Introduction
Il carcinoma della mammella è il tumore più frequentemente diagnosticato nelle donne e la seconda causa di decessi correlati al cancro 1. alto tasso di mortalità di cancro al seno è dovuto principalmente al fallimento della terapia convenzionale per mitigare ed eliminare la malattia metastatica; circa il 90% dei decessi correlati al cancro sono dovute a metastasi 2. La comprensione dei meccanismi molecolari alla base della cascata metastatica è di primaria importanza per lo sviluppo di terapie efficaci sia precoce e il cancro al seno in fase avanzata.
Precedenti ricerche hanno contribuito a chiarire la natura più fasi di metastasi del cancro al seno e si ipotizza che il risultato sia della progressione del cancro e metastasi dipende in gran parte le interazioni tra cellule tumorali e l'ambiente host 3. Osservazioni cliniche indicano che molti tumori mostrano tropismo d'organo, vale a dire., La tendenza a metastatizzare preferenzialmente a specifici organs.In case di cancro al seno, la malattia di un paziente si diffonde in genere o metastatizza a 5 siti principali, tra cui l'osso, polmoni, linfonodi, fegato e cervello 4-6. Molte teorie sono state sviluppate per spiegare questo processo, ma solo pochi hanno resistito alla prova del tempo. La teoria di Ewing di metastasi, proposto nel 1920, ipotizza thatthe la distribuzione delle metastasi era strettamente dovuta a fattori meccanici; quale le cellule tumorali sono effettuate in tutto il corpo dai normali modelli di flusso di sangue fisiologica definiti e semplicemente arrestano nel primo letto capillare che incontrano 7. Al contrario, "seme e suolo" ipotesi di Stephen Paget 1889 ha suggerito che le interazioni molecolari supplementari erano responsabili per la sopravvivenza e la crescita delle metastasi, in cui le cellule tumorali ( "semi") in grado di stabilire solo se stessi e microambienti organo proliferatein che producono fattori molecolari appropriati ( "terreno ") 8. Quasi un secolo dopo, Leonard Weiss sottoha preso una meta-analisi dei dati autoptici pubblicati in precedenza e ha confermato la previsione di Ewing che molti tumori metastatici rilevati al momento della autopsia sono stati trovati nelle proporzioni previste che ci si aspetterebbe se tropismo d'organo metastatico è stata determinata da modelli di flusso di sangue da solo. Tuttavia, in manyinstances c'erano meno o più di metastasi formate in certi siti, allora ci si aspetterebbe da fattori meccanici proposte di Ewing 9. Questi conti e teorie suggeriscono che specifici microambienti organo giocano un ruolo critico nei modelli di diffusione e la successiva crescita e la sopravvivenza di molti tumori, tra cui il cancro al seno.
Gli sforzi di ricerca in passato si sono concentrate principalmente su fattori derivati delle cellule tumorali e il loro contributo al tropismo d'organo osservata in metastasi del cancro al seno 10-12, fattori per quanto poco la ricerca ha esplorato derivati dal microambiente organo che possono fornire una nicchia favorevole per l'istituzionedelle metastasi del cancro al seno. Questo è in gran parte attribuibile alle sfide tecniche di studiare componenti del microambiente organo in vitro.
L'attuale articolo descrive una vasta ex vivo sistema modello per studiare l'influenza delle componenti solubili del linfonodo, ossa, polmoni e cervello sul comportamento metastatico delle cellule di cancro al seno umano. Precedenti studi hanno convalidato questo sistema modello dimostrando che le diverse linee di cellule del cancro al seno mostrare un comportamento maligno specifico organo-specifica linea cellulare e in risposta a media-organo condizionata che corrisponde alla loro in vivo metastatico potenziale 13. Questo sistema modello può essere utilizzato per identificare e valutare i fattori solubili specifici organi di derivazione che possono giocare un ruolo nel comportamento metastatico della mammella e altri tipi di cellule tumorali, comprese le influenze sulla crescita, la migrazione, staminali come il comportamento e l'espressione genica, nonché l'identificazione dinuovi potenziali bersagli terapeutici per il cancro. Questo è il primo sistema vivo ex modello che può essere usato per studiare il comportamento metastatico organo-specifiche in dettaglio e valutare il ruolo di fattori solubili organo-derivato nel guidare il processo di metastasi del cancro.
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Protocol
Tutti gli studi su animali sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni del Consiglio canadese sulla cura degli animali, sotto protocolli approvati dalla Western University Animal Usa sottocommissione.
1. Isolamento Organo (polmone, cervello, ossa, Linfonodo)
- Preparare quattro sterili 50 ml provette coniche (una per ciascun organo di essere isolato) contenente circa 30 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Pre-pesare ogni tubo di PBS usando una bilancia elettronica.
