Introduction
Borstkanker is de meest gediagnosticeerde kanker bij vrouwen en de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen 1. Borstkanker hoge sterftecijfer is vooral te wijten aan het falen van conventionele therapie te verminderen en te elimineren gemetastaseerde ziekte; ongeveer 90% van kanker-gerelateerde sterfgevallen te wijten metastase 2. Het begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanismen van de metastatische cascade grootste belang voor de ontwikkeling van therapeutische effectief zowel vroege als late stadium van borstkanker.
Verleden onderzoek heeft geholpen verhelderen de meerdere stappen aard van de uitzaaiing van borstkanker en het wordt verondersteld dat het resultaat van zowel de progressie van kanker en metastase is grotendeels afhankelijk van interacties tussen kankercellen en de nieuwe omgeving 3. Klinische observaties tonen aan dat veel kankers tonen orgaan tropisme, dwz., De neiging om bij voorkeur metastaseren specifieke organs.In case borstkanker, ziekte van een patiënt typisch verspreidt of uitzaaiing 5 belangrijkste plaatsen, zoals het been, longen, lymfeknopen, lever en hersenen 4-6. Veel theorieën zijn ontwikkeld om dit proces uit te leggen, maar slechts een paar hebben de tand des tijds doorstaan. Ewing's theorie van metastase, in de jaren 1920 voorgesteld, de hypothese datde verdeling van metastase was strikt door mechanische factoren; waarbij tumorcellen in het lichaam via de normale fysiologische gedefinieerd bloedstroom patronen worden uitgevoerd en eenvoudig te arresteren in het eerste capillaire bed die ze tegenkomen 7. Daarentegen Stephen Paget 1889 "zaad en aarde" hypothese geopperd dat bijkomende moleculaire interacties verantwoordelijk waren voor overleving en groei van metastasen, waarbij kankercellen ( "seeds") zich alleen kunnen oprichten en proliferatein orgaan microenvironments passende moleculaire factoren produceren ( "bodem ") 8. Bijna een eeuw later, Leonard Weiss ondernam een meta-analyse van eerder gepubliceerde data autopsie bevestigd Ewing voorspelling dat vele uitgezaaide tumoren waargenomen bij de autopsie werden gevonden in de verwachte verhoudingen die zou worden verwacht wanneer orgaan met metastasen tropisme alleen bepaald door de bloedstroom patronen. In manyinstances waren er minder of meer metastasen gevormd op bepaalde plaatsen dan zou Ewing voorgestelde mechanische factoren 9 verwachten. Deze rekeningen en theorieën suggereren dat specifiek orgaan microenvironments een cruciale rol in de verspreiding patronen en de daaropvolgende groei en overleving van vele vormen van kanker, zoals borstkanker spelen.
Eerder onderzoek inspanningen zijn voornamelijk gericht op tumor- cellen afgeleide factoren en hun bijdrage aan het orgaan tropisme waargenomen bij borstkanker metastase 10-12, maar weinig onderzoek is onderzocht factoren afgeleid van het micro orgaan dat kan gunstig niche in de vaststellingborstkanker metastasen. Dit is grotendeels te danken aan de technische uitdagingen van het bestuderen componenten van het orgel in vitro micro-omgeving.
De huidige artikel beschrijft een gedetailleerd ex vivo model voor het bestuderen van de invloed van de oplosbare bestanddelen van de lymfeknoop, bot, long en hersenen op het metastatisch gedrag van humane borstkankercellen. Eerdere studies hebben dit modelsysteem bevestigd door aan te tonen dat verschillende borstkankercellijnen tonen cellijn specifieke en orgaanspecifieke maligne gedrag in reactie op geconditioneerde media-orgaan dat overeenkomt met de in vivo metastatisch potentieel 13. Dit model kan worden gebruikt voor het identificeren en specifieke organen afgeleide oplosbare factoren die een rol spelen bij het metastatische gedrag van borstkanker en andere soorten kankercellen, met inbegrip invloeden op de groei, migratie evalueren, stam-achtig gedrag en genexpressie en de identificatie vanpotentiële nieuwe therapeutische doelwitten voor kanker. Dit is de eerste ex vivo model dat kan worden gebruikt om orgaanspecifieke metastatisch gedrag in detail te onderzoeken en de rol van organen afgeleide oplosbare factoren voor het proces van metastase te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Canadese Raad over Animal Care, in het kader van protocollen door de Western University Animal Gebruik Subcommissie goedgekeurd.
1. Organ Isolation (Lung, hersenen, botten, lymfkliertest)
- Neem vier steriele 50 ml conische buizen (een voor elk orgaan te isoleren) die ongeveer 30 ml steriel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Pre-wegen elk buisje PBS met behulp van een elektronische weegschaal.
