Abstract
Müdigkeit ist ein prominentes Symptom für viele Krankheiten und Störungen und reduziert die Lebensqualität für viele Menschen. Das Fehlen klarer Pathogenese und ein Scheitern der laufenden Interventionen angemessen zu Ermüdung bei allen Patienten bleibt ein Bedarf an neuen Behandlungsmöglichkeiten zu behandeln. Trotz der therapeutischen Notwendigkeit und Bedeutung der präklinischen Forschung in viel versprechende neue Therapien zu helfen identifizieren, einige präklinische Tests von Müdigkeit zur Verfügung. Darüber hinaus ist die häufigste präklinischen Assay verwendet Müdigkeit ähnliches Verhalten, freiwillige Radfahr beurteilen zu können, nicht geeignet für den Einsatz mit einigen Stämmen von Mäusen, nicht empfindlich auf Drogen sein kann, die Müdigkeit zu verringern, und hat relativ geringen Durchsatz. Das aktuelle Protokoll beschreibt eine neue, nicht-freiwilligen präklinischen Test von Müdigkeit ähnliches Verhalten, dem Laufband Ermüdungstest, und liefert den Beweis für ihre Wirksamkeit Müdigkeit artiges Verhalten bei Mäusen mit einem Chemotherapeutikum behandelt bekannt zu verursachen Ermüdung bei Menschen und Müdigkeit bei der Aufdeckung -ähnlichen Verhalten in animals. Dieser Test kann eine vorteilhafte Alternative zu Radfahr sein, wie Ermüdungsartiges Verhalten und mögliche Eingriffe können in einer größeren Zahl von Mäusen über einen kürzeren Zeitraum bewertet werden, wodurch schnellere Entdeckung neuer therapeutischer Optionen ermöglicht.
Introduction
Müdigkeit wirkt sich auf eine Vielzahl von Menschen, kann deutlich die Lebensqualität reduzieren, und häufig hat eine unklare oder unbekannter Pathogenese. Krebs-related fatigue (CRF), zum Beispiel, wird von der Mehrheit der Krebspatienten erfahren Behandlung unterziehen und kann lange bleiben auch nach der Krebsbehandlung und in Abwesenheit von nachweisbaren Krebs 1 abgeschlossen ist. Darüber hinaus ist Müdigkeit auch ein prominentes Symptom in zahlreichen anderen Krankheiten und Störungen, einschließlich chronischem Müdigkeitssyndrom, Depressionen, Diabetes und Fibromyalgie. Glücklicherweise gibt es nicht-pharmakologische Interventionen , die einige Menschen zu helfen , erleben Müdigkeit fähig sind (zB Übung kann CRF reduzieren für einige Brustkrebspatientinnen 2,3), aber viele Menschen fehlt immer noch eine wirksame Behandlung. Darüber hinaus wurden bestehende medikamentöse Behandlungen für CRF nicht gefunden worden , im Großen und Ganzen zu sein, wenn überhaupt, wirksam 4-7.
Trotz der therapeutischen Notwendigkeit und der Mangel an Drug Behandlungsmöglichkeiten, präklinische Tests von Müdigkeit in der Entdeckung und Entwicklung von neuartigen Behandlungen Müdigkeit zu unterstützen fehlen, vor allem in Tiermodellen. Einer der wenigen präklinischen Tests von Müdigkeit für Studien an Nagetieren ist freiwillig Radfahr Aktivität (VWRA) 9-15, in denen Mäuse und andere Nagetiere sind den freien Zugang zu einem Laufrad und ihre tägliche Laufaktivität gegeben wird aufgezeichnet. In vielen Studien ist VWRA das einzige Maß für ermüdungsähnliche Verhalten, mit Müdigkeit ähnliches Verhalten definiert (entweder VWRA oder dem aktuellen Protokoll) als eine Abnahme der gemessenen körperlichen Aktivität in der experimentellen Gruppe. Obwohl VWRA eine nützliche Längs Maß für Ermüdungsähnliches Verhalten bereitstellen kann, ist es eine relativ geringe Durchsatzassay ausgeführt variiert beträchtlich zwischen den Inzucht - Mausstämmen 16, und es erfordert Fächer einzeln untergebracht werden, was Veränderungen im Verhalten und Testleistung verursachen kann 17-19. Andere Tests, wie zum Beispiel Heimkäfig Verhaltensüberwachung undAnalyse kann auch eine kontinuierliche Datenerfassung liefern und einige Systeme erlauben kann für Themen in Paaren 20 untergebracht werden. Diese Assays sind nützlich, kann aber weniger empfindlich als Mittel zur Erfassung Ermüdungsartiges Verhalten und wie Radfahr sind auch Low-Durchsatz.