- Euthanize 6-12 settimane vecchio topo da CO 2 inalazione. I topi devono essere lasciati nella camera di CO 2 per circa 1 - 2 minuti o fino a quando il mouse smette di muoversi e la respirazione. l'eutanasia di successo può essere ulteriormente confermata da una mancanza di battito cardiaco, quando controllato manualmente con un dito. Evitare dislocazione cervicale come questo metodo può rompere vasi sanguigni del collo che porta a difficoltà di rimozione di linfonodi ascellari.
Nota: Il lavoro precedente ha utilizzate in modo specificosani topi nudi femminili, Hsd: atimici Nude- Foxn1 nu 13. - In una cappa coltura di tessuti sterili, posizionare il mouse sul dorso su un blocco di polistirolo espanso, diffondere le arti e utilizzare perni per mantenere al loro posto.
- Utilizzando pinze sterili e forbici, tagliare la pelle addominale sulla linea mediana ai genitali e tagliare verso l'alto verso la bocca. Delicatamente tirare indietro la cute addominale dai muscoli addominali e perno in posizione sul blocco di polistirolo espanso.
- Individuare il ascellare, brachiale, e linfonodi inguinali.
Nota: I linfonodi sono di solito circondate da tessuto adiposo. I linfonodi inguinali sono le più facili da individuare come si trovano superficialmente all'incrocio di due vasi sanguigni sulla pelle addominale posteriore tirato. linfonodi ascellari e linfatici brachiale si trovano più in profondità all'interno del tessuto e richiedono delicata manovra di tessuto.- Dopo aver individuato i linfonodi, usare le forbici per tagliare delicatamente e con attenzione la linfa nodes dalla pelle, grasso e vasi e rimuoverli dal mouse. Per confermare la corretta dissezione, rotolare la pinza sopra il tessuto rimosso. Se un nodulo duro esiste quando rotolare la pinza sopra il tessuto, poi un linfonodo è probabilmente stato rimosso con successo.
- Posizionare linfonodi rimossi in ghiaccio PBS freddo.
- Utilizzando le pinze e forbici, aprire la cavità addominale tagliando attraverso la parete addominale esposta in un movimento ascendente verso il petto. tagliare con cura attraverso lo sterno, esponendo la cavità toracica.
- Individuare il diaframma sotto i polmoni e tagliare il diaframma. Dovrebbe tirare verso le costole a causa della tensione.
- Sollevare i polmoni da sotto e tagliare il tessuto sottostante verso la trachea. Questo permette ai polmoni di rimuovere liberamente dalla cavità toracica. Rimuovere il cuore e polmoni in blocco e mettere in ghiaccio PBS freddo. Il cuore può essere rimossa dai polmoni qui o appena prima di pesare nella Fase 2.
- Rimuovi ilperni, mantenendo il mouse in posizione sul pad polistirolo espanso. Capovolgere il mouse e tagliare la pelle della parte bassa della schiena tutta la strada di fronte a fianco a fianco.
- Utilizzando un pezzo di garza sterile, per tenere il busto del mouse, sbucciare la pelle posteriore del mouse sopra le gambe ei piedi del mouse.
- Utilizzando lo stesso pezzo di garza sterile, tenere la gamba in atto, con attenzione rompere l'articolazione della caviglia del piede mouse e sbucciare la pelle sopra il giunto prossimale verso l'articolazione del ginocchio.
- Utilizzando le forbici, rimuovere la tibia libero dal ginocchio e mettere in ghiaccio PBS freddo.
- Ripetere i passaggi 1.11) a 1.12) con arto opposto.
- Utilizzando pinze, tenere il femore in luogo, tagliare circostante tessuto muscolare utilizzando le forbici e rimuovere il femore, ponendolo in ghiaccio PBS freddo.
- Ripetere il passaggio 1.14) con arto opposto.
- Utilizzando un nuovo pezzo di garza sterile, tenere la testa del mouse sul posto. Utilizzando pinze e forbici, rimuovere delicatamente la pelle per esporre le sKull. Utilizzando le forbici, tagliare con attenzione il cranio occipitale dal centro superiore in linea retta e verso il basso per esporre il cervello posteriore.
- Utilizzando pinze, scoop sotto il cervello verso l'anteriore e rimuovere l'intero cervello. Mettere il cervello in ghiaccio PBS freddo.
- Ripetere passaggi 1.1) a 1.17) per almeno quattro topi.
2. Organo di pesatura
- Dopo aver isolato organo, pesare ogni tubo PBS contenente polmone e tessuto cerebrale con una bilancia elettronica.
- Calcolare la differenza di peso sottraendo il peso pre-isolamento (solo PBS) dal peso del tubo PBS + organi (polmone e cervello).
- Determinare la quantità di supporti necessari per risospendere frammenti di tessuto dalla differenza di peso calcolato.
Nota: Lung e tessuto cerebrale sono il peso normalizzato da risospensione in un 4: 1 Media: rapporto di tessuto (vol / peso).
