Introduction
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes et la deuxième principale cause de décès liés au cancer 1. taux de mortalité élevé de cancer du sein est principalement due à l'échec de la thérapie conventionnelle pour atténuer et éliminer la maladie métastatique; environ 90% des décès liés au cancer sont dus à des métastases 2. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de la cascade métastatique est primordiale pour le développement de thérapies efficaces à la fois précoce et le cancer du sein à un stade avancé.
Des recherches antérieures ont permis d' élucider la nature multi - étapes des métastases du cancer du sein et il est émis l' hypothèse que le résultat à la fois la progression du cancer et des métastases dépend en grande partie des interactions entre les cellules cancéreuses et l'environnement hôte 3. Les observations cliniques indiquent que de nombreux cancers présentent un tropisme d'organe, ie., La tendance à métastaser préférentiellement à particulier organs.In le TASe de cancer du sein, la maladie d'un patient se propage habituellement ou des métastases à 5 sites principaux, y compris les os, les poumons, les ganglions lymphatiques, le foie et le cerveau 4-6. De nombreuses théories ont été développées pour expliquer ce processus, mais seulement quelques-uns ont résisté à l'épreuve du temps. La théorie de Ewing de métastases, proposée dans les années 1920, l'hypothèse quela distribution des métastases était strictement due à des facteurs mécaniques; dans lequel les cellules tumorales sont réalisées dans le corps par des schémas d'écoulement de sang physiologique normal défini et simplement arrêter dans le premier lit capillaire ils rencontrent 7. En revanche, 1889 "semences et le sol" hypothèse de Stephen Paget a suggéré que les interactions moléculaires supplémentaires étaient responsables de la survie et la croissance des métastases, de sorte que les cellules cancéreuses ( «graines») ne peuvent se mettre en place et microenvironnements d'organes proliferatein qui produisent des facteurs moléculaires appropriés ( «sol ») 8. Presque un siècle plus tard, Leonard Weiss sousa pris une méta-analyse des données d'autopsie publiés précédemment et confirmé la prédiction de Ewing que de nombreuses tumeurs métastatiques détectées au moment de l'autopsie ont été trouvés dans les proportions prévues qui seraient attendus si le tropisme d'organe métastatique a été déterminée par des modèles d'écoulement de sang seul. Cependant, dans manyinstances il y avait plus ou moins de métastases formées sur certains sites alors seraient attendus par des facteurs mécaniques proposées d'Ewing 9. Ces comptes et théories suggèrent que microenvironnements d'organes spécifiques jouent un rôle essentiel dans les modèles de diffusion et la croissance ultérieure et la survie de nombreux cancers, notamment le cancer du sein.
Les efforts de recherche antérieurs ont porté principalement sur les facteurs dérivés de cellules tumorales et leur contribution à l'tropisme organe observé dans les métastases du cancer du sein 10-12, facteurs mais peu de recherches ont exploré dérivées du microenvironnement organe qui peuvent fournir un créneau favorable pour la mise en placedes métastases du cancer du sein. Cela est en grande partie attribuable aux difficultés techniques de l' étude des composants du microenvironnement d'organes in vitro.
Le présent article décrit un système ex vivo du modèle global pour étudier l'influence des composants solubles du ganglion lymphatique, des os, du poumon et du cerveau sur le comportement métastatique des cellules cancéreuses du sein humain. Des études antérieures ont permis de valider ce système modèle en démontrant que les différentes lignées cellulaires de cancer du sein présentent un comportement malin spécifique organe spécifique lignée de cellules et en réponse aux moyens d'organes conditionné qui correspond à leur potentiel métastatique in vivo 13. Ce système de modèle peut être utilisé pour identifier et évaluer les facteurs solubles spécifiques organes dérivés qui peuvent jouer un rôle dans le comportement métastatique du sein et d'autres types de cellules cancéreuses, y compris les influences sur la croissance, la migration, la tige-comme le comportement, et l'expression des gènes, ainsi que l'identification dede nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le cancer. Ceci est le premier ex vivo système modèle qui peut être utilisé pour étudier le comportement métastatique spécifique d'organe en détail et d'évaluer le rôle des facteurs solubles organes dérivés dans la conduite du processus de métastase du cancer.
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Protocol
Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément aux recommandations du Conseil canadien de protection des animaux, en vertu de protocoles approuvés par le Sous-comité des animaux Utiliser l'Université Western.
1. Isolement d'organes (poumon, cerveau, os, ganglions lymphatiques)
- Préparer quatre tubes de 50 ml stériles coniques (un pour chaque organe à isoler) contenant environ 30 ml de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Pré-peser chaque tube de PBS en utilisant une balance électronique.
- Euthanasier 6-12 semaine vieille souris par inhalation de CO 2. Les souris doivent être laissés dans la chambre de CO 2 pendant environ 1 - 2 min ou jusqu'à ce que la souris cesse de bouger et de respirer. l'euthanasie réussie peut être confirmée par un manque de rythme cardiaque lors d'un contrôle manuellement à l'aide d'un doigt. Évitez la dislocation cervicale que cette méthode peut se rompre les vaisseaux sanguins du cou conduisant à des difficultés à retirer les ganglions lymphatiques axillaires.
