Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Stamcelle Basert Konstruert immunitet mot HIV-infeksjon i humanisert Mouse Model

Published: July 2, 2016 doi: 10.3791/54048
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Abstract

Med den raske utviklingen av stamcelle-baserte genterapi mot HIV, det er trykk krav til en dyremodell for å studere den hematopoetiske differensiering og immunfunksjon av de genetisk modifiserte celler. Den humaniserte benmarg / Lever / Thymus (BLT) mus modellen gir mulighet for fullstendig rekonstituering av et humant immunsystem i periferien, som omfatter T-celler, B-celler, NK-celler og monocytter. Den menneskelige thymus implantat gir også mulighet for thymus utvalg av T-celler i autolog thymus vev. I tillegg til studiet av HIV-infeksjon, står modellen som et kraftig verktøy for å studere differensiering, utvikling og funksjon av celler avledet fra hematopoietiske stamceller (HSCs). Her skisserer vi byggingen av humanisert non-obese diabetic (NOD) -severe kombinert immunsvikt (SCID) -Felles gammakjede knockout (c γ - / -) -Bone-marg / Lever / Thymus (NSG-BLT) mus med HSCs omsatte med CD4 kimære antigen reseptor (CD4CAR)lentivirus vektor. Vi viser at den CD4CAR HSCs kan med hell differensiere til flere linjene, og har anti-HIV-aktivitet. Målet med studien er å demonstrere bruken av NSG-BLT musemodell som en in vivo modell for konstruert immunitet mot HIV. Det er verdt å merke seg at, fordi lentivirus og menneskelig vev blir brukt, bør eksperimenter og operasjoner utføres i en klasse II biosikkerhet skap i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) med spesielle forholdsregler (BSL2 +) anlegg.

Introduction

Til tross for suksessen av kombinert anti-retroviral terapi, er HIV-infeksjon fortsatt er en livslang sykdom. Den cellulære immunrespons mot HIV spiller meget viktig rolle i å kontrollere HIV-replikasjon. Nylige fremskritt i stamcelle manipulasjon har tillatt for den raske utviklingen av genterapi tilnærminger for HIV-behandling 1-3. Som et resultat, er det viktig å ha en passende dyremodell som tillater in vivo studie av effekten av celle-basert terapi mot HIV.

Arbeide med HIV i dyremodeller er komplisert ved det faktum at viruset bare infiserer humane celler. For å omgå denne begrensningen, har forskere tydd til hjelp sykdomsmodeller som Simian Immunodeficiency Virus (SIV) i rhesusape 4,5. Dessverre er det store begrensninger i denne modellen på grunn av den iboende forskjeller mellom arter og forskjellene mellom SIV og HIV. I tillegg bare høyt spesialiserte anlegg er capable til å understøtte arbeids med ikke-humane primater og hver macaque krever en stor investering. Det er således et stort behov for en modell som utnytter det humane immunsystem, som er mottagelig for HIV-infeksjon / patogenese, og er mindre økonomisk prohibitive.

Den ikke-obese diabetic (NOD) -severe kombinert immunsvikt (SCID) -Felles gammakjede knockout (c γ - / -) (eller NSG) Blood / Lever / Thymus (BLT) humanisert musemodell er i økende grad vist seg å være et viktig verktøy for å studere HIV-infeksjon. Ved å implantere blodkreft stamceller (HSCs) og foster thymus, mus er i stand til å utvikle og rekapitulere et menneskets immunsystem 1-3. En type stamceller basert genterapi innebærer 'omdirigere' perifere T-celler til å målrette HIV ved å omprogrammere blodkreft stamceller (HSCs) til å differensiere i antigen spesifikke T-celler. Vi har tidligere vist at konstruksjons HSCs med et molekylært klonet anti-HIV-spesifikk T-celle-rereseptoranalyser (TCR) mot SL9 epitop (aminosyre 77-85; SLYNTVATL) av HIV-1 Gag kan omdirigere stamceller til å danne modne T-celler som undertrykker HIV-replikasjon i den humaniserte NSG-BLT musemodell 6. Påminnelse om å bruke et molekylært klonet TCR er at det er begrenset til et spesifikt humant leukocyttantigen (HLA) subtype som begrenser anvendelsen av denne terapien. Kimære antigen-reseptorer (CAR), på den annen side, kan være universelt brukes på alle HLA-undergrupper. Innledende studier ble utført ved bruk av en bil konstruert med de ekstracellulære og transmembrane domener av humant CD4 fusjonert til det intracellulære ζ aliserte domenet av CD3 (kalt CD4ζCAR). CD4ζCAR uttrykt på CD8 T-celler kan gjenkjenne HIV-kappe og utløse en cytotoksisk T-cellerespons som er lik den som er formidlet av en T-celle-reseptor 7. Vi har nylig vist at menneske HSCs kan endres med CD4ζCAR, som deretter kan differensiere til flere blodkreft lineages, inkludert funksjonelle T-celler som kan undertrykke HIV-replikasjon i humanisert musemodell 8. Med den raske fremme i kimære antigen reseptor behandling for kreft 9, og den pågående karakterisering av potente brede nøytraliserende antistoffer 10-12 mot HIV som tillater bygging av enkeltkjedeantistoff biler, er det oppfattes at mange nye kandidat konstruksjoner, i tillegg til CD4ζCAR , vil bli generert og testet for stamcellebasert genterapi av HIV-sykdommer og andre sykdommer. I tillegg kan det humaniserte NSG-BLT musemodell som inneholder slike antigen-spesifikke biler også være et nyttig verktøy for å undersøke nærmere humane T-celleresponser in vivo. Viktigere, vår protokoll skiller seg fra tidligere beskrevne fremgangsmåter for konstruksjon av humaniserte av BLT mus 13-15 ved at HSCs i geléaktige proteinblandingen blir brukt i stedet for føtale leverbadebukser 16. Denne protokollen beskriver: 1) bygging av humanized BLT mus konstruert med CD4ζCAR; og 2) karakterisering av differensieringen av de genetisk modifiserte celler; og 3) karakterisering av funksjonaliteten av de genetisk modifiserte celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethic Uttalelse: Human fostervev ble innhentet fra Advanced Biosciences Resources eller fra Novogenix og ble oppnådd uten identifiserende informasjon og ikke krever IRB godkjennelse for sitt bruk. Animal forskning beskrevet i dette manuskriptet ble utført under skriftlig samtykke fra University of California, Los Angeles, og (UCLA) Forsøksdyrutvalget (ARC) i henhold til alle relevante føderale, statlige og lokale retningslinjer. Spesielt ble disse studiene utført under strengt samsvar med retningslinjene i The Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Research Council og akkreditering og retningslinjer av Foreningen for vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care (AALAC) International henhold til UCLA ARC Protocol Antall 2010-038-02B. Alle operasjoner ble utført under ketamin / xylazin og isoflurananestesi og alle anstrengelser ble gjort for å minimere dyr smerte og ubehag.