Im Gegensatz zu VWRA, Maus Tretmühle Tests stützen sich nicht auf freiwillige Aktivität und kann in kurzer Zeit abgeschlossen werden, für einen höheren Durchsatz ermöglicht. Im Vergleich zu VWRA verwenden diese Tests externe Motivatoren. Insbesondere gibt es normalerweise eine elektrifizierte Metallgitter an der Rückseite des sich bewegenden Bandes angeordnet Mäuse mit einem elektrischen Schock zu liefern sollten sie laufen einzustellen. Zusätzlich zu diesem Schock Gitter, Mäuse können auf dem Laufband über mehrere andere Methoden ausgeführt werden motiviert, einschließlich Stoßen, stossen, oder sie mit einer Hand, einer Bürste oder einem anderen Werkzeug zu berühren und kurze Luftstöße auf sie zu lenken. Statt Müdigkeit, sind Tests Maus Tretmühle häufig verwendet, um zu messen aeroben und / oder anaerobic Trainingskapazität 21-25. Die Mäuse sind motiviert, zu laufen, bis sie nicht in der Lage oder nicht willens sind, auf dem Laufband als Mittel, um weiterzulaufen weiterer Elektroschocks zu entkommen. Testing dann endet, wenn Mäuse, die das Kriterium für die Erschöpfung erfüllen. In diesen Protokollen, um sicherzustellen, dass Mäuse wahre physiologische Erschöpfung zu erreichen, ist das Kriterium für die Erschöpfung oft als er fünf Sekunden lang mit an der Spitze des Stoßnetz und in Ermangelung definiert angesichts der wiederholten aversiven Reize weiterlaufen. Somit kann Ermüdungsähnliches Verhalten in typischen Laufband Tests maskierenden aufgrund der starken aversive Natur der externen Motivation und Kriterium für den Test zu beenden. Interessanterweise und im Gegensatz zu vielen anderen Studien mit Nagetieren Tretmühlen, eine aktuelle Publikation beschreibt eine andere Version einer Tretmühle Ermüdungstest, die im Rahmen einer Untersuchung der Auswirkungen von sozialem Stress bei Mäusen 26 verwendet wurde. Obwohl die von dieser Gruppe verwendete Methode unterschied sich deutlich von der current Protokoll (dh sie verwendet , um eine einspurige Laufband und benötigt 10 Sekunden eines elektrischen Schlags als Kriterium ihre Prüfung für die Beendigung), ihre Studie unterstreicht die Nützlichkeit und das Interesse an einer schnellen, einfachen Ermüdungstest der Entwicklung der Maus Laufband.
Müdigkeit ist wahrscheinlich durch nachweisbar zu sein, andere als Radfahr und Veränderungen in der Routineverhalten. CRF macht Patienten mit einer geringeren Menge an Muskelermüdung erschöpft fühlen, wie durch Elektromyographie - Analyse bestimmt, als Menschen ohne CRF 27. Zusätzlich reduziert die Motivation in bemerkt worden , und wird von mehreren Skalen zur Messung menschlicher Ermüdungs 28,29 gemessen. Somit sollte ein nützliches preclinical Assay Ermüdungsähnliches Verhalten zwischen gesunden und ermüdeten Mäuse auf der Grundlage einer andere Maßnahme als physiologische Fähigkeit unterscheiden, und sollte nicht verdunkeln Abnahmen der Motivation. Um dieses Ziel zu erreichen, während Einschränkungen von VWRA und anderen Tests zu vermeiden, die aktuellen Verfahren was durch die Anpassung der Maus Tretmühletest entwickelt. Dieses Verfahren verwendet einen Schockgitter als einzige externe motivator Mäuse auf dem Laufband zu machen. Mäuse lernen schnell, dass das Gitter einen aversiven Reiz bietet und wird von ihm sofort wegziehen, wenn sie auf dem Laufband gelegt und in einiger Entfernung von ihm halten beim Laufen.
Wenn Mäuse Müdigkeit, verbringen sie zunehmend mehr Zeit in Richtung der Rückseite des Laufband statt Geschwindigkeit zu dem vorderen Ende aufrecht zu erhalten. Daher ist das Kriterium für die Beendigung des Tests in diesem Protokoll zu verbringen fünf Sekunden lang in der vorgesehenen Ermüdungszone (dh der Rückseite des Laufband, im Bereich von etwa einer Körperlänge von dem Schock Gitter zu und einschließlich dem Schock Gitter). Dies nutzt die aversiven Natur des Gitters ohne Mäuse erfordern viele oder keine tatsächliche Schocks nach dem Training zu erhalten. Indem Mäuse Tests unter Verwendung des aktuellen Kriterium abzuschließen anstatt Erschöpfung (wie oben definiert),Dieses Verfahren stellt ein Mittel, um das Laufband mit ermüdungs Verhalten eher als seine maximale (oder nahezu maximalen) physiologische Fähigkeit zu messen. Somit kann dieses Verfahren stellen eine einfache, Hochdurchsatz-Assay von Ermüdungsartiges Verhalten bei Mäusen und kann entweder als eigenständige oder ergänzende Maßnahme zu anderen Assays Ermüdungsähnliches Verhalten dienen.
