Introduction
Oprettelse af syntetiske celle størrelse, gigantiske unilamelvesikler (GUVs) er af stigende interesse for in vitro-rekonstruktion af forskellige cellulære processer til at opbygge en ramme for generering af en kunstig celle-lignende system 1,2. Mens GUVs består af lipidmembraner er fremragende efterligner af naturlige, biologiske membraner, de er ustabile mod miljømæssige udsving og har en forholdsvis kort holdbarhed. På grund af disse begrænsninger har amfifile blokcopolymerer blevet anvendt som lipid efterligner til dannelse polymere vesikler eller polymersomes. I denne forbindelse polymersomes fordelagtige i udviklingen af biomimetiske cellesystemer på grund af deres øgede stabilitet 3, kemisk alsidighed 4,5 og modificerbare fysiske træk 6 - 8.
Aktuelle metoder til at danne gigantiske størrelse polymersomes omfatter electroformation 9 og template-rehydrering 10, begge af which er tidskrævende, arbejdskrævende, kræver specialiseret udstyr og producere lave udbytter af intakte gigantiske polymersomes. En simpel gel-assisteret rehydrering metode blev for nylig udviklet til produktion af lipid GUVs 11. Her beskriver vi en tilpasning af gelen-assisteret rehydrering teknik til at skabe gigantiske polymersomes med varierende polymersammensætninger, kontrolleret størrelse og i forskellige buffersammensætninger.
Kort fortalt 1% vægt / volumen standard-DNA-gel-elektroforese agarose film dehydreret på et dækglas. Polymer opløsninger fremstillet i chloroform derefter spredt over dehydreret agarose film og lov til at fordampe. Efter fuldstændig fjernelse af opløsningsmiddel, er polymerfilm rehydreret i bufferen af valg med moderat opvarmning (40-70 ° C) og giant (> 4 um) størrelse polymersomes dannes inden for 30 min. Denne metode hurtigt producerer hundredvis af fuldt intakte, velformede polymersomes bruger standard laboratorieudstyr og reagents på minimale omkostninger.
Figur 1. Skematisk afbilder gel-assisteret rehydrering metode. Giant polymersomes sammensat af en diblokcopolymer dannes efter ~ 30 minutters rehydratisering. Den hydrofile blok betegnes i magenta og den hydrofobe blok betegnes i grøn. Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
1. Polymer og Agarose Fremstilling
Bemærk: Handsker og en lab coat, bør der på alle tidspunkter i hele denne protokol. Beskyttelsesbriller er ligeledes påkrævet under arbejdet med organiske opløsningsmidler eller ethvert skridt med mulig sprøjt.
- Der fremstilles en 5 mg / ml opløsning af polymer i chloroform. Der tilsættes 1 ml chloroform til 5 mg fast poly (ethylenoxid) - b- poly (butadien) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) diblokcopolymer i et hætteglas og hvirvel til opløses fuldstændigt. Udfør alle trin ved hjælp chloroform i et stinkskab.
- Bland i en fluorescens-mærket lipid (købt allerede opløst i chloroform) ved en 0,5 mol% slutkoncentration i 99,5 mol% umærket polymer.
- F.eks pipette ~ 12 pi af en 1 mg / ml fluorescensmærket lipid i chloroform til 997,58 pi PEO-PBD, EO 22 -BD 37 polymer i chloroform (med en molekylvægt på 2.950 Dalton) til en slutkoncentration på 0.5 mol-% mærket lipid blandet og 99,5 mol% polymer.
- Store opløsning i en lufttæt hætteglas med en chloroform-resistent låg ved -20 ° C. Wrap blikkenslagere tape på hætteglas kant, hvor låget skrues på hætteglasset og fastgør låget på hætteglasset. Wrap et stykke blikkenslagere tape på ydersiden af låget og endelig wrap Parafilm på ydersiden af båndet for at sikre minimal fordampning.
- Lav en 1% vægt / volumen agarose-opløsning ved at blande 0,5 mg standard agarose i 50 ml vand (eller 50 ml 100 mM saccharose) i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe. Kog agarose løsning i en standard mikrobølgeovn for ~ 1 min (eller indtil helt opløst som bemærket af rydningen af opløsning).
Bemærk: Den agaroseopløsning kan anvendes efter få minutters afkøling eller lov til at størkne, lagres og smeltet igen under anvendelse af samme procedure.
2. Agarose Film Forberedelse
- Skær enden væk fra en 1.000 pi pipettespids for at forhindre tilstopning. Ved hjælp af cut spids, pipette 300 ul smeltet agaroseopløsning ned på en 25 mm firkantet dækglas direkte fra producenten.