1. Konstruksjon av humanisert Mus Konstruert med CD4 kimære antigen reseptor

  1. Behandler Fetal Thymus og isolere CD34 + HSCs fra Fetal Liver
    1. thymus Processing
      1. Vask forsiktig thymus i fosfat-bufret saltvann (PBS), pH 7,4, i et 15 ml konisk rør. Gjenta vasketrinn 3 - 4 ganger.
      2. Legg til 7 ml RPMI-medium + 10% FBS + Pen / strep. Dekanter alt i en steril 100 mm petriskål.
      3. Bruk skalpeller for å kutte thymus i små biter på omtrent 1 mm 2. Plasser hver eneste thymus brikke i en enkelt brønn på en 96-brønns plate. Bruk buet sløv tang ved overføring thymus stykker til 96-brønns plate.
        1. Tilsett en liten mengde av medium (100-200 pl) til alle brønnene, slik at vevet ikke tørker. Visualiser henhold mikroskop (thymus har fliker og bør se ut sekker med celler).
          MERK: Kast stykker som ser tvilsom på noen måte;Det er ofte bindevev, og dette bør ikke bli implantert.
      4. Fjern de bekreftet-thymus biter og legg dem i en T25 cellekultur kolbe. Legg 7 ml RPMI-medium supplert med 10% FBS og 450 ug / ml av piperacillin / tazobactam og amfotericin B. forsiktig stein kolben for å blande. Kultur kolben over natten ved 37 ° C / 5% CO2.
        MERK: Dette trinnet er nødvendig for å forhindre bakteriell forurensning av vevet.
      5. (Valgfritt trinn) Fryse thymus for fremtidig bruk. Stabilisere de biter i 90% humant AB serum med 10% dimetylsulfoksid (DMSO) i 10 minutter. Fryse dem med en hastighet på 1 ° C / min til -50 ° C, og deretter rask avkjøling til -150 ° C. Når du er klar til å tine, raskt tine i en 37 ºC vannbad og vask forsiktig 3x i RPMI komplett media uten DMSO.
    2. Liver Processing
      1. Vask forsiktig leveren i PBS i en 50 ml konisk tube. Gjenta vasketrinn 3 - 4 ganger.
      2. Tilsett 10 ml (Iscove modifiserte Dulbeccos Media) IMDM media til 50 ml konisk tube. Dekanter alt inn i en 100 mm sterile petriskål.
      3. Homogen leveren vev ved hjelp av to skalpeller. Skjær leveren i små biter på ca 3 mm 2. Klipp ut og kast hvit bindevev.
      4. Bruk 10 ml sprøyte utstyrt med en 16 gauge butt nål for å ta opp leveren stykker og media. Deretter overføre til en 50 ml konisk tube.
      5. Forsiktig resuspender media og vev fjæring og utvise 5-7 flere ganger for å homogenisere vev helt.
      6. Forbered 10 ml IMDM media supplert med enzymer: 500 U / ml kollagenase, 2400 U / ml hyaluronidase, og 300 U / ml DNase samt 450 mikrogram / ml piperacillin / tazobaktam og amfotericin B. Filter media via en 0,22 mikrometer filter da legge media til leveren suspensjon.
      7. Cap 50 ml konisk rør inneholdende suspensjonen leveren og slutter tett med selvtettende film som Parafilm to hindre lekkasjer. Roter i et rør rotator i inkubator ved 37 ºC i 90 minutter.
      8. Filtrer den fordøyd cellesuspensjonen gjennom en 100 um celle sil inn i en frisk 50 ml tube.
        MERK: Legg PBS til suspensjonen for å bringe det totale volum opp til 50 ml. Dele dette inn i to rør på 50 ml rør som hver inneholdt 25 ml cellesuspensjon.
      9. Sakte og forsiktig underlag cellene i hvert rør med 10 ml tetthetssentrifugering media (for eksempel Ficoll). Spin ved 1200 xg i 20 min uten brems. Merk: Alle sentrifugering er nevnt i denne protokollen blir gjort ved romtemperatur (25 ° C).
      10. Fjern forsiktig grensesnitt (ie., Buffy coat) fra hvert rør og overføring til to separate 50 ml rør. Bringe volumet av hvert rør av grensesnitt opp til 50 ml med PBS. Spin 300 xg i 7-10 min. Aspirer supernatanten forsiktig.
      11. Kombiner de to pellets. Vask tre ganger med 50 ml PBS inneholdende 2% FBS. Spin 300 xg for 7-10 mi hver tid mens nøye aspirering av supernatanten.
      12. Resuspender pelleten i 50 ml RPMI-medium + 10% FBS. Telle celler ved hjelp hemocytometer på dette før du går videre til cellesortering.
      13. Sorter CD34 + celler umiddelbart ved hjelp av CD34 sortering Kit (f.eks., CD34 mikroperler), i henhold til produsentens protokoll.
        MERK: Alternativt kan cellene dyrkes i RPMI media + 10% FBS på 1 million / ml over natten.
      14. Spar både CD34 + og CD34- brøkdel.
        MERK: På dette trinnet, kan CD34 + og CD34- cellene fryses ved hjelp Bambanker frysing media eller andre minus medier. Fryse 1 ml av 4 - 6 x 10 6 CD34 + celler per rør og fryse 1 ml av 40 - 60 x 10 6 CD34- celler per rør.