3. generazione di supporti Lung- e Braintree condizionata
- In una t sterileproblema cappuccio cultura, invertire i tubi PBS contenente polmoni o il cervello tre volte per rimuovere residui di sangue da organi e aspirare PBS contenenti sangue. Ripetere con fresca PBS freddo fino a soluzione appare chiara senza evidenza di sangue.
- Posizionare i polmoni e il cervello in separati 60 millimetri 2 piatti in vetro di Petri. Utilizzando due lame bisturi sterile, polmoni tritare o cervelli ripetutamente affettare avanti e indietro fino a quando frammenti di tessuto sono circa ~ 1 mm 3 dimensioni.
- frammenti di tessuto Risospendere in volume appropriato (determinati in precedenza al passo 2.3) del Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM): mezzi F12 addizionato con 1x concentrato integratore mitogeno e la penicillina (50 ug / ml) / streptomicina (50 mg / ml).
- Aggiungere frammenti di polmone o di tessuto cerebrale risospesa per un pozzetto di un 6-pozzetti.
- Incubare frammenti di tessuto in mezzi per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo l'incubazione, raccogliere condizionata multimediale per ogni tessuto e fn ulteriore diluito aggiungendo tre volumi equivalenti di mezzi freschi in una provetta conica da 50 ml.
- Centrifugare a 1000 xg in mezzi condizionati diluito per ciascun organo a 4 ° C per 15 minuti per rimuovere grandi frammenti di tessuto. Raccogliere il surnatante media e filtrare attraverso un filtro siringa da 0,22 micron.
- Pool di supporti condizionato da ciascun organo (es., Del polmone con polmone e al cervello con il cervello) da più topi per tenere conto della variabilità del mouse-to-mouse. Aliquotare e conservare mezzi condizionati a -80 ° C fino al momento dell'uso.
4. generazione di supporti midollo osseo condizionata
- In una cappa coltura di tessuti sterili, tagliare il tessuto in eccesso dal tessuto osseo e rimuovere epifisi (terminali) dalle ossa con le forbici.
- Utilizzando un 27 ½ ago G, filo cavità midollare delle ossa spingendo 1 ml di PBS attraverso il centro di ogni osso. Questo vi permetterà di raccogliere le cellule del midollo osseo stromali (BMSC) in una nuova provetta contenente PBS.
- Centrifugare a 1,000 xg per 5 minuti a 4 ° C e lavare BMSC due volte con PBS. Risospendere le cellule stromali del midollo osseo in 20 ml di mezzi di crescita delle cellule stromali del midollo (DMEM: mezzi F12 addizionato con 1x concentrati mitogeno supplemento, penicillina (50 ug / ml) / streptomicina (50 mg / ml) e 10% di siero boven fetale (FBS) ).
- Piastra 10 ml di cellule stromali del midollo osseo risospeso in un pallone T75.
Nota: Unire e le cellule piastra da ogni 2 topi in ogni contenitore T75; per quattro topi, due palloni T75 sono necessari (circa 1 x 10 7 cellule / fiasco). - Incubare ossei cellule stromali del midollo osseo in stromale mezzi di crescita delle cellule per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto da entrambi i palloni T75 e mettere in pallone nuovo T75, etichettare questo fiasco come "Floater Flask". Aggiungere fresca stromali del midollo terreni di coltura cellulare per precedenti 2 palloni e incubare tutte e 3 palloni a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Dopo cellule raggiungono circa il 70% di confluenza (circa 5 - 7giorni), le cellule di passaggio. Per fare questo, rimuovere medie e lavare le cellule due volte con PBS (3 ml ogni lavaggio). Rimuovere PBS e aggiungere 3 ml di soluzione di tripsina / EDTA, assicurando che la tripsina copre l'intera superficie del pallone. Dopo che le cellule si sollevano il pallone (~ 2 - 3 min), fermata tripsinizzazione reazione aggiungendo 3 ml di osso stromali terreni di coltura delle cellule). Centrifugare 900 xg per 5 minuti a 4 ° C, scartare media e risospendere le cellule in 10 ml di mezzi di crescita delle cellule stromali del midollo fresco.
- Cellule piscina da tutti i palloni e il passaggio 1: 5 in tre nuovi palloni T75 e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2. Dopo che le cellule ancora una volta raggiungono il 70%, ripetere il punto 4.6 e piscina e di passaggio tutte le cellule aderenti una seconda volta. Re-plate tutte le cellule a quattro fiaschi T75 e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2. mezzi Bone crescita delle cellule stromali dovrebbero essere utilizzati per tutte le fasi.
