Introduction
Creación de vesículas sintéticas, de tamaño de células gigantes unilamelares (GUVs) es de creciente interés en la reconstrucción in vitro de diferentes procesos celulares para construir un marco para la generación de un sistema de célula de 1,2 como artificial. Mientras GUVs compuestas de membranas lipídicas son excelentes imitadores de membranas naturales, biológicos, que son inestables frente a las fluctuaciones ambientales y tienen una vida útil bastante corta. Debido a estas limitaciones, los copolímeros de bloques anfifílicos se han utilizado como imita de lípidos para formar vesículas de polímero, o polímerosomas. Dentro de este contexto, polímerosomas son ventajosos en el desarrollo de sistemas de células biomiméticos debido a su mayor estabilidad 3, versatilidad química 4,5 y rasgos físicos modificables 6 - 8.
Los métodos actuales para formar polímerosomas de tamaño gigante incluyen electroformation 9 y rehidratación con plantilla de 10, ambos de which consumen mucho tiempo, los equipos de trabajo intensivo, requieren competencias específicas y producir bajos rendimientos de polímerosomas gigantes intactas. Un método de rehidratación gel asistida sencilla fue desarrollado recientemente para la producción de lípidos GUVs 11. A continuación, describimos una adaptación de la técnica de rehidratación en gel asistida para crear polímerosomas gigantes con composiciones de polímeros diferentes, tamaño controlado, y en diversas composiciones de amortiguamiento.
En pocas palabras, el 1% w / v películas estándar electroforesis en gel de agarosa de ADN se deshidrató en un cubreobjetos de vidrio. soluciones de polímero preparado en cloroformo continuación, se extienden a través de la película de agarosa deshidratado y se dejó evaporar. Después de la eliminación completa del disolvente, las películas de polímero se rehidratan en el tampón de elección con un calentamiento moderado (40-70 ° C) y el gigante (> 4 micras) polímerosomas tamaño se forman dentro de 30 min. Este método produce rápidamente cientos de polímerosomas totalmente intactos y bien formadas utilizando equipos de laboratorio estándar y reagents a un costo mínimo.
Figura 1. Esquema que representa el método de rehidratación en gel asistida. Polímerosomas gigantes compuestas de un copolímero de dos bloques se forman después de ~ 30 minutos de rehidratación. El bloque hidrófilo se denota en magenta y el bloque hidrófobo se denota en verde. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
1. Polímeros y Agarosa Preparación
Nota: Los guantes y una bata de laboratorio se debe usar en todo momento a lo largo de este protocolo. Las gafas de seguridad son igualmente necesarios durante el trabajo con cualquier disolvente orgánico o en cualquier fase con posibles salpicaduras.
- Preparar una solución de 5 mg / ml de polímero en cloroformo. Añadir 1 ml de cloroformo a 5 mg de poli sólido (óxido de etileno) - poli b- (butadieno) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) de copolímero de dibloque en un vial de vidrio y agitar para disolver completamente. Realizar todos los pasos utilizando cloroformo en una campana de humos química.
- Mezclar en un lípido marcado con fluorescencia (comprado ya disuelto en cloroformo) a una concentración final de 0,5% en moles de polímero sin marcar 99,5% en moles.
- Por ejemplo, la pipeta ~ 12 l de un lípido 1 mg / ml marcado con fluorescencia en cloroformo en 997,58 l PEO-PBD, EO 22 -BD 37 de polímero en cloroformo (con un peso molecular de 2.950 Daltons) para una concentración final de 0.5% en moles esfingosina marcada mezcla y 99.5% de polímero mol.
- Conserve la solución en un frasco hermético con una tapa cloroformo resistente a -20 ° C. Envuelva la cinta fontaneros en el borde del vial, donde los tornillos de la tapa sobre el vial y asegurar la tapa en el frasco. Envolver otro trozo de cinta fontaneros en el exterior de la tapa y, finalmente, envolver Parafilm en el exterior de la cinta para asegurar una evaporación mínima.