  2. Transduksjon av CD34 + celler
    1. Beregn antall overførings brønner som kreves av en seks godt vev-kultur plate. 1 tillegg kan brukes til å transdusere opp til 8 x 10 6 celler. Tilhver BLT mus, vil 0,5 x 10 6 CD34 + bli implantert sammen med CD34- celler og tymus under nyrekapselen og 0,5 x 10 6 CD34 + celler blir injisert intravenøst. Antall CD34 + celler til bruk bestemmes av antall mus (1 million celler per mus).
    2. Belegge det nødvendige antall brønner i en ikke-vevskultur behandlede 6-brønns plate med 1,25 ml av rekombinant human fibronektin oppløsning (f.eks., Retronectin) (20 ug / ml i PBS) i hver brønn. Dekk platen og la den stå i 2 timer ved romtemperatur i en ren biosikkerhet skap.
    3. Aspirer fibronektin oppløsning fra brønnene og tilsett 1,25 ml FACS-buffer (PBS med 4% FBS) til hver brønn for å blokkere. La maskinen stå ved romtemperatur (25 ° C) i 30 minutter.
    4. Aspirer FACS-buffer og vaske brønnene en gang med PBS.
    5. Hold PBS i de belagte brønner, til platen er klar til bruk. Oppbevar platen ved 4 ºC over natten hvis det ikke brukes umiddelbart.
    6. Plate CD34 + celler i Infection medium (2% humant serumalbumin i Yssels Serum-Free T-Cell Medium) i fibronektin løsnings-belagte brønner (~ 2 x 10 6 celler / ml) og inkuber ved 37 ° C i 1 time.
    7. Bruke en pipette for å legge til lentiviral vektor til brønnene ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) mellom 2 - 10. Bland forsiktig og inkuberes over natten ved 37 ° C.
      MERK: titer av lentivirus vektor brukes bør bestemmes på forhånd.
    8. Høste celler neste morgen ved å forsiktig skrape bunnen av brønnene med en celle skrape. Samle celler og telle med hemocytometer på dette tidspunktet.
    9. For å forberede celler for implantat, kombinere 0,5 x 10 6 omsatte CD34 + celler med 4,5 x 10 6 CD34- celler per mus, delmengde i sterile 1,5 ml skrukork. Spinn cellene ned ved 300 xg til pellets dem, aspirer supernatant. Snurr dem igjen ved 300 xg og aspirer eventuelle gjenværende supernatanten ved hjelp av en P10 pipette og aspirere veldig carefully. Holde de tørre pelletene på is gjennom hele studien. Merk: For å sørge for at cellene er levedyktig, kan du bruke de pelleterte celler og utføre operasjonen innen 2-3 timer.
    10. For å forberede celler for injeksjon, spinne 0,5 x 10 6 omsatte CD34 + celler per mus til pellets dem, aspirer supernatant. Resuspender celler i 100 ul RPMI-medium per mus og holde på is.
    11. For å sjekke transduksjon effektivitet, alikvoter ~ 1 x 10 5 ikke-transdusert og transdusert CD34 + celler fra hver tilstand og kultur i 200 ul cytokin-medium (RPMI media med 10% FBS, supplert med 100 ng / ml humant IL-3, IL-6 , SCF) i 96-brønns plate i 5 - 7 dager ved 37 ° C.
      MERK: Celler som brukes i dette trinnet brukes ikke for kirurgi, men for å sikre at transduksjon er vellykket og vektoren er ikke giftig for stamcelle overlevelse og fornyelse. Transduksjon effektivitet kan kontrolleres ved å se etter genekspresjon av vektoren (f.eks., GFP og CD4) og analysere ved flowcytometri.
  3. Vev transplantasjoner Konstruer genmodifiserte mus
    1. På samme dag før kirurgi utføre total kroppsbestråling av de NOD.Cg- Prkdc scid Il2rg t m1Wjl / SzJ (NSG) immunkompromitterte mus med en Cesium-137 irradiator og en dose på 2,7 Gy (270Rad).
      MERK: NSG mus er alvorlig immunsvikt. Derfor sine boliger og vedlikehold må samsvare med den høyeste helsestandard og håndteres av høyt utdannet personale.
    2. Hell thymus stykker og medium fra flasken inn i en 60 mm parabolen. Hell PBS inn i en annen 60 mm skål, som vil bli brukt til å rense trochar og holde nyre våt.
    3. Chill positive forskyvning pipetter ved å plassere dem i åpne 1,5 ml sterile skrukork på is. Hold på isen med de tørkede celle pellets og geléaktige proteinblanding som Matrigel.
      MERK: Det er viktig å holde den geléaktige proteinblanding og noen rør eller tips somvil berøre det kaldt til enhver tid til implantatet nålen er lastet.