- Tillad agarose afkøle til ~ 65-75 ° C før deposition. Hvis agarose er også cool, vil den begynde at klumpe på overfladen under udbringningen processen. Omvendt, hvis agarose er for varmt, vil det kræve mere spredning at klæbe agarose til overfladen.
- Hold bare kanten af dækglasset med behandskede fingre og bruge den lange kant af en anden 1000 pi pipette spids at sprede agarose jævnt hen over overfladen af dækglasset. Flyt pipettespidsen frem og tilbage over dækglasset indtil agarosen fuldstændigt klæber til og dækker dækglasset.
- Placer agarose-coatet dækglas på et stykke Parafilm med agarose opad. Når det ønskede antal dækglas overtrækkes, anbringes Parafilm med dækglassene i en 37 ° C inkubator til dehydrering af agarose på overfladen i mindst 1 time.
Bemærk: Dehydreringbestemmes ved forsvinden af det synlige lag af agarose; dækglasset skal se fladt og klar. Når filmene er fuldt dehydreret, butik dækglas med agarose opad i en engangs plastik petriskål.
3. Polymer Film Formation
- Pipette 30 pi fremstillet polymeropløsning på agarose film.
- Hold bare kanten af dækglasset med behandskede fingre og bruge den lange kant af en 18 G nål til at sprede løsning på tværs af de agarose film ved hjælp af en cirkulær sprede bevægelse. Fortsæt spredning indtil opløsningen inddampes.
Bemærk: Vær forsigtig med den skarpe ende af nålen. - Placer polymerfilm i en plast Petri-skål polymer opad, og sætte petriskålen i et standardhus vakuumtørreskab dækket i aluminiumsfolie (for at forhindre fotoblegning af det mærkede lipid) i mindst 1 time for at fjerne fuldt eventuelt tilbageværende opløsningsmiddel.
4. Dannelse af Polymersomes
- Klæbe en coverwell, enten en hjemmelavet polydimethylsiloxan (PDMS) godt (an ~ 0,5 cm tyk blok af hærdede PDMS med ~ 1 cm diameter af den midterste udstanset) eller en kommercielt tilgængelig godt til dækglasset overtrukket med polymerfilmen. Tryk coverwell forsigtigt på polymerovertrukne dækglas med polymeren opad indtil en tæt forsegling dannes mellem coverwell og dækglasset. Pas på ikke at trykke for hårdt og bryde dækglasset.
- Tilføj 200-500 pi rehydrering opløsning (vand er fint, men en række buffere eller medier virker også) til kammeret (rehydrering volumen afhænger af størrelsen af coverwell klæbet).
- Skabe et fugtighedskammer for at formindske fordampning af rehydreringsopløsning. Placer en valset, våd Kimwipe langs kanterne af et glas petriskål. Placer polymerfilmen med klæbet coverwell ind fugtighedskammeret og dække med et låg. Dæk petriskål med alufolie for at minimere fotoblegning. Placerepetriskålen på en varmeplade indstillet til 40 ° C i mindst 30 min.
- Juster temperaturen af varmepladen under rehydrering fra 24-70 ° C til at tune størrelse af vesiklerne dannet (figur 5). 70 ° C er nær T m af agarose så der bør udvises forsigtighed, når du fortsætter ud over denne temperatur.
5. Karakterisering af Polymersomes ved fluorescens Recovery efter Fotoblegning (FRAP)
- Flyt dækglasset med den vedhæftede coverwell direkte til et inverteret mikroskop til billeddannelse.
- Vælg den relevante filtersæt baseret på den fluorescerende lipid indbefattet i polymeropløsningen. For Rhodamin-mærkede lipider doteret i polymeropløsninger, bruge et 560/25 nm excitation filter og et 607/36 nm emission filter, eller sammenlignelige filtersæt.
- Brug en 100X olie målsætning at fokusere på den øvre overflade af dækglasset, hvor polymersomes vil blive klæbet. Hvis polymersomes er særligtstore (> 20 um), eller hvis polymerfilmen er for tyk, bør en lavere effekt objektiv (f.eks 40X) anvendes til bedre at visualisere polymersomes.
- Identificer polymersomes hjælp af fluorescens mikroskopi. Identificer polymersomes af den karakteristiske hule, sfærisk vesikel med en diameter> 5 um.
- Karakterisere membranfluiditet anvendelse af fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) på et fluorescensmikroskop indeholdende en justerbar kondensator. På grund af den vedhængende natur og stram pakning af polymersomes på substrater, er naturlig bevægelse af polymersomes begrænset, øge FRAP billedkvalitet.