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Protocol
Dieses Verfahren wurde durch das National Institute of Diabetes und Magen-Darm-und Nierenerkrankungen Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Vorbereitung
- Damit für die schnelle Identifizierung von jeder Maus vor der Prüfung, Tätowierung die Schwänze aller Mäuse, die mit Kennzeichnungen trainiert und getestet werden.
Hinweis: Dieser Schritt ist optional. Permanent Marker oder andere Verfahren zur Identifizierung kann als Alternative zum Tätowieren verwendet werden. - Vor der Ausbildung und Prüfung Mäuse, stellen Sie sicher, dass das Gerät nur auf eine ebene Fläche ist und auf den gewünschten Neigungswinkel zu dem Laufband gesetzt: und stellen Sie den Stromschlag-Frequenz (empfohlener Neigungswinkel 10 °, zur gesamten Ausbildung und Prüfung konsistent gehalten werden) und Intensität in geeigneter Weise (empfohlen: 2 Hz, 1,22 mA).
HINWEIS: Der Stromschlag verwendet wird, sollte nicht mehr als ein mildes Kribbeln erzeugen, wenn sie durch einen ungloved Finger berührt und sollte in einem pulsatilen fash geliefert werdenIon (mit jedem Schlag dauerhafte 200 ms). - Legen Sie ein sauberes Blatt Metzgerei Papier oder ein absorbierendes Kissen unter dem Laufband fäkale Boli und Urin während des Trainings und Tests zu sammeln.
- Legen Sie ein Blatt Papier oder ein absorbierendes Kissen über das dritte von der Tretmühle Gehäuse (dh der klaren Kunststoffdeckel, der die Tretmühle Fahrspuren deckt) am weitesten von dem Schock Gitter.
HINWEIS: Dieser Schritt ist optional, wird aber ein dunkler Raum zu schaffen und zusätzliche Ermutigung kann der untere Teil des Laufbandes zu vermeiden. - Wenn die Planung einer Drahtbürste zu verwenden, um zusätzliche Motivation beim Training zur Verfügung zu stellen, stellen Sie sicher, dass man leicht verfügbar ist vor dem Training beginnen.
- Stellen Sie sicher, dass jedes Arzneimittel oder Verfahren zur Induktion und / oder Linderung von Müdigkeit zur Verfügung und kann bei Schritt 2.14 vorbereitet oder durchgeführt werden.
2. Training Mäuse, denen das Laufband zu verwenden
HINWEIS: Die Ausbildung ist notwendig, dass Mäuse, um sicherzustellen,sind mit dem Laufband und Aufgabe vertraut und können in geeigneter Weise durchführen, wenn getestet. Wenn die Mehrheit der Mäuse trainiert häufig Schocks erhalten oder anderweitig schlechte Ergebnisse bei jeder Trainingseinheit sollten zusätzliche Schulungen durchgeführt werden. Am ersten Tag werden die meisten Mäuse mehrere Male schockiert sein. Am zweiten Tag der Ausbildung sollten die Mäuse werden selten mit dem Netz in Kontakt. Wenn eine Maus durchweg schlechte Trainingsleistung zeigt, sollte es aus der Studie entfernt werden. Für weibliche C57BL / 6NCr Mäuse, dann ist dies ein seltenes Ereignis (weniger als 1% haben von Studien aufgrund der schlechten Trainingsleistung entfernt worden ist), aber es sollte, dass andere Stämme können während des Trainings durchführen anders vermerkt werden.
- Mit dem Laufband ab (und die Geschwindigkeit auf 0 m / min), einzeln heben die Mäuse von den Schwanz und Platz Mäuse in einzelne Spuren einer Maus Tretmühle. drehen Unverzüglich auf dem entsprechenden Gitter nach jeder Maus auf dem Laufband platzieren. Stellen Sie sicher, dass Mäuse, platziert direkt on das Laufband.
HINWEIS: Die Höhe der Zeit und Entfernung jeder Maus am Schwanz gehalten wird , sollte vor , indem Sie den Käfig in der Nähe der Tretmühle minimiert werden Mäuse auf dem Laufband zu übertragen und / oder ermöglicht Mäuse auf eine solide Plattform zu stehen (zB einen Drahtkäfig Deckel ), bis sie in der Nähe der Tretmühle sind und der Experimentator ist bereit, sie in der Tretmühle zu platzieren. - Lassen Mäuse frei das Laufband für 1-3 min erkunden oder bis jede Maus seiner Fahrspur und / oder empfangen zumindest einen Schock aus dem Netz erforscht hat.
