Introduction
Opprettelse av syntetiske celle størrelse, gigantiske unilamellære vesikler (GUVs) er å øke interessen for in vitro oppbyggingen av ulike cellulære prosesser for å bygge et rammeverk for generering av en kunstig celle-lignende system 1,2. Mens GUVs består av lipid membraner er gode etterligner av naturlige, biologiske membraner, de er ustabile mot miljøsvingninger og har en ganske kort holdbarhet. På grunn av disse begrensninger har amfifile blokk-kopolymerer vært brukt som etterligner lipid for å danne polymer-vesikler eller polymersomes. Innenfor denne konteksten, polymersomes er en fordel i utviklingen av biomimetic cellesystemer på grunn av deres økt stabilitet 3, kjemisk allsidighet 4,5 og modifiserbare fysiske egenskaper 6 - 8.
Dagens metoder for å danne gigantiske størrelse polymersomes inkluderer electroformation 9 og malbasert rehydrering 10, begge which er tidkrevende, arbeidskrevende, krever spesialisert utstyr og produsere lave utbytter av intakte gigantiske polymersomes. En enkel gel-assistert rehydratisering metoden ble nylig utviklet for fremstilling av lipid GUVs 11. Her beskriver vi en tilpasning av den gel-assistert rehydrering teknikk for å lage store polymersomes med varierende polymerblandinger, kontrollert størrelse, og i forskjellige bufferblandinger.
I korthet, blir 1% vekt / volum av standard DNA-gel-elektroforese agarose filmer dehydratisert på et dekkglass. Polymeroppløsninger fremstilt i kloroform blir deretter spredt over dehydrert agarose film og tillatt å fordampe. Etter fullstendig fjerning av løsningsmiddel, blir polymerfilmer rehydrert i buffer av valg med moderat oppvarming (40-70 ° C) og gigant (> 4 mm) størrelse polymersomes blir dannet i løpet av 30 min. Denne metoden produserer raskt hundrevis av helt intakt, velformede polymersomes med standard laboratorieutstyr og Reagents på minimale kostnader.
Figur 1. Skjematisk viser den gel-assistert rehydrering metode. Giant polymersomes sammensatt av en diblokk-kopolymer som er dannet etter ~ 30 minutter for rehydratisering. Den hydrofile blokk er angitt i magenta og den hydrofobe blokk betegnes i grønt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
1. Polymer og Agarose Forberedelse
Merk: Hansker og labfrakk skal til enhver tid gjennom hele denne protokollen. Vernebriller er likeledes nødvendig under arbeid med organiske løsemidler eller takt med mulig sprut.
- Fremstille en 5 mg / ml oppløsning av polymer i kloroform. Tilsett 1 ml kloroform til 5 mg fast poly (etylenoksyd) - b- poly (butadien) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) diblokk-kopolymer i et hetteglass og virvel til fullt ut å oppløse. Utfør alle trinn ved hjelp kloroform i avtrekksskap.
- Bland i en fluorescensmerket lipid (kjøpt som allerede er oppløst i kloroform) med en 0,5 mol% endelig konsentrasjon på 99,5 mol% umerket polymer.
- For eksempel, pipette ~ 12 pl av en 1 mg / ml fluorescensmerkede lipid i kloroform til 997,58 ul PEO-PBD, EO 22 -BD 37 polymer i kloroform (med en molekylvekt på 2950 dalton) til en endelig konsentrasjon på 0.5 mol% merket lipid blandet og 99,5 mol% polymer.
- Lagres oppløsning i en lufttett flaske med en kloroform-resistente lokk ved -20 ° C. Pakk rørleggere tape på hettekanten der lokket skruer på flasken og fest lokket på glasset. Vikle en annen del av rørleggere bånd på utsiden av lokket og til slutt vikle Parafilm på utsiden av båndet for å sikre minimal fordampning.
- Lage en 1% w / v agarose løsning ved å blande 0,5 mg standard agarose i 50 ml vann (eller 50 ml 100 mM sukrose) i en 250 ml Erlenmeyerkolbe. Kok agarose løsning i en standard mikrobølgeovn for ~ 1 min (eller til den er helt oppløst som nevnt av clearing av løsningen).
Merk: agarose oppløsning kan brukes etter noen minutter med avkjøling eller tillates å størkne, lagres og re-smeltet ved bruk av den samme prosedyre.
2. Agarose Film Forberedelse
- Skjær slutten av av en 1000 mL pipette tips for å hindre tilstopping. Bruke kuttet spissen, pipette 300 mL av smeltet agarose løsning mot en 25 mm firkantet glass dekk direkte fra produsenten.