Remarque: Des travaux antérieurs ont spécifiquement utilisésouris nues femelles en bonne santé, Hsd: athymiques Nude- Foxn1 nu 13. - Dans une hotte de culture de tissus stériles, placer la souris sur le dos sur un matelas en mousse de polystyrène, répartir les membres et utiliser des broches pour les maintenir en place.
- En utilisant des pinces et des ciseaux stériles, couper la peau abdominale à la ligne médiane au niveau des organes génitaux et couper vers le haut vers la bouche. Tirez doucement la peau abdominale des muscles abdominaux et la broche en place sur le coussin de mousse de polystyrène.
- Localisez le axillaire, brachial, et les ganglions lymphatiques inguinaux.
Note: Les ganglions lymphatiques sont habituellement entourées par le tissu adipeux. Les ganglions inguinaux sont les plus faciles à trouver car ils se trouvent en surface à la jonction de deux vaisseaux sanguins sur la peau abdominale tiré vers l'arrière. ganglions axillaires et lymphatiques brachial sont situés plus profondément dans le tissu et nécessitent des manœuvres en douceur des tissus.- Après avoir localisé les ganglions lymphatiques, utilisez les ciseaux pour couper doucement et soigneusement la lymphe pasdes de la peau, la graisse et les vaisseaux et les retirer de la souris. Pour confirmer la dissection correcte, rouler la pince sur le tissu enlevé. Si une boule dure existe en roulant la pince sur le tissu, puis un ganglion lymphatique a probablement été enlevé avec succès.
- Placez les ganglions lymphatiques prélevés dans le froid de la glace PBS.
- À l'aide des pinces et ciseaux, ouvrir la cavité abdominale en coupant à travers la paroi abdominale exposée dans un mouvement ascendant vers la poitrine. Découpez soigneusement à travers le sternum, l'exposition de la cavité thoracique.
- Localisez le diaphragme sous les poumons et couper le diaphragme. Il faut tirer vers les côtes en raison de la tension.
- Soulevez les poumons par le dessous et couper le tissu sous-jacent vers la trachée. Cela permet aux poumons d'être enlevés librement de la cavité thoracique. Retirez le cœur et les poumons en bloc et dans le froid de la glace PBS. Le cœur peut être retiré des poumons ici ou juste avant le pesage dans l'étape 2.
- Retirer leépingles, en gardant la souris en place sur le coussin de mousse de polystyrène. Retournez la souris et couper la peau du tout le chemin du bas du dos en face de flanc à flanc.
- En utilisant un morceau de gaze stérile pour maintenir le torse de la souris, peler la peau du dos de la souris sur les jambes et les pieds de la souris.
- En utilisant le même morceau de gaze stérile, tenir la jambe en place, soigneusement briser l'articulation de la cheville du pied de la souris et peler la peau sur l'articulation proximale vers l'articulation du genou.
- Avec des ciseaux, enlever le tibia libre de l'articulation du genou et dans le froid de la glace PBS.
- Répétez les étapes 1.11) à 1,12) avec membre opposé.
- En utilisant des pinces, maintenez le fémur en place, couper entourant le tissu musculaire à l'aide des ciseaux et enlever le fémur, le plaçant dans du PBS glacé.
- Répétez l'étape 1.14) avec membre opposé.
- L'utilisation d'un nouveau morceau de gaze stérile, maintenir la tête de la souris en place. En utilisant des pinces et ciseaux, retirez délicatement la peau pour exposer les skull. Avec des ciseaux, découpez soigneusement le crâne occipitale du centre haut en ligne droite et vers le bas pour exposer le cerveau postérieur.
- En utilisant des pinces, scoop sous le cerveau vers l'antérieur et retirer l'ensemble du cerveau. Placez le cerveau dans le froid de la glace PBS.
- Répéter les étapes 1.1) à 1,17) pendant au moins quatre souris.
2. Organe de pesée
- Après l'isolement d'organes, peser chaque tube PBS contenant du poumon et les tissus du cerveau en utilisant une balance électronique.
- Calculer la différence de poids en soustrayant le poids de pré-isolement (PBS uniquement) à partir du poids du tube PBS + organes (poumon et cerveau).
- Déterminer la quantité de support nécessaire pour remettre en suspension des fragments de tissus provenant de la différence de poids calculée.
Note: Lung et les tissus du cerveau sont le poids normalisé par resuspension dans un 4: 1 des médias: rapport de tissu (vol / poids).
3. Génération de médias Lung- et conditionné Un cerveau
- Dans un t stérilequestion culture capot, inverser les tubes PBS contenant du poumon ou du cerveau trois fois pour éliminer le sang résiduel à partir d'organes et Aspirer PBS contenant du sang. Répéter avec le froid PBS frais jusqu'à ce que la solution semble claire avec aucune preuve de sang.
- Placez les poumons et le cerveau de 60 mm 2 boîtes de Pétri en verre séparés. L' utilisation de deux lames de scalpel stériles, les poumons émincer ou cerveaux par tranchage à plusieurs reprises avant et en arrière jusqu'à ce que des fragments de tissus sont d' environ ~ 1 mm 3 dans la taille.