- Hacer una solución de agarosa al 1% w / v mediante la mezcla de 0,5 mg de agarosa estándar en 50 ml de agua (o 50 ml 100 mM de sacarosa) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Hervir la solución de agarosa en un microondas estándar para ~ 1 min (o hasta que esté completamente disuelto como se ha señalado por el desmonte de la solución).
Nota: La solución de agarosa se puede utilizar después de unos minutos de enfriamiento o se deja solidificar, almacenada y re-fundidos usando el mismo procedimiento.
2. Preparación de película de agarosa
- Corte el extremo de una punta de pipeta de 1.000 l para evitar la obstrucción. Con la punta de corte, 3 pipeta00 l de solución de agarosa fundida sobre un cuadrado de 25 mm cubreobjetos de cristal directamente desde el fabricante.
- Permitir que la agarosa se enfríe a ~ 65-75 ° C antes de la deposición. Si la agarosa es demasiado frío, comenzará a acumularse en la superficie durante el proceso de difusión. Por el contrario, si la agarosa es demasiado caliente, se requerirá más difusión para adherir la agarosa a la superficie.
- Almacenar casi el borde del cubreobjetos con los dedos enguantados y utilizar el borde largo de la otra punta de la pipeta de 1.000 l para difundir la agarosa de manera uniforme en toda la superficie del cubreobjetos. Mueva la punta de la pipeta de ida y vuelta a través del cubreobjetos hasta que la agarosa se adhiere por completo a y cubre el cubreobjetos.
- Coloque el cubreobjetos de agarosa-revestido sobre un trozo de Parafilm con la agarosa hacia arriba. Una vez se recubren el número deseado de cubreobjetos, coloque el Parafilm con los cubreobjetos en una incubadora a 37 ° para deshidratar la agarosa sobre la superficie durante al menos 1 hr.
Nota: La deshidrataciónse determina por la desaparición de la capa visible de agarosa; el cubreobjetos debe tener aspecto liso y claro. Una vez que las películas son totalmente deshidratado, tienda de cubreobjetos con la superficie de agarosa hacia arriba en una placa de Petri de plástico desechable.
3. Formación de película de polímero
- Pipeta 30 l preparados solución de polímero sobre la película de agarosa.
- Almacenar casi el borde del cubreobjetos con los dedos enguantados y utilizar el borde largo de una aguja de 18 G para extender la solución a través de las películas de agarosa utilizando un movimiento circular de difusión. Continuar la difusión hasta que se evaporó la solución.
Nota: Tenga cuidado de la punta de la aguja. - Colocar las películas de polímero en un lado de polímero placa de Petri de plástico hacia arriba y poner la placa de Petri en un desecador de vacío de la casa estándar cubierto con papel de aluminio (para evitar photobleaching de la esfingosina marcada) durante al menos 1 h para eliminar totalmente cualquier disolvente residual.
4. Formación de Polymersomes
- Adherir una coverwell, ya sea un polidimetilsiloxano hecho en casa (PDMS) bien (a ~ 0,5 cm de espesor de bloques de PDMS curado con ~ 1 cm de diámetro de la parte media troquelan) o una disponible en el mercado, así que el cubreobjetos recubierto con la película de polímero. Pulse el coverwell suavemente sobre el cubreobjetos recubierto con polímero con el polímero hacia arriba hasta que se forma un sello hermético entre la coverwell y el cubreobjetos. Tenga cuidado de no presionar demasiado y romper el cubreobjetos.
- Añadir la solución de rehidratación 200-500 l (agua está muy bien, pero una serie de tampones o medios de comunicación también funciona) a la cámara (volumen de rehidratación depende del tamaño de la coverwell adherido).