    4. Anesthetize musene: Vei mus individuelt og plate vekter; øre punsj musene å telle dem. Injisere dem intraperitonealt med 15 ul Ketamin (2,6 mg / ml i saltvann) / Xylazin (100 mg / ml i saltvann) pr gram kroppsvekt). Sett musene tilbake i buret og vente på det å være fullt bedøvet.
      MERK: Kontroller anestesi nivå av musen ved å klemme en pote. Hvis musen refleksivt flinches, administrere 25-50% av den opprinnelige mengden av Ketamin / xylazine å bedøve musen lenger. Vent til den ikke refleksivt vike til å utføre operasjonen.
    5. Bruke Oster klippemaskinen (barbermaskin), barbere venstre side av hver mus fra hofte til skulder mellom sentrum av ryggen og magen. Subkutant injisere 0,3 ml av den fortynnede karprofen (6 mg / kg) inn i dyrets skulder eller inguinal trekant (ben grop). Ved hjelp av en bomullspinne, sette en liten dråpe av kunstige tårerpå hvert øye og lå musen på sin side tilbake i buret.
      MERK: Grense kirurgi prep til en merd (ca. 4-5 mus) av gangen.
    6. Skyll kanylen av 16 gauge kreft implantat nål (troakarnål) med PBS. Ved hjelp av et par butte buede tang, plassere et stykke av thymus fra 60 mm skål inn i åpningen av kanylen med trokaren rett innenfor åpningen, og deretter trekke tilbake på trokaren for å aspirere vevet inn i kanylen.
    7. Bruke en positiv fortrengnings pipette og en kjølt spiss for å sette 5 ul kald gelatinøse proteinblandingen i røret med en tørket cellepellet (CD34 + og CD34- blanding for implanterte celler) og rør forsiktig for å generere cellesuspensjon. Ikke pipetter opp og ned. Pipetter geléaktige proteinblandingen / cellesuspensjon inn i åpningen av kanylen og langsomt trekke tilbake på trokaren for å laste nålen.
      MERK: Det anbefales å ha en hjelper å laste pipetten mens en manipulerer implantatet nål.
      8. <li> Rens barberte området av musen med povidon-jod og deretter tørke ned området med en spritserviett tre ganger. Bestem den mørkeste flekk under huden. Dette indikerer plasseringen av milten. Nyrene er ca 5 mm rygg til milten. Løft opp huden med buet pinsett og lage en 15 mm lang innsnitt med kirurgiske sakser i huden parallelt til milten. Deretter lage en tilsvarende kutt i bukhinnen lag under. Hos menn, må nyren være lett synlig, og kan ekstruderes ved å trykke mot underlivet. Du kan støtte nyrene med pinsetten eller et par buede sløv tang. Hos kvinner, eggstokkene har en tendens til å blokkere nyre fra lett uttrekking. Ved hjelp av en pinsetten, plukke opp eggstokken og nøye eksponere ut nyrene.
    8. Bruk nål-tipped pinsett til å nappe et lite hull i den bakre enden av nyren.
      MERK: Ikke bruk disse nål-tipped pinsett til å håndtere biologiske farlige materialer.
    9. Skyv implantatetnålen inn i dette hullet og langs nyrene til åpningen av kanylen er helt dekket av nyren.
    10. Forsiktig ekstrudere vevet under nyrekapslen, og trekk nålen ut igjen. Thymus brikkene kan være klissete så bruk en buet pinsett for å sørge for at thymus stykket ikke kommer ut med nålen.
    11. Løft opp peritoneum med tang og forsiktig bruker pinsetten til å skyve nyre tilbake på plass. Knyt en dobbel-knyttede sting i bukhinnen bruker 4-0 Vicryl absorberbare suturer. Bruk to autoklips såret klipp for å lukke huden.
    12. Bland omsatte CD34 + celler som ble satt til side for injeksjon og opptak 100 pl (0.5x10 6 celler) i en insulinsprøyte. Injisere disse cellene inn i musen gjennom retroorbitale veneinjeksjon eller andre veier for intravenøs injeksjon. Ved hjelp av en bomullspinne, sette en liten dråpe kunstige tårer på hvert øye og lå musen på sin side tilbake i et bur.
    13. Når alle mus har been implantert, bekrefter at dyrene er kommet til bevissthet og ambulerer normalt før du forlater dem.
    14. Post-operative omsorg: Dagen etter operasjonen, subkutant injisere 0,3 ml fortynnet Carprofen (6 mg / kg) og 1,2 ml sterilt saltvann inn hver mus. 2 og 3 dager etter kirurgi, subkutant injisere 1,5 ml steril saltløsning til hver mus. Overvåke mus og snittene for 10-14 dager etter operasjonen. Fjern autoklips og veie mus etter 10-14 dager. MERK: Mus er svak etter stråling og injeksjon av saltvann hindrer dyrene fra å bli dehydrert.
    15. Etter 8 - 10 uker, sjekk engraftment av blødning mus og utføre FACS analyse på perifert blod, farging for markører som CD45, CD3, CD4, CD8, og eventuelle gener vektoren skal uttrykke.