- Fokus mikroskopet på polymersome af interesse. Luk kondensatoren til et lille område og sikre, at kanten af en polymersome er inden for imaging område af interesse.
- Øge eksponeringen kameraet og sikre, at alle neutrale filtre tæthed fjernes effektivt photobleach regionen af interesse. Tillad membranen fl uorescence intensitet til photobleach i 30-60 sekunder eller indtil fluorescensintensiteten væsentligt reduceret.
- Sluk for lampen og fuldt åbne kondensatoren. Formindsk eksponeringen tilbage til start indstillinger og begynde straks tage billeder hver 30 sek i 3 min.
- Beregn membran diffusionskoefficienter anvendelse af standardmetoder 12. Hvis den blegede region genvinder fluorescensintensiteten i 3-5 min, indikerer dette, at membranen er fluid.
6. Karakterisering af Polymersome Størrelse
Figur 6. Proces for størrelsen analyse af polymersomes hjælp imaging software. Trin-for-trin instruktioner om, hvordan man måler diameteren af vesikler dannes. Brugeren skal kende kalibrering enheder i pixels / um af mikroskopet anvendes.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
- Åbn de erhvervede billeder af polymersomes i billedanalyse software 13.
- Indstil skalaen for billedet ved at klikke på analysere drop down boksen og klikke på "sæt skala".
- Kalibrere skalaen for mikroskopet under anvendelse af standardmetoder (dvs. et mikrometer).
- Udfyld kalibrering enheder, og klik på "ok".
- Klik på linjen værktøjskassen og trække en linje, der spænder over diameteren af en vesikel.
- Saml målinger længde ved at klikke på analysere drop down boksen og klikke "foranstaltning".
- Fortsæt måling enkelte vesikler efter ovenstående procedure og vil blive tilføjet til vinduet målinger data hver ny måling.
- Tryk på "Ctrl + D" efter tegning hver linje og måle længden til at trykke trukket på linjenbillede gør det lettere at spore, hvilke vesikler er blevet analyseret.
Representative Results
Polymersomes blev dannet ved anvendelse af fremgangsmåden ovenfor (figur 1) og den fælles laboratorieudstyr vist i figur 2 skitseret. Polymersomes blev rehydreret med deioniseret vand (figur 3) og afbildes på et omvendt mikroskop i epifluorescens ved anvendelse af en 100X olie mål. Bemærk, at hvis polymersomes ikke er synlige, kan de have dannet på numre for store til at fange med en 100X olie mål; en lavere effekt objektiv muligvis anvendes i stedet. En af fordelene ved at anvende gel-assisteret rehydrering er alsidigheden af dannelse polymersomes i forskellige rehydreringsopløsninger. Polymersomes lykkedes dannet i deioniseret vand, en fuld pattedyrcelle dyrkningsmedium, saccharoseopløsninger og to fysiologisk relevante bufferopløsninger (phosphatpufret saltvand (PBS) eller Tris-bufret saltvand (TBS)), som vist i figur 4. Under standardbetingelser (rehydreringmed vand ved 40 ° C i 1 time), er større end ~ 70 polymersomes typisk findes pr 40 x 40 um 2 synsfelt. Mens overfladen produktion af polymersomes er ikke homogen, der er snesevis af synsfelter med denne repræsentative udbytte. Endvidere polymersomes var stabile i opløsning i mindst 24 timer.
Polymersomes størrelse blev let tunet af rehydratisering polymerfilm ved varierende temperaturer. Polymersomes dannet i deioniseret vand ved stuetemperatur havde en gennemsnitlig diameter på 2,9 ± 0,7 um. Efterhånden som temperaturen stiger under rehydrering, den gennemsnitlige størrelse af de polymersomes øger også (tabel 1). Ved høje temperaturer (> 60 ° C), polymersomes dannet med størrelser endnu større end 100 pm (figur 5).
Alle billedbehandling blev afsluttet ved hjælp af open source imaging software (figur 6).Billeder opsamlede blev åbnet i programmet. Den kalibrerede pixelstørrelse blev indgået indstillet skala kassen. Ved hjælp af linje værktøj, blev linjer trukket på tværs af diametre. Efter hver enkelt linie blev trukket, blev den kalibreret længde måles og sættes til resultaterne boksen. Data kan derefter plottes i den matematiske software valg (f.eks Excel, Prism, Origin, etc.)