- mezzi F12 + 1x mitogeno concentrato su: consentono alle cellule di raggiungere confluenza, lavare le cellule tre volte con PBS e aggiungere osso stromali collezione media delle cellule (DMEMpplement + penicillina (50 ug / ml) / streptomicina (50 mg / ml); 10 ml / T75), facendo in modo che questo supporto è privo di FBS. Raccogliere media-midollo condizionata osso 72 ore più tardi, filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron, piscina, aliquota e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Se lo si desidera, di confermare il fenotipo delle cellule stromali del midollo osseo isolate (BMSC) utilizzando anticorpi contro il mouse Sca-1, CD105, CD29, CD73 e, CD44, utilizzando citometria di flusso standard tecniche come descritto in precedenza 13.
5. generazione di supporti linfonodo condizionata
- In una cappa coltura di tessuti sterili, invertire tubo PBS contenente linfonodi tre volte per rimuovere il sangue residuo linfonodi e aspirare sanguinosa PBS. Ripetere con fresca PBS freddo fino a soluzione appare chiara senza evidenza di sangue.
- Mettere linfonodi in capsule di Petri 60 millimetri 2 di vetro. Utilizzando due lame bisturi sterile, i nodi linfatici tritare ripetutamente affettare avanti e indietro fino Tissue frammenti sono circa 1 mm 3 dimensioni.
- In una provetta conica, frammenti di tessuto risospendere in 10 ml di Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) mezzi addizionato con penicillina (50 ug / ml) / streptomicina (50 mg / ml), 5 x 10 -5 M sterile β-mercaptoetanolo ( 1.75 ml / 500 ml media) e il 10% FBS.
- Centrifugare a 900 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere tutte le cellule in 30 ml media. Aggiungere 5 ml media / bene in un 6-pozzetti e incubare per 7 giorni a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Dopo l'incubazione di 7 giorni, scartare i media, lavare cellule aderenti con 5 ml di caldo PBS e aggiungere 5 ml di mezzi freschi in ogni pozzetto. Consentono alle cellule di crescere fino a confluenza (circa 5 - 7 giorni), trypsinize, piscina per tutte le cellule, e il passaggio come descritto al punto 4.6. cellule Re-plate a 6-pozzetti. Ripetere questa operazione tre volte.
- Dopo tre passaggi, consentono alle cellule di crescere fino a confluenza, lavare i pozzetti tre volte con PBS e aggiungere 2 ml / pozzetto di DMEM: F12 + 1xsupplemento concentrato mitogeno e la penicillina (50 mg / ml) / streptomicina (50 mg / ml), assicurando che questo supporto è privo di FBS. Raccogliere media-nodi linfatici condizionata dopo 72 ore, piscina, aliquota e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Se lo si desidera, di confermare il fenotipo delle cellule stromali del linfonodo isolate (LNSC) utilizzando anticorpi contro CD45 mouse e gp38, utilizzando citometria di flusso standard tecniche come descritto in precedenza 13.
6. L'utilizzo di supporti Organo condizionata per saggi a valle del comportamento metastatico delle cellule tumorali
- Una volta che i mezzi di organo-condizionata è stato generato come descritto nei passi 1 - 5, usarlo per effettuare diverse cellule valle e test di biologia molecolare per determinare l'influenza dei fattori organo-derivati solubili sul comportamento metastatico delle cellule tumorali. Esempi di test standard (già descritto in letteratura) comprendono saggi proteici 13, saggi di crescita cellulari <sup> 13, migrazione cellulare Saggi 13, tumorsphere formazione 14, e RT-PCR 15. I mezzi di comunicazione di base originali utilizzati per generare il supporto organo condizionata (per esempio, incondizionata DMEM:. Multimediale F12 integrato con 1x concentrato supplemento mitogeno e la penicillina (50 mg / ml) / streptomicina (50 mg / ml) dovrebbe essere utilizzato come controllo negativo .
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Representative Results
Generazione di Media-Organ condizionata
Una panoramica Schema / schematica del processo di isolamento organo e generazione di mezzi condizionati è presentato nella figura 1, con immagini rappresentative fotografiche della procedura illustrata in figura 2. Si deve notare che quando questo protocollo era prima fase di sviluppo, il fegato è stato incluso nella nostra analisi perché è un sito comune di metastasi del cancro al seno. Tuttavia, a causa della grande quantità di proteasi prodotte e secrete dal fegato, è molto difficile mantenere il fegato vitale sufficiente a generare mezzi buona qualità condizionati. media-Liver condizionata non è anche stabile una volta isolato, e si tende ad essere un sacco di precipitato proteico, probabilmente per lo stesso motivo. Pertanto fegato non è stato incluso in ogni ulteriore analisi.
(Figura 3A) e BMSCs dimostrando un aspetto più piccola (Figura 3C). Analisi del flusso citometria a conferma che sono in gran parte LNSCs CD45 - e gp38 +, con ~ 60% delle cellule che possiedono un CD45 - gp38 + fenotipo indicativo di LNSCs 16 (Figura 3B). Le BMSCs dovrebbe essere positivo per CD44 e CD29, debolmente positivo per CD105 e Sca-1, e negativo per CD73 (Figura 3D - H), indicativo di BMSCs 17,18.