- Schalten Sie das Laufband und langsam die Geschwindigkeit zu erhöhen, bis sie (etwa 1,5 bis 3,0 m / min) zu bewegen beginnt. Überwachen Sie alle Mäuse, um sicherzustellen, dass sie zu Fuß beginnen. Wenn eine Maus beginnt nicht zu Fuß oder geht auf den Schock Gitter, bereit sein, durch Antippen der Maus mit einer Drahtbürste oder Schwanz Kitzel zu intervenieren.
- Erhöhen Sie langsam die Laufbandgeschwindigkeit bis 8 m / min. Starten Sie einen Timer und Überwachung Verhalten fortzusetzen.
- Erhöhen Laufband Geschwindigkeit9 m / min bei 5 min, 10 m / min bei 7 min, und das Laufband bei 10 min zu stoppen.
- Lassen Sie die Mäuse kurz die Tretmühle erkunden, dann entfernen und zurück jeweils in seinen Käfig.
- Reinigen Sie das Laufband und Gitter mit Alkohol und ersetzen das Papier oder absorbierende Kissen unter dem Laufband.
- Zum Zug zusätzliche Mäuse, wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.7.
HINWEIS: Lassen Sie Alkohol auf dem Laufband zu stellen neue Mäuse vor, um zu trocknen. - Am zweiten Tag der Ausbildung, wiederholen Sie Schritt 2.1. Schalten Sie auf dem Laufband und erhöhen die Geschwindigkeit auf 10 m / min. Starten Sie einen Timer.
HINWEIS: Laufbandgeschwindigkeit kann schneller erhöht werden als die am ersten Tag des Trainings. - Erhöhen Laufbandgeschwindigkeit bis 11 m / min bei 5 min, 12 m / min bei 10 min, und stoppen Sie das Laufband bei 15 min.
- Entfernen Sie Mäuse und bringt sie in ihre Käfige.
- Reinigen Sie das Laufband und Gitter mit Alkohol und ersetzen das Papier oder absorbierende Kissen unter dem Laufband. Zum Zug zusätzliche Mäuse, wiederholen Sie die Schritte 2.9 bis 2.12.
- Führen zusätzliche Tage (3 Tage) der Ausbildung in der gleichen Weise wie bei der zweiten Tag.
Hinweis: Dieser Schritt ist optional, wird aber dringend empfohlen, wenn die meisten oder alle Mäuse (des gleichen Geschlechts und Stamm) mit der Aufgabe Anzeige Schwierigkeit ausgebildet. Mäuse können in der Regel gut in Schritt 3 , wenn sie 3 Tage lang geschult wurden (dh mit einem zusätzlichen Tag der Ausbildung), obwohl zusätzliche oder weniger Tage Training geeignet sein können in Abhängigkeit von ihrer Leistung während der zweiten Trainingstag und die Dauer der Schritt 2.14. - Lassen Sie mindestens einen ganzen Tag, in dem die Mäuse auf dem Laufband keine Exposition, bevor Sie fortfahren müssen, passieren zu Schritt 3.
HINWEIS: Jedes Medikament (e) verwendet zu induzieren und / oder zu lindern Ermüdung während dieses Schrittes verabreicht werden sollte.
ANMERKUNG: Diese Zeitdauer kann in der Länge und verwendet, variiert werden, Müdigkeit und / oder Test Eingriffe zu induzieren Ermüdung zu verringern oder zu beseitigen. Wenn die Prüfung Mäuse mehr als 7 Tage nach Abschluss der Ausbildung wird eine Pilotstudie empfohlen,sicherzustellen, dass die verwendeten Mäuse während des Tests durchführen wird.
3. Tretmühle Ermüdungstest
HINWEIS: Bei diesem Test Müdigkeit ähnliches Verhalten wie die Ausgaben 5 aufeinander folgenden Sekunden in der "Ermüdungszone" definiert ist. Die Ermüdungszone wird als die Region, die den Teil des Laufbandes innerhalb von etwa 1 Körperlänge des Stoß grid sowie das Gitter selbst definiert. Vor der Prüfung sicherzustellen, dass der Punkt, der diese Zone abgrenzen zu den Experimentator klar ist, wie durch eine Markierung an der Oberseite oder Seite der Tretmühle Fahrspuren angelegt wird.
- Stellen Sie die Laufbandgeschwindigkeit bis 12 m / min. Das Laufband nicht starten. Stellen Sie sicher, dass die Schockgitter ausgeschaltet sind.
- Individuell platzieren Mäuse in getrennte Fahrspuren der Tretmühle. Schalten Sie den entsprechenden Gitter unmittelbar nach jeder Maus auf dem Laufband platzieren.
- Gleichzeitig das Laufband zu starten und eine Stoppuhr.