- Tillat agarose avkjøles til ~ 65-75 ° C før deponering. Hvis agarose er også kult, vil den begynne å klumpe seg på overflaten i løpet av spredningsprosessen. Derimot, hvis agarose er for varmt, vil det kreve mer spredning for å feste agarose til overflaten.
- Hold bare kanten av dekkglass med hansker fingre og bruker langsiden av en annen 1000 mL pipette for å spre agarose jevnt over overflaten av dekkglass. Flytt pipettespissen frem og tilbake over dekkglass til agarose helt holder og dekker dekkglass.
- Plasser agarose-belagte dekkglass på et stykke av Parafilm med agarose vendt opp. Når det ønskede antall Dekkglass er belagt, plasseres Parafilm med objektglassene i en 37 ° C inkubator for å dehydratisere agarose på overflaten i minst 1 time.
Merk: Dehydreringbestemmes ved forsvinningen av det synlige laget av agarose; dekkglass bør se flat og klar. Når filmene er helt dehydrert, Dekk butikken med agarose siden opp i en engangs plast petriskål.
3. Polymer Film Formation
- Pipetter 30 pl stilles polymeroppløsning på agarose film.
- Hold bare kanten av dekkglass med hansker fingre og bruker langsiden av en 18 G nål til å spre løsningen over agarose filmene ved hjelp av en sirkulær spredning bevegelse. Fortsett å spre inntil oppløsningen inndampes.
Merk: Vær forsiktig med den skarpe enden av nålen. - Plasser polymerfilmer i en petriskål av plast polymer side vender opp og sette den petriskål inn i et standard hus vakuumeksikator dekket med aluminiumsfolie (for å hindre fotobleking av den merkede lipid) i minst 1 time for å fullstendig fjerne eventuelt resterende oppløsningsmiddel.
4. Dannelse av Polymersomes
- Følge en coverwell, enten en hjemmelaget polydimetylsiloksan (PDMS) samt (AN ~ 0,5 cm tykk blokk av herdede PDMS med ~ 1 cm diameter av den midtre utstanset) eller et kommersielt tilgjengelig godt til dekkglass belagt med polymerfilmen. Trykk på coverwell forsiktig ned på polymer-belagte dekkglass med polymeren vendt opp til en tett forsegling dannes mellom coverwell og dekkglass. Vær forsiktig så du ikke trykker for hardt og bryte dekkglass.
- Legg 200-500 ul rehydrering løsning (vann er bra, men en rekke buffere eller medier fungerer også) til kammeret (rehydrering volum avhenger av størrelsen av den coverwell følges).
- Skape et fuktighetskammer for å redusere avdamping av rehydrering løsning. Plasser en rullet, våt Kimwipe langs kantene av et glass petriskål. Plasser polymerfilmen med den klebet coverwell inn i fuktighetskammeret og dekkes med et lokk. Dekk petriskål med aluminiumsfolie for å minimere photobleaching. Plasspetriskål på en varm plate innstilt på 40 ° C i minst 30 min.
- Juster temperaturen på varmeplaten ved rehydratisering 24-70 ° C for å justere størrelsen av vesiklene er dannet (figur 5). 70 ° C er i nærheten av T m av agarose så forsiktighet bør brukes når du fortsetter utover denne temperaturen.
5. Karakterisering av Polymersomes ved fluorescens gjenoppretting etter fotobleking (FRAP)
- Flytt dekkglass med levd coverwell direkte til en invertert mikroskop for bildebehandling.
- Velge den riktige filtersettet basert på den fluoriserende lipid inkludert i polymerløsningen. For rhodaminmerkede lipider dopet inn i polymerløsninger, bruk en 560/25 nm eksitasjon filter og en 607/36 nm utslipp filter, eller sammenlignbare filtersett.
- Bruk en 100X olje-objektiv for å fokusere på den øvre overflate av dekkglass hvor polymersomes blir overholdt. Hvis polymersomes er spesieltstor (> 20 pm) eller hvis polymerfilmen er for tykk, bør et lavere effekt objektiv (f.eks 40X) anvendes for å bedre visualisere polymersomes.
- Identifiser polymersomes bruker fluorescens mikroskopi. Identifisere polymersomes ved den karakteristiske hule, sfæriske vesikler med en diameter på> 5 um.
- Karakter membranfluiditet med fluorescens restitusjon etter fotobleking (FRAP) på et fluorescens mikroskop som inneholder en justerbar kondensator. På grunn av den heftende natur og tett pakking av polymersomes på underlag, er naturlig bevegelse av polymersomes begrenset, øker FRAP bildekvalitet.