Breast Cancer cellulare RespOnse per organo appropriato modelli di migrazione e variazioni di espressione genica
Utilizzando questo sistema ex vivo modello, è stato precedentemente dimostrato che le cellule del cancro al seno umano con diversi background genetico migrazione mostra differenziale e modelli di crescita verso condizioni organo specifico. In particolare, questi modelli riflettono i noti modelli di diffusione metastatica di queste linee di cellule in vivo 13. Nel corso di studio, osso (231-BoM) - e del polmone (231-LM2) -favorire varianti delle varianti di cellule di cancro al seno umano MDA-MB-231 (un gentile dono del Dr. Joan Massagué 11,12) sono state anche utilizzato in un test di migrazione transwell per confermare modelli di migrazione organo appropriato. I risultati dimostrano che il 231-BoM variante osso in cerca migra preferenzialmente ai media osseo condizionata ossa sopra brain e lung- supporti condizionata (Figura 4A, a sinistra). allo stesso modo, Il 231-LM2 variante del polmone in cerca migra preferenzialmente a media-polmone condizionata oltre supporto osseo condizionata osso e media-cervello condizionata (Figura 4A, a destra). Inoltre, l'analisi RT-qPCR dimostra che l'esposizione di 231-MDA-MB cellule del cancro al seno parentali di osso o di media-polmone condizionata provoca un up-regulation di geni associati con metastasi osso-specifica (CXCR4, IL-11, TGFß1) o lung- metastasi specifico (VCAM1) delle cellule di cancro al seno in vivo 11,12 (Figura 4B). Questi risultati dimostrano la validità del sistema ex vivo per quanto riguarda il tropismo d'organo previsto di cellule di carcinoma mammario in vivo, e indica che fattori solubili presenti in mezzi organo-condizionata possono influenzare metastatico fenotipo cellulare oltre a favorire la migrazione.
Media-Organ condizionata Contiene potenziali solubili Mediatori di comportamento metastatico
Una serie di anticorpi basato sul mouse sull'etichetta biotina è stato utilizzato per valutare la presenza e l'identità di fattori solubili comuni a media-organo condizionata da diversi organi. Questo array include anticorpi contro 308 del proteins.This solubili del mouse gamma più comune di proteine è stato precedentemente utilizzato per identificare i fattori solubili di interesse associato con la cascata presente metastatica nei media osseo condizionata polmone e ossa, come mostrato nella Chu et al (2014) e Pio et al (2015), rispettivamente 13,14. Nel corso di studio, i risultati di matrice di proteine sono mostrati per i media basale (Figura 5A) rispetto al linfa node- (Figura 5B) e media-cervello condizionata (Figura 5C). Evidenziato accanto a ogni array sono fattori solubili presenti nei mezzi di comunicazione che sono stati trovati per essere associato con gradini in cascata metastatica nella letteratura 19-29. Questi fac solubiletori possono essere la pena di indagare come potenziali mediatori di metastasi secondarie all'interno di questi siti di organi.
Figura 1. Schema del processo di Organo isolamento e la generazione di mezzi condizionati. (Nodi polmoni, cervello, femore, tibia e linfatici) I tessuti vengono raccolte dal mouse. I polmoni, i nodi linfatici del cervello e viene tritato con un bisturi. Il midollo osseo viene prelevato dalla cavità midollare delle ossa spingendo PBS attraverso la cavità con un ago 27½ G. frammenti polmonari e del tessuto cerebrale sono incubate per un periodo di 24 ore prima della diluizione con tre volumi equivalenti di mezzi freschi basali e raccolti per fare media lung- e-encefalica condizionata. Il midollo osseo e le cellule stromali nodo linfatiche sono diversi passaggi 2 - 3 volte prima di incubazione con i media basale per rendere i media nodi condizionata ossa e linfatici. mezzi raccolte possono essere pooled e conservati a -80 ° C fino al momento dell'utilizzo in saggi a valle, come gli array di proteine, saggi di crescita cellulari, saggi di migrazione cellulare, tumorsphere formazione, e RT-PCR. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. rappresentativi Immagini fotografiche della Procedura per Organo isolamento e la generazione di mezzi condizionati. Al giorno 0, polmoni, cervello, femore, tibia e linfonodi sono raccolti dal mouse. I nodi polmoni, cervello e linfonodi sono collocati in 60 mm 2 piatto di vetro Petri e tritato con due lame di bisturi a circa 1 mm 3 dimensioni. Il midollo osseo viene prelevato dalla cavità midollare delle ossa spingendo PBS attraverso la cavità con un ago G 27 ½ in una nuova provettadi PBS. I frammenti di tessuto polmonare e cerebrali sono incubate per un periodo di 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2 prima della diluizione con tre volumi equivalenti di mezzi freschi e raccolti per fare media lung- e-encefalica condizionata dopo 24 ore. Le cellule del midollo osseo e linfonodi stromali vengono incubate a 37 ° C e 5% di CO 2 e diversi passaggi 2 - 3 volte (~ 3 settimane in totale) prima di sostituire i media con i media basale senza siero per la formazione di ossa e della linfa dei media-node condizionata. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Caratterizzazione di isolati cellule linfatiche nodo e Bone Marrow stromali. Immagine di microscopia in campo chiaro che mostra la morfologia delle cellule stromali del linfonodo (LNSCs) (A). (B) Flusso rappresentativaanalisi di citometria di LNSCs utilizzando una ficoeritrina (PE) coniugata anticorpo gp38 e un isotiocianato di fluorescina (FITC) coniugata anticorpi CD45. immagine di microscopia in campo chiaro che mostra la morfologia delle cellule del midollo osseo stromali (BMSCs) (C). (DH) Flusso di Rappresentante analisi di citometria di BMSCs utilizzando PE coniugati (profili neri) anticorpi contro (D) CD44, (E) CD106, (F) Sca-1, (G) CD29, (H) gli anticorpi CD73 relative al controllo isotipico (profili bianchi). Un minimo di 10.000 eventi vitali sono stati raccolti per campione. Questa cifra è stata modificata dal 13. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Ogan-appropriata modelli di migrazione e variazioni di espressione genica in risposta a Media Organ condizionata. (A) Bone in cerca di 231-BoM varianti (a sinistra, barre a righe) o varianti del polmone in cerca di 231-LM2 (destra, bar a strisce) del-231 MDA-MB materno umano linea di cellule di cancro e dei genitori MDA-MB- 231 cellule (entrambi i pannelli, barre piene) sono stati piastrati su inserti di gelatina rivestite (con 8 micron pori) prima del posizionamento nei media basale (DMEM: F12 + supplemento mitogeno concentrato) o organo-CM. Le piastre sono state incubate a 37 ° C e 5% CO 2 per 18 ore. (B) intera popolazione parentali MDA-MB-231 cellule sono state esposte a uno osso-CM (sinistra) o polmone-CM (destra) per 48h. RNA è stato isolato e quantificato utilizzando RT-qPCR. Cambiamenti di espressione genica in risposta ad organo-CM (barre nere) sono stati normalizzati per GAPDH e espresse in relazione all'espressione basale basale media (barre grigie). I dati sono presentati come media ± SEM (N = 3; fold-passaggio dal rispettivo controllo negativo dei media basale). * = Significativamente differenti dai media basale; δ = significativamente diversi da linea cellulare dei genitori trattati con le stesse condizioni dei media; P <0,05, ANOVA. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Organo condizionata supporto contiene potenziali solubili Mediatori di comportamento metastatico. Una serie di anticorpi basato sul mouse sull'etichetta biotina è stato utilizzato per identificare i fattori solubili presenti nei linfonodi-CM e il cervello-CM. Le membrane sono state incubate con campioni di biotinilati (A) i media basale (DMEM: F12 + supplemento mitogeno concentrato), (B) linfonodi-CM o (C) del cervello-CM a 4 o CO / N e visualizzati utilizzando chemiluminescence. Ovali blu indicano controlli interni positivi, scatole rivestite indicano controlli negativi interni e scatole solide indicare i fattori solubili di interesse che sono potenzialmente coinvolti nel comportamento metastatico delle cellule di cancro al seno al linfonodo o il cervello. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Metastasi è un processo complesso attraverso il quale una serie di eventi cellulari sono in ultima analisi responsabile per l'invasione dei tessuti e tumorale lontana istituzione 4,30,31. Il sistema ex vivo modello qui presentato può essere utilizzato per studiare due aspetti importanti della progressione metastatica: homing delle cellule del cancro o la migrazione ad un organo specifico ( "arrivare") e la crescita in tale organo ( "crescere lì"). Molti studi hanno precedentemente concentrati sull'individuazione caratteristiche molecolari chiave associati con le cellule tumorali stesse che contribuiscono al processo di metastasi. Ad esempio, il lavoro svolto dal gruppo di Joan Massagué ha identificato le firme genetiche distinte associati a specifici polmone, osso-specifica, ed i modelli specifici cerebrali di diffusione 10-12,32. Anche se questo lavoro fornisce spunti importanti per quanto riguarda il contributo delle cellule tumorali a questo processo, molto meno si sa circa il ruolo dei fattori organo-specifiche contributo di tegli microambiente secondario, che è rimasto relativamente difficile da studiare 13.
