Introduction
Bröstcancer är den vanligaste diagnostiserade cancerformen hos kvinnor och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall 1. Bröstcancer höga dödligheten är främst på grund av fel i konventionell behandling för att minska och eliminera metastatisk sjukdom; ungefär 90% av cancerrelaterade dödsfall beror på metastaser 2. Att förstå de underliggande molekylära mekanismerna för metastaserande kaskad är avgörande för utvecklingen av läkemedel effektiva i både tidigt och sent skede bröstcancer.
Tidigare forskning har bidragit till att belysa den flerstegs karaktär av bröstcancer metastaser och det antas att resultatet av både cancer progression och metastasering är till stor del beroende på samspelet mellan cancerceller och värdmiljön 3. Kliniska observationer tyder på att många cancerformer visar organ tropism, dvs. Tendensen att företrädesvis metastasera till specifika organs.In CASe av bröstcancer, sprider en patients sjukdom typiskt eller sprider sig till 5 viktigaste platserna, inklusive ben, lungor, lymfkörtlar, lever och hjärna 4-6. Många teorier har utvecklats för att förklara denna process, men bara ett fåtal har stått emot tidens tand. Ewings teori om metastas, som föreslås i 1920-talet, hypotesen thatthe distribution av metastaser var strikt på grund av mekaniska faktorer; varigenom tumörceller sker i hela kroppen av normala definierade fysiologiska blodflödesmönster och helt enkelt stoppa i första kapillär sängen de möter 7. I motsats, Stephen Pagets 1889 "utsäde och jord" hypotes föreslog att ytterligare molekylära interaktioner var ansvariga för överlevnad och tillväxt av metastaser, varigenom cancerceller ( "frön") endast kan etablera sig och proliferatein organmikromiljöer som producerar lämpliga molekylära faktorer ( "jord ") 8. Nästan ett sekel senare, Leonard Weiss enligttog en meta-analys av tidigare publicerade obduktions uppgifter och bekräftade Ewings förutsägelse som många metastaserande tumörer som upptäcks vid obduktion hittades i de förväntade proportioner som skulle förväntas om metastatisk organ tropism bestämdes genom blodflödesmönster ensam. Men i manyinstances det fanns färre eller fler metastaser bildas vid vissa platser då kan förväntas av Ewings föreslagna mekaniska faktorer 9. Dessa konton och teorier tyder på att specifika mikromiljöer organ spelar en avgörande roll i spridningsmönster och efterföljande tillväxt och överlevnad av många cancerformer, bland annat bröstcancer.
Tidigare forskning har främst fokuserat på tumörcells härledda faktorer och deras bidrag till organ tropism observerats vid bröstcancer metastaser 10-12, men lite forskning har undersökt faktorer som härrör från orgelmikro som kan ge en gynnsam nisch för inrättandetav bröstcancermetastaser. Detta är till stor del tillskrivas de tekniska utmaningarna att studera komponenterna i orgelmikro in vitro.
Den aktuella artikeln beskrivs en omfattande ex vivo modellsystem för att studera påverkan av lösliga komponenter i lymfkörtel, ben, lunga och hjärna på den metastatiska beteendet hos humana bröstcancerceller. Tidigare studier har validerat detta modellsystem genom att visa att olika bröstcancercellinjer visar cellinje specifik och organspecifika malignt beteende som svar på organkonditionerade media som motsvarar deras in vivo metastatisk potential 13. Detta modellsystem kan användas för att identifiera och utvärdera specifika organhärledda lösliga faktorer som kan spela en roll i den metastatiska beteendet hos bröst- och andra typer av cancerceller, inklusive påverkan på tillväxt, migration, stjälkliknande beteende och genuttryck, samt identifiering avpotentiella nya terapeutiska mål för cancer. Detta är den första ex vivo modellsystem som kan användas för att studera organspecifik metastatisk beteende i detalj och för att utvärdera rollen av organhärledda lösliga faktorer i att driva processen för cancermetastas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier genomfördes i enlighet med rekommendationerna från den kanadensiska rådet om Animal Care, enligt protokoll som godkänts av Western University Animal Använd underutskott.
1. Organ Isolering (lunga, hjärna, ben, lymfkörtel)
- Förbereda fyra sterila 50 ml koniska rör (en för varje organ som skall isoleras) innehållande approximativt 30 ml sterilt fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Pre-väga varje rör av PBS med användning av en elektronisk våg.