- Euthanaseren 6-12 week oude muis door CO 2 inhalatie. Muizen moet worden overgelaten in de CO 2 kamer voor ongeveer 1-2 min of tot de muis niet meer beweegt en ademhaling. Succesvol euthanasie kan verder worden bevestigd door het ontbreken van hartslag bij het handmatig gecontroleerd met een vinger. Voorkomen cervicale dislocatie omdat deze methode bloedvaten van de nek leidt tot problemen verwijderen axillaire lymfeklieren kunnen scheuren.
Let op: Eerder werk heeft specifiek gebruiktgezond vrouwelijk naakt muizen, Hsd: Athymische nude- Foxn1 nu 13. - In een steriele weefselkweek kap, plaatst u de muis op zijn rug op een piepschuim pad, verspreid de ledematen en gebruiken pinnen om ze op hun plaats te houden.
- Met behulp van een steriel pincet en een schaar, knip de abdominale huid op de middenlijn aan de genitaliën en snijd omhoog naar de mond. Trek de rug van de buikhuid van de buikspieren en speld op zijn plaats op het piepschuim pad.
- Zoek de oksel, arm en lies lymfeklieren.
Opmerking: lymfeklieren zijn meestal omringd door vetweefsel. De inguinale lymfeknopen zijn het makkelijkst te lokaliseren omdat ze oppervlakkig op de kruising van twee bloedvaten op de teruggetrokken buikhuid gevonden. Oksel en arm lymfeklieren bevinden zich dieper in het weefsel en vereisen zachte manoeuvreren van weefsel.- Nadat u de lymfeklieren hebben gelegen, gebruik dan de schaar om zachtjes en voorzichtig snijd de lymfe geendes ze weg van de huid, vet en vaten en uit de muis. Om een goede dissectie te bevestigen, rol de tang op het verwijderde weefsel. Als een harde knobbel bestaat wanneer het rollen van de tang over het weefsel, dan is een lymfeklier is waarschijnlijk met succes verwijderd.
- Bewaar verwijderde lymfeklieren in ijskoude PBS.
- Behulp van de tang en schaar, open de buikholte door snijden door de blootgestelde buikwand boven te bewegen naar de borst. Knip voorzichtig door het borstbeen, het blootstellen van de borstholte.
- Zoek het middenrif onder de longen en snijd het middenrif. Het moet trekken aan de ribben door spanning.
- Til de longen van onderaf en snijd het onderliggende weefsel in de richting van de luchtpijp. Hierdoor kan de longen vrij van de borstholte verwijderd. Verwijder het hart en de longen en bloc en plaats in ijskoud PBS. Het hart kan uit de longen hier of vlak voor het wegen in stap 2 worden verwijderd.
- Verwijder depennen, waarbij de muis op zijn plaats op het polystyreenschuim pad. Draai de muis over en snijd de huid van de onderrug helemaal over van flank naar flank.
- Met behulp van een steriel gaasje op de romp van de muis te houden, schil de rug huid van de muis over de benen en voeten van de muis.
- Het gebruik van hetzelfde stuk steriel gaasje, houdt het onderbeen in plaats zorgvuldig te breken het enkelgewricht van de muis voet en schil de huid over het gewricht proximaal in de richting van het kniegewricht.
- Met een schaar, verwijder de tibia vrij van het kniegewricht en plaats in ijskoud PBS.
- Herhaal stap 1.11) tot 1.12) met tegengestelde ledematen.
- Met behulp van een tang, houdt het dijbeen op zijn plaats, weggesneden omliggende spierweefsel met behulp van de schaar en verwijder het dijbeen, waardoor het in ijskoud PBS.
- Herhaal stap 1.14) met tegengestelde ledematen.
- Met behulp van een nieuw stuk van steriel gaas, houdt het hoofd van de muis op zijn plaats. Met behulp van een tang en schaar, verwijder voorzichtig de huid aan de s blootKull. Met een schaar, knip voorzichtig het achterhoofd schedel uit de top midden in een rechte lijn naar beneden en naar de achterste hersenen bloot te leggen.
- Met behulp van een tang, schep onder de hersenen in de richting van de voorste en verwijder de gehele hersenen. Plaats de hersenen in ijskoud PBS.
- Herhaal 1,1) tot 1,17) stappen gedurende ten minste vier muizen.
2. Organ Weighing
- Na orgel isolatie, wegen elk PBS buis met long- en hersenweefsel met behulp van een elektronische weegschaal.
- Bereken het gewichtsverschil door het aftrekken van de pre-isolatie gewicht (alleen PBS) van het gewicht van de buis PBS + organen (longen en hersenen).
- Bepaal de hoeveelheid media nodig weefselfragmenten resuspenderen van de berekende gewichtsverschil.
Opmerking: Lung en hersenweefsel gewichtspercentages genormaliseerd door resuspensie in een 4: 1 media: weefsel verhouding (vol / gew).