HINWEIS: Verwenden Sie nicht eingreifen, während außer Testen Mäuse zu entfernendass erfüllen das Kriterium für die Entfernung (siehe Schritt 3.5). - Erhöhen Laufbandgeschwindigkeit angezeigt , wie in Tabelle 1. Sorgfältig beobachten alle Mäuse während des gesamten Tests.
HINWEIS: Das Laufband aufgelistet Geschwindigkeiten wurden in Tabelle 1 basierend auf Beobachtungen von erwachsenen weiblichen C57BL / 6NCr Mäuse ausgewählt. Höhere Laufband Geschwindigkeiten für größere (zB Auszucht CD-1 - Mäuse) oder athletischer Mäuse geeignet sein. - Wenn eine Maus für 5 kontinuierliche sec in der Ermüdungszone bleibt, umgehend die Maus aus dem Laufband zu entfernen und die Dauer aufzeichnen und distanzieren es lief.
- Wenn keine Mäuse auf dem Laufband bleiben, das Laufband zu stoppen. Reinigen Sie das Laufband und Gitter mit Alkohol und ersetzen das Papier oder absorbierende Kissen unter dem Laufband.
- Um zu testen, zusätzliche Mäuse, wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.6.
Hinweis: Dieser Schritt ist optional.
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Representative Results
Dieses Protokoll ermöglicht ermüdungsähnliche Verhalten bei Mäusen gemessen werden mit einem Laufband. Die Daten in diesem Abschnitt wurde von Trainings- und Test 3 separate Gruppen von Mäusen erhalten das aktuelle Protokoll (ohne Abbildung 1A und 1C) verwendet wird . Ermüdung, 5-Fluorouracil (5-FU), einem zytotoxischen Chemotherapeutikum bekannt zu verursachen Ermüdung beim Menschen 30 und Ermüdungsartiges Verhalten bei Mäusen 10,13 wurde induzieren , verabreicht. Alle präsentierten Daten sind von erwachsenen weiblichen C57BL / 6NCr Mäusen. Die Mäuse wurden 9-10 (Abbildung 1 und 2) oder 9-13 (Abbildung 3) Wochen alt zum Zeitpunkt des Testens.
Abbildung 1 zeigt die Daten von Mäusen , die 5 Tage lang trainiert wurden, dann mit 5-FU (60 mg / kg / Tag für 5 Tage) behandelt, wie es in einem zuvor veröffentlichten Modell 10, Müdigkeit zu induzieren. Nach Abschluss der Behandlung wurden sie mit Hilfe eines exer getestetübungsKapazitätsTest (1A), die Tretmühle verwendet Geschwindigkeiten in Tabelle 2 und einer Drahtbürste, Schwanz kitzeln und Luft Puffs aufgeführten Mäuse zu motivieren , bis unfähig zu laufen laufen. Der Test endete, wenn eine Maus 5 Sekunden lang auf dem Schock Gitter verbracht. Am folgenden Tag wurden die Mäuse mit der Tretmühle Ermüdungstest (Abbildung 1B) getestet. Dieses Protokoll kann während des Tests zwischen Chemotherapie behandelten und Kontrollmäusen (1B), während ein Laufband Kapazitätstest nicht (Abbildung 1A) einen signifikanten Unterschied in der Streckenlauf erfassen. Um zu überprüfen, dass der Unterschied in der Tretmühle Ermüdungstest fand, war Müdigkeit artiges Verhalten zu messen, wurde die Maus VWRA in einem separaten Experiment gemessen. Nach Akklimatisierung und Erfassung der grundlegenden Radfahr Aktivität wurde VWRA während der Dunkel-Zyklus ( "Nacht", wenn das Rad läuft tritt in erster Linie), gemessen während der 5 Tage von 5-FU-Behandlung und für einen einusätzliche Nacht über Abschluss der 5-FU-Behandlung. Mäuse 5-FU - Behandlung unterziehen angezeigt Müdigkeit artiges Verhalten durch die zweite Nacht der Behandlung (1C). Dieser Effekt über den Verlauf des Experiments erhöht und über das Ende der Behandlung blieb, was darauf hinweist , dass Ermüdungsähnliches Verhalten in den Mäusen aus den 1A und 1B detektierbar sein sollte. Da die Tretmühle Ermüdungstest zum Nachweis von Unterschieden in der Entfernung von Steuerung und 5-FU-behandelten Mäuse laufen fähig war, unterstützt dies den Schluss, dass das Laufband Ermüdungstest zur Messung der Müdigkeit ähnliches Verhalten fähig ist.
