Abstract
HIVに対する幹細胞ベースの遺伝子治療の急速な発展に伴い、造血分化と遺伝的に修飾された細胞の免疫機能を研究するための動物モデルの差し迫った必要性があります。ヒト骨髄/肝臓/胸腺（BLT）マウスモデルは、T細胞、B細胞、NK細胞および単球を含む末梢におけるヒト免疫系の完全な再構成を可能にします。人間の胸腺インプラントはまた、自家胸腺組織におけるT細胞の胸腺選択を可能にします。 HIV感染の研究に加えて、モデルは、造血幹細胞（HSC）に由来する細胞の分化、発達と機能を研究するための強力なツールとして立っています。ここでは、ヒト化非肥満糖尿病（NOD）の建設を概説複合免疫不全（SCID）-commonガンマ鎖ノックアウト（Cγ - / - ）-severe HSCを形質導入と-Bone骨髄/肝臓/胸腺（NSG-BLT）マウスをCD4キメラ抗原受容体（CD4CAR）とレンチウイルスベクター。我々はCD4CAR HSCが正常に複数の系統に分化し、抗HIV活性を有することができることを示します。研究の目的は、HIVに対する工学的免疫のためのin vivoモデルとしてNSG-BLTマウスモデルの使用を実証することです。それは、レンチウイルスとヒト組織を用いているため、実験や手術は、特別な予防措置（BSL2 +）の施設でバイオセーフティレベル2（BSL2）でクラスII安全キャビネット内で行うべきである、ということは注目に値します。
Introduction
組み合わせ抗レトロウイルス療法の成功にもかかわらず、HIV感染は依然として生涯疾患です。 HIVに対する細胞性免疫応答は、HIVの複製を制御するのに非常に重要な役割を果たしています。幹細胞操作の最近の進歩は、HIV治療1-3ための遺伝子治療アプローチの迅速な開発を可能にしました。その結果、HIVに対する細胞ベースの治療の有効性のインビボ研究において可能適切な動物モデルを有することが重要です。
動物モデルにおいてHIVの操作ウイルスが唯一のヒトの細胞に感染しているという事実によって複雑になります。この制限を回避するために、科学者は、アカゲザル4,5にサル免疫不全ウイルス（SIV）などの疾患モデルを使用することに頼っています。残念ながら、種間の固有の違いやSIVとHIVの間の違いにこのモデルの主要な制限があります。また、唯一の専門性の高い施設は、cですヒト以外の霊長類での作業を支援するapable、各マカクは、大規模な投資が必要。従って、HIV感染/発症に対して感受性であるヒト免疫系を利用し、より少ない財政法外であるモデルの差し迫った必要性があります。
非肥満糖尿病（NOD）-severe複合免疫不全（SCID）-commonガンマ鎖ノックアウト（Cγ - / - ）（またはNSG）血液/肝臓/胸腺（BLT）ヒト化マウスモデルますます重要なツールであることが証明されていますHIV感染を研究します。造血幹細胞（HSC）および胎児胸腺を移植することにより、マウスが開発し、ヒトの免疫系1-3を再現することができます。幹細胞ベースの遺伝子治療の一つのタイプは、抗原特異的T細胞に分化する造血幹細胞（HSC）を再プログラミングすることによってHIVを標的とするために、末梢T細胞を「リダイレクト」することを含みます。我々は以前に示した、分子クローニングされた抗HIV特異的T細胞の再と工学のHSCSL9エピトープ（アミノ酸77-85; SLYNTVATL）に対する受容体（TCR）は、HIV-1のGagは、ヒト化NSG-BLTマウスモデル6におけるHIVの複製を抑制する成熟T細胞の形成に幹細胞をリダイレクトすることができます。分子クローン化TCRを使用する注意点は、それがこの治療の適用を制限する特定のヒト白血球抗原（HLA）のサブタイプに制限されることです。キメラ抗原受容体（CAR）、一方、普遍すべてのHLAサブタイプに適用することができます。初期の研究は、CD3のドメインを細胞内シグナル伝達ζに融合されたヒトCD4の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインで構成CARを利用して実施された（CD4ζCARと呼ばれます）。 CD4ζCARは、HIVエンベロープを認識し、T細胞受容体7によって媒介されるものと同様である細胞傷害性T細胞応答を誘発することができるCD8 T細胞上に発現しました。我々は最近、ヒトHSCは、複数の造血リーに分化することができるCD4ζCARで修飾することができることを実証しましたヒト化マウスモデル8においてHIV複製を抑制することができる機能的なT細胞を含むneages。癌9ためのキメラ抗原受容体療法、および一本鎖抗体車の構築を可能にする、HIVに対する強力な幅広い中和抗体10-12の継続的な特徴付けの急速な進歩により、それはCD4ζCARに加えて、知覚、多くの新たな候補構築物であります、生成され、HIV疾患および他の疾患の幹細胞ベースの遺伝子治療のためにテストされます。