. Figur 2. Billede af de fælles og billige lab nødvendige materialer til dannelsen af polymersomes De emner, der kræves er: Parafilm, en 18,5 G nål, polymer i chloroform eller et andet passende opløsningsmiddel, en 1000 pi pipettespids, en Erlenmeyerkolbe, pincet, agarose, 25 mm kvadratiske dækglas, PDMS imaging brønde og et glas petriskål. klik her for atse en større version af dette tal.
Figur 3. Billeder af gelen-assisteret rehydrering metode. Opløst agarose er spredt på en 25 mm firkantet dækglas indtil en endnu film frakker hele dækglas. Dækglas derefter anbragt i en 37 ° C inkubator og film dehydreres. En polymeropløsning deponeres på dehydreret agarose film og spredes under anvendelse af en nål i en cirkulær bevægelse. Den dækglas derefter placere i en ekssikkator O / N til fuldt ud at fordampe eventuelle rester af opløsningsmidler. Endelig og billedbehandling kammer klæbes til underlaget og polymerer hydreret med løsning af valg og placeret i en petriskål ved 40 ° C i mindst 25 minutter for at give mulighed for dannelse af polymersomes. Klik her for at se en større version af denne figur. >
Figur 4. Polymersomes kan dannes i en række forskellige puffere. PEO-PBD polymerfilm blev rehydreret med den angivne puffer ved 40 ° C i 1 time. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Forøgelse af temperaturen under rehydrering øger størrelsen af polymersomes. Repræsentative epifluorescens billeder af polymersomes dannet i vand ved de angivne rehydrering temperaturer. Stigende temperatur resulterer i større polymersomes. Scale bar = 10 um._blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Temperatur (° C) | Gennemsnitlig størrelse (um) |
| 24 | 2,93 ± 0,7 |
| 40 | 5,76 ± 2,5 |
| 50 | 6,65 ± 2,4 |
| 60 | 11,46 ± 5,8 |
| 70 | 14.04 ± 7,0 |
Tabel 1. Øge temperaturen under rehydrering resulterer i forøget polymersome størrelse. Gennemsnitlige diametre større end 100 polymersomes i vand per forskellig temperatur tilstand blev beregnet og er afbildet her. Fejl er standardafvigelsen.
Discussion
Polymersomes er ved at blive almindeligt udforskes som biologiske membran efterligner. De robuste og alsidige egenskaber af polymerer gøre dem bredt attraktivt for undersøgelser, der kræver membran funktionalisering, lang levetid og tunet lydhørhed. Traditionelle metoder til at danne gigantiske størrelse polymersomes 9,10 (> 4 um) er arbejdskrævende og kræver dyrt og specialiseret udstyr. Her præsenterer vi for første gang, en hurtig, alsidig og robust fremgangsmåde til dannelse gigantiske størrelse polymersomes anvendelse af standard billige laboratoriereagenser og udstyr.
Brug af gel-assisteret rehydrering, kan unilamellare polymersomes dannes hurtigt (<30 min), i en række forskellige rehydreringsopløsninger (herunder cellekulturmedier) og med en række forskellige polymerer (data ikke vist). Dannelsen af multilamellare eller asymmetriske vesikler blev ikke observeret med denne teknik. I hele dette arbejde anvendte vi poly (ethylenoxid) - b- poly (butadien) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) neutral diblokcopolymer. Mange forskellige polymersammensætninger (herunder ladede diblokcopolymerer) fungerer godt ved hjælp af denne metode (ikke vist). Men nogle kommercielt tilgængelige triblokcopolymerer og højere molekylvægt diblokcopolymerer (~> 5000 dalton) ikke danner distinkte polymersomes. For alle eksperimenterne i dette manuskript blev en lav koncentration af mærket lipid doteret ind polymeropløsningerne udelukkende til visualisering. kan også anvendes andre metoder til visualisering, herunder polymerer direkte funktionaliseret med et fluorescerende farvestof. Polymersomes kan ligeledes afbildet med lysfeltmikroskopi, selvom fluorescensmikroskopi giver større opløsning.
De fleste mindre ændringer af protokollen typisk ikke ændrer resultater. For eksempel vil små forskelle i koncentration af polymeropløsningen spredes på dækglassene ikke ændre dannelsen af polymeren film dannet. Mens den komplette koncentrationsområde ikke blev bestemt, vil polymersome dannelse held forekomme med et stort udvalg af polymere film koncentrationer (f.eks 1-10 mg / ml). Men der er nogle protokol ændringer, der negativt påvirker polymersome formation. Det mest bemærkelsesværdige er, at runde dækglas (i stedet for firkantede) resultat i meget dårlig dannelse af polymersomes. Vi forklarer det med den ekstremt jævnt lag agarose på glasset som faktisk hindrer dannelsen af polymersomes.