Das Laufband Ermüdungstest kann auch Müdigkeit ähnliches Verhalten bei Mäusen eine Chemotherapie erhalten in verschiedenen Dosierungen und Behandlungsschemata zu erkennen. Mäusen eine 80 mg / kg Dosis von 5-FU pro Woche für 2 Wochen Empfangen (eine kumulative Dosis von etwa der Hälfte von dem, was Mäuse erhielten in Abbildung 1 (Figur 2) gezeigt.
Da die Zahl der Trainingseinheiten und / oder die Länge der Zeit zwischen Ausbildung und Prüfung kann in Abhängigkeit von den verwendeten Mäuse und das Verfahren variieren verwendet Ermüdung zu induzieren, ist es wichtig, dass Änderungen in diesen Variablen kann die Erkennung von Ermüdungsähnliches Verhalten nicht verhindern. Die Versuche gezeigt in den 1A und 1B (in denen Mäuse erhielten 5 Tagen nach der Ausbildung) und 2 (in denen Mäuse 3 Tage Ausbildung erhalten) veranschaulichen , dass die Ermüdungsartigen Verhalten ist nachweisbar , wenn die Anzahl der Trainingseinheiten und die Zeit zwischen der Ausbildung und Tests geändert.
In Abbildung 3 wurden keine Chemotherapeutika verabreicht werden , aber Mäuse wurden mit dem Trainieren wöchentlich Ermüdungstest getestet. Obwohl Mäuse rep werden getesteteatedly mit diesem Protokoll, sie können aber weniger bereit , sich bei wiederholter Prüfung (Abbildung 3) zu laufen. Der Prozentsatz der Mäuse, die nicht während der wöchentlichen Tests laufen würde erhöht mit jedem Test und nach dem zweiten Test mindestens die Hälfte der getesteten Mäuse nicht auf dem Laufband laufen. Diese Daten legen nahe, dass Tests mit diesem Protokoll sollte auf eine oder zwei Tests begrenzt werden, um eine hohe Rate von nicht konformen Mäusen zu vermeiden.
Abb . 1: Die Tretmühle Ermüdungstest, wie Freiwillige Radfahr und im Gegensatz zu dem Laufband Übung Capacity Test, Ermittelt Fatigue-ähnliches Verhalten in Mäusen , die tägliche Chemotherapie An den Tagen 1-5, wurden die Mäuse trainiert täglich auf dem Laufband. An den Tagen 6-10 unterzog Mäuse Behandlung mit 5-FU (60 mg / kg / Tag) Ermüdung oder PBS zu induzieren. (A) Am Tag 11 wurden die Mäuse mit einer Standardlaufband ex getestetercise Kapazitätstest. (B) Am Tag 12 unterzog Mäuse die Tretmühle Ermüdungstest. (C) Radfahr Aktivität (in Prozent der unbehandelten Basislauf gezeigt). Die Mäuse wurden 7 Tage lang laufen Rad Käfigen eingewöhnt und Laufbasis Rad wurde über 4 weitere Nächte gesammelt und gemittelt für jede Maus läuft Basis Rad zu bestimmen. An den Tagen 1-5, wurden die Mäuse mit 5-FU (60 mg / kg / Tag) oder PBS behandelt. 1 Nacht ist die Nacht nach der ersten Dosis von 5-FU. Für den Feldern A und B, sind Daten Mittelwert + SD 5-6 Mäuse pro Behandlungsgruppe. Für Panel C sind Daten Mittelwert ± SD von 6 Mäusen pro Behandlungsgruppe. ** P <0,01, Student-t - Test; *** P <0,001, Zwei-Wege wiederholten Messungen Varianzanalyse mit Bonferroni - Korrektur Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: wöchentliche Behandlung mit 5-FU Induziert Fatigue-ähnliches Verhalten bei Mäusen an den Tagen 1 bis 3 wurden die Mäuse trainiert täglich auf dem Laufband.. An den Tagen 4 und 11 erhielten die Mäuse Injektionen von 5-FU (80 mg / kg) oder PBS. Am Tag 12, unterzog sich Mäuse, die das Laufband Ermüdungstest. Daten sind Mittelwerte + SD von 12 Mäuse pro Behandlungsgruppe. * P <0,05, t - Test nach Student Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Die Entfernung Run und Task - Einhaltung von Mäusen während der wiederholten Tretmühle Ermüdungsprüfungen an den Tagen 1 bis 3 wurden die Mäuse trainiert täglich auf dem Laufband. An den Tagen, 5, 12, 19, 26 und 33, Mäuse unterzog Tretmühle Ermüdungstests. MEis erhielt zwei Injektionen von PBS am Tag vor dem Test und eine einzige Injektion von 30 min vor dem Test. (A) Entfernung während jeder Woche des Testens von Mäusen laufen. Daten sind Mittelwerte + SD von 12 Mäusen. (B) Der Anteil der Nicht-Starters Mäuse während jeder Testwoche. Nichtstarter Mäuse wurden willkürlich als Mäuse definiert , die nicht für mindestens 6 min lief. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Zeit (min) | Geschwindigkeit (m / min) | ||
| 0 | 12 | ||
| 0,5 | 14 | ||
| 1 | 16 | ||
| 6 | 18 | ||
| 30 | 20 | ||
| 45 | 22 | 60 | 24 |
| 75 | 26 |
Tabelle 1: Tretmühle Geschwindigkeit während des Ermüdungsprüfung.