2. Karakterisering av Differensiering og utvikling av genmodifisert Cells

  1. karakterisering avGenmodifiserte celler fra perifert blod
    1. 8 - 10 uker etter transplantasjon, få 50 - 100 mL av mus blod fra retro-orbital blø. Sett i Mikrosentrifugerør inneholder 10 mL av EDTA. Sentrifuger cellene ved 350 xg i 3 min. Samle plasma. Fryse ved -80 for ELISA analyse eller plasma virusmengde analysen hvis musen er HIV smittet.
    2. Tilsett 2 ml NH4CI (83%) oppløsning til å lysere røde blodceller. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur (25 ° C). Etter inkubering, tilsettes 10 ml RPMI 10% FBS for å fylle røret. Spin 300 xg i 5 min. Aspirer supernatanten forsiktig. Cellene er klare for immunofarging og flow-cytometri analyse og andre analyser.
      MERK: Markører til ulike hematopoetiske celleslektsnavn, aktivisering og fenotypiske markører for naive eller minnecellene kan måles hver 2 uker før og etter HIV-infeksjon ved flowcytometri. Gates er skapt ved farging celler med isotype kontroller. Det anbefales å farge helsesertifikaterhy menneskelige PBMC og bruke det som positiv kontroll. Alternativt kan mus avlives og opptil 1 ml perifert blod kan fås fra hjertestans punktering som vil gi nok celler for flere paneler av strømningsanalyse 17.
  2. Karakterisering av genmodifisert Celler fra milt, thymus og benmarg
    1. Harvest-Spleen, Thymus og benmarg fra humanisert BLT Mus
      1. Avlive mus ved hjelp av overdose av isofluran. Bekreft dødshjelp med sekundær halshugging. Spray overflaten av skrotten med 70% etanol for å holde pels fester seg til vev. Peke ut bena på en voks disseksjon skuffen.
      2. Bruk kirurgisk saks, klippe åpne huden, og deretter skjære gjennom peritoneal laget for å eksponere kroppens hulrom.
      3. Fjern milten ved hjelp av pinsett. Fjern det thymisk implantatet på nyrene ved hjelp av tenger og sakser. Sett thymic implantatet og milt i merkede rør Containing 5 ml PBS.
      4. Fra midten av magen klippe og fjern skinnet fra den distale del av musen dekker underekstremitetene.
      5. Skjær av muskler fra de lavere ekstremiteter med saks og forsiktig forrykke acetabulum fra hofteleddet. Fjern femur og tibia og plassere dem i et rør som inneholdt 5 ml PBS.
    2. Isolering av Splenocytter
      1. Plasser en 100 um cellefilter på en 50 ml konisk rør. Fukt sil med 3 ml RPMI media supplert med 10% FBS og Pen / strep (RPMI komplett media).
      2. Plasser milt på celle sil. Ved hjelp av gummistemplet av en 10 ml sprøyte, mos milten for å dissosiere det gjennom silen inn i 50 ml tube.
      3. Skyll celle sil med 5 ml RPMI fullstendige media 4 til 5 ganger.
      4. Spin cellene ved 300 xg i 10 min.
      5. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml røde blodceller lyseringsbuffer. Inkuber ved rom temperature i 10 min. Tilsett 20 ml RPMI fullstendige media og sentrifugering ved 300 xg for 7 min.
      6. Aspirer supernatanten og resuspender pellet i 10 ml RPMI fullstendige media og filtrere igjen gjennom en 100 mikrometer celle sil. Telle celler ved hjelp hemocytometer.
        MERK: Celler kan anvendes for ex vivo-tester, strømningsanalyse og kan viably frosset for senere bruk. Før celletelling, kan Trypan blå brukes til å bestemme antall levedyktige celler.
    3. Isolering av humane thymocytter fra Implant
      1. Plasser thymus inn i 5 ml PBS i en brønn i en 6-brønners plate. Bruke rene butte pinsett og saks kutte thymus i små biter.
      2. Plasser en sterilisert rustfritt stål firkantet inn i brønnen. Ved hjelp av gummistemplet av en 10 ml sprøyte, mos thymus brikkene på rustfritt stål for å bryte fra hverandre thymus.
      3. Suspender cellene godt og siles gjennom en 100 mikrometer celle sil. Spin cellene ved 300 xg i 10 min.Suspendere celler i 10 ml RPMI fullstendige media. Hvis klumper er synlige, passerer resuspendert-cellene gjennom en celle sil igjen.
      4. Telle celler ved hjelp hemocytometer.
        MERK: Celler kan brukes til strømningsanalyse og viably frosset for senere bruk.
    4. Isolering av Celler fra Bone Marrow
      1. Rengjør og steriliser morter med 70% etanol. Plasser femur og tibia i mørtel. Tilsett 5 ml kald PBS. Bruk støter for å knuse bein til PBS blir lys rosa og skyet.
      2. Pipettere opp væsken fra mørtelen og filteret gjennom en 50 uM cellefilter plassert på et 50 ml konisk rør. Vask mørtel med 5 ml PBS og gjenta fem ganger til PBS blir klart.
      3. Spinn cellene ned ved 300 xg for 7 min. Aspirer supernatanten og resuspender i 10 ml RPMI fullstendige media.
      4. Telle celler ved hjelp hemocytometer.
        MERK: Celler kan brukes for ex vivo-analyser, flow analyse og kan være viably frossen feller senere bruk.