3. Productie van long- en hersen- geconditioneerde media
- Steriel tkwestie cultuur kap, omkeren PBS buizen die de longen of de hersenen drie keer om de resterende bloed uit de organen en zuig PBS met bloed te verwijderen. Herhaal dit met verse koude PBS tot oplossing helder met geen bewijs van bloed verschijnt.
- Plaats de longen en hersenen in afzonderlijke 60 mm 2 glazen petrischaaltjes. Met behulp van twee steriele scalpel bladen, gehakt longen of hersenen door herhaaldelijk heen en weer te snijden tot weefsel fragmenten zijn ongeveer ~ 1 mm 3 in grootte.
- Resuspendeer weefsel fragmenten in geschikte volume (eerder bepaald in stap 2,3) of Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM): F12 medium aangevuld met 1 x geconcentreerde mitogeen vullen en penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml).
- Voeg geresuspendeerde longen of hersenweefsel fragmenten één putje van een 6-wells plaat.
- Incubeer weefselfragmenten in media gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Na de incubatie, verzamel geconditioneerde media voor elk weefsel en ferdere verdunnen door toevoeging van drie gelijke hoeveelheden vers medium in een 50 ml conische buis.
- Centrifugeer bij 1000 xg in verdunde geconditioneerde media voor elk orgaan bij 4 ° C gedurende 15 min om grote weefselafval te verwijderen. Verzamel media supernatant en te filteren door middel van een 0,22 pm spuitfilter.
- Pool geconditioneerde media uit elk orgaan (bijv., Long met long en hersenen met de hersenen) van meerdere muizen vertegenwoordigen muis tot muis variabiliteit. Aliquot en bewaar geconditioneerde medium bij -80 ° C tot gebruik.
4. Genereren van Bone Marrow-conditioning Media
- In een steriele weefselkweek kap, trimmen overtollige weefsel uit het bot en verwijder epifysen (eindstukken) uit de botten met een schaar.
- Met behulp van een 27 G naald ½ spoelen mergholte van beenderen door op 1 ml PBS door het midden van elk been. Dit zal u toelaten om stromale beenmergcellen (BMSC) verzamelen in een nieuwe buis met PBS.
- Centrifugeer bij 1,000 g gedurende 5 min bij 4 ° C en wassen BMSC tweemaal met PBS. Resuspendeer beenmerg stromale cellen in 20 ml bot stromale cel kweekmedium (DMEM: F12 medium aangevuld met 1 x geconcentreerde mitogeen supplement, penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 ug / ml) en 10% foetaal boven serum (FBS) ).
- Plaat 10 ml geresuspendeerd beenmerg stromale cellen in een T75 fles.
Opmerking: Combineer en plaat cellen van elk 2 muizen in elke T75 kolf; vier muizen zijn twee T75 kolven nodig (ca. 1 x 10 7 cellen / fles). - Incubeer beenmerg stromale cellen in bot stromale celgroei media gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Na de incubatie, verwijder media uit zowel T75 kolven en in gebruik genomen nieuwe T75 fles, etiket deze kolf als "Floater Fles". Voeg frisse bot stromale celgroei media vorige 2 kolven en incubeer alle 3 kolven bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na de cellen te bereiken ongeveer 70% samenvloeiing (ongeveer 5-7dagen) passage cellen. Om dit te doen, verwijder medium en was de cellen tweemaal met PBS (3 ml per wasbeurt). Verwijderen PBS en voeg 3 ml trypsine / EDTA-oplossing, zodat trypsine bedekt het gehele oppervlak van de kolf. Na de cellen til de kolf (~ 2 - 3 min), halte trypsine reactie door toevoeging van 3 ml bot stromale celgroei media). Centrifuge 900 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, verwijderen media en resuspendeer cellen in 10 ml vers bot stromale celgroei media.
- Pool cellen van alle kolven en passage 1: 5 in drie nieuwe T75 flessen en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Na de cellen nogmaals 70% te bereiken, herhaalt u stap 4.6 en zwembad en de passage van alle aanhangend cellen een tweede keer. Opnieuw plate alle cellen vier T75 flessen en incubeer 37 ° C en 5% CO2. Bot stromale cel groeimedia worden gebruikt voor alle stappen.
- Laat cellen om samenvloeiing bereiken, wassen cellen drie keer met PBS en voeg bot stromale cellen verzameling media (DMEM: F12 media + 1x geconcentreerd mitogeen supplement + penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml); 10 ml / T75), om ervoor te zorgen dat deze media vrij is van FBS. Verzamel beenmerg geconditioneerde medium 72 uur later, gefiltreerd door een 0,22 urn filter, pool, hoeveelheid en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
- Desgewenst bevestigen fenotype van de geïsoleerde beenmerg-stromacellen (BMSC) met behulp van antilichamen tegen muizen Sca-1, CD105, CD29, en CD73, CD44, onder toepassing van standaard technieken flowcytometrie zoals eerder 13 beschreven.