- Fokus mikroskopet på polymersome av interesse. Lukk kondensatoren til en liten region og sørge for at kanten av en polymersome er innenfor bildebehandling regionen av interesse.
- Øk kameraet eksponering og sikre alle nøytral tetthet filtre er fjernet for å effektivt photobleach regionen av interesse. Tillat membranen fl uorescence intensitet til photobleach i 30-60 sekunder eller inntil fluorescensintensiteten er betydelig redusert.
- Slå av lampen og fullt åpne kondensatoren. Redusere eksponeringen tilbake til startinnstillingene og starter umiddelbart å ta bilder hvert 30. sekund i 3 min.
- Beregn membran Diffusjonskoeffisientene bruker standardmetoder 12. Hvis bleket regionen gjenvinner fluorescens intensitet i 3-5 min, indikerer dette at membranen er flytende.
6. Karakterisering av Polymersome Size
Figur 6. Prosess for størrelsen analyse av polymersomes bruker bildebehandlingsprogrammer. Steg-for-steg instruksjoner om hvordan man kan måle diameteren på vesikler dannet. Bruker må vite kalibreringsenheter i piksler / um av mikroskopet brukes.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Åpne de oppkjøpte bilder av polymersomes i bildeanalyse programvare 13.
- Sette skalaen for bildet ved å klikke på analysere rullegardinlisten og klikke "set skala".
- Kalibrer målestokk for mikroskopet ved bruk av standard metoder (dvs. et mikrometer).
- Fyll ut kalibreringsenheter og klikk "ok".
- Klikk på linjen verktøykasse og trekke en linje som strekker seg over diameteren på en vesikkel.
- Samle lengdemålinger ved å klikke på analysere rullegardinlisten og klikke på "tiltak".
- Fortsett å måle individuelle vesikler følgende fremgangsmåten ovenfor, og hver ny måling vil bli lagt til målinger data vinduet.
- Trykk "Ctrl + D" etter tegning hver linje og måle lengden å innprente linjen trukket påimage som gjør det lettere å spore hvilke vesikler er blitt analysert.
Representative Results
Polymersomes ble dannet ved anvendelse av prosedyren beskrevet ovenfor (figur 1) og det vanlige laboratorieutstyr er vist på figur 2. Polymersomes ble rehydrert med deionisert vann (figur 3) og avbildes på et invertert mikroskop i epifluorescens ved hjelp av en 100X olje-objektiv. Merk at hvis polymersomes ikke er synlige, kan de ha dannet på størrelser for store til å fange opp med en 100X olje mål; en lavere effekt objektiv kan trenge å bli brukt i stedet. En av fordelene ved bruk av gel-assistert rehydrering er allsidigheten av å danne polymersomes i en rekke rehydrering løsninger. Polymersomes ble med hell dannet i deionisert vann, en hel pattedyrcellekulturmedium, sukrose-løsninger og to fysiologisk relevante bufferløsninger (fosfat-buffret saltvann (PBS) eller Tris-bufret saltvann (TBS)), som vist i figur 4. Under standardbetingelser (rehydreringmed vann ved 40 ° C i 1 time), er større enn ~ 70 polymersomes typisk finnes per 40 x 40 mikrometer 2 synsfelt. Mens overflaten produksjon av polymersomes er ikke homogent, er det dusinvis av synsfelt med denne representanten yield. Videre polymersomes var stabile i løsningen i minst 24 timer.
Polymersomes størrelse var lett innstilt ved å rehydrere polymer filmer ved varierende temperaturer. Polymersomes dannet i avionisert vann ved romtemperatur hadde en gjennomsnittlig diameter på 2,9 ± 0,7 um. Etter hvert som temperaturen øker i løpet rehydratisering, er den gjennomsnittlige størrelse av de polymersomes øker også (tabell 1). Ved høye temperaturer (> 60 ° C), polymersomes dannet med størrelser og med større enn 100 um (figur 5).
All bildebehandling ble gjennomført ved hjelp av open-source bildebehandlingsprogrammer (figur 6).Bilder samlet inn ble åpnet i programmet. Den kalibrerte pikselstørrelse ble inngått satt skala boksen. Ved hjelp av linjeverktøyet, ble linjene trukket over diameter. Etter hver enkelt linje ble trukket, ble kalibrert lengde målt og lagt til resultater boksen. Data kan deretter bli plottet i matematisk programvare av valg (for eksempel Excel, Prism, Origin, etc.)