また、これらの抗原特異的な自動車を含むヒト化NSG-BLTマウスモデルはまた、密接に、インビボでのヒトT細胞応答を調べるために有用なツールを提供することができます。ゼラチン状タンパク質混合物中の造血幹細胞が胎児肝幹16の代わりに使用されているという点で重要なことは、我々のプロトコルは、13-15 BLTマウスのヒト化構築のための以前に記載された方法とは異なります。このプロトコルは、説明しますhumaniの1）建設CD4ζCARで操作ZED BLTマウス。 2）遺伝的に改変された細胞の分化の特徴を、 3）遺伝的に改変された細胞の機能性の特徴付けを。
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Protocol
倫理文：ヒト胎児組織は、先端生命科学リソースから、またはNovogenixから入手した情報を識別することなく得られたものであり、その使用のためのIRB承認を必要としませんでした。この原稿に記載された動物の研究は、すべての連邦、州、および地方のガイドラインに従ったカリフォルニア大学ロサンゼルス校、および（UCLA）動物研究委員会（ARC）の書面による承認の下で行われました。具体的には、これらの研究は、国家研究評議会の実験動物の管理と使用に関する指針のガイドライン及び認定および実験動物管理の評価と認定（AALAC）国際協会のガイドラインに厳密に従っ下で行いましたUCLA ARCプロトコル番号2010-038-02B下。すべての手術はケタミン/キシラジンおよびイソフルラン麻酔下で実施し、すべての努力は、動物の痛みや不快感を最小限に抑えるために行われました。
CD4キメラ抗原受容体を用いて操作ヒト化マウスの1建設
- 胎児胸腺を処理し、胎児の肝臓からのCD34 +造血幹細胞の単離
- 胸腺処理
- 穏やかに15 mlのコニカルチューブに、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に胸腺を洗います。繰り返し洗浄ステップ3から4回。
- 7ミリリットルRPMI培地+ 10％FBS +ペニシリン/ストレプトマイシンを追加します。無菌の100ミリメートルペトリ皿にすべてをデカントします。
- 約1mm 2の小片に胸腺をカットするメスを使用してください。 96ウェルプレート上の単一のウェルに一つ一つの胸腺ピースを置きます。 96ウェルプレートに胸腺の作品を転送するときに使用すると、鈍鉗子を湾曲しました。
- 組織が乾燥しないように全てのウェルに - （200μlの100）は、メディアの少量を追加します。顕微鏡下で可視化（胸腺はローブを持っているし、細胞の袋のようになります）。
注：どのような方法で疑わしい見て任意の部分を捨てます。結合組織と、これが注入されるべきではないことが多いです。
- 組織が乾燥しないように全てのウェルに - （200μlの100）は、メディアの少量を追加します。顕微鏡下で可視化（胸腺はローブを持っているし、細胞の袋のようになります）。
- 確認された胸腺片を外し、T25細胞培養フラスコにそれらのすべてを配置します。 10％FBSを補充7ミリリットルRPMI培地と混合するピペラシリン/タゾバクタムとアムホテリシンBを優しく岩フラスコの450μgの/ mlのを追加します。文化37ºC/ 5％CO 2でフラスコ一晩。
注：この手順は、組織の細菌汚染を防止するために必要とされます。 - （オプションの手順）将来の使用のために胸腺をフリーズします。 10分間10％ジメチルスルホキシド（DMSO）で90％ヒトAB血清中のチャンクを平衡化します。 -50ºC、-150ºCに、その後急速冷却に1ºC/分の速度でそれらを凍結。解凍する準備ができたら、速やかに37ºC水浴中で解凍し、穏やかに、DMSOを含まないRPMI完全培地中で3回洗います。
- 肝処理
- 穏やかに50mLのコニカルチューブにPBSで肝臓を洗います。繰り返し洗浄ステップ3から4回。
- 50ミリリットルコニカルチューブに10ミリリットル（イスコフ改変ダルベッコメディア）IMDM培地を追加します。 100ミリメートル滅菌ペトリ皿にすべてをデカントします。
- 2メスを使用して、肝臓組織をホモジナイズします。約3mm 2の小片に肝臓をカット。切り出し、任意の白の結合組織を捨てます。
- 肝臓片とメディアを取るために16ゲージの鈍針を装着した10ミリリットル注射器を使用してください。その後、50ミリリットルコニカルチューブに移します。
- ゆっくりメディアや組織懸濁液を再懸濁し、完全に組織を均質化するために5-7回以上を追放。