- Avliva 6-12 veckor gamla musen genom CO 2 inandning. Möss bör lämnas kvar i CO 2 kammaren under ca 1 - 2 min eller tills musen slutar röra sig och andning. Framgångsrik dödshjälp kan bekräftas ytterligare av bristande hjärtslag när kontrolleras manuellt med ett finger. Undvika cervikal dislokation eftersom denna metod kan brista blodkärl i nacken som leder till svårighet att ta bort axillära lymfkörtlar.
Obs: Tidigare arbete har specifikt användsfriska nakna honmöss, Hsd: atymiska Nude- Foxn1 nu 13. - I en steril vävnadsodling huva, placera musen på rygg på en polystyrenskum pad, sprida benen och använda stift för att hålla dem på plats.
- Med hjälp av steril pincett och sax, klippa bukhuden vid mittlinjen på könsorgan och skär upp mot munnen. Dra försiktigt tillbaka bukhuden från magmusklerna och stift på plats på polystyrenskum dynan.
- Leta upp armhålan, brachial, och inguinala lymfkörtlar.
Notera: Lymfkörtlar är vanligtvis omgiven av fettvävnad. De inguinala lymfkörtlar är lättast att hitta eftersom de finns ytligt vid korsningen av två blodkärl på dras tillbaka bukhuden. Armhålan och brachialis lymfkörtlar ligger djupare i vävnaden och kräver varsam manövrering av vävnad.- När du har hittat lymfkörtlar, använda sax för att försiktigt och noggrant skära lymfan ingendes bort från huden, fett och fartyg och ta bort dem från musen. För att bekräfta korrekt dissektion, rulla tången över den borttagna vävnaden. Om en hård klump föreligger när rullande pincetten över vävnaden, då en lymfkörtel har troligen tagits bort framgångsrikt.
- Placera borttagna lymfkörtlar i iskall PBS.
- Med användning av de pincett och sax, öppna bukhålan genom att skära igenom den exponerade bukväggen i en uppåtgående rörelse mot bröstet. Skär försiktigt genom bröstbenet, exponera brösthålan.
- Leta membranet under lungorna och skär membranet. Det bör dra mot revbenen på grund av spänning.
- Lyft lungorna underifrån och skär den underliggande vävnaden mot luftstrupen. Detta tillåter lungorna att avlägsnas fritt från brösthålan. Ta bort hjärtat och lungorna i klump och placera i iskall PBS. Hjärtat kan avlägsnas från lungorna här eller strax före vägning i steg två.
- Ta bortstift, hålla musen på plats på polystyrenskum dynan. Vänd på musen och skär huden på nedre delen av ryggen hela vägen över från flank till flank.
- Med användning av en steril bit gasväv för att hålla bålen av musen, och skala tillbaka huden på musen över ben och fötter av musen.
- Med användning av samma bit steril gasbinda, hålla underbenet på plats, försiktigt bryta fotleden av musen foten och skala huden över skarven proximalt mot knäleden.
- Med sax, ta bort skenbenet fri från knäleden och plats i iskall PBS.
- Upprepa steg 1,11) till 1,12) med motsatt lem.
- Använd pincett, hålla lårbenet på plats, skära bort omgivande muskelvävnad med hjälp av sax och ta bort lårbenet, placera den i iskall PBS.
- Upprepa steg 1,14) med motsatt lem.
- Med hjälp av en ny bit steril gasbinda, hålla huvudet av musen på plats. Med hjälp av pincett och sax, försiktigt bort huden för att exponera skull. Med sax, klippa noggrant nack skallen från överst i mitten på en rak och nedåt linje för att exponera den bakre hjärnan.
- Använd pincett, skopa under hjärnan mot den främre och ta bort hela hjärnan. Placera hjärnan i iskall PBS.
- Upprepa steg 1,1) till 1,17) för åtminstone fyra möss.
2. Organ Vägning
- Efter organ isolering, väga varje PBS rör innehållande lung- och hjärnvävnad med hjälp av en elektronisk våg.
- Beräkna viktskillnaden genom att subtrahera det förutisoleringsvikt (endast PBS) från vikten av PBS röret + organ (lungor och hjärna).
- Bestämma mängden av media som krävs för att återsuspendera vävnadsfragment från den beräknade viktskillnaden.
Obs: Lung och hjärnvävnad är vikt normaliseras genom resuspension i en 4: 1 media: vävnad förhållande (vol / vikt).
3. Generering av Lung- och hjärnkonditionerade media
- I en steril tfråga kultur huva, invertera PBS rör innehållande lunga eller hjärna tre gånger för att avlägsna kvarvarande blod från organ och aspirera PBS innehållande blod. Upprepa med färsk kall PBS tills lösningen ser klar utan några tecken på blod.