- Crear una cámara de humedad para disminuir la evaporación de la solución de rehidratación. Coloque un Kimwipe laminado, húmedo a lo largo de los bordes de una placa de Petri de vidrio. Coloque la película de polímero con el coverwell adherido a la cámara de humedad y cubrir con una tapa. Cubrir la placa de Petri con papel de aluminio para reducir al mínimo photobleaching. Lugarla placa de Petri sobre una placa caliente ajustada a 40 ° C durante al menos 30 min.
- Ajuste la temperatura de la placa caliente durante la rehidratación a partir 24-70 ° C para ajustar el tamaño de las vesículas formadas (Figura 5). 70 ° C es cerca de la Tm de la agarosa por lo que se debe tener precaución cuando se avanza más allá de esta temperatura.
5. Caracterización de polímerosomas de recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP)
- Mueva el cubreobjetos con el adherido coverwell directamente a un microscopio invertido para la imagen.
- Seleccione el conjunto de filtro adecuado en función de los lípidos fluorescente incluido en la solución de polímero. Para lípidos marcados con rodamina dopados en las soluciones de polímeros, utilizar un filtro de 560/25 nm de excitación y un filtro de 607/36 nm de emisión, o conjuntos de filtros comparables.
- Utilice un objetivo de aceite 100X para concentrarse en la superficie superior del cubreobjetos en la que se adhieren los polímerosomas. Si los polímerosomas son especialmentegrandes (> 20 micras) o si la película de polímero es demasiado gruesa, un objetivo de potencia más bajo (por ejemplo, 40X) se debe utilizar para visualizar mejor los polímerosomas.
- Identificar los polímerosomas utilizando microscopía de fluorescencia. Identificar polímerosomas por la vesícula característica hueco, esférica con un diámetro> 5 micras.
- Caracterizar fluidez de la membrana mediante la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP) en un microscopio de fluorescencia que contiene un condensador ajustable. Debido a la naturaleza adherente y apretado embalaje de polímerosomas sobre los sustratos, el movimiento natural de los polímerosomas está limitado, el aumento de la calidad de imagen FRAP.
- Enfocar el microscopio en el polimersoma de interés. Cierre el condensador a una pequeña región y asegurar que el borde de una polimersoma es dentro de la región de imagen de interés.
- Aumentar la exposición de la cámara y asegurar todos los filtros de densidad neutra se retiran para photobleach efectivamente la región de interés. Permitir que la membrana fl fluorescencia intensidad para photobleach durante 30-60 seg o hasta que la intensidad de la fluorescencia disminuye significativamente.
- Apagar la lámpara y abra completamente el condensador. Disminuir la exposición a los valores de partida y comenzar de inmediato la captura de imágenes cada 30 segundos durante 3 minutos.
- Calcular los coeficientes de difusión de membrana utilizando métodos estándar 12. Si la región blanqueada recupera la intensidad de fluorescencia dentro del 3-5 min, esto indica que la membrana es fluido.
6. Caracterización de polimersoma Tamaño
Figura 6. Proceso para el análisis del tamaño de polímerosomas utilizando software de imagen. Paso a paso las instrucciones sobre cómo medir el diámetro de las vesículas formadas. El usuario debe conocer las unidades de calibración en píxeles / m del microscopio usado.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Abrir las imágenes adquiridas de polímerosomas en el software de análisis de imagen 13.
- Establecer la escala de la imagen haciendo clic en el cuadro desplegable y analice la "escala de conjunto" clic.
- Calibrar la báscula para el microscopio utilizando métodos estándar (es decir, un micrómetro).
- Rellenar las unidades de calibración y haga clic en "ok".
- Haga clic en la caja de herramientas de línea y dibujar una línea que atraviesa el diámetro de una vesícula.
- Recoge las mediciones de longitud haciendo clic en el cuadro analice desplegable y haciendo clic en "medida".
- Continuar midiendo las vesículas individuales siguiendo el procedimiento anterior y se añadirá a la ventana de mediciones de datos cada nueva medición.