- 500 U / mlのコラゲナーゼ、2400 U / mlのヒアルロニダーゼ、及び300 U / mlのDNアーゼと同様に450 / mlのピペラシリン/タゾバクタムとアムホテリシンBの後、0.22μmのフィルタを介してメディアをフィルタ：酵素を補充した10ミリリットルIMDM培地を準備します肝臓懸濁液にメディアを追加。
- 肝臓懸濁液を含む50mlコニカルチューブに蓋をし、そのようなパラフィルムトンなどの自己密封フィルムでしっかりと密封Oリークを防ぎます。 90分間37ºCでインキュベータ内チューブ回転で回転させます。
- 新しい50mlチューブに100μmのセルストレーナーを介して消化された細胞懸濁液をフィルタリングします。
注：50ミリリットルの総容量のアップをもたらすために懸濁液にPBSを追加します。細胞懸濁液を25 mlを含むそれぞれの50mlチューブの2つのチューブにこれを分割します。 - ゆっくりと静かに10ミリリットル密度遠心分離媒体（ 例えば、フィコール）と各チューブに細胞をアンダーレイ。ブレーキなしで20分間、1200×gでスピン。注：このプロトコルに記載されたすべての遠心は、室温（25ºC）で行われます。
- 慎重に各チューブからインターフェイス（ すなわち 、軟膜）を削除して、二つの別々の50mlチューブに移します。 PBSで50ミリリットルまでのインタフェースの各チューブのボリュームを持参。 10分 - 7、300×gでスピン。注意深く上清を吸引。
- 2ペレットを組み合わせます。 2％FBSを含む50 mlのPBSで3回洗浄します。 10メートル - 7のための300×gでスピンたびに慎重に上清を吸引しながら。
- 50ミリリットルRPMI培地+ 10％FBS中でペレットを再懸濁。細胞選別に進む前に、この時点で血球計数器を用いて細胞を数えます。
- ソートCD34 +細胞は、すぐに、製造業者のプロトコルに従って、キット（ 例えば 、CD34マイクロビーズ）を選別CD34を使用します。
注：また、細胞を一晩/ 100万でRPMI培地+ 10％FBS mlの培養することができます。 - CD34 +およびCD34 - 画分の両方を保存します。
注：このステップでは、CD34 +およびCD34-細胞はBambanker凍結メディアまたは他の凍結マスコミを使って凍結することができます。 4の1ミリリットルフリーズ-チューブあたり6×10 6 CD34 +細胞を、1mlの40凍結-チューブあたり60×10 6 CD34-細胞を。
- 胸腺処理
- CD34 +細胞の形質導入
- 6ウェル組織培養プレートの必要な伝達井戸の数を計算します。 1ウェル8×10 6個の細胞まで形質導入するために使用することができます。ために各BLTマウスは、0.5×10 6 CD34 +は腎臓被膜下にCD34-細胞と胸腺と一緒に移植され、0.5×10 6 CD34 +細胞を静脈内注射します。使用するCD34 +細胞の数は、マウス（マウス当たり100万個の細胞）の数によって決定されます。
- コートの非組織培養プレートのウェルの必要数は、組換えヒトフィブロネクチン溶液1.25 mlを6ウェルプレートを処理し（ 例えば 、レトロネクチン）（PBS中に20μg/ mlで）を各ウェルに。プレートをカバーし、それがきれいな生物学的安全キャビネットの中で、室温で2時間放置します。
- ウェルから吸引するフィブロネクチン溶液及び遮断するための各ウェルにFACS緩衝液（4％FBSを含むPBS）の1.25ミリリットルを追加します。プレートを30分間室温（25ºC）で放置します。
- 吸引し、FACS緩衝液およびPBSで一回、ウェルを洗浄します。
- プレートは使用可能な状態になるまで、コーティングしたウェルにPBSを保管してください。すぐに使用しない場合は一晩、4ºCでプレートを保管してください。
- 感染培地でプレートCD34 +細胞（たYssel無血清T細胞培地中の2％ヒト血清アルブミン）、フィブロネクチン溶液でコーティングされたウェル（〜2×10 6細胞/ ml）で1時間、37ºCでインキュベートします。
- 間で感染の多重度（MOI）でウェルにレンチウイルスベクターを追加するために、ピペットを使用して、2 - 10.穏やかに混合し、37ºCで一晩インキュベートします。
注：使用するレンチウイルスベクターの力価は、事前に決定されるべきです。 - 優しく細胞スクレーパーでウェルの底をこすることによって翌朝細胞を採取します。細胞を収集し、この時点で血球計数器でカウントされます。
- インプラントのための細胞を調製するために、マウスあたり4.5×10 6 CD34-細胞、滅菌1.5ミリリットルのスクリューキャップチューブにアリコートと0.5×10 6形質導入CD34 +細胞を兼ね備えています。それらをペレットに300×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引。 300×gで再度スピンし、P10ピペットを用いて任意の残りの上清を吸引し、非常にCAを吸引refully。研究を通して氷の上で乾燥ペレットを保管してください。注：細胞はペレット化した細胞を使用し、2-3時間以内に手術を行う、生存していることを確認するために。