En af de mest bemærkelsesværdige udfordringer ved denne teknik er evnen til at inddrive polymersomes fra overfladen med et højt udbytte. Der er visse tilfælde, hvor fjernelse af polymersomes fra den oprindelige overflade kan være fordelagtig. På grund af den høje baggrund fluorescens fra dehydreret polymerfilm, fjerne individuelle polymersomes og klæbe dem at rense dækglas vil øge billedkvalitet og karakterisering (particularly under FRAP analyse). For at gøre dette, forsigtig pipettering med en pipettespids, hvor tanden er afskåret vil desorbere polymersomes fra overfladen (selv om antallet af vesikler genvundne er betydeligt lavere end de oprindeligt dannet). Polymersomes kan derefter placeres på modificerede dækglas overflader, hvilket tillader polymersome at interagere med den nye dækglas. Typisk for neutrale PEO-PBD polymersomes, dækglassene behandlet med ozon i 15 minutter tillade polymersomes at falde ned til overfladen til billeddannelse. Forskellige overflade ændring er påkrævet for forskellige polymersome kompositioner (fx negativt eller positivt ladede polymerer).
De fleste materialer, der anvendes i denne protokol med succes lagres og bruges til dage til uger. Den størknede agarose kan reboiled og genbruges indtil agarosen begynder at have aggregater selv efter kogning, eller den størknede agarose begynder at tørre. Dækglas med tørrede agarose film kan lagres og anvendelsed ubestemt tid (f.eks måneder). Polymeren opløst i chloroform kan opbevares ved -20 ° C i flere måneder. Når polymerfilmen tørres på agarose film, imidlertid brug filmene skal opbevares under husvakuum og anvendes inden for to uger (længere tids opbevaring blev ikke direkte bestemmes, men der er tydelige forskelle i polymersomes dannet af polymerfilm ældre end to uger).
Brug af gel-assisteret rehydrering protokol præsenteres her, er hundreder af ensartet formede polymersomes dannet hurtigt med blot et par timers arbejde ved hjælp af standardudstyr og billige laboratoriereagenser. Endvidere kan polymersomes dannes i en række fysiologiske pufferopløsninger og fra forskellige polymersammensætninger (ikke vist). Mindre ændringer af metoden ikke negativt ændrer dannelsen af polymersomes, rendering gel-assisteret rehydratisering en alsidig og tilgængelig teknik til forskere med varierende teknisk expertise.
Evnen til nemt at oprette gigantiske polymersomes på størrelsen omfanget af celler er afgørende for opbygningen af kunstige celle-lignende systemer. Brugervenligheden og alsidighed gel-assisteret rehydrering at gøre disse polymersomes byder på et stort avancement i biomimetiske vilkår for oprettelsen af robuste celle-membran efterligner. For eksempel ved anvendelse af denne teknik, strategier til indkapsling af forskellige intracellulære komponenter, funktionalisering af polymeren med celle-membran proteiner og inkorporering af membrantransportproteiner, for blot at nævne nogle få, kan designes til at bygge polymersome-baserede kunstige celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 ml Erlenmeyer flask | VWR | 89000-360 | |
| 18 guage needle | VWR | BD-305196 | |
| 25 mm square coverslips | VWR | 48366-089 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | A standard agarose for DNA gel electrophoresis |
| Chloroform | Sigma | 288306-2L | |
| Commerical coverwell | Electron Microscopy Sciences | 70336 | Press-to-Seal Silicone Isolators |
| Fiji Image Analysis Software | ImageJ | Free Download: http://fiji.sc/Fiji | |
| Glass vial with Teflon Lid | VWR | 66009-556 | 1.9 ml capacity, case of 144 |
| Liss-rhodamine B PE Lipid | Avanti Polar Lipids | 810150C | 1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | 10.2 cm x 38.1 m |
| poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940) | Polymer Source | P2904-BdEO | http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf |
| Pastic Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Teflon tape | VWR | 300001-057 | 1/2" width |
References
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments. Nanoscale. , (2015).
- Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a, Bates, F. S., Discher, D. E. Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability. Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).
- Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups. Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).
- Egli, S., et al. Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes. J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).
- Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers. Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).
- Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors. Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).
- Henderson, I. M., Paxton, W. F. Salt, shake, fuse - Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).
- Discher, B. M. Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
- Howse, J. R., et al. Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions. Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).