- Placera lungor och hjärna i separata 60 mm 2 glas petriskålar. Med hjälp av två sterila skalpellblad, finhackar lungor eller hjärna genom att upprepade gånger skära fram och tillbaka tills vävnadsfragment är ungefär ~ 1 mm 3 i storlek.
- Återsuspendera vävnadsfragment i lämplig volym (bestämd tidigare i steg 2,3) i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM): F12-medium supplementerat med 1x koncentrerades mitogen komplement och penicillin (50 ^ g / ml) / streptomycin (50 | j, g / ml).
- Lägga resuspenderas lung- eller hjärnvävnadsfragment till en brunn i en 6-brunnsplatta.
- Inkubera vävnadsfragment i media under 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO2. Efter inkubation samla konditionerat medium för varje vävnad och fTTERLIGARE späd genom att tillsätta tre likvärdiga volymer färskt medium i en 50 ml koniska rör.
- Centrifugera vid 1000 x g i utspädd konditionerat medium för varje organ vid 4 ° C under 15 min för att avlägsna stora vävnadsrester. Samla media supernatanten och filtrera genom ett 0,22 um sprutfilter.
- Pool konditionerat medium från varje organ (dvs., Lunga med lung- och hjärn med hjärnan) från flera möss för att redogöra för mus-till-mus variabilitet. Alikvot och lagra konditionerade media vid -80 ° C fram till användning.
4. Generering av benmärg konditionerade medier
- I en steril vävnadsodling huva, trimma överflödig vävnad från ben och avlägsna epifyser (gavlar) från benen med en sax.
- Med hjälp av en 27 ½ G-nål, spola märghålan av ben genom att trycka 1 ml PBS genom centrum av varje ben. Detta gör att du kan samla benmärg stromaceller (BMSC) till ett nytt rör innehållande PBS.
- Centrifugera vid 1,000 x g under 5 min vid 4 ° C och tvätta BMSC två gånger med PBS. Resuspendera benmärgsstromaceller i 20 ml ben stromal celltillväxtmedium (DMEM: F12-medium supplementerat med 1x koncentrerad mitogen komplettera, penicillin (50 ^ g / ml) / streptomycin (50 | j, g / ml) och 10% fetalt boven serum (FBS) ).
- Plattan 10 ml återsuspenderade benmärgsstromaceller i en T75-flaska.
Obs: Kombinera och plåtceller från varje 2 möss i varje T75 kolv; för fyra möss, två T75-kolvar behövs (cirka 1 x 10 7 celler / flaska). - Inkubera benmärgsstromaceller i ben stromala celltillväxtmedium under 24 h vid 37 ° C och 5% CO2. Efter inkubation, ta bort media från både T75-kolvar och sätta in nya T75 kolv, märka denna kolv som "Floater Flask". Lägg färsk ben stromaceller tillväxtmedier tidigare 2 kolvar och inkubera alla 3 flaskor vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter celler uppgå till cirka 70% konfluens (ca 5-7dagar) passageceller. För att göra detta, ta bort medium och tvätta cellerna två gånger med PBS (3 ml varje tvätt). Ta bort PBS och tillsätt 3 ml trypsin / EDTA-lösning, se till att trypsin täcker hela ytan av kolven. Efter celler lyft kolven (~ 2-3 min), stoppa trypsinisering reaktion genom att tillsätta 3 ml ben stromaceller celltillväxtmedium). Centrifugera 900 xg under 5 min vid 4 ° C, kassera media och återsuspendera cellerna i 10 ml färskt ben stromal celltillväxtmedium.
- Pool-celler från alla kolvar och passagen 1: 5 i tre nya T75-kolvar och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2. Efter celler åter nå 70%, Upprepa steg 4,6 och pool och passage all vidhäftande celler en andra gång. Re-platta alla celler till fyra T75-kolvar och inkubera 37 ° C och 5% CO2. Bone stromal celltillväxtmedier bör användas för alla steg.
- Låt cellerna att nå sammanflödet, tvätta cellerna tre gånger med PBS och tillsätt ben stromaceller samling media (DMEM: F12 media + 1x koncentrerad mitogen supplement + penicillin (50 ^ g / ml) / streptomycin (50 | j, g / ml); 10 ml / T75), att se till att detta medium är fritt från FBS. Samla in benmärgskonditionerade media 72 h senare, filtrera genom ett 0,22 ^ m filter, pool, alikvot, och förvara vid -80 ° C fram till användning.