- 注射用の細胞を調製するために、それらをペレットに吸引上清をマウスあたり0.5×10 6形質導入CD34 +細胞をスピン。マウスあたり100μlのRPMI培地中で細胞を再懸濁し、氷上に保ちます。
- 100ng / mlのヒトIL-3、IL-6を補充した200μlのサイトカイン培地（10％FBSを含むRPMI培地、の各条件と文化からの形質導入効率を確認するには、一定分量〜1×10 5非形質導入し、形質導入したCD34 +細胞37ºCで7日 - 5のための96ウェルプレートで、SCF）。
注：その伝達を確実にするが、この工程で使用される細胞は、手術のために使用されていないが成功し、ベクトルは、幹細胞の生存および再生のために毒性ではありません。形質導入効率（GFPおよびCD4が、 例えば ）ベクターの遺伝子発現を探すことによってチェックし、フローサイトメトリーによって分析することができます。
- 遺伝子組み換えマウスを構築するための組織移植
- 手術前の同じ日にセシウム137照射装置および2.7 Gyの（270Rad）の投与量でNOD.Cg- PRKDC SCID IL2RGトンm1Wjl / SzJ（NSG）免疫不全マウスの全身照射を行います。
注：NSGマウスは、重度の免疫不全です。したがって、彼らの住宅やメンテナンスは最高の衛生基準に適合し、高度な訓練を受けたスタッフによって処理されなければなりません。 - 60ミリメートル皿にフラスコから胸腺作品やメディアを注ぎます。トロカールをきれいにし、湿った腎臓を維持するために使用される他の60mm皿にPBSを注ぎます。
- 氷の上に開いて1.5ミリリットルの滅菌スクリューキャップチューブでそれらを配置することによって、正の変位ピペットチップを冷やします。乾燥した細胞ペレットや、マトリゲルなどのゼラチン状タンパク質混合物と氷上で保管してください。
注：ゲル状のタンパク質混合物および任意のチューブを維持することが重要であるかのヒントことインプラント針がロードされるまで、すべての回で、それは寒さに触れます。 - マウスを麻酔：個々のマウスとレコードの重みを計量します。耳は彼らと数匹のマウスをパンチ。ケタミン15μlの（生理食塩水で2.6 mg / mlで）体重1g当たり/キシラジン（生理食塩水で100 mg / mlで））を腹腔内にそれらを注入します。バックケージにマウスを入れて、それが完全に麻酔されるのを待ちます。
注：足を絞ることによって、マウスの麻酔レベルを確認してください。マウスは反射的にフリンチ行動した場合、さらにマウスを麻酔するためにケタミン/キシラジンの元の量の25から50までパーセントを管理します。それは反射的に手術を行うために尻込みしなくなるまで待ちます。 - オスタークリッパー（シェーバー）を使用して、背中の中心と胃の間に肩腰から各マウスの左側を剃ります。皮下動物の肩や鼠径部の三角形（脚ピット）に希釈しカルプロフェン（6ミリグラム/キログラム）の0.3ミリリットルを注入。綿棒を使用して、人工涙液の小滴を入れてそれぞれの目の上に、背面ケージにその側にマウスを置きます。
注：1ケージに手術の準備を制限 - 時（約4〜5匹のマウス）。 - PBSで16ゲージがんインプラント針（トロカール）のカニューレをフラッシュします。鈍曲がったピンセットを使用して、ちょうど開口部内にトロカールとカニューレの開口部に60ミリメートル皿から胸腺の作品を配置し、その後、カニューレに組織を吸引するためにトロカールに引き戻します。
- 乾燥した細胞ペレット（移植された細胞のためのCD34 +およびCD34-混合物）でチューブに冷たいゼラチン状タンパク質混合物の5μLを入れ、軽く細胞懸濁液を生成するために攪拌し、正の変位ピペットとチルドチップを使用してください。アップピペットとダウンしないでください。カニューレの開口部にゲル状のタンパク質の混合物/細胞懸濁液をピペットで、ゆっくりと針をロードするためにトロカールに引き戻します。
注：これは、1インプラントの針を操作しながら、ピペットをロードするためのヘルパーを持っていることをお勧めします。 <LI>ポビドンヨードでマウスの毛を剃っ面積をスワブし、その後アルコールでエリアを拭いてくださいは、3回を拭きます。皮膚の下の最も暗い場所を決定します。これは、脾臓の位置を示しています。腎臓、脾臓に約5ミリメートルの背側です。湾曲した鉗子で皮膚を持ち上げ、脾臓に対する皮膚並列に手術用ハサミで長さ15mmの切開を行います。そして、下の腹膜層で同様のカットをします。男性では、腎臓が簡単に表示されている必要があり、腹部を押すだけで簡単に押し出すことができます。あなたは、止血剤または湾曲鈍ピンセットで腎臓をサポートすることができます。女性で、卵巣が容易な抽出から腎臓をブロックする傾向があります。止血剤を使用して、卵巣をピックアップし、慎重に腎臓を公開します。