- Pulse la tecla "Ctrl + D" después de dibujar cada línea y la medición de la longitud para imprimir la línea trazada en elimagen por lo que es fácil el seguimiento de los cuales han sido analizados vesículas.
Representative Results
Polímerosomas se formaron mediante el procedimiento descrito anteriormente (Figura 1) y el equipo de laboratorio común se muestra en la Figura 2. Polímerosomas se rehidrataron con agua desionizada (Figura 3) y captación de imagen sobre un microscopio invertido de epifluorescencia en el uso de un objetivo de aceite 100X. Tenga en cuenta que si polímerosomas no son visibles, podrían haber formado en tallas más grandes para capturar con un objetivo de aceite de 100X; puede necesitar ser utilizado en lugar de un objetivo de potencia inferior. Una de las ventajas del uso de la rehidratación en gel asistida es la versatilidad de formar polímerosomas en una variedad de soluciones de rehidratación. Polímerosomas se formaron con éxito en agua desionizada, un medio de mamífero completo de cultivo de células, las soluciones de sacarosa y dos soluciones tampón fisiológicamente relevantes (solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina tamponada con Tris (TBS)), como se muestra en la Figura 4. En condiciones estándar (rehidratacióncon agua a 40 ° C durante 1 hora), mayor que 70 ~ polímerosomas se encuentran típicamente por 40 x 40 m 2 campo de visión. Mientras que la producción de superficie de polímerosomas no es homogénea, hay docenas de campos de visión con este rendimiento representativo docenas. Además, polímerosomas eran estables en solución durante al menos 24 h.
tamaño polímerosomas se sintoniza fácilmente mediante rehidratación películas de polímero a temperaturas variables. Polímerosomas formados en agua desionizada a RT tenían un diámetro medio de 2,9 ± 0,7 m. Como la temperatura aumenta durante la rehidratación, el tamaño medio de las polimersomas también aumenta (Tabla 1). A altas temperaturas (> 60 ° C), polímerosomas formadas con tamaños incluso mayores que 100 micras (Figura 5).
Todo el procesamiento de la imagen se completó con software de imágenes de código abierto (Figura 6).Imágenes recogidas fueron abiertos en el programa de software. El tamaño de píxel calibrado se ha introducido en la caja de escala establecida. Usando la herramienta de línea, las líneas se dibujan en todos los diámetros. Tras la extracción de cada línea individual, la longitud calibrada se midió y se agrega al cuadro de resultados. A continuación, los datos se pueden trazar en el software matemático de elección (por ejemplo, Excel, Prisma, origen, etc.)
. Figura 2. Cuadro de los materiales de laboratorio comunes y económicos necesarios para la formación de polímerosomas Los elementos necesarios son: Parafilm, un 18,5 g de agujas, de polímero en cloroformo u otro disolvente apropiado, una punta de pipeta de 1.000 l, un matraz Erlenmeyer, pinzas, agarosa, 25 mm cubreobjetos cuadrados, pozos de imagen PDMS y una placa de Petri de vidrio. Por favor, haga clic aquí paraver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Imágenes del método de rehidratación gel asistida. Disuelto agarosa se extiende sobre un cubreobjetos cuadrado 25 mm hasta una aún capas de película todo el cubreobjetos. Los cubreobjetos se ponen entonces en una incubadora a 37 ° y la película es deshidratado. Una solución de polímero se deposita sobre la película de agarosa deshidrata y se extendió el uso de una aguja en un movimiento circular. El cubreobjetos se coloca a continuación en un desecador O / N se evapore totalmente cualquier residuo de disolvente. Por último, y cámara de imágenes se adhiere al sustrato y polímeros se rehidratan con solución de elección y se coloca en una placa de Petri a 40 ° C durante por lo menos 25 minutos para permitir la formación de polímerosomas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. >
Figura 4. polímerosomas pueden formar en una variedad de diferentes tampones. Películas de polímero PEO-PBD se rehidrataron con el tampón indicado a 40 ° C durante 1 hr. Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. El aumento de la temperatura durante la rehidratación aumenta el tamaño de las polimersomas. Imágenes de epifluorescencia representativos de polímerosomas formados en agua a las temperaturas de rehidratación indicados. El aumento de temperatura produce polímerosomas más grandes. Barra de escala = 10 micras._blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Temperatura (° C) | Tamaño promedio (m) |
| 24 | 2,93 ± 0,7 |
| 40 | 5,76 ± 2,5 |
| 50 | 6,65 ± 2,4 |
| 60 | 11,46 ± 5,8 |
| 70 | 14.04 ± 7.0 |
Tabla 1. El aumento de la temperatura durante la rehidratación resultados en el aumento de tamaño polimersoma. Los diámetros medios de más de 100 polímerosomas en agua por diferentes condiciones de temperatura se calcularon y se representan aquí. El error es la desviación estándar.