3. Funksjonell Karakterisering av genmodifisert Cells

  1. HIV-smitte og Overvåkning av Replication over tid Viral
    1. Etter bekreftelse av menneskets immunsystem rekonstituering injisere ønskede mengden HIV-virus via retro-orbital vene injeksjon ved hjelp av en insulinsprøyte. Etter HIV-infeksjon, samle 100 ul perifert blod via retro-orbital blødning hver 2. uke.
    2. Harvest-plasma ved å følge trinnene i del 2.1.1 - 2.1.2. For HIV virusmengde analysen trekke viral RNA bruker RNA ekstraksjon kit i henhold til produsentens instruksjoner og måle virusmengde ved real time RT-PCR med passende primer og probe sett for HIV-viruset som brukes 4,8,18,19.
    3. For å måle celleassosiert HIV RNA og identifisere celler som er aktivt med HIV-infeksjon, først utføre RBC lysis følge trinn 2.1.2
    4. Resuspender cellesuspensjon i en; Ml PBS, dele likt inn to rør. Spin 300 xg i 5 min. Aspirer supernatant.
    5. For å måle celleassosiert RNA, trekke RNA ved hjelp av RNA ekstraksjon kit i henhold til produsentens instruksjoner og utføre real-time RT-PCR ved hjelp av egnede primer og probe sett.
      MERK: Det er viktig at primer / sonde ikke gjenkjenner lentivirus brukes til modifiserte stamceller
    6. For å måle HIV-infiserte celler ved flow, resuspender cellene i det andre røret i 50 ul FACS-buffer og utføre overflate flekken med ønskede antistoff, slik som anti-CD45, anti-CD4 og anti-CD3. Etter overflaten flekken, fikse og permeabilize celler og beis intracellulært for gag uttrykk ved hjelp anti-Gag antistoff (klone KC57). Utfør flowcytometri.
  2. Ex vivo Cytokin-analyse av genet modifiserte celler fra Splenocytter
    1. Harvests splenocytter fra mus som beskrevet i avsnitt 2.2.2.
    2. Forbered målceller. For å teste den funksjonelleligheten av CD4 kimære antigen reseptor modifiserte T-celler, bruker HIV-infiserte T1 celler som målceller. Infisere T1 celler med HIV 3 dager før den cytokin-analysen bekrefter HIV-infeksjon ved å farge cellene med intracellulært anti-HIV-gag-antistoffet (klon KC57). Bruk uinfiserte T1 celler som kontroll målceller.
    3. Co-ruge splenocytes med mål eller kontrollceller på 1: 1-forhold over natten. For best resultat, utføre en titrering (1: 1, 1: 3, 1: 9) av effektor (splenocytes) versus målceller (infiserte t1s). For eksempel, suspendere 0,9 millioner splenocytes i 0,25 ml RPMI komplett media, legger 0,9, 0,3 eller 0,1 millioner smittet T1 eller uinfiserte t1s resuspendert i 0,25 ml RPMI komplett media.
    4. Den neste morgen, legge til protein transport inhibitor i 6 timer for å hemme protein transport og utføre farging for ekstracellulære markører og intracellulær ekspresjon av cytokiner som tidligere beskrevet i åtte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser en skisse av konstruere humaniserte BLT mus med modifisert stamcelle. 10 uker etter implantatkirurgi, ble musene avlivet for å evaluere differensiering og utvikling av genmodifiserte celler. Som vist i figur 2, ble flere lymfoide vev (blod, milt, thymus og benmarg) høstes fra en mus som var modifisert med CD4ζCAR. Den CD4ζCAR anvendt i denne protokollen inneholder CD4-kimær-reseptor-antigen og GFP som kan påvises ved anti-CD4-antistoff og ekspresjon av GFP 8. Celler ble isolert og farvet med antistoff mot human CD45, så vel som anti-CD4-antistoff og analysert ved strømningscytometri. GFP og CD4 doble positive celler ble detektert, hvilket indikerer tilstedeværelse av CD4CAR + -celler i flere lymfoide vev.