- 手術前の同じ日にセシウム137照射装置および2.7 Gyの（270Rad）の投与量でNOD.Cg- PRKDC SCID IL2RGトンm1Wjl / SzJ（NSG）免疫不全マウスの全身照射を行います。
- 腎臓カプセルの後方端に小さな穴を摘み取るために針が先端に付いたピンセットを使用してください。
注：生物学的有害物質を処理するために、これらの針が先端に付いた鉗子を使用しないでください。 - インプラントをスライドさせカニューレの開口部が完全に腎臓被膜で覆われているまで、この穴におよび腎臓に沿って針。
- 静かに腎臓被膜下組織を押し出し、バック針を引き出します。胸腺の作品はとても胸腺片を針で出てこないことを確認するに湾曲鉗子を使用してスティッキーすることができます。
- 鉗子で腹膜を持ち上げ、ゆっくりと元の位置に戻し腎臓をプッシュするために止血剤を使用しています。 4-0ビクリル吸収性縫合糸を使用して、腹膜中1ダブル結ばステッチを接続します。 2オートクリップを使用して皮膚を閉じるには、クリップを巻か。
- 注射のために取っておいた形質導入CD34 +細胞を混合し、インスリン注射器に100μL（0.5×10 6細胞）を取り込みます。後眼窩静脈注射または静脈内注射の他の経路を介してマウスにこれらの細胞を注入します。綿棒を使用して、ケージに戻す側にマウスを各眼に人工涙液の小滴を入れて置きます。
- すべてのマウスは、Bを持っていたら移植EEN、動物は意識を取り戻し、それらを離れる前に、通常ambulatingされていることを確認してください。
- 手術後のケア：手術の翌日、皮下各マウスに滅菌生理食塩水の希釈カルプロフェン（6ミリグラム/キログラム）の0.3ミリリットルと1.2ミリリットルを注入。 2、3日は、皮下、各マウスに滅菌生理食塩水の1.5ミリリットルを注入し、手術を投稿してください。手術後10-14日のためのマウスや切開を監視します。オートクリップを取り外し、10〜14日後のマウスの重量を量ります。注：放射線と生理食塩水の注入が脱水なってから動物を防止した後、マウスが低迷しています。
- 8後 - 10週間、表現しなければならないようなCD45、CD3、CD4、CD8、および任意の遺伝子などのマーカー、ベクターの染色、マウスを出血および末梢血のFACS分析を行うことによって、生着を確認してください。
2.分化の特徴と遺伝子改変細胞の開発
- のキャラクタリゼーション末梢血からの遺伝子改変された細胞
- 8 - レトロ眼窩出血からマウス血液100μlの - 10週間の移植後、50を得ます。 EDTA10μlのを含むマイクロ遠心チューブに配置します。 3分間350×gで遠心分離した細胞。血漿を収集します。マウスがHIVに感染している場合、ELISA分析または血漿ウイルス負荷アッセイのために-80で凍結。
- 赤血球を溶解2mLのNH 4 Clで（83％）溶液を加えます。室温（25ºC）で5分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを埋める10 mlのRPMI 10％FBSを追加します。 5分間、300×gでスピン。注意深く上清を吸引。細胞は免疫染色のために準備ができていると分析し、他のアッセイフローサイトメトリー。
注：ナイーブまたはメモリセルのための様々な造血細胞系統のためのマーカー、活性化、および表現型マーカーは、フローサイトメトリーにより2週間毎にHIV感染の前及び後に測定することができます。ゲイツは、アイソタイプ対照で細胞を染色することによって作成されます。 healtを染色することをお勧めしますHY人間PBMCおよび使用などのポジティブコントロール。あるいは、マウスを安楽死させことができ、末梢血の最大1 mlをフロー分析17の複数のパネルのために十分な細胞を提供する心臓穿刺から得ることができます。
- 脾臓、胸腺および骨髄からの遺伝子改変された細胞のキャラクタリゼーション
- ヒト化BLTマウスから収穫脾臓、胸腺および骨髄
- イソフルランの過剰投与を使用して、マウスを安楽死させます。二頸椎脱臼で安楽死を確認してください。組織に付着する毛を維持するために70％エタノールでカーカスの表面にスプレー。ワックス解剖トレイに手足を突き止めます。
- 手術用はさみを使って、皮膚を切開し、その後体腔を露出するように腹膜層を切断。
- ピンセットを用いて脾臓を削除します。ピンセットやハサミを使って腎臓への胸腺インプラントを削除します。ラベルされたチューブのコンタに胸腺インプラントと脾臓を入れてining 5mlのPBS。