- des fragments de tissus Remettre en suspension dans un volume approprié (déterminé précédemment à l'étape 2.3) de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM): milieu F12 supplémenté avec 1x concentré complément mitogene et de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml).
- Ajouter des fragments de poumon ou de tissus du cerveau remis en suspension pour un puits d'une plaque à 6 puits.
- Incuber les fragments de tissus dans un milieu pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Après incubation, collecter des milieux conditionnés pour chaque tissu et futres dilué en ajoutant trois volumes équivalents de milieu frais dans un tube conique de 50 ml.
- Centrifuger à 1000 xg dans un milieu conditionné dilué pour chaque organe à 4 ° C pendant 15 min pour éliminer les gros débris de tissu. Recueillir surnageant des médias et filtrer à travers un filtre à seringue de 0,22 um.
- Piscine climatisée médias de chaque organe (ie., Du poumon avec des poumons et du cerveau avec le cerveau) de souris multiples pour tenir compte de la variabilité souris à la souris. Aliquoter et stocker milieux conditionnés à -80 ° C jusqu'à utilisation.
4. Génération des médias Bone Marrow conditionné
- Dans une culture de tissu hotte stérile, couper l'excès de tissu de l'os et retirer épiphyses (pièces d'extrémité) des os avec des ciseaux.
- L'utilisation d'un 27 ½ aiguille G, cavité médullaire au ras des os en poussant 1 ml de PBS à travers le centre de chaque os. Cela vous permettra de recueillir des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) dans un nouveau tube contenant du PBS.
- Centrifugeuse à 1,000 xg pendant 5 min à 4 ° C et laver BMSC deux fois avec PBS. Remettre en suspension les cellules stromales de la moelle osseuse dans 20 ml de milieu de croissance des cellules du stroma osseux (DMEM: F12 complémenté avec 1 x concentré mitogene supplément, de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml) et 10% de sérum de boven fœtal (FBS) ).
- Plaque de 10 ml de cellules stromales de moelle osseuse en suspension dans un flacon T75.
Remarque: Combiner et cellules de la plaque de tous les 2 souris dans chaque flacon T75; pour quatre souris, deux flacons T75 sont nécessaires (environ 1 x 10 7 cellules / flacon). - Incuber les cellules osseuses stromales de la moelle osseuse dans le stroma des milieux de croissance cellulaire pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Après incubation, retirer les supports des deux flacons T75 et de mettre dans le nouveau flacon T75, étiqueter ce flacon comme "Floater Flask". Ajouter un milieu de croissance de cellules fraîches de stroma os précédentes 2 flacons et incuber les 3 flacons à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Après que les cellules atteignent environ 70% de confluence (environ 5-7jours) de cellules de passage. Pour ce faire, éliminer le milieu et laver les cellules deux fois avec du PBS (3 ml à chaque lavage). Retirer PBS et ajouter 3 ml d'une solution de trypsine / EDTA, en veillant à ce que la trypsine couvre toute la surface du flacon. Après que les cellules se soulèvent le ballon (~ 2 - 3 min), arrêtez trypsinisation réaction en ajoutant 3 ml d'os stromal milieux de croissance cellulaire). Centrifugeuse 900 g pendant 5 min à 4 ° C, jeter les médias, et remettre les cellules dans 10 ml de milieu de croissance de cellules fraîches stromale osseuse.
- Les cellules de la piscine de tous les flacons et passage 1: 5 en trois nouveaux flacons T75 et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. Après que les cellules une fois atteint à nouveau 70%, répétez l'étape 4.6 et de la piscine et de passage toutes les cellules adhérentes une seconde fois. Re-plaque toutes les cellules à quatre flacons T75 et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. les milieux de croissance des cellules du stroma osseux doit être utilisé pour toutes les étapes.
- media F12 + 1x mitogène concentré su: Laisser les cellules atteignent la confluence, laver les cellules trois fois avec du PBS et ajouter os stromal collection media cellulaire (DMEMpplement + pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml); 10 ml / T75), en veillant à ce que ce média est libre de FBS. Collecter les médias de la moelle osseuse conditionné 72 heures plus tard, filtrer à travers un filtre de 0,22 um, piscine, aliquote, et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Si l'on désire confirmer le phénotype des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) isolées en utilisant des anticorps contre la souris Sca-1, CD105, CD29, et CD73, CD44, en utilisant des techniques de cytométrie débit standard comme décrit précédemment 13.
5. Génération des médias ganglionnaire conditionné
- Dans une hotte de culture de tissus stériles, inverser le tube PBS contenant des ganglions lymphatiques trois fois pour éliminer le sang résiduel des ganglions lymphatiques et aspirée sanglante PBS. Répéter avec le froid PBS frais jusqu'à ce que la solution semble claire avec aucune preuve de sang.
- Placez les ganglions lymphatiques dans des boîtes de Pétri en verre de 60 mm 2. L'utilisation de deux lames de scalpel stériles, les ganglions lymphatiques hachis par tranchage à plusieurs reprises avant et en arrière jusqu'à ce tissufragments e sont d' environ 1 mm 3 dans la taille.
- Dans un tube conique, les fragments de tissu de remise en suspension dans 10 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) milieu supplémenté avec de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml), 5 x 10 -5 M β-mercaptoéthanol stérile ( 1,75 ul / 500 ml de milieu) et 10% de FBS.
- Centrifuger à 900 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension toutes les cellules dans 30 ml de milieu. Ajouter 5 ml de milieu / puits dans une plaque à 6 puits et incuber pendant 7 jours à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Après l'incubation de 7 jours, jeter les médias, laver les cellules adhérentes avec 5 ml PBS chaud et ajoutez 5 ml de milieu frais dans chaque puits. Permettre aux cellules de croître jusqu'à la confluence (environ 5 - 7 jours), trypsiniser, piscine toutes les cellules, et le passage comme décrit à l'étape 4.6. cellules Re-plaque à plaque de 6 puits. Répétez cette étape trois fois.
- Après trois passages, permettent aux cellules de croître jusqu'à la confluence, laver les puits trois fois avec du PBS et ajouter 2 ml / puits de DMEM: F12 + 1xSupplément concentré mitogene et de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml), en veillant à ce que ce support est dépourvu de FBS. Collecter les médias de nœuds lymphatiques conditionné après 72 heures, piscine, aliquote, et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Si l'on désire confirmer le phénotype des cellules des ganglions lymphatiques de stroma isolées (LNSC) en utilisant des anticorps dirigés contre le CD45 et gp38 de souris, en utilisant des techniques de cytométrie en flux standards comme décrit précédemment 13.
6. Utilisation d'Organ conditionné médias pour dosages en aval liés à Métastases Comportement des cellules cancéreuses
- Une fois que les médias d'organes conditionné a été généré comme décrit dans les étapes 1 - 5, de l'utiliser pour effectuer différentes cellules en aval et des analyses de biologie moléculaire afin de déterminer l'influence des facteurs d'organes dérivés solubles sur le comportement métastatique des cellules cancéreuses. Des exemples d'analyses classiques (décrits par ailleurs dans la littérature) comprennent des réseaux de protéines 13, les dosages de croissance cellulaire <sup> 13, la migration cellulaire Dosages 13, tumorsphere formation 14 et RT-PCR 15. Les milieux de base originaux utilisés pour générer les médias d'organe-conditionné (ie, DMEM inconditionnée:. F12 supplémenté avec 1x concentré supplément de mitogène et de la pénicilline (50 pg / ml) / streptomycine (50 pg / ml) doit être utilisé comme témoin négatif .
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Representative Results
Génération des médias Organ-conditionné
Une vue d' ensemble diagramme / schématique du procédé d'isolement d'organes et de génération de milieu conditionné est présenté à la figure 1, avec des images photographiques représentatives de la procédure représentée sur la figure 2. Il convient de noter que , lorsque ce protocole a d' abord été en cours d' élaboration, le foie a été incluse dans notre analyse, car il est un site commun de métastases du cancer du sein. Toutefois, en raison de la grande quantité de protéases produite et sécrétée par le foie, il est très difficile de maintenir le foie viable suffisamment longtemps pour produire un milieu conditionné de bonne qualité. médias du foie conditionné est pas non plus stable une fois isolé et il a tendance à être beaucoup de protéines précipité, probablement pour la même raison. Par conséquent, le foie n'a pas été inclus dans une analyse plus poussée.
(figure 3A) et BMSC montrant une apparence plus petite (figure 3C). Analyse par cytométrie en flux confirme que LNSCs sont en grande partie CD45 - et gp38 +, avec environ 60% des cellules possédant un CD45 - gp38 + indicatif du phénotype LNSCs 16 (figure 3B). Les BMSCs devraient être positifs pour CD44 et CD29, faiblement positifs pour CD105 et Sca-1, et négatif pour CD73 (Figure 3D - H), indicatif de BMSCs 17,18.
Cellule de cancer du sein Response Organ approprié Tendances migratoires et les changements d'expression génétique
En utilisant cette ex vivo système modèle, il a déjà été démontré que les cellules de cancer du sein humain avec divers milieux génétiques migration différentielle d'exposition et des modèles de croissance vers des conditions spécifiques d'organes. En particulier, ces schémas correspondent aux modes de dissémination métastatique connues de ces lignées cellulaires in vivo 13. Dans l'étude actuelle, l' os (231-BoM) - et du poumon (231-LM2) -favoriser variantes des variantes de cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231 (une sorte don du Dr. Joan Massagué 11,12) ont également été utilisé dans un essai de migration transwell pour confirmer les schémas de migration organes appropriés. Les résultats démontrent que le 231-BoM variante ostéotrope migre préférentiellement aux médias de la moelle osseuse conditionné sur des cerveaux et lung- milieu conditionné (figure 4A, à gauche). De même, Le 231-LM2 variante du poumon en quête migre préférentiellement aux médias du poumon conditionné sur les médias de la moelle osseuse conditionné et les médias du cerveau conditionné (figure 4A, à droite). En outre, l'analyse par RT-qPCR démontre que l'exposition-231 MDA-MB cellules de cancer du sein parental pour désossée ou le support du poumon conditionné provoque une régulation positive des gènes associés à des métastases osseuses spécifiques (CXCR4, l'IL-11, TGFß1) ou lung- métastase spécifique (VCAM1) de cellules de cancer du sein in vivo 11,12 (figure 4B). Ces résultats démontrent la validité du système ex vivo en ce qui concerne le tropisme d'organe prévu des cellules cancéreuses du sein in vivo, et indique que les facteurs solubles présents dans les milieux d'organes conditionné peuvent influencer le phénotype cellulaire métastatique , en plus de la promotion de la migration.
Médias Organ conditionné Contient potentiels solubles Médiateurs de métastatiques Comportement
Un ensemble d'anticorps de souris à base d'étiquette de biotine a été utilisé pour évaluer la présence et l'identité des facteurs solubles dans les milieux communs d'organes conditionné à partir de différents organes. Ce tableau comprend des anticorps contre 308 proteins.This de souris solubles réseaux de protéines la plus courante a déjà été utilisé pour identifier les facteurs solubles d'intérêt associés à la cascade métastatique présent dans les médias de la moelle conditionné pulmonaires et osseuses comme indiqué dans Chu et al (2014) et Pio et al (2015) , respectivement 13,14. Dans l'étude actuelle, les résultats du tableau de protéines sont présentés pour les médias basale (figure 5A) par rapport à la lymphe node- (figure 5B) et les médias du cerveau conditionné (Figure 5C). Mis en évidence à côté de chaque tableau sont des facteurs solubles présents dans les médias qui ont été trouvés pour être associés aux étapes de la cascade métastatique dans la littérature 19-29. Ces fac solublesteurs peuvent être intéressant à étudier en tant que médiateurs potentiels de métastases secondaires au sein de ces sites d'organes.
Figure 1. Vue d' ensemble schématique du processus d'isolement d' organes et de génération de milieu conditionné. (Nœuds poumons, cerveau, fémur, tibia et lymphatiques) Tissues sont récoltées à partir de la souris. Les poumons, les ganglions lymphatiques et le cerveau sont émincés avec un scalpel. La moelle osseuse est récoltée à partir de la cavité médullaire des os en poussant PBS à travers la cavité avec une aiguille 27½ G. fragments de poumon et de tissus du cerveau sont incubées pendant une période de 24 heures avant de le diluer avec trois volumes équivalents de milieux de base et frais prélevés pour rendre les médias lung- et le cerveau conditionné. Os cellules stromales noeud lymphatiques moelle et sont repiquées 2 - 3 fois avant incubation avec les milieux de base pour rendre les médias de nœud conditionné os et les ganglions lymphatiques. les médias peuvent être récoltées pooled et conservés à -80 ° C jusqu'à utilisation dans des essais en aval tels que les puces à protéines, des dosages de croissance cellulaire, les tests de migration cellulaires, tumorsphere formation et RT-PCR. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Représentant des images photographiques de la procédure d'isolement d'organes et de génération de milieu conditionné. Au jour 0, les poumons, le cerveau, le fémur, le tibia et les ganglions lymphatiques sont collectées à partir de la souris. Les noeuds poumons, le cerveau et les ganglions lymphatiques sont placés dans une boîte de 60 mm 2 de pétri en verre et émincés avec deux lames de scalpel à environ 1 mm3 en taille. La moelle osseuse est récoltée à partir de la cavité médullaire des os en poussant PBS à travers la cavité avec une aiguille 27 G ½ dans un nouveau tubede PBS. Les fragments de tissus du poumon et du cerveau sont mises en incubation pendant une période de 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2 avant de le diluer avec trois volumes équivalents de milieu frais et recueillis pour faire lung- support et le cerveau conditionné après 24 heures. Les cellules de la moelle osseuse et des ganglions lymphatiques stromales sont incubées à 37 ° C et 5% de CO 2 et repiquées 2 - 3 fois (~ 3 semaines au total) avant de remplacer les médias avec les médias basales sans sérum pour faire l' os et de la lymphe médias noeud-conditionné. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Caractérisation des cellules isolées des ganglions lymphatiques et la moelle osseuse stromales. (A) de l' image de microscopie à champ clair montrant la morphologie des cellules ganglionnaires stromales (LNSCs). (B) Flux ReprésentantL' analyse par cytométrie de LNSCs en utilisant une phycoérythrine (PE) conjuguée à l' anticorps gp38 et un isothiocyanate de fluorescéine (FITC) CD45. image de microscopie en champ clair montrant la morphologie des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) (C). (DH) , le flux représentatif l' analyse par cytométrie de BMSC en utilisant PE conjugués (profils noirs) des anticorps dirigés contre (D) , CD44 (E) , CD106, (F) Sca-1, (G) , CD29 (H) des anticorps de CD73 par rapport au témoin isotypique (profils blancs). Un minimum de 10.000 événements viables ont été recueillies par échantillon. Ce chiffre a été modifié depuis 13. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Organ appropriés Tendances migratoires et les changements d'expression génétique en réponse à Organ conditionné Media. (A) ostéotrope 231-BoM variantes ( à gauche, barres rayées) ou des variantes de poumon en quête de 231 LM2 (droite, bars rayés) de la-231 MDA-MB sein humain lignée cellulaire de cancer, ainsi que des parents MDA-MB- 231 ( les deux panneaux, des barres solides) ont été étalées sur des inserts revêtus de gélatine (avec des pores de 8 um) avant le placement dans un milieu de base (DMEM: F12 + supplément de mitogene concentré) ou d' organes-CM. Les plaques ont été incubées à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 18 heures. (B) Ensemble de la population parentale cellules MDA-MB-231 ont été exposés à l' os-CM ( à gauche) ou le poumon-CM ( à droite) pour 48h. ARN a été isolé et quantifié par RT-qPCR. Changements d'expression génique en réponse à l' organe-CM (barres noires) ont été normalisées à GAPDH et exprimées par rapport à l' expression de référence dans les médias basale (barres grises). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (N = 3; rabattable changement de contrôle négatif respectif de milieux de base). * = Significativement différent de milieux de base; δ = significativement différent de la lignée de cellules parentales traitées avec les mêmes conditions de presse; P <0,05, ANOVA. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Contient Figure 5. Organ conditionné médias potentiels solubles Médiateurs de métastatiques Comportement. Un réseau d'anticorps de souris à base de marqueur biotine a été utilisé pour identifier les facteurs solubles présents dans ganglionnaire-CM et le cerveau-CM. Les membranes ont été incubées avec des échantillons biotinylés de (A) milieux de base (DMEM: F12 + supplément de mitogène concentré), (B) ganglionnaire-CM ou (C) brain-CM à 4 o CO / N et visualisées en utilisant chemiluminescence. Ovales bleus indiquent des contrôles positifs internes, boîtes alignées indiquent les contrôles négatifs internes et des boîtes pleines indiquent des facteurs solubles d'intérêt qui sont potentiellement impliqués dans le comportement métastatique des cellules de cancer du sein à ganglions lymphatiques ou le cerveau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Métastase est un processus complexe par lequel une série d'événements cellulaires sont ultimement responsables de l' invasion des tissus et de la tumeur lointaine création 4,30,31. L'ex vivo système de modèle présenté ici peut être utilisé pour étudier deux aspects importants de la progression métastatique: le cancer homing des cellules ou de migration à un organe spécifique ( "y arriver") et la croissance de cet organe ( «il y en croissance»). De nombreuses études ont déjà mis l'accent sur l'identification des caractéristiques moléculaires clés associés aux cellules cancéreuses elles-mêmes qui contribuent au processus de métastases. Par exemple, le travail effectué par le groupe de Joan Massagué a identifié les signatures de gènes distincts associés à spécifiques du poumon, spécifique à l' os, et les modes de propagation 10-12,32 spécifique du cerveau. Bien que ce travail fournit des informations importantes en ce qui concerne la contribution des cellules cancéreuses à ce processus, on sait beaucoup moins sur le rôle des facteurs spécifiques d'organes contribué par til microenvironnement secondaire, qui est resté relativement difficile à étudier 13.
Ce système modèle ex vivo a été préalablement validé comme une représentation précise du microenvironnement organe secondaire en démontrant que la migration spécifique de la lignée cellulaire de cancer du sein et de la croissance d' organes CM reflète ces lignées cellulaires »dans le profil in vivo de la dissémination métastatique. Une étude réalisée par Chu et ses collègues a utilisé quatre lignées de cellules de cancer du sein humain différentes en faisant varier le potentiel métastatique in vivo, y compris des cellules MDA-MB-231 et SUM-159 (hautement métastatique métastaser dans les ganglions lymphatiques, les poumons, le foie, les os et le cerveau in vivo ) et de la migration SUM-149 et MDA-MB-468 (modérément métastatique métastaser dans les ganglions lymphatiques et des poumons in vivo) dans. les deux SUM-159 lignées cellulaires MDA-MB-231 et affiché amélioré vers marrow- osseuse, la lymphe node- et du poumon CM tandis que les lignées cellulaires SUM-149 et MDA-MB-468 ont migré vers les poumons préférentiellement-CM 13. L'étude actuelle démontre que désossée et du poumon en quête MDA-MB-231 variants de deux préfèrent migrer vers marrow- osseuse et les poumons-CM, respectivement, et que l'exposition à l'organe-CM peut favoriser l'expression des gènes et désossée métastatiques pulmonaires associées préalablement identifiés par Massagué et ses collègues 11,12. Pris ensemble, ces résultats démontrent que l' organe-CM fournit une plate - forme ex vivo représentatifs des facteurs solubles spécifiques d'organes trouvés in vivo qui influent sur le phénotype et le comportement des cellules du cancer du sein.
Identification des facteurs solubles présents dans les organes spécifiques et leurs niveaux relatifs d'expression constitue un point de départ pour déterminer leur influence potentielle sur le comportement des cellules cancéreuses. De plus, en utilisant des techniques telles que immunodéplétion peuvent permettre à l'utilisateur d'épuiser efficacement une protéine d'intérêt à partir d' organes CM pour déterminer son effet sur le comportement cellulaire in vitro. Par exemple, De nombreux facteurs solubles présents dans des micro-environnements spécifiques d'organes fonctionner comme agents chimio-attractifs et ont le potentiel d'induire la migration et la prolifération cellulaire. Travaux antérieurs réalisés à l' aide du poumon CM a conduit à l'identification de plusieurs facteurs solubles présents dans le poumon CM qui peuvent agir comme agents chimio - attractifs pour les cellules du cancer du sein, y compris l' ostéopontine (OPN) et la L-sélectine (VEND) 13. Immunodepleting par ces facteurs de poumon CM Chu et ses collègues ont pu démontrer la migration et / ou la croissance des métastases hautement MDA-MB-231 cellules de cancer du sein 13 cellulaire réduite. Ces résultats montrent que des milieux conditionnés générés à partir des organes entiers fournit un outil précieux pour étudier les effets des facteurs solubles spécifiques sur le comportement des cellules cancéreuses, par l'utilisation de techniques traditionnelles in vitro.
Bien que ce soit un système modèle assez simple, il y a quelques étapes du protocole expérimental qui sont critiques pour successful génération de médias d'organes conditionné. Tout d'abord, l'utilisation de souris âgées de 6-12 semaines définis pour la récolte des organes est important, afin de contrôler les effets liés à l'âge, soit liées au développement (avant 6 semaines) ou liées au vieillissement chez les souris âgées. Deuxièmement, la stérilité est d'une importance capitale dans tout le protocole et peut être mieux assurée par l'utilisation d'une technique aseptique rigoureuse et travailler dans une hotte de culture de tissus stériles, en utilisant stérilisés tissus consommables et réactifs de la culture ainsi que des antibiotiques doux dans tous les milieux de culture et les suppléments ( ie., de la pénicilline / streptomycine). L' un des défis à l' utilisation in vivo ou ex vivo des systèmes modèles est la variabilité inhérente de l' animal à animal. Si cela observe des étapes de dépannage comprend la mise en commun des milieux conditionnés obtenus à partir de plusieurs lots de souris avant de les utiliser dans les expériences en aval, ainsi que de faire en sorte que les médias lung- et le cerveau sont conditionnés de façon précise le poids normalisé dans chaque moidia collection expérience par resuspension dans un 4: 1 des médias: rapport de tissus (volume / poids). En outre, les cellules stromales de ganglions lymphatiques primaires et de moelle osseuse ne devraient pas être autorisés à dépasser 70% de confluence à un passage donné ou être augmenté au-delà de 5 passages totaux, sinon ils vont se différencier en phase terminale.
Les modifications apportées au protocole présenté dans cet article pourraient être envisagées pour permettre l'application de différents domaines de recherche. Bien que ce modèle a été jusqu'ici utilisé exclusivement pour la recherche sur le cancer du sein, il peut potentiellement être utilisé pour étudier le rôle des facteurs solubles organes dérivés dans d'autres types de cancer, ainsi que les états physiologiques et pathologiques normaux supplémentaires. En outre, bien que cette méthode a été utilisée ici avec des modèles de souris nude immunodéprimés, cette technique est théoriquement ne se limite pas à cette espèce de souris, et même pourrait être utilisée avec d'autres types de modèles animaux.
Bien que ce modèle fournit des important aperçu de la contribution des facteurs solubles spécifiques organes dérivés sur le comportement des cellules cancéreuses, il est pas sans ses limites. Tout d'abord ce modèle se concentre uniquement sur le composant soluble de microenvironnements d'organes, qui néglige l'importance de la matrice extracellulaire (ECM). L'ECM est le composant non cellulaire présent dans tous les types et les fonctions tissulaires pour fournir à la fois un échafaudage physique pour les cellules, ainsi que la capacité à induire des signaux biochimiques et biomécaniques essentiels requis pour divers processus cellulaires, y compris la morphogenèse, la différenciation cellulaire et l' homéostasie 33 -35. Fait important, la composition physique et biochimique de l'ECM est très hétérogène et peut varier considérablement entre les différents types de tissus. Par conséquent, la composition spécifique du tissu de la MEC peut également avoir une influence sur le tropisme d'un organe au cours de la métastase cancéreuse qui peut être négligée avec ce modèle. L'ECM peut également agir pour concentrer des facteurs solubles spécifiques d'une manière qui appropriately les présente à certaines cellules, et sans cette réglage fin de l'ECM, l'induction de la signalisation cellulaire peut être diminuée ou modifiée 36. Bien que le modèle mentionné dans le présent document ne dispose pas d'un composant ECM approprié, de nombreuses études pourraient être renforcées en utilisant une approche complémentaire utilisant à la fois le modèle mentionné ici avec un composant approprié ECM. Par exemple, les fibroblastes d'organes primaires disponibles dans le commerce qui synthétisent ECM endogène ou composants ECM recombinants pourraient être utilisés en plus généré organe-CM pour déterminer l'étendue de l'ensemble microenvironnement d'organes sur le comportement cellulaire.
Il est possible que le micro-soluble produite à partir d'organes CM ne peut mimer de façon appropriée ce qui est présent au cours du processus physiologique de métastases. Cancer cellule de survie, la croissance et la progression dépendent fortement des interactions des cellules cancéreuses hôtes 4,30,31. Génération de l'ensemble d'organes CM peut conduire à la presence de facteurs solubles ne sont normalement pas exprimés par des types cellulaires qui interagissent avec les cellules cancéreuses lors de la progression métastatique. Par ailleurs, il a déjà été démontré que la présence d'une tumeur primaire peut moduler le microenvironnement de sites métastatiques distantes, ce qui "amorçage" pour les métastases 37. Étant donné que le protocole actuel utilise des organes provenant de souris porteuses de tumeurs non saines, il serait intéressant de comparer les facteurs solubles dérivés à partir d'organes de souris porteuses d'une tumeur primaire du sein.
En raison de la séparation mécanique des organes entiers lors de la génération de divers organes-CM, les facteurs intracellulaires peuvent être libérés dans les milieux environnants qui peuvent normalement pas être rencontrées physiologiquement par les cellules cancéreuses. En outre, désossée et des ganglions lymphatiques dérivées des milieux conditionnés nécessite la mise en culture de cellules stromales isolées à partir de ces organes avant leur collecte. Les types présents au cours ex vivo de cellules cultuanneau peut ne pas représenter avec précision l'étendue des types cellulaires rencontrés physiologiquement par les cellules cancéreuses. Alors que les cellules stromales sécrètent principalement de nombreux facteurs associés à différents microenvironnements organes, en utilisant ces procédés peuvent ne pas tenir compte de l'influence d'autres types présents dans les tissus et les organes 38 cellulaires. Enfin, nous avons inclus un supplément de mitogène dans les médias de base utilisés pour générer des supports d'organes conditionné, parce que nous avons constaté que cela était nécessaire pour maintenir la viabilité des deux organes de culture (du poumon et du cerveau) et le BMSC isolé et LNSC. Toutefois, nous reconnaissons la mise en garde que la présence de ce supplément de mitogène aurait stimulé les organes pour produire artificiellement des facteurs solubles qu'ils ne pourraient pas normalement faire,
En résumé, de nombreuses études ont indiqué que les microenvironnements d'organes spécifiques peuvent influencer profondément la biologie des cellules tumorales. Malgré les limitations discutées, l'ex vivo système modèle présenté ici represents une technique globale pour étudier l'influence du microenvironnement soluble dans de nombreux organes solides sur le comportement cellulaire. Dans le laboratoire des auteurs, ce système modèle a été et continue d'être utilisé comme un moyen d'étudier un grand nombre des événements cellulaires associés à des métastases, y compris l'invasion, la migration, la prolifération, le comportement de tige analogue, et des modifications de l'expression génique. Les données obtenues à partir de ces études pourraient à leur tour informer l'application clinique potentielle de ce système modèle pour les cellules cancéreuses du sein primaires isolées à partir de tumeurs de patients afin de déterminer leur réponse à divers microenvironnements représentant des sites métastatiques potentiels. Pris ensemble, il est à espérer que la poursuite de la compréhension de l'interaction entre les cellules tumorales et microenvironnement pendant le processus de tropisme d'organe métastatique conduira à l'amélioration du traitement du cancer à l'avenir.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml conical tubes | Thermo Scientific (Nunc) | 339652 | Keep sterile |
| 1x Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Nude mice | Harlan Laboratories | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu | Use at 6 - 12 weeks of age |
| Polystyrene foam pad | N/A | N/A | The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Keep sterile |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | Keep sterile |
| Gauze pads | Fisher Scientific | 22-246069 | Keep sterile |
| 60 mm2 glass petri dishes | Sigma-Aldrich | CLS7016560 | Keep sterile |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | S95937A | Keep sterile |
| DMEM:F12 | Life Technologies | 21331-020 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 1x Mito + Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Keep sterile |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051-500ML | Keep sterile |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | R-001-100 | Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Scientific (Nunc) | 140675 | Keep sterile |
| 0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | Z359904 | Keep sterile |
| T75 tissue culture flasks | Thermo Scientific (Nunc) | 178905 | Keep sterile |
| Transwells | Sigma-Aldrich | CLS3464 | Keep sterile, use for migration assays |
| Anti-mouse Sca-1 | R&D Systems | FAB1226P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD105 | R&D Systems | FAB1320P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD29 | R&D Systems | FAB2405P-025 | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD73 | R&D Systems | FAB4488P | use at 10 µl/106 cells |
| Anti-mouse CD44 | R&D Systems | MAB6127-SP | use at 0.25 µg/106 cells |
| Anti-mouse CD45 | eBioscience | 11-0451-81 | use at 5 µl/106 cells |
| Anti-mouse gp38 | eBioscience | 12-5381-80 | use at 10 µl/106 cells |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Keep sterile |
| Protein arrays | RayBiotech Inc. | AAM-BLM-1-2 | Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate |
References
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