| Zeit (min) | Geschwindigkeit (m / min) |
| 0 | 10 |
| 10 | 15 |
| 15 | 16.8 |
| 18 | 18.6 |
| 21 | 20.4 |
| 24 | 22.2 |
| 27 | 24 |
| 30 | 25.8 |
| 33 | 27.6 |
| 36 | 29.4 |
| 39 | 31.2 |
| 42 | 33 |
| 45 | 34.8 |
| 48 | 36.6 |
Tabelle 2: Laufbandgeschwindigkeit während des Trainings Kapazitätstests.
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Discussion
Das aktuelle Protokoll beschreibt, wie eine Maus Tretmühle zu verwenden Müdigkeit ähnliches Verhalten zu messen. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber VWRA, einem gemeinsamen preclinical Assay Ermüdungsähnliches Verhalten. VWRA erfordert, dass Mäuse, die mit dem Testgerät zu interagieren, zu wählen. Als Ergebnis interagieren einige Inzucht erzeugten Stämme von Mäusen selten mit dem Rad 16 und laufen so wenig , daß es schwierig oder unmöglich sein kann , eine Ermüdungsinduzierte Abnahme der Aktivität zu identifizieren. Im Gegensatz dazu eliminiert die Tretmühle Ermüdungstest, dass die Wahl und ist daher eine echte Alternative Test von Müdigkeit ähnliches Verhalten für Mäuse, die auf Laufräder werden nicht ausgeführt. Dieses Protokoll kann als Ersatz oder Ergänzung zu VWRA und andere Maßnahmen von Müdigkeit ähnliches Verhalten verwendet werden und kann besonders nützlich sein bei der Prüfung mögliche medikamentöse Therapien Müdigkeit in Mausmodellen zu reduzieren. über eine Pilotstudie, dass Müdigkeit ähnliches Verhalten zu beobachten ist in einem bestimmten Mausmodell, potenzielle Behandlung Nach der Etablierungs könnte Müdigkeit zu lindern, verabreicht werden und Müdigkeit ähnliches Verhalten zu reduzieren. Wenn eine medikamentöse Behandlung Müdigkeit ähnliches Verhalten dämpft bei der Verwendung dieses Protokoll getestet, es (oder ein ähnliches Medikament) kann zur Behandlung bestimmter Formen der menschlichen Ermüdung von therapeutischem Wert sein. Darüber hinaus, obwohl es beim Übergang von der präklinischen Studien zur klinischen Studien noch viele notwendigen Schritte sind, dieses Protokoll ermöglicht eine größere Anzahl von Mäusen in einem viel kürzeren Zeitrahmen als VWRA getestet werden, so daß Ermüdungsartigen Effekte und mögliche Behandlungen untersucht werden können und verstanden schneller.
Es gibt mehrere wichtige Einschränkungen und Überlegungen bewusst zu sein, wenn dieses Protokoll verwenden. Zunächst sei darauf hingewiesen , dass, wie dieser Test körperliche Aktivität erfordert Ermüdungsähnliches Verhalten zu messen, ist es nicht für die Testbedingungen geeignet sein kann , die Kachexie oder Muskelschwund (zB Krebs im fortgeschrittenen Stadium) induzieren. Wir haben auch beobachtet, dass, wenn die gleichen Mäuse wiederholt getestet werden, es sein kann,eine Abnahme der Gesamt Compliance (3B). Dieser Effekt kann nicht unter allen Prüfplänen oder in allen Arten von Mäusen beobachtet werden, und medikamentöse Behandlung oder sonstige Eingriffe könnten diesen Effekt zu verändern, aber es ist ein wichtiger Aspekt, wenn Studien mit dieser Methode zu planen. Darüber hinaus gibt es eine Verletzungsgefahr, wenn eine Maus in den Spalt fällt zwischen dem Laufband und dem Schock Gitter, während das Laufband läuft. Um dieses Risiko zu minimieren, Mäuse sorgfältig im gesamten Ausbildung und Prüfung sollten beobachtet ihre Sicherheit zu gewährleisten und die Verwendung von sehr jungen oder kleinen (<15 g) Mäuse sollten vermieden werden. Schließlich, obwohl Pilotdaten schlägt gesammelt, dass weibliche CD-1 und männliche und weibliche transgene Mäuse auf einem 129S1 / SvImJ Hintergrund wird diese Aufgabe auszuführen (Daten nicht gezeigt), bis heute ist dieses Protokoll vor allem Mäusen zu testen weibliche C57BL / 6NCr verwendet . Als solches ist zu beachten, dass andere Geschlechter und Mausstämmen in Trainings- und Testleistung unterscheiden. Zuletzt,obwohl Pilot erhobenen Daten, dass diese Aufgabe auf einem 129S1 / SvImJ Hintergrund CD-1 und männliche und weibliche transgene Mäuse weibliche schlägt vor (Daten nicht gezeigt), bis heute wird ausführen, hat dieses Protokoll in erster Linie verwendet worden, 9-10 Wochen alte weibliche testen C57BL / 6NCr Mäusen. Als solches ist zu beachten, dass Mäuse, unterschiedlichen Alters, des Geschlechts oder Dehnungen in Trainings- und Testleistung unterscheiden.