5. Het genereren van lymfkliertest airconditioning Media
- In een steriele weefselkweek kap, omkeren PBS buis met lymfeklieren drie keer om de resterende bloed uit de lymfeklieren en zuig bloedige PBS te verwijderen. Herhaal dit met verse koude PBS tot oplossing helder met geen bewijs van bloed verschijnt.
- Plaats lymfeklieren in 60 mm 2 glazen petrischaaltjes. Met behulp van twee steriele scalpel bladen, gehakt lymfeklieren door herhaaldelijk heen en weer te snijden tot tissuE-fragmenten zijn ongeveer 1 mm3 groot.
- In een conische buis, resuspendeer weefselfragmenten in 10 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) medium aangevuld met penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml), 5 x 10 -5 M steriele β-mercaptoethanol ( 1,75 pl / 500 ml media) en 10% FBS.
- Centrifugeer bij 900 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer alle cellen in 30 ml media. Voeg 5 ml medium / putje in een 6-wells plaat en incubeer gedurende 7 dagen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na 7 dagen incubatie media verwijderen, wassen hechtende cellen met 5 ml warm PBS en voeg 5 ml vers medium aan elk putje. Een cel in staat om te groeien tot confluentie (ongeveer 5-7 dagen), trypsinize, zwembad alle cellen en passage zoals beschreven in stap 4.6. Opnieuw plate cellen 6-wells plaat. Herhaal deze stap drie keer.
- Na drie passages, zodat de cellen groeien tot samenvloeiing, wassen putjes driemaal met PBS en voeg 2 ml / putje van DMEM: F12 + 1xgeconcentreerd mitogeen supplement en penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 gg / ml), zodat de folie vrij van FBS. Verzamel lymfe-node geconditioneerde media na 72 uur, zwembad, hoeveelheid, en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
- Desgewenst bevestigen fenotype van de geïsoleerde lymfeknopen stromale cellen (LNSC) met behulp van antilichamen tegen muizen CD45 en gp38, onder toepassing van standaard technieken flowcytometrie zoals eerder 13 beschreven.
6. Gebruik van Organ-geconditioneerde media betreffende Downstream Testen om metastatische gedrag van kankercellen Verwante
- Zodra het orgaan geconditioneerde medium werd gegenereerd zoals beschreven in stappen 1-5, gebruiken verschillende benedenstroomse cel en moleculaire biologie assays uit te voeren om de invloed van oplosbare orgaan afgeleide factoren op de metastatische gedrag van kankercellen te bepalen. Voorbeelden van standaard assays (elders in de literatuur beschreven) omvatten eiwitarrays 13, cellulaire groei assays <sup> 13, celmigratie assays 13, tumorsphere formatie 14 en RT-PCR 15. De originele basismedium gebruikt om het orgel geconditioneerde medium genereren (dwz ongeconditioneerde DMEM. F12 medium aangevuld met 1 x geconcentreerde mitogeen vullen en penicilline (50 gg / ml) / streptomycine (50 ug / ml) worden gebruikt als een negatieve controle .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generatie van Organ geconditioneerde Media
Overzichtsdiagrammen / schema van het proces van orgaan isolatie en productie van geconditioneerd medium wordt getoond in Figuur 1, met representatieve fotografische beelden van de in figuur 2 procedure. Opgemerkt wordt dat bij dit protocol werd voor het eerst in ontwikkeling is lever inbegrepen in onze analyse omdat het een gemeenschappelijke plaats van borstkankermetastasen. Vanwege de grote hoeveelheid proteasen geproduceerd en uitgescheiden door de lever, is het zeer moeilijk om de lever te laten voortbestaan lang genoeg om goede kwaliteit geconditioneerde media genereren. -Lever geconditioneerde media is niet stabiel eenmaal geïsoleerd en neigt er veel eiwit precipitaat, waarschijnlijk om dezelfde reden. Derhalve lever was niet in verdere analyse.
(figuur 3A) en BMSCs demonstreren van een kleinere verschijning (figuur 3C). Flow cytometrische analyse bevestigt dat LNSCs grotendeels CD45 - en gp38 +, met ~ 60% van de cellen bezitten een CD45 - gp38 + fenotype indicatief LNSCs 16 (figuur 3B). , Indicatief BMSCs 17,18 - de BMSCs moet positief voor CD44 en CD29, zwak positief voor CD105 en Sca-1, en negatief voor CD73 (H Figuur 3D) zijn.
Cell Borstkanker Response naar Organ-geschikte migratiepatronen en Gene Expression Wijzigingen
Met behulp van deze ex vivo modelsysteem, heeft eerder aangetoond dat de menselijke borstkankercellen met verschillende genetische achtergronden vertonen differentiële migratie en groeipatronen richting specifiek orgaan omstandigheden. Met name deze patronen geven de bekende metastatische verspreiding patronen van deze cellijnen in vivo 13. In de huidige studie, bot (231-RvB) - en long (231-LM2) -zoekende varianten van de MDA-MB-231 menselijke borstkanker cel varianten (een soort geschenk van Dr. Joan Massagué 11,12) zijn ook gebruikt in een transwell migratie test om orgel passende migratiepatronen bevestigen. De resultaten tonen aan dat de bot-zoekende 231-RvB variant voorkeur migreert naar het beenmerg geconditioneerde media op hersen- en long- geconditioneerde media (figuur 4A, links). evenzo, De long op zoek naar 231-LM2 variant voorkeur migreert naar long-geconditioneerde media dan beenmerg geconditioneerde media en aan de hersenen geconditioneerde media (figuur 4A, rechts). Bovendien, RT-qPCR analyse toont aan dat de blootstelling van de ouderlijke MDA-MB-231-borstkankercellen tot bot- of long geconditioneerde media veroorzaakt een opregulatie van genen geassocieerd met bot-metastase specifieke (CXCR4, IL-11, TGFß1) of long- specifieke metastase (VCAM1) van borstkankercellen in vivo 11,12 (Figuur 4B). Deze resultaten tonen de geldigheid van het ex vivo systeem met betrekking tot de verwachte orgaan tropisme van borstkankercellen in vivo, en geeft aan dat oplosbare factoren aanwezig in organen geconditioneerde media metastatische cel fenotype kunnen beïnvloeden Naast het bevorderen van migratie.
-Orgel airconditioning Media Bevat Potentiële Oplosbare Mediators van gemetastaseerd Behavior
Een biotine label-gebaseerde muizenantilichaam matrix werd gebruikt om de aanwezigheid en de identiteit van gemeenschappelijke oplosbare factoren in-orgaan geconditioneerde media van verschillende organen te bepalen. Deze array omvat antilichamen tegen 308 van de meest voorkomende oplosbare muis proteins.This eiwitarray is eerder gebruikt om oplosbare factoren van belang in verband met metastatische cascade aanwezig in de long en beenmerg geconditioneerde media identificeren zie Chu et al (2014) en Pio e.a. (2015) respectievelijk 13,14. In de huidige studie, zijn eiwitarray resultaten getoond basale media (figuur 5A) vergeleken met lymfe node (figuur 5B) en brain-geconditioneerde medium (figuur 5C). Gewezen naast elkaar array oplosbare factoren in de media die gevonden zijn geassocieerd met stappen in de metastatische cascade in de literatuur 19-29. Deze oplosbare factors kan de moeite waard te onderzoeken als mogelijke mediatoren van secundaire metastasen binnen deze organen sites.
Figuur 1. Schematische Overzicht van het proces van Organ Isolatie en Generatie van geconditioneerde media. Weefsels (longen, hersenen, dijbeen, het scheenbeen en lymfeklieren) worden geoogst van de muis. Longen, hersenen en zijn lymfklieren vermalen met een scalpel. Beenmerg wordt geoogst uit de mergholte van de botten door op PBS door de holte met een 27½ G naald. Long- en hersenweefsel fragmenten worden gedurende een periode van 24 uur voor verdunning met drie gelijke volumes verse basale media verzameld long- en hersenen geconditioneerde media. Beenmerg en lymfklier stromale cellen worden gepasseerd 2-3 keer vóór incubatie met basale media aan het bot en lymfe-node geconditioneerde media te maken. Geoogste media kan worden pooled en bij -80 ° C tot klaar voor gebruik in downstream assays zoals eiwitten arrays, cellulaire groei assays, cellulaire migratie assays, tumorsphere formatie, en RT-PCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Representatieve fotografische afbeeldingen van de procedure for Organ Isolatie en genereren van geconditioneerde media. Op dag 0, de longen, hersenen, femur, tibia en lymfeklieren verzameld uit de muis. De longen, hersenen en lymfeklieren in een 60 mm2 glazen petrischaal en vermalen met twee scalpelmesjes ongeveer 1 mm3 groot. Het beenmerg wordt gewonnen uit de mergholte van beenderen door op PBS door de holte met een 27 ½ G naald in een nieuwe buisPBS. De long en hersenweefsel fragmenten geïncubeerd gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2 vóór verdunning met drie gelijke volumes vers medium en verzameld long- en hersenen geconditioneerde media na 24 uur. Het beenmerg en lymfeklieren stromale cellen worden geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO 2 en aan passage 2-3 keer (~ 3 weken totaal) voor de vervanging van media door serum- vrij basale media bot en lymfe-knooppunt geconditioneerde media. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Karakterisering van Geïsoleerde lymfkliertest en stromale beenmergcellen. Beeld Helder-veld microscopie toont de morfologie van lymfeklier stromale cellen (LNSCs) (A). (B) Representatieve stromingcytometrie analyse van LNSCs met een fycoerythrine (PE) geconjugeerd gp38 antilichaam en een fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd CD45 antilichaam. helderveld microscopie afbeelding toont de morfologie van beenmerg stromale cellen (BMSCs) (C). (DH) Representatieve stroming cytometrie analyse van BMSCs gebruik PE geconjugeerd (zwart profielen) antilichamen tegen (D) CD44, (E) CD106, (F) Sca-1, (G) CD29, (H) CD73 antilichamen ten opzichte van de isotype controle (witte profielen). Een minimum van 10.000 levensvatbare evenementen werden verzameld per monster. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Organ-geschikte migratiepatronen en genexpressie verandert als gevolg van Organ-geconditioneerde media. (A) Bone-op zoek naar 231-RvB varianten (links, gestreepte staven) of long op zoek naar 231-LM2 varianten (rechts, gestreepte staven) van de MDA-MB-231 menselijke borstkanker cellijn evenals ouderlijke MDA-MB- 231 cellen (beide panelen, gevulde staven) werden uitgeplaat op met gelatine gecoate inzetstukken (8 urn poriën) voorafgaand aan plaatsing in basale media (DMEM: F12 + geconcentreerde mitogeen supplement) of orgaan-CM. Platen werden geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 18 uur. (B) Het hele populatie ouderlijke MDA-MB-231 cellen werden blootgesteld aan been CM (links) of long-CM (rechts) gedurende 48 uur. RNA werd geïsoleerd en gekwantificeerd met behulp van RT-qPCR. Genexpressie verandert als gevolg van orgaan-CM (zwarte staven) werden genormaliseerd op GAPDH en uitgedrukt in verhouding tot de uitgangswaarde expressie in basale media (grijze balken). Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM (N = 3; fold-verandering ten opzichte van de respectieve negatieve controle van de basale media). * = Significant verschillend van basale media; δ = significant verschillend van ouderlijke cellijn behandeld met dezelfde media voorwaarden; P <0,05, ANOVA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Organ-conditioning Media Bevat Potentiële Oplosbare mediatoren van gemetastaseerde Behavior. Een biotine label-gebaseerde muizenantilichaam serie werd gebruikt om oplosbare factoren die aanwezig zijn in lymfeklier-CM en de hersenen-CM te identificeren. Membranen werden geïncubeerd met gebiotinyleerde monsters (A) basaal medium (DMEM: F12 + geconcentreerde mitogeen supplement), (B) lymfklier-CM of (C) brain-CM op 4 o CO / N en gevisualiseerd met behulp chemiluminescence. Blauwe ovalen duiden interne positieve controles, gevoerd vakken geven interne negatieve controles en solide vakjes geven oplosbare factoren van belang die mogelijk betrokken zijn bij de metastatische gedrag van borstkankercellen naar de lymfeklieren of de hersenen. Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metastase is een complex proces waarbij een reeks cellulaire gebeurtenissen uiteindelijk veroorzaken weefselinvasie en verre tumor inrichting 4,30,31. De ex vivo modelsysteem gepresenteerde kunnen worden gebruikt om twee belangrijke aspecten van metastatische progressie studeren: kankercel homing of migratie naar een specifiek orgaan ( "daarheen") en groei van dat orgaan ( "daar groeien"). Vele studies hebben eerder gericht op het identificeren van mol specifieke eigenschappen van de kankercellen zich die bijdragen aan het metastase proces. Zo heeft het werk gedaan door de groep Joan Massagué geïdentificeerd verschillende genen handtekeningen in verband met long-specifieke, bot-specifieke, en de hersenen-specifieke patronen van spread 10-12,32. Hoewel deze werkzaamheden belangrijke inzichten met betrekking tot de bijdrage van kankercellen deze werkwijze veel minder bekend over de rol van orgaanspecifieke factoren bijgedragen door tHij secundaire micro-omgeving, die relatief moeilijk om te studeren 13 is gebleven.
Dit ex vivo modelsysteem is eerder gevalideerd als een accurate weergave van de secundaire orgel micro door aan te tonen dat borstkanker cellijn-specifieke migratie en groei in orgaan- CM weerspiegelt deze cellijnen in vivo model van metastatische verspreiding. Een studie van Chu en collega's gebruikt vier verschillende humane borstkankercellijnen met verschillende metastatisch potentieel in vivo, zoals MDA-MB-231 en SUM-159 (sterk metastatische uitzaaien naar de lymfeklieren, longen, lever, botten en hersenen in vivo ) en de SUM-149 en MDA-MB-468 (matig metastatische, uitzaaien naar de lymfeklieren en longen in vivo) in. Zowel de MDA-MB-231 en SUM-159 cellijnen weergegeven verbeterde migratie in de richting van beenmerg, lymfe node en long-CM, terwijl de SUM-149 en MDA-MB-468 cellijnen bij voorkeur migreerden in de richting van de longen-CM 13. De huidige studie toont aan dat bot- en long-zoekende MDA-MB-231-varianten zowel de voorkeur aan respectievelijk migreren naar beenmerg en longen-CM en dat blootstelling aan orgel-CM kan de expressie van bot- en longen uitgezaaide geassocieerde genen te bevorderen eerder geïdentificeerd door Massagué en collega's 11,12. Samengenomen tonen deze resultaten aan dat orgaan-CM verschaft een ex vivo platform representatief orgaanspecifieke oplosbare factoren in vivo in het ontstaan en het gedrag van borstkankercellen beïnvloeden.
Identificatie van oplosbare factoren aanwezig in specifieke organen en hun relatieve expressieniveaus verschaft een uitgangspunt voor hun mogelijke invloed op kankercellen gedragsbepalende. Bovendien kunnen met technieken zoals immunodepletie kan de gebruiker daadwerkelijk afbrekende een eiwit van interesse van orgaan-CM zijn effect op in vitro cellulaire gedrag bepalen. BijvoorbeeldVeel oplosbare factoren aanwezig in specifiek orgaan microenvironments fungeren als chemoattractanten en hebben het potentieel om cellulaire migratie en proliferatie te induceren. Contract gedaan via long CM heeft geleid tot de identificatie van vele oplosbare factoren aanwezig in long-CM die kan werken als chemoattractanten voor borstkankercellen, zoals osteopontine (OPN) en L-selectine (SELL) 13. Door deze factoren immunodepleting van long-CM, Chu en collega's konden verminderde celmigratie en / of groei van zeer metastatische MDA-MB-231-borstkankercellen 13 tonen. Deze resultaten tonen aan dat geconditioneerde media geproduceerd van een geheel orgaan verschaft een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de effecten van bepaalde oplosbare factoren op kankercellen gedrag, door het gebruik van traditionele in vitro technieken.
Hoewel dit een vrij eenvoudig model systeem, zijn er een aantal stappen in de experimentele protocol die essentieel zijn voor successfu zijnl generatie-orgel geconditioneerde media. Ten eerste, het gebruik van muizen tussen de gedefinieerde leeftijd van 6-12 weken voor het oogsten van organen is belangrijk om te controleren voor leeftijdgebonden effecten, verband houdend met de ontwikkeling (voor 6 weken) of in verband met veroudering in oudere muizen. Ten tweede steriliteit van het grootste belang gehele protocol en kan het beste worden gewaarborgd door het gebruik van strikte aseptische techniek en werken in een steriele weefselkweek kap, gebruik gesteriliseerd weefselkweek verbruiksgoederen en reagentia alsook mild antibiotica in alle kweekmedia en supplementen ( dwz., penicilline / streptomycine). Een van de uitdagingen bij het gebruik van in vivo of ex vivo model is een absoluut dier per dier variabiliteit. Als dit geconstateerd, stappen voor probleemoplossing onder meer het bundelen van geconditioneerde media verkregen uit meerdere batches van muizen voor gebruik in downstream-experimenten, maar ook ervoor te zorgen dat long- en aan de hersenen geconditioneerde media zijn nauwkeurig gewicht-genormaliseerde in elk media verzameling experiment door resuspensie in een 4: 1 media: weefsel verhouding (volume / gewicht). Bovendien moet het primaire lymfeklieren en beenmerg stromale cellen niet mogen 70% confluentie overschrijden elk passage of worden gegroeid dan 5 totaal passages, anders zullen zij terminaal differentiëren.
Wijzigingen aan het protocol in dit artikel zou kunnen worden beoogd om toepassing op verschillende gebieden van het onderzoek mogelijk te maken. Hoewel dit model nu toe uitsluitend gebruikt voor borstkanker onderzoek kan eventueel worden gebruikt om de rol van organen afgeleide oplosbare factoren in andere soorten kanker en andere normale fysiologische en ziektetoestanden bestuderen. Bovendien, terwijl deze methode hier gebruikt met immunogecompromitteerde naakt muismodellen, deze techniek is theoretisch niet tot deze soorten muizen en zelfs zou kunnen worden gebruikt met andere typen diermodellen.
Hoewel dit model biedt important inzicht over de bijdrage van specifieke-orgel afgeleide oplosbare factoren op kankercel gedrag, het is niet zonder beperkingen. Eerste dit model richt zich uitsluitend op de oplosbare component van het orgel micro-omgevingen, waarin het belang van de extracellulaire matrix (ECM) verwaarloost. De ECM is de niet-cellulaire component aanwezig in alle weefsels en functies zowel fysiek scaffold voor cellen, alsook de mogelijkheid om belangrijke biochemische en biomechanische signalen induceren vereist verscheidene cellulaire processen, waaronder morfogenese, cellulaire differentiatie en homeostase 33 bieden -35. Belangrijk is dat de fysische en biochemische samenstelling van de ECM is sterk heterogeen en kunnen sterk variëren tussen soorten weefsels. Daarom kan de weefsel-specifieke samenstelling van de ECM ook invloed hebben op orgaan tropisme tijdens metastase die kunnen worden genegeerd met dit model. De ECM kunnen ook werken om specifieke oplosbare factoren te concentreren op een manier die appropriately stelt ze bepaalde cellen, en dit zonder fijnafstemming van de ECM, kan de inductie van cellulaire signalering ten dele of gewijzigd 36. Hoewel de in dit artikel genoemde model mist een passende ECM component konden veel studies worden versterkt door het gebruik van een gratis benadering gebruik te maken van zowel de hier genoemde samen met een geschikte ECM component model. Zo zou de handel verkrijgbare primaire orgaan fibroblasten die endogeen of recombinant ECM ECM componenten synthetiseren worden gebruikt naast gegenereerde orgaanspecifieke CM bepalen de volle omvang van het gehele orgaan micromilieu op celgedrag.
Het is mogelijk dat de oplosbare micro gegenereerd orgaanspecifieke CM niet op adequate nabootsen wat fysiologisch aanwezig tijdens het proces van metastase. Kankercel overleving, groei en progressie zijn in hoge mate afhankelijk van kankercel-gastheer interacties 4,30,31. Genereren van hele orgaan- CM kan leiden tot presence van oplosbare factoren die normaal niet uitgedrukt celtypen die interageren met kankercellen in metastatische progressie. Verder is eerder aangetoond dat de aanwezigheid van een primaire tumor micro-omgeving van de verre metastasen kunnen moduleren, waardoor "priming" hen metastase 37. Aangezien de huidige protocol gebruikt organen afkomstig van gezonde, niet-tumordragende muizen, zou het nuttig de oplosbare factoren afgeleid van organen van muizen met een primaire borsttumor te vergelijken.
Door de mechanische scheiding van gehele organen tijdens het genereren van verschillende orgaansystemen-CM, kan intracellulaire factoren worden vrijgegeven in de omringende media die normaal niet fysiologisch worden blootgesteld kankercellen. Bovendien, bot- en lymfe-node afgeleide geconditioneerde media vergt het kweken van stromale cellen geïsoleerd uit deze organen voorafgaand aan hun collectie. De celtypen tijdens ex vivo cultu aanwezigring mag geen getrouw beeld geven van de breedte van cellulaire soorten fysiologisch waarmee kankercellen. Terwijl stromale cellen scheiden voornamelijk vele factoren die samenhangen met verschillende orgaansystemen microenvironments, met behulp van deze methoden geen rekening met de invloed van andere celtypes aanwezig in weefsels en organen 38. Tenslotte, inclusief mitogeen we een supplement in het basismedium gebruikt om organen geconditioneerde media genereren, omdat we vonden dat dit nodig was om de levensvatbaarheid van zowel de gekweekte organen (longen en hersenen) en de geïsoleerde BMSC en LNSC handhaven. Echter, we erkennen het voorbehoud dat de aanwezigheid van deze mitogeen supplement de organen kunnen hebben gestimuleerd om kunstmatig te produceren oplosbare factoren die ze misschien niet normaal te maken,
Samengevat, hebben vele studies aangegeven dat specifiek orgaan microenvironments diep beïnvloeden tumorcel biologie. Ondanks de beperkingen besproken, de ex vivo modelsysteem hier gepresenteerde represents een uitgebreide techniek voor het bestuderen van de invloed van de oplosbare micromilieu van vele vaste organen op cellulair gedrag. In het laboratorium van de auteurs is dit modelsysteem en blijft worden gebruikt als een middel van het bestuderen van vele cellulaire geassocieerd met metastase, waaronder invasie, migratie, proliferatie, stam-achtig gedrag en veranderingen genexpressie. De verkregen met deze studies gegevens kunnen op haar beurt de potentiële klinische toepassing van dit modelsysteem primaire borstkanker cellen geïsoleerd uit patiënten tumoren om hun reactie op verschillende micro-omgevingen die mogelijke metastasen bepalen. Samengenomen wordt gehoopt dat verder begrip van de wisselwerking tussen de micro en tumorcellen tijdens het proces van metastatische orgaan tropisme zal leiden tot verbetering van de behandeling van kanker in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
- Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278 (1928).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
- Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
- Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
- Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
- Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
- Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
- Zlotnik, A.
- Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
- Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
- Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805 (2014).
- Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
- Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
- Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
- Chiang, A. C., Massague, J.
- Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
- Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).