- Om så önskas, bekräftar fenotypen av de isolerade benmärgs stromaceller (BMSC) med användning av antikroppar mot mus-Sca-1, CD105, CD29, och CD73, CD44, med användning av standard flödescytometri tekniker som beskrivits tidigare 13.
5. Framställning av Lymph Node konditionerade media
- I en steril vävnadsodling huva, invertera PBS rör innehållande lymfkörtlar tre gånger för att avlägsna kvarvarande blod från lymfkörtlar och aspirera blodig PBS. Upprepa med färsk kall PBS tills lösningen ser klar utan några tecken på blod.
- Placera lymfkörtlar i 60 mm 2 glas petriskålar. Med hjälp av två sterila skalpellblad, färs lymfkörtlar genom att upprepade gånger skära fram och tillbaka tills tissue fragment är ungefär 1 mm 3 i storlek.
- I ett koniskt rör, återsuspendera vävnadsfragment i 10 ml av Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) medium kompletterat med penicillin (50 ^ g / ml) / streptomycin (50 pg / ml), 5 x 10 -5 M steril β-merkaptoetanol ( 1,75 | j, l / 500 ml medium) och 10% FBS.
- Centrifugera vid 900 xg under 5 min vid 4 ° C och återsuspendera alla celler i 30 ml medium. Tillsätt 5 ml medium / brunn i en 6-brunnars platta och inkubera under 7 dagar vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter den 7 dagars inkubering, kassera media, tvätta vidhäftande celler med 5 ml varm PBS och tillsätt 5 ml färskt medium till varje brunn. Låt cellerna växa till sammanflytning (ca 5 - 7 dagar), trypsinize, pool alla celler, och passage som beskrivs i steg 4,6. Re-platta celler till 6-brunnar. Upprepa detta steg tre gånger.
- Efter tre passager, tillåta celler att växa till sammanflytning, tvätta brunnarna tre gånger med PBS och tillsätt 2 ml / brunn av DMEM: F12 + 1xkoncentrerad mitogen tillägg och penicillin (50 mikrogram / ml) / streptomycin (50 pg / ml), se till att detta medium är fritt från FBS. Samla lymfkörtelkonditionerade media efter 72 timmar, pool, prov, och förvara vid -80 ° C fram till användning.
- Om så önskas, bekräftar fenotypen av de isolerade lymfkörtel stromaceller (LNSC) med användning av antikroppar mot mus-CD45 och gp38, med användning av standard flödescytometri tekniker som beskrivits tidigare 13.
6. Användning av organkonditionerade media för nedströms analyser besläktade med metastatisk beteende av cancerceller
- När media organrade har genererats som beskrivs i steg 1 - 5, använda den för att utföra olika nedströms cell och molekylärbiologiska analyser för att bestämma inverkan av lösliga faktorer organ erhållas på metastaserad beteende av cancerceller. Exempel på standardanalyser (beskrivs på annan plats i litteraturen) innefattar proteinchip 13, cellulära tillväxtanalyser <sup> 13, cellulär migration analyser 13, tumorsphere bildningen 14, och RT-PCR 15. De ursprungliga basmedium som används för att generera den organkonditionerade media (dvs obetingad DMEM:. F12-medium supplementerat med 1x koncentrerades mitogen komplement och penicillin (50 ^ g / ml) / streptomycin (50 | ig / ml) skall användas som en negativ kontroll .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av Organkonditionerade medier
Ett översiktsschema / schematisk vy av processen för organ isolering och generering av konditionerade media presenteras i fig 1, med representativa fotografiska bilder av det förfarande som visas i figur 2. Det bör noteras att när detta protokoll var först under utveckling, var levern ingår i vår analys eftersom den är en vanlig plats för bröstcancer metastaser. Men på grund av den stora mängden av proteaser som produceras och utsöndras av levern, är det mycket svårt att hålla levern livskraftig tillräckligt länge för att generera god kvalitet konditionerade mediet. Lever-konditionerat medium är inte heller stabila när isolerade, och det tenderar att vara en hel del protein fällning, troligen av samma skäl. Därför lever inte ingick i någon vidare analys.
(Figur 3A) och BMSCs visar en mindre framträdande (figur 3C). Flödescytometrisk analys bekräftar att LNSCs är till stor del CD45 - och gp38 +, med ~ 60% av celler som har en CD45 - gp38 + fenotyp som indikerar LNSCs 16 (figur 3B). De BMSCs ska vara positiv för CD44 och CD29, svagt positiv för CD105 och Sca-1, och negativa för CD73 (figur 3D - H), som indikerar BMSCs 17,18.
Breast Cancer Cell Response till Organ anpassad migrationsmönster och genuttryck Ändringar
Med hjälp av denna ex vivo modellsystem, har det tidigare visats att humana bröstcancerceller med olika genetiska bakgrunder uppvisar differentiell migration och tillväxtmönster mot särskilda villkor organ. Noterbart är dessa mönster återspeglar de kända metastatiska spridning mönster av dessa cellinjer in vivo 13. I den aktuella studien, ben (231-BOM) - och lunga (231-LM2) -seeking varianter av MDA-MB-231 humana bröstcancer-cellvarianter (en vänlig gåva från Dr. Joan Massagué 11,12) har också varit används i en Transwell migration analys för att bekräfta organ lämplig migrationsmönster. Resultaten visar att benet sökande 231-BoM variant vandrar företrädesvis till benmärgen konditionerade media över hjärn och lung- konditionerat medium (Figur 4A, vänster). Liknande, Lungan sökande 231-LM2 variant vandrar företrädesvis till lungkonditionerade media över benmärgskonditionerade media och hjärna konditionerade media (Figur 4A, höger). Vidare visar RT-qPCR analys att exponering av föräldra MDA-MB-231-bröstcancerceller till ben- eller lunga konditionerade media orsakar en uppreglering av gener associerade med benspecifikt metastas (CXCR4, IL-11, TGFß1) eller lung- specifik metastas (VCAM1) av bröstcancerceller in vivo 11,12 (Figur 4B). Dessa resultat visar giltigheten av ex vivo-system med avseende på den förväntade organ tropism av bröstcancerceller in vivo, och indikerar att lösliga faktorer i organkonditionerade medier kan påverka metastatisk cellfenotyp förutom att främja migration.
Organ konditionerade media Innehåller Potentiella lösliga mediatorer av metastaser Behavior
En biotinmärkning baserad musantikropp array användes för att bedöma närvaron och identiteten av gemensamma lösliga faktorer vid organkonditionerade media från olika organ. Denna grupp innehåller antikroppar mot 308 av de vanligaste lösliga mus proteins.This proteinchip har tidigare använts för att identifiera lösliga faktorer av intresse i samband med metastaserande kaskad närvarande inom lung- och benmärgskonditionerat medium enligt Chu et al (2014) och Pio et al (2015) respektive 13,14. I den aktuella studien, är protein array resultat visas för basal media (figur 5A) jämfört med lymfa node- (figur 5B) och hjärna-konditionerade media (figur 5C). Markerad bredvid varje rad är lösliga faktorer som finns i media som har visat sig vara associerade med steg i metastaserande kaskad i litteraturen 19-29. Dessa lösliga factorer kan vara värt att undersöka som potentiella medlare av sekundära metastaser inom dessa platser orgel.
Figur 1. Översikt Skiss över processen för organ Isolering och Generation av konditionerade media. Vävnader (lungor, hjärna, lårben, skenben och lymfkörtlar) skördas från musen. Lungor, är hjärna och lymfknutor malet med en skalpell. Benmärg skördas från märghålan av benen genom att trycka PBS genom kaviteten med en 27½ G nål. Lung- och hjärnvävnadsfragment inkuberas under en period av 24 h före utspädning med tre ekvivalenta volymer av färska basmedier och samlas för att göra lung- och hjärnkonditionerade media. Benmärg och lymfkörtel stromaceller pass 2 - 3 gånger innan inkubation med basala media för att göra ben och lymfkörtelkonditionerade media. Skördade media kan vara pooled och lagrades vid -80 ° C tills produkten ska användas i efterföljande analyser såsom proteinchip, cellulära tillväxtanalyser, cellulära migrationsanalyser, tumorsphere bildning och RT-PCR. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa fotografiska bilder av förfarandet för organ Isolering och generering av konditionerat medium. Vid dag 0, är lungorna, hjärnan, lårben, skenben och lymfkörtlar som samlats in från musen. Lungorna, hjärna och lymfknutor placeras i en 60 mm 2 glaspetriskål och hackades med två skalpellblad till cirka 1 mm 3 i storlek. Benmärgen skördas från märghålan av ben genom att trycka PBS genom kaviteten med en 27 ½ G-nål i ett nytt rörPBS. De lung- och hjärnvävnadsfragment inkuberas under en period av 24 h vid 37 ° C och 5% CO2 före utspädning med tre likvärdiga volymer av färskt medium och uppsamlades för att göra lung- och hjärnkonditionerade media efter 24 tim. Benmärgen och lymfkörtel stromaceller inkuberas vid 37 ° C och 5% CO2 och passerades 2 - 3 gånger (~ 3 veckor totalt) innan du byter media med serumfritt basala medier för att göra ben och lymfkörtel konditionerade media. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Karakterisering av Isolerade lymfkörtel och benmärgsstromaceller. (A) Bright fält mikroskopi bild som visar morfologin av lymfkörtel stromaceller (LNSCs). (B) representant flödecytometri-analys av LNSCs med användning av en fykoerytrin (PE) -konjugerad gp38 antikropp och en fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugerad CD45-antikropp. (C) ljusfältsmikroskopi bild som visar morfologin hos benmärgs stromaceller (BMSCs). (DH) Representant flöde cytometri-analys av BMSCs använder PE konjugerat (svarta profiler) antikroppar mot (D) CD44, (E) CD106, (F) Sca-1, (G) CD29, (H) CD73-antikroppar i förhållande till isotypkontroll (vita profiler). Minst 10.000 levande händelser samlades per prov. Denna siffra har ändrats från 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. EllerGAN-lämplig migrationsmönster och genuttryck Förändringar som svar på organkonditionerade media. (A) Bone Sökande 231-BoM varianter (vänster stapel) eller lung söker 231-LM2 varianter (höger, randiga staplar) i MDA-MB-231 human bröstcancercellinje samt föräldra MDA-MB- 231-celler (båda panelerna, fyllda staplar) ströks ut på gelatinbelagda skär (med 8 um porer) före placering i basala media (DMEM: F12 + koncentrerad mitogen tillägg) eller organ CM. Plattorna inkuberades vid 37 ° C och 5% CO2 under 18 h. (B) hela befolkningen paren MDA-MB-231-celler exponerades för antingen ben-CM (vänster) eller lunga-CM (till höger) i 48 h. RNA isolerades och kvantifieras med hjälp av RT-qPCR. Genuttryck förändringar som svar på organ CM (svarta staplar) normaliserades till GAPDH och uttryckt i förhållande till baslinjen uttryck i basal media (grå staplar). Data presenteras som medelvärde ± SEM (N = 3; fold-change från respektive negativ kontroll av basal media). * = Signifikant skild från basala medier; δ = avsevärt skiljer sig från föräldra cellinje behandlad med samma medie villkor; P <0,05, ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Organ konditionerade media Innehåller Potentiella lösliga mediatorer av metastaserande beteende. En biotin etikett baserad musantikroppen array användes för att identifiera lösliga faktorer i lymfkörtel-CM och hjärna-CM. Membran inkuberades med biotinylerade prover av (A) basala media (DMEM: F12 + koncentrerad mitogen bilaga), (B) lymfkörtel-CM eller (C) brain-CM vid 4 o CO / N och visualiserades med användning chemiluminescence. Blå ovaler anger interna positiva kontroller, fodrade rutor indikerar interna negativa kontroller och fasta rutor indikerar lösliga faktorer av intresse som potentiellt är involverade i metastaserad beteende av bröstcancerceller till lymfkörtel eller hjärna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metastas är en komplex process genom vilken en serie av cellulära händelser är ytterst ansvarig för vävnadsinvasion och avlägsna tumören etablering 4,30,31. Ex vivo modellsystem som presenteras här kan användas för att studera två viktiga aspekter av metastasutvecklingen: cancercell målsökande eller migrering till ett visst organ ( "Tvillingarna") och tillväxt i detta organ ( "växer där"). Många studier har tidigare fokuserat på att identifiera viktiga molekylära egenskaper som förknippas med cellerna själva cancer som bidrar till metastaser processen. Till exempel har arbete Joan Massagué grupp identifierat olika gener signaturer i samband med lung-specifik, ben specifika, och hjärnspecifika mönster spridnings 10-12,32. Även om detta arbete ger viktiga insikter när det gäller bidrag av cancerceller till denna process, mycket mindre är känt om den roll som organspecifika faktorer bidrog av than sekundär mikro, som har varit relativt svårt att studera 13.