Questo sistema modello ex vivo è stato precedentemente convalidato come una rappresentazione accurata del microambiente organo secondario, dimostrando che la migrazione specifica linea di cellule di cancro al seno e la crescita in organo-CM rispecchia queste cellule linee 'nel modello vivo di diffusione metastatica. Uno studio condotto da Chu e colleghi hanno utilizzato quattro differenti linee di cellule di cancro al seno umano con vari potenziale metastatico in vivo, tra cui MDA-MB-231 e SUM-159 (altamente metastatico, metastasi al linfonodo, polmone, fegato, ossa e cervello in vivo ) e la somma-149 e MDA-MB-468 (moderatamente metastatico, metastasi al linfonodo e del polmone in vivo) in. Sia le linee di cellule MDA-MB-231 e SUM-159 visualizzata migliorata la migrazione verso dal midollo osseo, linfa node- e polmone-CM, mentre le linee di cellule SUM-149 e MDA-MB-468 preferenzialmente migrati verso polmone-CM 13. L'attuale studio dimostra che osso e polmone in cerca di MDA-MB-231 varianti di entrambi preferiscono migrare rispettivamente dal midollo osseo e del polmone-CM e che l'esposizione a organo-CM può favorire l'espressione dei geni osso e metastatici polmonari associate precedentemente identificato da Massagué e colleghi 11,12. Presi insieme, questi risultati dimostrano che organo-CM fornisce una piattaforma ex vivo rappresentante di fattori solubili organo-specifiche presenti in vivo che influenzano il fenotipo e il comportamento delle cellule del cancro al seno.
L'identificazione di fattori solubili presenti all'interno specifici organi e il loro tenore di espressione costituisce un punto di partenza per determinare il loro potenziale influenza sul comportamento delle cellule tumorali. Inoltre, utilizzando tecniche quali immunodeplezione può consentire all'utente di esaurire efficacemente una proteina di interesse da organo-CM per determinare il suo effetto sul comportamento cellulare in vitro. Per esempio, Molti fattori solubili presenti all'interno di specifici microambienti organo funzionare come chemioattrattanti e hanno il potenziale di indurre la migrazione cellulare e la proliferazione. Lavoro precedente fatto usando polmone-CM ha portato all'identificazione di molti fattori solubili presenti nel polmone-CM che possono agire come fattori chemiotattici per le cellule del cancro al seno, tra cui osteopontina (OPN) e L-selectina (SELL) 13. Con immunodepleting questi fattori da polmone-CM, Chu e colleghi sono stati in grado di dimostrare una ridotta migrazione e / o la crescita del altamente metastatiche MDA-MB-231 cellule del cancro al seno 13 cellulare. Questi risultati mostrano che mezzi condizionati generati da organi interi fornisce una risorsa preziosa per studiare gli effetti di fattori solubili specifici sul comportamento delle cellule del cancro, attraverso l'uso di tecniche tradizionali in vitro.
Anche se questo è un modello di sistema abbastanza semplice, ci sono alcuni passaggi del protocollo sperimentale che sono fondamentali per successful generazione di media-organo condizionata. In primo luogo, l'uso di topi di età definite di 6-12 settimane per la raccolta di organi tra è importante al fine di controllare gli effetti legati all'età, sia legati allo sviluppo (prima dei 6 settimane) o legati all'invecchiamento nei topi anziani. In secondo luogo, la sterilità è di estrema importanza per tutto il protocollo e può essere meglio garantita attraverso l'utilizzo di una rigorosa tecnica asettica e lavorare in una cappa coltura di tessuti sterili, utilizzando materiali di consumo sterilizzati Tissue Culture e reagenti così come gli antibiotici mite in tutte terreni di coltura e supplementi ( vale a dire., la penicillina / streptomicina). Una delle sfide con l'utilizzo in vivo o ex vivo sistemi modello è l'intrinseca variabilità da animale a animale. Se questo ha osservato, la risoluzione di passaggi includono messa in comune dei mezzi condizionati ottenuti da più gruppi di topi prima dell'uso negli esperimenti a valle, nonché di assicurare che i media lung- e-cervello condizionata, sono accuratamente peso-normalizzato in ogni media esperimento collezione da risospensione in un 4: 1 Media: rapporto tissutale (volume / peso). Inoltre, le cellule stromali linfonodali primario e del midollo osseo non dovrebbe essere consentito di superare il 70% di confluenza in ogni passaggio o essere cresciuto oltre 5 passaggi totali, altrimenti terminali differenziarsi.
Le modifiche al protocollo presentato in questo articolo potrebbero essere concepito per consentire l'applicazione di diversi campi di ricerca. Anche se questo modello è stato finora utilizzato esclusivamente per la ricerca sul cancro al seno, può potenzialmente essere utilizzato per studiare il ruolo di fattori solubili organo-derivati in altri tipi di cancro, così come ulteriori normali stati fisiologici e patologici. Inoltre, mentre questo metodo è stato usato qui con modelli di topo nudo immunocompromessi, questa tecnica è teoricamente non limitato a questa specie di topi e addirittura potrebbe potenzialmente essere utilizzato con altri tipi di modelli animali.
Anche se questo modello fornisce important comprensione quanto al contributo di specifici fattori solubili organo-derivato sul comportamento delle cellule del cancro, non è priva di limiti. Prima questo modello si concentra esclusivamente sul componente solubile di microambienti organo che trascura l'importanza della matrice extracellulare (ECM). L'ECM è il componente presente non cellulare in tutti i tipi di tessuto e funzioni per fornire sia un ponteggio fisica per le cellule, così come la capacità di indurre segnali biochimici e biomeccanici cruciali richiesto per vari processi cellulari, tra morfogenesi, differenziazione cellulare e l'omeostasi 33 -35. È importante sottolineare che la composizione fisica e biochimica della ECM è ampiamente eterogeneo e può variare notevolmente tra i tipi di tessuti. Pertanto, la composizione tessuto-specifica del ECM può anche avere un'influenza sul tropismo d'organo durante la metastasi del cancro che può essere trascurato con questo modello. L'ECM può anche agire concentrare fattori solubili specifici in un modo che appropriately li presenta ad alcune cellule, e senza questa messa a punto della ECM, l'induzione di segnalazione cellulare può essere ridotta o alterata 36. Anche se il modello di cui al presente documento manca una componente ECM del caso, molti studi potrebbero essere rafforzati utilizzando un approccio gratuito utilizzando sia il modello citato qui insieme a un componente di ECM adatto. Ad esempio, sono disponibili in commercio fibroblasti organo primari che sintetizzano ECM endogena o componenti ECM ricombinanti possono essere utilizzati in aggiunta ai generato organo-CM per determinare l'entità completa dell'intera microambiente organo sul comportamento cellulare.
E 'possibile che il microambiente solubile generato da organo-CM potrebbe non adeguatamente imitare ciò è presente fisiologicamente durante il processo di metastasi. Il cancro cellula di sopravvivenza, la crescita e la progressione sono altamente dipendenti dalle interazioni tumore-ospite cellule 4,30,31. Generazione di tutto l'organo-CM può comportare la pRESENZA di fattori solubili normalmente non espresso da tipi di cellule che interagiscono con le cellule tumorali durante la progressione metastatica. Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che la presenza di un tumore primario può modulare il microambiente di siti metastatici lontane, quindi "priming" loro metastasi 37. Dal momento che l'attuale protocollo utilizza organi provenienti da topi portatori di tumore sani, non, sarebbe utile per confrontare i fattori solubili derivati da organi da topi portatori di un tumore mammario primario.
A causa della separazione meccanica di interi organi durante la generazione di vari organi-CM, fattori intracellulari possono essere rilasciati nei media circostanti che non possono normalmente essere incontrate fisiologicamente dalle cellule tumorali. Inoltre, osso e linfonodi di derivazione mezzi condizionati richiede la coltura di cellule stromali isolate da questi organi prima della loro raccolta. I tipi di cellule presenti durante ex vivo cultuanello non può rappresentare accuratamente l'ampiezza dei tipi cellulari incontrati fisiologicamente dalle cellule tumorali. Mentre le cellule stromali principalmente secernono molti fattori associati a vari microambienti di organi, utilizzando questi metodi non può spiegare l'influenza di altri tipi di cellule presenti nei tessuti e organi 38. Infine, abbiamo incluso un supplemento mitogeno nei mezzi di base utilizzati per generare media-organo condizionata, perché abbiamo trovato che questo è stato necessario per mantenere la vitalità di entrambi gli organi in coltura (polmone e cervello) e l'isolato BMSC e LNSC. Tuttavia, riconosciamo l'avvertenza che la presenza di questo supplemento mitogeno potrebbe aver stimolato gli organi di produrre artificialmente fattori solubili che non potrebbero normalmente fare,
In sintesi, molti studi hanno indicato che specifici microambienti organi possono influenzare profondamente la biologia delle cellule tumorali. Nonostante le limitazioni discusse, la ex vivo sistema modello qui presentato represents una tecnica completa per studiare l'influenza del microambiente solubile di molti organi solidi sul comportamento cellulare. Nel laboratorio degli autori, questo sistema modello è stato e continua ad essere utilizzato come mezzo per studiare molti degli eventi cellulari associati con metastasi, compresa l'invasione, la migrazione, la proliferazione, comportamento staminale, e cambiamenti di espressione genica. I dati ottenuti da questi studi potrebbero a loro volta informare il potenziale applicazione clinica di questo modello di sistema per le cellule del cancro al seno primarie isolate da tumori di pazienti, al fine di determinare la loro risposta ai vari microambienti che rappresentano potenziali siti metastatici. Presi insieme, si auspica che un'ulteriore comprensione dell'interazione tra le cellule tumorali e microambiente durante il processo di tropismo d'organo metastatico porterà ad un miglioramento del trattamento del cancro in futuro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
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