Discussion
Polímerosomas están llegando a ser ampliamente explorados como miméticos de membrana biológica. Las propiedades robustas y versátiles de polímeros los hace muy atractivos para los estudios que requieren funcionalización membrana, longevidad y capacidad de respuesta sintonizado. Los métodos tradicionales para la formación de polímerosomas de tamaño gigante 9,10 (> 4 micras) son mano de obra intensiva y requieren equipos costosos y especializados. A continuación, presentamos por primera vez, un método rápido, versátil y robusto para la formación de polímerosomas de tamaño gigante que utilizan reactivos de laboratorio de bajo costo estándar y el equipo.
El uso de la rehidratación en gel asistida, polímerosomas unilamelares se pueden formar rápidamente (<30 min), en una variedad de soluciones de rehidratación (incluyendo medios de cultivo celular) y con una variedad de diferentes polímeros (datos no mostrados). No se observó la formación de vesículas multilamelares o asimétricos utilizando esta técnica. A lo largo de este trabajo, se utilizó poli (óxido de etileno) - poli b- (butadieno) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) copolímero de dibloques neutro. Muchas composiciones de polímeros diferentes (incluyendo copolímeros de dos bloques cargados) funcionan bien con este método (que no se muestra). Sin embargo, algunos copolímeros de tres bloques disponibles en el mercado y copolímeros de bloque doble de peso molecular más alto (~> 5.000 Dalton) no forman polímerosomas distintas. Para todos los experimentos en este manuscrito, una baja concentración de lípido marcado se dopado en las soluciones de polímeros sólo para fines de visualización. Otros métodos para la visualización, incluyendo polímeros funcionalizados directamente con un colorante fluorescente también se pueden utilizar. Polímerosomas mismo modo se pueden obtener imágenes con microscopía de campo claro, aunque microscopía de fluorescencia proporciona una mayor resolución.
La mayoría de las modificaciones menores en el protocolo normalmente no alteran los resultados. Por ejemplo, pequeñas diferencias en la concentración de la solución de polímero extiende sobre los cubreobjetos no alteran la formación del polímero fILM formado. Aunque no se determinó el intervalo de concentración completa, la formación polimersoma se producirá con éxito con una amplia gama de concentraciones de película de polímero (por ejemplo, 1 a 10 mg / ml). Sin embargo, hay algunas alteraciones de protocolo que no afectan negativamente a la formación de polimersoma. El más notable es que los cubreobjetos de vidrio redondos (en lugar de cuadrada) en consecuencia muy pobre formación de polímerosomas. Atribuimos esto a la capa extremadamente uniforme de agarosa en el cristal que en realidad impide la formación de polímerosomas.