Detta ex vivo modellsystem har tidigare godkänts som en korrekt representation av den sekundära organmikro genom att visa att bröstcancer cellinje-specifik migration och tillväxt i organ CM speglar dessa cellinjer "in vivo mönster metastatisk spridning. En studie av Chu och kollegor använde fyra olika humana bröstcancercellinjer med varierande metastatisk potential in vivo, inklusive MDA-MB-231 och SUM-159 (starkt metastatisk, metastasera till lymfkörteln, lunga, lever, ben och hjärna in vivo ) och SUM-149 och MDA-MB-468 (måttligt metastaserande, metastasera till lymfkörteln och lunga in vivo) i. Både MDA-MB-231 och SUM-159 cellinjer som visas förbättrad migration mot ben marrow-, lymfa node- och lung-CM medan SUM-149 och MDA-MB-468-cellinjer företrädesvis migrerade mot lung-CM 13. Den aktuella studien visar att ben- och lung söker MDA-MB-231 varianter både föredrar att migrera till ben marrow- och lung-CM respektive och att exponering för organ CM kan främja uttrycket av ben- och lungassocierade metastaserande gener tidigare identifierats av Massagué och kollegor 11,12. Sammantaget visar dessa resultat att organ-CM erbjuder en ex vivo plattform representativ för organspecifika lösliga faktorer funna in vivo som påverkar fenotypen och beteende av bröstcancerceller.
Identifiering av lösliga faktorer som finns inom specifika organ och deras relativa nivåer av uttryck ger en utgångspunkt för att fastställa deras potentiella inverkan på cancercellbeteende. Dessutom kan med hjälp av tekniker såsom immunotömning möjligt för användaren att på ett effektivt sätt tömma ett protein av intresse från organ CM för att bestämma dess effekt på in vitro cellbeteende. Till exempelMånga lösliga faktorer som finns inom specifika mikromiljöer organfunktion som kemoattrahenter och har potential att inducera cellulär migration och proliferation. Tidigare arbete med hjälp av lung-CM har lett till identifiering av många lösliga faktorer som förekommer i lungan-CM som kan fungera som kemoattraktanter för bröstcancerceller, inklusive osteopontin (OPN) och L-selektin (SELL) 13. Genom immunodepleting dessa faktorer från lung CM, Chu och kollegor kunde visa minskad cellulär migrering och / eller tillväxt av starkt metastaserande MDA-MB-231 bröstcancerceller 13. Dessa resultat visar att konditionerade medier genereras från hela organ ger en värdefull resurs för att studera effekterna av specifika lösliga faktorer om cancercellbeteende, genom användning av traditionella in vitro-tekniker.
Även om detta är en ganska okomplicerad modellsystem, finns det vissa steg i det experimentella protokollet som är kritiska för successful generering av organkonditionerade media. För det första är viktigt för att kontrollera för åldersrelaterade effekter, antingen relaterade till utvecklingen (före 6 veckor) eller relaterade till åldrande i äldre möss användningen av möss mellan de definierade åldrarna 6-12 veckor för skörd av organ. För det andra är av yttersta vikt sterilitet hela protokollet och kan bäst garanteras genom användning av rigorösa aseptisk teknik och arbete i en steril vävnadsodling huva, med hjälp av steriliserade vävnadsodlingsmaterial och reagenser samt milda antibiotika i alla odlingsmedia och kosttillskott ( dvs., penicillin / streptomycin). En av utmaningarna med att använda in vivo eller ex vivo modellsystem är den inneboende djur till djur variabilitet. Om detta observeras felsökningssteg inbegriper utbyte av konditionerat medium som erhållits från flera partier av möss före användning i experimenten nedströms, samt att se till att lung- och hjärnkonditionerade medier är exakt viktnormaliseras i varje migdia samling experiment genom resuspension i en 4: 1 media: vävnadsFörhållande (volym / vikt). Dessutom bör de primära lymfkörteln och benmärgsstromaceller inte tillåtas överstiga 70% konfluens vid varje given passage eller odlas efter 5 totalt passager, annars kommer de obotligt differentiera.
Ändringar i protokollet som presenteras i denna artikel skulle kunna föreställa sig att tillåta tillämpning på olika forskningsområden. Även om denna modell har hittills använts uteslutande för bröstcancerforskningen, kan den potentiellt användas för att studera betydelsen av organ härrörande lösliga faktorer i andra typer av cancer samt ytterligare normala fysiologiska och sjukdomstillstånd. Dessutom, medan denna metod har använts här med nedsatt immunförsvar nakna musmodeller, denna teknik är teoretiskt inte begränsad till denna art av möss och även skulle kunna användas tillsammans med andra typer av djurmodeller.