For å undersøke differensiering av genmodifiserte cellene splenocytter ble farget med antistoffer mot humant CD45 (lymfocytter), CD3 (T-celler), CD19 (B-celler), CD14 (monocytter og makrofager) og CD337 (NK-celler). Som vist i figur 3, CD4ζCAR hematopoetiske stamceller differensiere til flere linjene.

For å undersøke om CD4CAR modifiserte celler er funksjonelle, inkubert sammen vi splenocytes med målceller som CD4CAR celler ville gjenkjenne (HIV smittet T1 celler eller uinfiserte T1 celler som kontroll). Celler ble ko-inkubert over natten, og proteinet transport inhibitor ble tilsatt i ytterligere 6 timer. Etterpå ble cellene fiksert og permeabilisert å farge for intracellulær ekspresjon av cytokiner slik som IFNy og TNFa. Som vist i figur 4, CAR uttrykkende celler, produserte høyere mengde av IFNy og TNFa med infiserte T1 celler.

belastning / 54048 / 54048fig1.jpg "/>
Figur 1: Oversikt over byggingen av humanisert BLT mus med modifiserte stamceller FT. Fetal thymus. FL:. Fetal leveren Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: CD4-kimær-antigen-reseptor-modifiserte celler kan påvises i flere lymfoide vev mus med CD4CAR modifisert HSCs ble avlivet 10 uker etter operasjonen og flere lymfoide vev ble høstet og cellene ble farget med anti-human CD45 og anti-humane CD4-antistoffer og analysert ved flowcytometri. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 3:.. CD4 kimære antigen reseptor modifiserte celler kan differensiere til flere linjene Splenocytter fra CD4CAR modifiserte mus ble høstet og farget med antistoffer mot humant CD45, CD3, CD19, CD14 og CD337 og analysert ved flowcytometri Klikk her for å se et større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4:. Ex vivo cytokin analyse av CD4 CAR + T-celler Splenocytter fra HIV smittet CD4CAR mus ble stimulert med enten HIV-smittet eller infisert T1 celler og deres intracellulær produksjon av cytokin er vist. Klikk her for å viewa større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med CAR og HSC-baserte utviklet immunitet få fart mot kliniske studier, er det viktig å ha en skikkelig dyremodell for å nøye undersøke differensiering og funksjon av disse konstruerte celler. I denne protokollen beskrevet vi metoder for å konstruere og teste humanisert mus med genmodifiserte stamcellene utviklet mot HIV. Det er viktig å ha effektiv transduksjon av stamceller før transplantasjon. Imidlertid, på grunn av evnen til T-celler til å proliferere ved gjenkjenning av målceller, lave nivåer av stamcelle modifikasjon var tilstrekkelig til å gi en robust respons mot HIV-replikasjon 8.

Likevel, for å oppnå høy grad av stamcelle modifikasjon, anbefaler vi å bruke transduced CD34 + celler i geléaktige proteinblanding med autolog thymus i stedet for lever og thymus biter for mus kirurgi som hadde blitt beskrevet andre steder 13-15. Geléaktige proteinblanding er en solubilized vev basalmembran rik på ekstracellulære matrix proteiner. Under normale fysiologiske forhold, gelatin proteinblanding polymerisere for å fremstille en rekonstituert, biologisk aktiv og stabil matrise som ville tillate effektiv festing og differensiering av stamceller 20. Menneskelig celle tilberedning kan kontrolleres ved retro-orbital blødning og flowcytometri 6 - 8 uker etter operasjonen. For å sikre at vektoren ikke er toksisk for stamcelle overlevelse og fornyelse, er det anbefalt å titrere vektor i CD34 + celler før eksperimentet som beskrevet i 1.2.6.