Uno de los desafíos más notables de esta técnica es la capacidad de recuperar los polímerosomas de la superficie con un alto rendimiento. Hay ciertos casos en los que la eliminación de los polímerosomas de la superficie original puede ser ventajosa. Debido a la alta fluorescencia de fondo de la película de polímero deshidratado, eliminando polímerosomas individuales y adherirse a limpiar cubreobjetos aumentará la calidad de imagen y caracterización (particialmente durante el análisis FRAP). Para ello, pipeteado suave con una punta de pipeta en la que al final se ha cortado se desorber los polímerosomas de la superficie (aunque el número de vesículas recuperados es significativamente menor que las formadas originalmente). Polímerosomas entonces se pueden colocar en las superficies cubreobjetos modificados, lo que permite la polimersoma para interactuar con el nuevo cubreobjetos. Típicamente, para neutros polímerosomas PEO-PBD, cubreobjetos tratados con ozono durante 15 min permiten que los polímerosomas a caer a la superficie de formación de imágenes. Se requiere modificación de la superficie diferente para diferentes composiciones polimersoma (por ejemplo, negativa o positivamente cargado polímeros).
La mayoría de los materiales utilizados en este protocolo son almacenados y utilizados con éxito durante días o semanas. La agarosa solidificada se puede recalienta y volver a utilizar hasta que la agarosa comienza a tener agregados incluso después de la ebullición, o de la agarosa solidificada comienza a secarse. Los cubreobjetos con películas de agarosa secos se pueden almacenar y usodía indefinidamente (por ejemplo, meses). El polímero disuelto en cloroformo se puede almacenar a -20 ° C durante varios meses. Una vez que la película de polímero se seca en las películas de agarosa, sin embargo, las películas necesitan ser almacenados bajo vacío y se utiliza dentro de las dos semanas (no se determinó directamente almacenamiento a largo plazo, pero hay diferencias notables en polímerosomas formadas a partir de películas de polímero mayor que dos semanas).
Utilizando el protocolo de rehidratación en gel asistida que aquí se presenta, cientos de polímerosomas forma uniforme-se forman rápidamente con sólo unas pocas horas de trabajo de parto usando equipo estándar de laboratorio y reactivos de bajo costo. Además, polímerosomas se pueden formar en una variedad de soluciones tampón fisiológicas y de composiciones de polímero diferentes (no se muestra). Pequeñas alteraciones en el método no alteran negativamente la formación de polímerosomas, haciendo que la rehidratación en gel con ayuda de una técnica versátil y accesible para los científicos variando de correo técnicaXpertise.
La posibilidad de crear fácilmente polímerosomas gigantes en la escala de tamaño de las células es esencial para la construcción de sistemas similares a células artificiales. La facilidad de uso y la versatilidad de la rehidratación en gel asistida para hacer estos polímerosomas ofrece un gran avance en el campo biomimético para la creación de sólidos imita de la membrana celular. Por ejemplo, usando esta técnica, las estrategias para la encapsulación de los diferentes componentes intracelulares, la funcionalización del polímero con las proteínas y la incorporación de proteínas de transporte de membrana de la membrana celular, sólo para nombrar unos pocos, puede ser diseñado para construir células artificiales a base de polimersoma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 ml Erlenmeyer flask | VWR | 89000-360 | |
| 18 guage needle | VWR | BD-305196 | |
| 25 mm square coverslips | VWR | 48366-089 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | A standard agarose for DNA gel electrophoresis |
| Chloroform | Sigma | 288306-2L | |
| Commerical coverwell | Electron Microscopy Sciences | 70336 | Press-to-Seal Silicone Isolators |
| Fiji Image Analysis Software | ImageJ | Free Download: http://fiji.sc/Fiji | |
| Glass vial with Teflon Lid | VWR | 66009-556 | 1.9 ml capacity, case of 144 |
| Liss-rhodamine B PE Lipid | Avanti Polar Lipids | 810150C | 1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | 10.2 cm x 38.1 m |
| poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940) | Polymer Source | P2904-BdEO | http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf |
| Pastic Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Teflon tape | VWR | 300001-057 | 1/2" width |
References
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