Fig. 2. Bilde av de vanlige og rimelige lab materialer som kreves for dannelsen av polymersomes De elementer som kreves er: Parafilm, en 18,5 G nål, polymer i kloroform eller et annet passende oppløsningsmiddel, et 1000 mL pipettespiss, en Erlenmeyerkolbe, pinsett, agarose, 25 mm firkantDekk, PDMS bildebehandling brønner og et glass petriskål. klikk her for åse en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Bilder av gel-assistert rehydrering metoden. Oppløst agarose er spredt på et 25 mm firkantet dekk til en enda film strøk hele dekk. Dekk blir deretter satt inn i en 37 ° C inkubator og film er dehydrert. En polymeroppløsning avsettes på dehydrert agarose film og spres ved hjelp av en nål i en sirkulær bevegelse. Dekk deretter plassere i et tørke O / N for å fullt fordampe eventuelle løsemiddelrester. Til slutt, og bildebehandling kammeret er festet til underlaget og polymerer blir utvannet med løsning av valg og plassert i en petriskål ved 40 ° C i minst 25 min for å tillate dannelsen av polymersomes. Klikk her for å se en større versjon av denne figur. >
Figur 4. Polymersomes kan dannes i en rekke forskjellige buffere. PEO-PBD-polymerfilmer ble rehydrert med den angitte buffer ved 40 ° C i 1 time. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Ved å øke temperaturen i løpet av rehydrering øker størrelsen på de polymersomes. Representative epifluorescens bilder av polymersomes dannet i vann ved de angitte temperaturer rehydrering. Økende temperatur gir større polymersomes. Scale bar = 10 mikrometer._blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Temperatur (° C) | Gjennomsnittlig størrelse (mm) |
| 24 | 2,93 ± 0,7 |
| 40 | 5,76 ± 2,5 |
| 50 | 6,65 ± 2,4 |
| 60 | 11.46 ± 5,8 |
| 70 | 14.04 ± 7,0 |
Tabell 1. Ved å øke temperaturen i løpet av rehydrering fører til økt polymersome størrelse. Gjennomsnittlig diameter større enn 100 polymersomes i vann per forskjellig temperaturforhold ble beregnet og er vist her. Feil er standardavviket.
Discussion
Polymersomes blir allment utforsket som biologisk membran etterligner. Den robuste og allsidige egenskaper polymerer gjøre dem allment attraktivt for studier som krever membran funksjon, lang levetid og innstilt reaksjonsevne. Tradisjonelle metoder for dannelse av kjempestore polymersomes 9,10 (> 4 um), er arbeidskrevende og krever kostbart og spesialisert utstyr. Her presenterer vi for første gang, en hurtig, fleksibel og robust fremgangsmåte for å danne store størrelse polymersomes ved bruk av standard laboratorierimelige reagenser og utstyr.
Ved hjelp av gel-assistert rehydrering kan unilamellære polymersomes dannes raskt (<30 minutter), i en rekke av rehydrering-løsninger (inkludert cellekulturmedier) og med en rekke forskjellige polymerer (data ikke vist). Dannelse av multilamellære vesikler eller asymmetriske ble ikke observert ved anvendelse av denne teknikken. Gjennom dette arbeidet har vi brukt poly (etylenoksyd) - b- poly (butadien) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) nøytral diblokk copolymer. Mange forskjellige polymermaterialer (herunder belastet diblokk kopolymerer) fungerer godt sammen med denne metoden (ikke vist). Men noen kommersielt tilgjengelige triblokk kopolymerer og høyere molekylvekt diblokk kopolymerer (~> 5000 dalton) ikke danner distinkte polymersomes. For alle forsøkene i dette manuskriptet, ble en lav konsentrasjon av merket lipid dopet inn i polymerløsninger for visualisering formål. Andre metoder for visualisering, inkludert polymerer direkte funksjonalisert med et fluorescerende fargestoff kan også brukes. Polymersomes kan også avbildes med lyse felt mikroskopi, men fluorescens mikroskopi gir større oppløsning.
De fleste mindre endringer i protokollen vanligvis ikke endre resultatene. For eksempel, små forskjeller i konsentrasjonen av polymeroppløsningen spredd på objektglassene ikke forandre dannelsen av polymeren fILM dannet. Mens den kompkonsentrasjonsområdet ikke ble bestemt, vil polymersome formasjon med hell forekomme med et stort utvalg av polymerfilm konsentrasjoner (for eksempel, 1-10 mg / ml). Det er imidlertid noen protokoll endringer som negativt påvirker polymersome formasjon. Det mest bemerkelsesverdige er at runde dekkglass (i stedet for firkantet) resultat i svært dårlig dannelsen av polymersomes. Vi tilskriver dette til ekstremt jevnt lag med agarose på glasset som faktisk hindrer dannelsen av polymersomes.
Ett av de mest bemerkelsesverdige utfordringene i denne teknikk er muligheten til å gjenopprette polymersomes fra overflaten med et høyt utbytte. Det er visse tilfeller der fjerne polymersomes fra den opprinnelige overflate kan være fordelaktig. På grunn av den høye bakgrunn fluorescens fra dehydrert polymerfilm, fjerne individuelle polymersomes og følge dem til å rydde Dekk vil øke bildekvalitet og karakterisering (partisielt under FRAP analyse). For å gjøre dette, forsiktig pipettering med en pipette tips som til slutt har blitt kuttet vil desorbere polymersomes fra overflaten (om antallet vesikler gjen er betydelig lavere enn de opprinnelig dannet). Polymersomes kan deretter plasseres på modifiserte dekkflater, slik at polymersome å samvirke med den nye dekkglass. Typisk for nøytrale PEO-PBD polymersomes, Dekkglass ble behandlet med ozon i 15 minutter tillate polymersomes til å falle ned til overflaten for avbildning. Ulike overflatemodifikasjon kreves for ulike polymersome komposisjoner (f.eks negativt eller positivt ladet polymerer).
De fleste materialer som brukes i denne protokollen er med hell lagres og brukes i flere dager til uker. Den størknede agarose kan kokes og gjenbrukes til agarose begynner å ha aggregater selv etter koking, eller den størknede agarose begynner å tørke. Dekkglass med tørkede filmer agarose kan lagres og brukend ubestemt tid (f.eks måneder). Polymeren ble oppløst i kloroform kan oppbevares ved -20 ° C i flere måneder. Når polymerfilmen tørkes på agarose filmene, men filmene må lagres under husvakuum og brukes innen to uker (lengre tids lagring er ikke direkte bestemt, men det er merkbare forskjeller i polymersomes dannet fra polymerfilmer som er eldre enn to uker).
Bruke gel-assistert rehydrering protokoll som presenteres her, er hundrevis av jevnt-formet polymersomes dannet seg raskt med bare noen få timer med arbeid ved hjelp av standard utstyr og rimelig laboratoriereagenser. Videre kan polymersomes være utformet i en rekke fysiologiske bufferløsninger og fra forskjellige polymermaterialer (ikke vist). Mindre endringer i fremgangsmåten ikke negativt forandre dannelsen av polymersomes, slik at gel-assistert rehydrering en allsidig og tilgjengelig teknikk for å forskere med varierende teknisk expertise.
Muligheten til å enkelt lage gigantiske polymersomes på størrelsen omfanget av cellene er viktig for å bygge kunstige cellelignende systemer. Brukervennligheten og allsidigheten til gel-assistert rehydrering å gjøre disse polymersomes tilbyr et stort fremskritt i biomimetic feltet for etablering av robuste cellemembran etterligner. For eksempel, ved bruk av denne teknikken, strategier for innkapsling av forskjellige intracellulære komponenter, funksjonalisering av polymeren med celle-membran-proteiner og inkorporering av membrantransportproteiner, bare for å nevne noen, kan være konstruert for å bygge polymersome baserte kunstige celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 ml Erlenmeyer flask | VWR | 89000-360 | |
| 18 guage needle | VWR | BD-305196 | |
| 25 mm square coverslips | VWR | 48366-089 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | A standard agarose for DNA gel electrophoresis |
| Chloroform | Sigma | 288306-2L | |
| Commerical coverwell | Electron Microscopy Sciences | 70336 | Press-to-Seal Silicone Isolators |
| Fiji Image Analysis Software | ImageJ | Free Download: http://fiji.sc/Fiji | |
| Glass vial with Teflon Lid | VWR | 66009-556 | 1.9 ml capacity, case of 144 |
| Liss-rhodamine B PE Lipid | Avanti Polar Lipids | 810150C | 1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | 10.2 cm x 38.1 m |
| poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940) | Polymer Source | P2904-BdEO | http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf |
| Pastic Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Teflon tape | VWR | 300001-057 | 1/2" width |
References
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments. Nanoscale. , (2015).
- Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a, Bates, F. S., Discher, D. E. Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability. Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).
- Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups. Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).
- Egli, S., et al. Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes. J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).
- Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers. Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).
- Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors. Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).
- Henderson, I. M., Paxton, W. F. Salt, shake, fuse - Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).
- Discher, B. M. Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
- Howse, J. R., et al. Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions. Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).