Även om denna modell ger important insikt om bidrag av specifika organ härrörande lösliga faktorer cancer cellens beteende, är det inte utan sina begränsningar. Först denna modell fokuserar enbart på den lösliga komponenten av mikromiljöer organ som försummar vikten av den extracellulära matrisen (ECM). ECM är den icke-cellulära komponenten närvarande i alla vävnadstyper och funktioner för att ge både en fysisk klätterställning för celler, liksom förmågan att inducera viktiga biokemiska och biomekaniska signaler som krävs för olika cellulära processer, inklusive morfogenes, celldifferentiering och homeostas 33 -35. Viktigare, är den fysiska och biokemiska sammansättningen av ECM allmänt heterogen och kan variera stort mellan vävnader typer. Därför kan vävnadsspecifika sammansättningen av ECM också ha en inverkan på organ tropism under cancermetastaser som kan förbises med denna modell. ECM kan även verka för att koncentrera specifika lösliga faktorer på ett sätt som appropriately presenterar dem för vissa celler, och utan denna finjustering av ECM, kan induktion av cellulära signalerings minskas eller ändras 36. Trots att modellen som nämns i detta dokument saknar en lämplig ECM komponent, kan många studier stärkas med hjälp av en gratis strategi som utnyttjar både modellen nämns här tillsammans med en lämplig ECM komponent. Till exempel kan kommersiellt tillgängliga primära organ fibroblaster som syntetiserar endogen ECM eller rekombinanta ECM-komponenter användas utöver genererade organ CM för att bestämma den fulla omfattningen av hela organ mikro på cellulär beteende.
Det är möjligt att den lösliga mikromiljö genereras från organ-CM inte lämpligt kan efterlikna vad som är närvarande fysiologiskt under processen för metastas. Cancercellernas överlevnad, tillväxt och progression är i hög grad beroende på cancercell värd interaktioner 4,30,31. Generering av helt organ-CM kan resultera i att presence av lösliga faktorer som normalt inte uttrycks av celltyper som interagerar med cancerceller under metastasutvecklingen. Vidare har det tidigare visats att närvaron av en primär tumör kan modulera mikromiljön av avlägsna metastatiska platser, och därigenom "priming" dem för metastas 37. Eftersom det nuvarande protokollet använder organ som härrör från friska, icke tumörbärande möss, skulle det vara värt att jämföra de lösliga faktorer som härrör från organ från möss med en primär brösttumör.
På grund av den mekaniska separationen av hela organ under genereringen av olika organ CM kan intracellulära faktorer släppas ut i omgivande media som inte kan normalt påträffas fysiologiskt av cancerceller. Dessutom, ben- och lymfkörtel härrörande konditionerat medium kräver odling av stromala celler som isolerats från dessa organ före sin samling. De celltyper som är närvarande under ex vivo Culturing kan inte exakt representera bredden av cellulära typer stött fysiologiskt av cancerceller. Medan stromaceller utsöndrar huvudsakligen många faktorer i samband med olika organmikromiljöer, med hjälp av dessa metoder kan inte redogöra för inverkan av andra celltyper som finns i vävnader och organ 38. Slutligen ingår vi en mitogen tillägg i grundmedia används för att generera organkonditionerat medium, eftersom vi fann att detta krävdes för att upprätthålla lönsamheten för både odlade organ (lunga och hjärna) och den isolerade BMSC och LNSC. Men vi inser förbehållet att närvaron av denna mitogen tillägg kunde ha stimulerat organ för att på konstgjord väg producera lösliga faktorer som de normalt inte skulle göra,
Sammanfattningsvis har många studier tyder på att specifika mikromiljöer organ djupt kan påverka tumör cellbiologi. Trots de diskuterade begränsningarna, ex vivo modellsystem presenteras här represents en omfattande teknik för att studera påverkan av den lösliga mikromiljö av många fasta organ på cellulär beteende. I laboratoriet av författarna, har detta modellsystem varit och fortsätter att användas som ett medel för att studera många av de cellulära händelser som är förknippade med metastas, inklusive invasion, migration, proliferation, stjälkliknande beteende och genexpressionsförändringar. Data som erhållits från dessa studier kan i sin tur underrätta den potentiella kliniska tillämpningen av detta modellsystem för primär bröstcancer celler som isolerats från patientens tumörer i syfte att fastställa deras svar på olika mikromiljöer som representerar potentiella metastaser. Tagna tillsammans, är förhoppningen att ytterligare förståelse av växelverkan mellan mikromiljön och tumörceller under processen för metastatisk organ tropism kommer att leda till en förbättring av cancerbehandling i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
- Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278 (1928).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
- Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
- Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
- Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
- Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
- Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
- Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
- Zlotnik, A.
- Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
- Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
- Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805 (2014).
- Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
- Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
- Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
- Chiang, A. C., Massague, J.
- Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
- Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).