- 半ば腹部から切り取り、下肢をカバーするマウスの先端部分から皮膚を除去。
- はさみを使用して、下肢からの筋肉をカットし、慎重に股関節から寛骨臼を脱臼。大腿骨と脛骨を取り外し、PBSの5ミリリットルを含むチューブに配置します。
- 脾細胞の単離
- 50ミリリットルコニカルチューブに100μmのセルストレーナーを配置します。 10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシン（RPMI完全培地）を添加したRPMI培地の3ミリリットルとストレーナーを濡らします。
- セルストレーナーに脾臓を置きます。 10mLの注射器のゴム製プランジャーを用いて、50mlチューブにストレーナーを介して解離する脾臓をマッシュ。
- 5ミリリットルRPMI完全培地4〜5倍とセルストレーナーを洗浄します。
- 10分間、300×gで細胞をスピン。
- 5ミリリットルで上清を吸引し、ペレットを再懸濁し、赤血球溶解バッファー。部屋のテンペラでインキュベートします10分間チャー。 7分間300×gで20ミリリットルRPMI完全培地とスピンを追加します。
- 10ミリリットルRPMI完全培地中上清を吸引し、ペレットを再懸濁し、100μmのセルストレーナーを通して再び濾過します。血球計数器を用いて細胞を数えます。
注：細胞をex vivoでアッセイに使用することができ、フロー分析およびviably後の使用のために凍結することができます。細胞計数の前に、トリパンブルーは、生存細胞の数を決定することができます。
- インプラントからのヒト胸腺細胞の単離
- 6ウェルプレートのウェルにPBS 5mlに胸腺を置きます。きれいな鈍ピンセットやハサミを使用すると、小片に胸腺をカット。
- ウェルに滅菌したステンレスメッシュの正方形を配置します。 10ミリリットルの注射器のゴム製プランジャーを使用して、胸腺を離れて壊すためにステンレスメッシュ上胸腺作品をマッシュアップ。
- 100μmのセルストレーナーを通してよく、歪みの細胞を再懸濁します。 10分間、300×gで細胞をスピン。10ミリリットルRPMI完全培地中の細胞を一時停止します。塊が表示されている場合は、再度セルストレーナーを通して再懸濁し、細胞を渡します。
- 血球計数器を用いて細胞を数えます。
注：細胞は、フロー分析のために使用され、viably後の使用のために凍結することができます。
- 骨髄由来の細胞の単離
- クリーンおよび70％エタノールで乳鉢と乳棒を殺菌。乳鉢に大腿骨と脛骨を置きます。冷PBSの5ミリリットルを追加します。 PBSは、淡いピンクや曇りになるまで骨を粉砕する乳棒を使用してください。
- 50ミリリットルコニカルチューブに配置され、50μMセルストレーナーを通してモルタルおよびフィルタから流体をピペット。 5ミリリットルのPBSでモルタルを洗浄し、PBSが透明になるまで5回繰り返します。
- 7分間300×gで細胞をスピンダウン。 10ミリリットルRPMI完全培地中上清を吸引および再懸濁。
- 血球計数器を用いて細胞を数えます。
注：細胞をex vivoでアッセイに使用することができ、フロー分析およびviably凍結Fであることができます以降を使用。
- ヒト化BLTマウスから収穫脾臓、胸腺および骨髄
遺伝子改変された細胞の3機能解析
- HIV感染およびウイルス複製オーバータイムの監視
- ヒト免疫系の再構築を確認した後、インスリン注射器を用いて眼窩静脈注射によりHIVウイルスの所望量を注入します。 HIV感染後、2週間毎に眼窩採血を介して、100μlの末梢血を採取。
- 2.1.2 - 一部2.1.1の手順に従って収穫プラズマ。 HIVウイルス量アッセイのために、製造者の指示に従ってRNA抽出キットを用いてウイルスRNAを抽出し、HIVウイルスに適切なプライマーおよびプローブセットを用いてリアルタイムRT-PCRによるウイルス負荷を測定4,8,18,19を使用しました 。
- 細胞関連のHIV RNAを測定し、積極的にHIVに感染した細胞を同定するために、最初のステップ2.1.2以下のRBC溶解を行います
- 1で再懸濁し、細胞懸濁液; mlのPBSは、2つのチューブに均等に分割します。 5分間、300×gでスピン。上清を吸引。
- 細胞関連RNAを測定するために、製造者の指示に従ってRNA抽出キットを用いてRNAを抽出し、適切なプライマーおよびプローブセットを用いてリアルタイムRT-PCRを行います。
注：プライマー/プローブが変更された幹細胞に使用するレンチウイルスを認識しないことが重要です - 流れによってHIVに感染した細胞を測定するために、50μlのFACSの他のチューブで再懸濁細胞は、抗CD45、抗CD4および抗CD3などの所望の抗体を用いた表面の汚れをバッファリングし、実行します。表面染色した後、抗ギャグ抗体（クローンKC57）を使用して、gagの発現のために、細胞内で細胞や汚れを固定し、透過処理。フローサイトメトリーを実行します。