Kapasiteten på NSG-BLT musemodell for å støtte mukøs infeksjon, konsekvent viremi og cellulære immunresponser som gjør det til en svært nyttig modell for å studere HIV immunpatologi og celle-baserte terapier for å behandle HIV-infeksjon 1. Viktigst er T-celler som genereres fra NSG-BLT mus valgt i autolog thymus vev, slik at forskeren å studere skjebnenav genmodifiserte stamceller etter thymus utvalg 8,21. Med den beskrevne metoden, har vi vært i stand til å få 40% -90% menneskets immunceller tilberedning konsekvent. Lave nivåer av menneskecelle tilberedning kan skyldes flere faktorer, blant annet ferdighetene til den som utfører operasjonen, og kvaliteten på vev for transplantasjon. For å oppnå høy grad av menneskelig celle rekonstituering, er det viktig å sikre at transplantasjoner er sikkert plassert under nyrekapselen. I tillegg er det sterkt anbefalt å undersøke hver thymus implantat forberedt for operasjon under lett mikroskop og kast eventuelle tvilsomme stykker.

Selv om humanisert BLT musemodell er et lovende verktøy for å studere utviklet immunitet mot HIV (anmeldt i 1,15,22), har det sine egne begrensninger. Nemlig ikke denne modellen helt ligne et humant perifert immunsystem. Studier har vist nedsatt utvikling av hyper-mutert, klasse slått IgG Antibody 1,23. I tillegg bruker immunmangelfull mus er teknisk utfordrende og holde disse musene sunt krever betydelige ressurser og opplæring. Subtile opportunistiske infeksjoner kan manifestere seg som betydelige forskjeller mellom prøvene og potensielt ha negative konsekvenser for eksperimentering. Derfor er det viktig å ha godt forberedt fasiliteter og egnet kompetanse for å opprettholde integriteten i fremtiden data 1,24. Med disse begrensningene i tankene, gir fremdeles humanisert NSG-BLT musemodell et viktig redskap for studiet av stamcellebaserte utviklet immunitet, som er demonstrert av disse eksemplene 4,8.

Med utviklingen av utvikling av kimære antigen-reseptorer på grunnlag av HIV bred nøytraliserende antistoffer 10 og modifisering av signaldomenet for mer effektiv CAR 25, kan denne modellen og protokoll anvendes for å karakterisere og undersøke funksjonaliteten av genet modifisert cells med en ny generasjon av biler. I tillegg kan denne modellen potensielt romme studier av immunbasert terapi (for eksempel hemmende reseptorblokade) i forbindelse med Engineered immunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD34 microbead kit Miltenyi 130-046-702 For sorting human CD34+ progenitor cells
Bambanker Wako 302-14681 For freezing cells
QIAamp Viral RNA kit  Qiagen 52904 For measuring viral load in the serum
MACSQuant Flow Cytometer Miltenyi For flow analysis
BD LSRFortessa™ BD biosciences For flow analysis
Hyaluronidase Sigma H6254-500MG  For tissue digestion
Deoxyribonuclease I       Worthington LS002006  for tissue digestion
Collagenase Life technology 17104-019  for tissue digestion
CFX Real time PCR detection system Biorad For measuring viral load and gene expression
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) Thermo Fisher Scientific 10378016 For culturing cells
Piperacillin/tazobactam Pfizer Zosyn Anti-fungal
Amphotericin B (Fungizone antimycotic) Thermo Fisher Scientific 15290-018 Anti-fungal
Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units Becton Dickinson 427631  For surgery
Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case       Medline DYNJP2707  For surgery
Sutures, 4-0, vicryl           Owens and Minor 23000J304H   For surgery
Alcohol prep pads           Owens and Minor 3583006818 For surgery
Gloves, surgical, 6 1/2 Owens and Minor 4075711102 For surgery
Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium Gemini Bio-products 400-102 For CD34+ cell transduction
Human Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9511 For CD34+ cell transduction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  2. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
  3. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  4. Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208 (2009).
  5. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  6. Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649 (2012).
  7. Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
  8. Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  9. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
  10. Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
  11. Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
  12. West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
  13. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  14. Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  15. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  16. Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181 (2012).
  17. De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
  18. Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  19. Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  20. Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
  21. Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
  22. Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
  23. Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663 (2014).
  24. McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
  25. Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).

Tags

Medisin humanisert BLT mus kimære antigen reseptor HIV ikke-overvektige diabetikere human leukocytt antigen blodkreft stamceller
Stamcelle Basert Konstruert immunitet mot HIV-infeksjon i humanisert Mouse Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhen, A., Rezek, V., Youn, C., Rick, … More

Zhen, A., Rezek, V., Youn, C., Rick, J., Lam, B., Chang, N., Zack, J., Kamata, M., Kitchen, S. Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model. J. Vis. Exp. (113), e54048, doi:10.3791/54048 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter