Tillat celler å nå samløpet, vaske cellene tre ganger med PBS og legge bein stromal celle samling media (DMEM: F12 media + 1x konsentrert mitogen supplement + penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml); 10 ml / T75), og pass på at dette mediet er fritt for FBS. Samle benmargskondisjonerte media 72 timer senere, filtreres gjennom et 0,22 mikrometer filter, basseng, delmengde, og oppbevar ved -80 ° C inntil bruk.
- Om ønsket bekrefte fenotypen av de isolerte stromale benmargsceller (BMSC) ved bruk av antistoffer mot mus Sca-1, CD105, CD29, CD73 og, CD44, ved anvendelse av standard flowcytometri teknikker som beskrevet tidligere 13.
5. generasjon lymfeknutekondisjonerte Media
- I et sterilt vev kultur hette, invertere PBS inneholdende lymfeknuter tre ganger for å fjerne rester av blod fra lymfeknuter og aspirer blodig PBS. Gjenta med frisk kald PBS til løsning synes klart uten tegn til blod.
- Plasser lymfeknuter i 60 mm 2 glass petriskåler. Ved hjelp av to sterile skalpellblader, kjøttdeig lymfeknuter ved gjentatte ganger å ha klippet frem og tilbake til tissue fragmenter er omtrent 1 mm 3 i størrelse.
- I et konisk rør, resuspender vevfragmenter i 10 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medier supplert med penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml), 5 x 10 -5 M steril β-merkaptoetanol ( 1,75 ul / 500 ml medium) og 10% FBS.
- Sentrifuger ved 900 xg i 5 minutter ved 4 ° C og resuspender alle celler i 30 ml medium. Tilsett 5 ml medium / brønn i en 6-brønns plate og inkuberes i 7 dager ved 37 ° C og 5% CO2.
- Etter 7 dagers inkubering, kast media, vask adherente celler med 5 ml varm PBS og tilsett 5 ml friskt medium til hver brønn. Tillate celler å vokse til konfluens (ca. 5 - 7 dager), trypsineres, basseng alle celler, og passasje som beskrevet i trinn 4.6. Re-plate celler til 6-brønns plate. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Etter tre passasjer, tillate cellene å vokse til konfluens, vaskes brønnene tre ganger med PBS og tilsett 2 ml / brønn av DMEM: F12 + 1xkonsentrert mitogen supplement og penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml), slik at dette mediet er fritt for FBS. Samle lymfeknutekondisjonerte medier etter 72 timer, basseng, delmengde, og oppbevar ved -80 ° C inntil bruk.
- Om ønsket bekrefte fenotypen av de isolerte lymfeknute stromale celler (LNSC) ved bruk av antistoffer mot mus CD45 og gp38, ved hjelp av standard flowcytometri teknikker som beskrevet tidligere 13.
6. Bruk av Organ kondisjonerte Media for Nedstrøms Analyser knyttet til metastatisk Opptreden av kreftceller
- Når organ-kondisjonerte medier har blitt generert som beskrevet i punkt 1 - 5, bruke den til å utføre forskjellige nedstrøms celle og molekylærbiologiske analyser for å bestemme innvirkningen av oppløselige organ-avledede faktorer på den metastatiske adferd av kreftceller. Eksempler på standard analyser (beskrevet andre steder i litteraturen) omfatter protein matriser 13, cellulære vekstmålinger <sup> 13, cellulær migrasjon analysene 13, tumorsphere formasjonen 14, og RT-PCR 15. De opprinnelige basismedium som brukes til å generere media organ avkjølte (dvs. ubetinget DMEM.: F12 medium supplert med 1 x konsentrert mitogen supplement og penicillin (50 ug / ml) / streptomycin (50 ug / ml) skal brukes som en negativ kontroll .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av Organ kondisjonerte Media
En oversikt diagram / skjema av prosessen med organ isolering og generering av kondisjonert medium er presentert i figur 1, med representative fotografiske bilder av fremgangsmåten vist i figur 2. Det skal bemerkes at når denne protokollen var først under utvikling, ble leveren tatt i vår analyse, fordi det er et vanlig område av brystkreft metastasering. Men på grunn av den store mengden av proteaser som produseres og utskilles av leveren, er det meget vanskelig å holde leveren levedyktig lenge nok til å generere god kvalitet kondisjonert medium. Liver kondisjonerte media er heller ikke stabilt gang isolert, og det pleier å være mye protein bunnfall, trolig av samme grunn. Derfor lever ble ikke inkludert i noen videre analyse.
(figur 3A) og BMSCs demonstrere en mindre utseende (Figur 3C). Flowcytometrisk analyse bekrefter at LNSCs er i stor grad CD45 - og gp38 +, med ~ 60% av celler som har et CD45 - gp38 + fenotypen som indikerer LNSCs 16 (figur 3B). De BMSCs bør være positivt for CD44 og CD29, svakt positiv for CD105 og Sca-en, og negativ for CD73 (Figur 3D - H), en indikasjon på BMSCs 17,18.
Breast Cancer Cell RespOnse til Organ-aktuelle vandringsmønster og genuttrykk endringer
Ved hjelp av denne ex vivo modellsystemet, har det tidligere blitt demonstrert at humane brystcancerceller med forskjellig genetisk bakgrunn har differensiell migrering og vekstmønstre mot spesifikke organ forhold. Spesielt, disse mønstrene reflektere de kjente metastatiske formidlings mønstre av disse cellelinjer in vivo 13. I denne studien, bein (231-BOM) - og lunge (231-LM2) -søkende varianter av MDA-MB-231 humane brystkreft celle varianter (en slags gave fra Dr. Joan Massagué 11,12) har også vært brukes i en transwell migrasjon analyse for å bekrefte orgel-aktuelle vandringsmønster. Resultatene viser at beinet søkende 231-bom variant fortrinnsvis vandrer til benmargen kondisjonerte media over hjerne og lunge- betinget media (figur 4A, til venstre). på samme måte, Lunge-søkende 231-LM2 variant fortrinnsvis vandrer til lungekondisjonerte media enn benmargskondisjonerte medier og hjerne kondisjonerte media (figur 4A, høyre). Videre viser RT-qPCR analyse at eksponering av foreldre MDA-MB-231 brystkreftceller til ben- eller media lunge kondisjonerte fører til en oppregulering av gener assosiert med benspesifikk metastase (CXCR4, IL-11, TGFß1) eller lunge- spesifikk metastase (VCAM1) av brystcancer-celler in vivo 11,12 (figur 4B). Disse resultater viser gyldigheten av den ex vivo-systemet med hensyn til den forventede organ tropisme av brystkreftceller in vivo, og indikerer at løselige faktorer som er tilstede i organ-kondisjonerte medier kan påvirke metastatisk celle fenotype i tillegg til å fremme migrering.
Organ kondisjonerte Media Inneholder Potensielle Løselig Meklere av metastatisk Behavior
En biotin etikett basert mus antistoff utvalg ble brukt for å vurdere tilstedeværelse og identitet vanlige løselige faktorer i organ kondisjonerte media fra ulike organer. Denne matrise inneholder antistoffer mot 308 av de mest vanlige oppløselige mus proteins.This protein matrise har tidligere vært brukt for å identifisere løselige faktorer av interesse i forbindelse med metastatisk kaskade tilstede i lunge og benmarg kondisjonerte medier, som vist i Chu et al (2014) og Pio et al (2015) henholdsvis 13,14. I denne studien, er protein matrise resultater vist for basal media (figur 5A) sammenlignet med lymfe node- (figur 5B) og hjernen kondisjonerte media (figur 5C). Uthevet ved siden av hver rekke er løselige faktorer til stede i media som har blitt funnet å være assosiert med trinnene i metastatisk kaskade i litteraturen 19-29. Disse løselig factorer kan være verdt å undersøke som potensielle formidlere av sekundære metastaser i disse organ nettsteder.
Figur 1. Oversikt Skjematisk av prosessen med Organ Isolasjon og generasjon av betinget Media. Vev (lunger, hjerne, femur, tibia og lymfeknuter) er høstet fra musen. Lunger, er hjernen og lymfeknuter hakket med en skalpell. Benmarg er høstet fra marghulen av benene ved å skyve PBS gjennom hulrommet med en 27½ G nål. Lunge og hjerne vev fragmenter inkuberes i en periode på 24 timer før fortynning med tre tilsvarende volumer av friske basal media og samlet inn for å gjøre lunge- og hjernekondisjonerte medier. Benmarg og lymfeknute stromale celler er passert 2 - 3 ganger før inkubasjon med basale media for å gjøre bein og lymfeknutekondisjonerte medier. Høstet medier kan være pooled og lagret ved -80 ° C til den er klar til bruk i nedstrøms analyser som protein arrays, cellulære vekstanalyser, cellulære migrasjonsanalyser, tumorsphere dannelse, og RT-PCR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative Fotografier av prosedyren for Organ Isolasjon og generasjon av betinget Media. På dag 0, er det lunger, hjerne, femur, tibia og lymfeknuter hentet fra mus. Lungene, hjernen og lymfeknuter ble plassert i en 60 mm to glasspetriskål og hakket med to skalpellblader til ca. 1 mm 3 i størrelse. Benmargen er høstet fra marghulen av bein ved å skyve PBS gjennom hulrommet med en 27 ½ G nål inn i et nytt rørPBS. Lunge og hjerne vevsfragmentene blir inkubert i en periode på 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 før fortynning med tre tilsvarende volumer av friskt medium og oppsamlet for å lage lunge- og hjerne-kondisjonerte medier etter 24 timer. Benmargen og lymfeknute stromale celler inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2 og passert 2 - 3 ganger (~ 3 uker totalt) før du setter media med serum-frie basale media for å gjøre bein og lymfeknute kondisjonerte medier. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Karakterisering av isolerte lymfeknute og stromale benmargsceller. (A) Bright-felt mikroskopi bilde som viser morfologi av lymfeknute stromale celler (LNSCs). (B) Representant flytcytometri analyse av LNSCs ved hjelp av en fysoerytrin (PE) konjugert gp38 antistoff og et fluorescein (FITC) konjugert CD45 antistoff. (C) Bright felt mikroskopi bilde som viser morfologi av benmarg stromale celler (BMSCs). (DH) Representant flyt cytometri analyse av BMSCs ved hjelp av PE-konjugert (svarte profiler) antistoffer mot (D) CD44, (E) CD106, (F) Sca-en, (G) CD29, (H) CD73-antistoffer i forhold til isotype kontroll (hvite profiler). Et minimum på 10.000 levedyktige hendelser ble oppsamlet per prøve. Dette tallet har blitt forandret fra 13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Ellergan-aktuelle vandringsmønster og genekspresjon Endringer i Response til Organ kondisjonerte Media. (A) Bone søkende 231-Bom-varianter (venstre, stripete søyler) eller lunge søker 231-LM2 varianter (høyre, stripete barer) av MDA-MB-231 human brystkreft cellelinje samt foreldre MDA-MB- 231 celler (begge paneler, solid barer) ble sådd ut på gelatin-belagt inserts (med 8 mikrometer porer) før plassering i basal media (DMEM: F12 + konsentrert mitogen supplement) eller organ-CM. Platene ble inkubert ved 37 ° C og 5% CO2 i 18 timer. (B) hele befolkningen paren MDA-MB-231-celler ble utsatt for enten ben-CM (venstre) eller lunge-CM (til høyre) i 48 timer. RNA ble isolert og kvantifisert ved hjelp av RT-qPCR. Genuttrykk endringer i respons til organ-CM (svarte striper) ble normalisert til GAPDH og uttrykt i forhold til baseline uttrykk i basal media (grå søyler). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (N = 3; fold-endring fra respektive negativ kontroll med basal media). * = Signifikant forskjellig fra basal media; δ = signifikant forskjellig fra foreldrenes cellelinje behandlet med de samme medie forhold; P <0,05, ANOVA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Organ kondisjonerte Media Inneholder Potensielle Løselig Meklere av metastatisk Behavior. En biotin etikett basert mus antistoff utvalg ble brukt til å identifisere løselige faktorer til stede i lymfeknute-CM og hjerne-CM. Membraner ble inkubert med biotinylerte prøver av (A) basal medium (DMEM: F12 + konsentrert mitogen supplement), (B) lymfeknute-CM eller (C) hjerne-CM ved 4 o CO / N og visualisert ved anvendelse chemiluminescence. Blå ovaler indikerer interne positive kontroller, foret boksene indikerer interne negative kontroller og solide bokser indikerer løselige faktorer av interesse som er potensielt involvert i metastatisk oppførsel av brystkreft celler til lymfeknute eller hjernen. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metastase er en kompleks prosess der en rekke cellulære hendelser er i siste instans ansvarlig for vev invasjon og fjernt svulst etablering 4,30,31. Den ex vivo modell system presenteres her kan benyttes til å studere to viktige aspekter ved metastatisk progresjon: kreftcelle homing eller migrasjon til et bestemt organ ( "få det") og vekst i det organ ( "vokser der"). Mange studier har tidligere fokusert på å identifisere viktige molekylære egenskaper knyttet til kreftcellene seg som bidrar til metastaseprosessen. For eksempel har arbeid utført av Joan Massagué gruppe identifiseres distinkte genet signaturer assosiert med lunge-spesifikke, ben-spesifikk, og hjerne-spesifikke mønstre av spredning 10-12,32. Mens dette arbeidet gir viktig innsikt med hensyn til bidrag av kreftceller til denne prosessen, mye mindre er kjent om rollen som organspesifikke faktorer bidratt med than sekundær mikromiljøet, som har holdt seg relativt utfordrende å studere 13.
Denne eks vivo modellsystemet har tidligere blitt validert som en nøyaktig gjengivelse av det sekundære organ mikromiljøet ved å vise at brystkreftcellelinje-spesifikk migrasjon og vekst i organ-CM speil disse cellelinjer 'in vivo mønster av metastatisk spredning. En studie av Chu og kolleger brukte fire ulike menneskelige brystkreft cellelinjer med varierende metastatisk potensial in vivo, inkludert MDA-MB-231 og SUM-159 (svært metastatisk, metastaserer til lymfeknute, lunge, lever, bein og hjerne in vivo ) og SUM-149 og MDA-MB-468 (moderat metastatisk, metastaserer til lymfeknute og lunge in vivo) i. Både MDA-MB-231 og SUM-159 cellelinjer som vises forbedret migrasjon mot bein marrow-, lymfe node- og lunge-CM mens SUM-149 og MDA-MB-468 cellelinjer fortrinnsvis migrert mot lunge-cm 13. Den aktuelle studien viser at ben- og lunge-søker MDA-MB-231-varianter både foretrekker å migrere til bein marrow- og lunge-CM henholdsvis og at eksponering for organ CM kan fremme uttrykk for bein-og lunge-assosiert metastatisk gener tidligere identifisert ved Massagué og kolleger 11,12. Tatt sammen, disse resultater viser at organ-CM gir en ex vivo-plattform er representative for organspesifikke løselige faktorer som finnes in vivo som påvirker fenotypen og opptreden av brystkreftceller.
Identifisering av løselige faktorer som er tilstede i spesifikke organer og deres relative nivåer av ekspresjon gir et startpunkt for bestemmelse av deres potensielle innvirkning på kreftcelle oppførsel. Videre kan ved bruk av teknikker som for eksempel immunodepletion tillate brukeren til effektivt å tømme et protein av interesse fra organ-CM for å bestemme dens virkning på in vitro celleadferd. For eksempelMange løselige faktorer tilstede innenfor spesifikke organ microenvironments fungere som chemoattractants og har potensial til å indusere cellulær migrasjon og spredning. Tidligere arbeid gjøres ved hjelp av lunge-CM har ført til identifisering av mange løselige faktorer tilstede i lunge-CM som kan fungere som chemoattractants for brystkreftceller, inkludert osteopontin (OPN) og L-selektin (SELL) 13. Ved immunodepleting disse faktorene fra lunge-CM, Chu og kolleger var i stand til å demonstrere redusert cellemigrasjon og / eller vekst av høyt metastatiske MDA-MB-231 brystkreftceller 13. Disse resultater viser at kondisjonert medium som genereres fra hele organer gir en verdifull ressurs for å studere effekten av spesifikke løselige faktorer på kreftcelle oppførsel, ved bruk av tradisjonelle in vitro teknikker.
Selv om dette er en ganske grei modellsystem, er det noen trinn i forsøksprotokollen som er kritiske for successful generasjon av organkondisjonerte medier. For det første er viktig for å kontrollere for aldersrelaterte effekter, enten knyttet til utvikling (før 6 uker), eller relatert til aldring i eldre mus ved bruk av mus mellom de definerte alderen 6-12 uker for fjerning av organer. For det andre er sterilitet av største betydning i hele den protokoll og kan best ivaretas ved bruk av strenge aseptisk teknikk og arbeide i et sterilt vevskultur hette, ved bruk av steriliserte vevskultur materialer og reagenser, så vel som mild antibiotika i alle kulturmedier og kosttilskudd ( ie., penicillin / streptomycin). En av utfordringene med å bruke in vivo eller ex vivo modellsystemer er iboende dyr til dyr variabilitet. Hvis dette observeres, feilsøkingstrinn omfatter sammenslåing av kondisjonert medium innhentet fra flere grupper av mus før bruk i nedstrøms eksperimenter, samt å sikre at lunge- og hjernekondisjonerte medier er nøyaktig vekt-normalisert i hvert megdia samling eksperiment ved resuspensjon i en 4: 1 media: forholdet vev (volum / vekt). I tillegg bør de primære lymfeknute og stromale benmargsceller ikke få lov til å overstige 70% konfluens på et gitt passasje eller være vokst utover 5 totalt passasjer, ellers vil de terminalt differensiere.
Endringer i protokollen som presenteres i denne artikkelen kan tenkes å tillate søknad til ulike forskningsfelt. Selv om denne modellen har så langt blitt brukt utelukkende for brystkreft forskning, kan det potensielt brukes til å studere rollen til organ-avledet løselige faktorer i andre typer kreft samt ytterligere normale fysiologiske og sykdomstilstander. I tillegg, mens denne metoden har blitt benyttet her med nedsatt immunforsvar nakne musemodeller, er denne teknikken teoretisk ikke begrenset til denne art av mus, og til og med kan potensielt bli anvendt med andre typer av dyremodeller.
Selv om denne modellen gir important innsikt i bidraget fra spesifikke organ avledet løselige faktorer på kreftcelle atferd, er det ikke uten sine begrensninger. Først denne modellen fokuserer utelukkende på den løselige komponenten av organ microenvironments, som forsømmer viktigheten av den ekstracellulære matriks (ECM). ECM er den ikke-cellulær komponent som foreligger i alle vevstyper og funksjoner for å tilveiebringe både en fysisk stillas for celler, så vel som evnen til å indusere viktige biokjemiske og biomekaniske signaler som kreves for forskjellige cellulære prosesser, herunder morfogenese, cellulær differensiering og homeostase 33 -35. Viktigere, den fysiske og biokjemiske sammensetningen av ECM er allment heterogen og kan variere sterkt mellom vev typer. Derfor kan det vev-spesifikke sammensetning av ECM også ha en innflytelse på organ tropisme i løpet av kreft metastase som kan bli oversett med denne modellen. ECM kan også virke til å konsentrere spesifikke løselige faktorer på en måte som appropriately presenterer dem til visse celler, og uten denne finjustering av ECM, kan induksjonen av cellesignalisering være redusert eller endret 36. Selv om modellen som er nevnt i denne artikkelen mangler en passende ECM-komponent, kan mange studier skal styrkes ved en gratis tilnærming utnytte både modellen nevnt her sammen med en passende ECM komponent. For eksempel kan kommersielt tilgjengelige primære organ fibroblaster som syntetiserer endogene ECM eller rekombinante ECM komponenter brukes i tillegg til genererte organ-CM for å bestemme det fulle omfanget av hele organet mikromiljøet på cellulære oppførselen.
Det er mulig at det oppløselige mikromiljøet som genereres fra organ-CM ikke kan hensiktsmessig etterligne det som er til stede fysiologisk under prosessen av metastasering. Kreft celle overlevelse, vekst og progresjon er svært avhengig av kreftcelle-vert interaksjoner 4,30,31. Generering av hele organ CM kan resultere i presence av løselige faktorer normalt ikke uttrykt av celletyper som samhandler med kreftceller i løpet av metastatisk progresjon. Videre har det tidligere blitt vist at tilstedeværelse av en primærtumor kan modulere mikromiljøet av fjerne metastaser, for derved å "priming" dem for metastasering 37. Siden den aktuelle protokollen bruker organer som stammer fra friske, ikke-tumorbærende mus, ville det være verdt å sammenligne de oppløselige faktorer som stammer fra organer fra mus som bærer en primær brysttumor.
På grunn av den mekaniske separasjon av hele organer under genereringen av forskjellige organ-CM, kan intracellulære faktorer bli frigjort inn i det omgivende media som ikke normalt kan påtreffes fysiologisk av kreftceller. I tillegg, ben- og lymfeknute-avledede kondisjonert medium krever dyrking av stromale celler isolert fra disse organene før sin samling. Celletypene tilstede under ex vivo Culturingen kan ikke nøyaktig representere bredden i cellulære typer oppstått fysiologisk av kreftceller. Mens stromale celler i hovedsak skiller ut mange faktorer forbundet med ulike organ microenvironments, ved hjelp av disse metodene kan ikke gjøre rede for påvirkning av andre celletyper som finnes i vev og organer 38. Til slutt, vi inkludert en mitogen supplement i basis medier brukes til å generere media organ klimaanlegg, fordi vi fant ut at dette var nødvendig for å opprettholde levedyktigheten til begge de dyrkede organer (lunge og hjerne) og isolerte BMSC og LNSC. Men vi erkjenner det forbeholdet at tilstedeværelsen av denne mitogen supplement kunne ha stimulert organene til kunstig produsere løselige faktorer som de kanskje ikke normalt gjør,
I sammendraget, har mange studier antydet at spesifikke organ microenvironments kan dypt påvirke tumorcellebiologi. Til tross for de omtalte begrensningene, ex vivo modellsystemet presenteres her represents en omfattende teknikk for å studere innflytelsen av det oppløselige mikromiljøet av mange faste organer på cellulær oppførsel. I laboratoriet av forfatterne, har dette modellsystemet vært og fortsetter å bli brukt som et middel til å studere mange av de cellulære hendelser assosiert med metastase, inkludert invasjon, migrering, proliferasjon, stem-lignende oppførsel, og genuttrykk endringer. Dataene oppnådd fra disse studiene kan i sin tur underrette den potensielle kliniske anvendelsen av dette modellsystemet for primær brystkreft celler isolert fra pasientens tumor, for å bestemme deres respons på forskjellige mikromiljøer som representerer potensielle metastaser. Til sammen er det å håpe at videre forståelse av samspillet mellom mikromiljøet og kreftceller under prosessen med metastatisk organ tropisme vil føre til forbedring av kreftbehandling i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
- Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278 (1928).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
- Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
- Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
- Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
- Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
- Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
- Zlotnik, A.
- Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
- Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
- Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805 (2014).
- Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
- Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
- Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
- Chiang, A. C., Massague, J.
- Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
- Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).