- 脾細胞からの遺伝子改変された細胞のex vivoサイトカインアッセイ
- マウスから収穫脾臓細胞は、セクション2.2.2で説明したように。
- 標的細胞を準備します。機能をテストするにはCD4キメラ抗原受容体修飾されたT細胞の性を、標的細胞としてHIV感染T1細胞を用います。 、サイトカインアッセイの3日前にHIVに感染してT1細胞に感染抗HIVギャグ抗体（クローンKC57）で細胞内の細胞を染色することによってHIV感染を確認。コントロール標的細胞として非感染T1細胞を使用してください。
- 一晩1：1の比率で標的または対照細胞と脾臓細胞を共培養します。最良の結果のために、滴定を行って（1：1、1：3、1：9）エフェクター（脾細胞）の標的細胞対（感染のT1）。例えば、0.25ミリリットルRPMI完全培地に再懸濁0.9、0.3または010万感染T1または未感染のT1を追加し、0.25ミリリットルRPMI完全培地中090万脾細胞を再懸濁します。
- 翌朝は、タンパク質輸送を阻害し、8で前述したように、細胞外マーカーおよびサイトカインの細胞内発現のために染色を行うために6時間タンパク質輸送の阻害剤を加えます。
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Representative Results
図1は、修正された幹細胞とヒトBLTマウスの構築の概要を示します。 10週間の移植手術後、マウスは、遺伝子改変された細胞の分化及び発達を評価するために屠殺しました。 図2に示すように、複数のリンパ組織（血液、脾臓、胸腺および骨髄）CD4ζCARで修飾されたマウスから採取しました。このプロトコルで使用さCD4ζCARは、抗CD4抗体およびGFP 8の発現によって検出することができるCD4キメラ抗原受容体とGFPを含有します。細胞を単離し、ヒトCD45に対する抗体、ならびに抗CD4抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析しました。 GFPおよびCD4二重陽性細胞は、複数のリンパ組織におけるCD4CAR +細胞の存在を示す、検出されました。
遺伝子改変細胞の分化を調べるために、脾細胞は、ヒトCD45（リンパ球）、CD3（T細胞）、CD19（B細胞）、CD14（単球およびマクロファージ）およびCD337（NK細胞）に対する抗体で染色しました。 図3に示すように 、CD4ζCAR造血幹細胞は、複数の系統に分化します。
CD4CAR改変された細胞が機能的であるかどうかを調べるために、我々はCD4CAR細胞（HIV感染T1細胞または対照としての非感染T1細胞）を認識するであろう標的細胞と脾細胞を同時インキュベート。細胞を一晩共培養し、タンパク質輸送の阻害剤は、さらに6時間添加しました。その後、細胞を固定し、そのようなIFNγおよびTNFαなどのサイトカインの細胞内発現のために染色するために透過処理しました。 図4に示すように、CARを発現する細胞は、感染T1細胞をIFNγおよびTNFαのより高い量を産生しました。
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図1：変更された幹細胞を用いたヒト化BLTマウスの構築の概要FT：胎児胸腺。 FL：胎児の肝臓、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：CD4キメラ抗原受容体は、改変された細胞は、複数のリンパ組織中で検出することができる CD4CAR有するマウスは、手術、複数のリンパ組織を回収し、細胞を抗ヒトCD45および抗ヒトCD4抗体で染色した後のHSCは、10週屠殺した修飾。フローサイトメトリーによって分析した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：CD4キメラ抗原受容体修飾された細胞は複数の系統に分化することができます CD4CAR改変マウスからの脾細胞を採取し、ヒトCD45、CD3、CD19、CD14およびCD337に対する抗体で染色し、フローにより分析したフローサイトメトリーで拡大表示こちらをクリックしてください。この図のバージョン。
図4：CD4 CAR + T細胞のex vivoサイトカインアッセイ HIV感染CD4CARマウス由来の脾細胞は、HIV感染または未感染のいずれかのT1細胞を刺激し、サイトカインのそれらの細胞内生産が示されている争うにはこちらをクリックしてください。この図のWA拡大版。
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Discussion
CARおよびHSCベースに設計免疫が臨床研究に向けて勢いを増しと、密接にこれらの操作された細胞の分化と機能を調べるために、適切な動物モデルを有することが重要です。このプロトコルでは、HIVに対する工学的遺伝的に改変された幹細胞とヒト化マウスを構築し、テストするための方法を説明しました。移植の前に、幹細胞の効率的な形質導入を有することが重要です。しかしながら、標的細胞の認識に増殖するT細胞の能力に起因して、幹細胞の修飾の低レベルは、HIV複製8に強い応答を生成するのに十分でした。
それにもかかわらず、幹細胞改変の高いレベルを達成するために、我々は、自己胸腺の代わりに別の場所で13-15に記載されていたマウスの手術のために肝臓および胸腺塊とゲル状のタンパク質の混合物で形質導入したCD34 +細胞を使用することをお勧めします。ゼラチン状のタンパク質の混合物がsolubilizです細胞外マトリックスタンパク質に富む編組織基底膜。通常の生理学的条件下で、ゼラチン状タンパク質混合物は、幹細胞20の効果的な付着および分化を可能にする再構成された、生物学的に活性なおよび安定したマトリックスを生成するために重合します。ヒト細胞の再構成は、眼窩採血によって確認されたと6フローサイトメトリーすることができます - 8週間後に手術。ベクターは、幹細胞の生存および更新のための毒性がないことを保証するためには、1.2.6で説明したように、実験に先立って、CD34 +細胞中のベクターを滴定することをお勧めします。
粘膜感染、一貫性のウイルス血症及び細胞性免疫応答をサポートするために、NSG-BLTマウスモデルの容量は非常に有用なモデルは、HIV感染1を治療するために、HIV免疫病理学および細胞ベースの治療を研究することができます。最も重要なことは、NSG-BLTマウスから生成されたT細胞が運命を調べるために研究を可能にする自己胸腺組織に選択されます胸腺選択8,21の後に遺伝子改変された幹細胞の。記載されている方法では、我々は一貫して40％-90％のヒトの免疫細胞の再構成を取得することができました。人間の細胞の再構成の低レベルの手術や移植のための組織の品質を実行している人のスキルなど、複数の要因に起因することができます。ヒト細胞の再構成の高レベルを達成するために、移植を確実腎臓被膜下に配置されていることを確認することが重要です。また、非常に光学顕微鏡下手術の準備を各胸腺移植片を調べ、疑わしい部分を破棄することをお勧めします。
ヒト化BLTマウスモデルは、HIV（1,15,22に見直さ）に対する工学的な免疫を研究するための有望なツールですが、それは独自の制限があります。すなわち、このモデルは、完全にヒト末梢免疫系を模倣していません。研究は、超変異し、クラススイッチのIgG antiboの障害の発展を示しています1,23 DY。さらに、免疫不全マウスを使用することは技術的に困難であり、健康的なこれらのマウスを維持することは、かなりのリソースやトレーニングを必要とします。微妙な日和見感染症は、試料にわたってとして有意差を発揮し、潜在的な実験にマイナスの結果をもたらす可能性があります。したがって、将来のデータ1,24の整合性を維持するために十分に準備施設や適切な訓練を受けたスタッフを持っていることが重要です。これらの例4,8によって実証されるように心の中でこれらの制限により、ヒト化NSG-BLTマウスモデルは、依然として、幹細胞に基づく工学的免疫の研究のための重要なツールを提供します。
HIV広範な中和抗体10、より効率的なCAR 25のシグナリングドメインの改変に基づくキメラ抗原受容体を開発する傾向と、このモデル及びプロトコルは、遺伝子修飾されたセルの機能を特徴付けし、調査するために使用することができ自動車の新しい世代とのls。また、このモデルは、潜在的に操作された免疫と組み合わせた（ような阻害受容体遮断など）、免疫ベースの治療の研究を収容することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 microbead kit | Miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | For freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| Piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| Sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
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