Während des Testens ist es entscheidend, dass Mäuse, die Ermüdungs Kriterien erfüllen, werden effizient und schnell entfernt, wie schlechte Entfernungstechnik zusätzliche Motivation kann vorgesehen werden, eine Maus weiter ausgeführt werden, was zu etwas anderem als Ermüdungsartiges Verhalten gemessen werden. Obwohl die spezielle Methode der Entfernung auf Experimentator Komfort abhängen wird, beinhaltet ein einfaches Verfahren zur Entfernung des Zeige- und Mittelfinger einer Hand. Jeder Finger sollte dem Eintritt in die Tretmühle Spur voneinander vor gerade und leicht auseinander gehalten werden und zeitnah um den Schwanz geschlossen, in der Nähe der Basis, oder über ter Scruff der Maus. Einmal sicher erfaßt, kann die Maus leicht entfernt werden.
Es ist wichtig, für Mäuse vertraut mit dem Schock Gitter zu sein Motivation zu schaffen, während des Tests zu laufen, aber häufige Erschütterungen während des Trainings kann zu Testleistung beeinträchtigen. Nach dem ersten Tag der Ausbildung, werden zu Fuß die meisten Mäuse auf dem Laufband erfolgreich und durch Laufen oder Hüpfen weg auf dem Laufband zu einem Schock reagieren, dann wieder aufnehmen zu Fuß zurück in Richtung Netz zu vermeiden treiben. Einige Mäuse können jedoch reagieren stark auf Schocks und / oder Wege zu finden, der die Aufgabe nicht durchführen, ohne dass zu empfangen. Mäuse, die stark auf die Stoßstromnetz reagieren können häufigere Schocks erhalten, verbringen weniger Zeit auf dem Laufband, und versuchen kann, aus der Tretmühle zu entkommen. Mit diesen Mäusen kann der Experimentator legen Sie eine behandschuhte Hand auf der Rückseite der Spur, um sanft die Maus ermutigen weiterlaufen. Um zu vermeiden, auf dem Laufband, können einige Mäuse eine Beschränkung des Stoßes gr auszunutzenIch würde. Das Gitter erfordert mindestens zwei Punkte von den direkten Hautkontakt (dh zwei oder mehr Pfoten berühren das Netz sein muss) , ein Tier zu schocken. Wenn also eine Maus darauf sitzt zwei Füße, ohne dass das Netz zu berühren, wird es nicht schockiert sein. Wenn dieses Verhalten beobachtet wird, kann der Experimentator sanft mit der Maus verschieben, um es dazu führen, dass seine Füße bewegen und einen Stromschlag erhalten oder mit der Maus heben, um es auf dem Laufband zu ersetzen. Wenn diese Maßnahmen erfolgreich sind, sollte die Maus beginnen auf dem Laufband zu Fuß konsequenter innerhalb von einigen Minuten und in Zukunft Schulungen. Wenn dieser Eingriff nicht erfolgreich ist, sollte die Maus aus der Studie entfernt werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Exer 3/6 Animal Treadmill | Columbus Instruments | 1050-RM Exer-3/6 | |
| Stopwatch | Daigger | EF24490M | |
| Wire brush | Fisher Scientific | 03-572-5 | |
| Compressed air | Dust-Off | FALDSXLPW | |
| Absorbent pads | Daigger | EF2175CX | |
| Butcher paper | Newell Paper Company | 4620510 | |
| Alcohol (70%) | Fisher Scientific | BP82011 |
References
- Hofman, M., Ryan, J. L., Figueroa-Moseley, C. D., Jean-Pierre, P., Morrow, G. R.
- Schwartz, A. L. Daily fatigue patterns and effect of exercise in women with breast cancer. Cancer Pract. 8 (1), 16-24 (2000).
- Schwartz, A. L., Mori, M., Gao, R., Nail, L. M., King, M. E. Exercise reduces daily fatigue in women with breast cancer receiving chemotherapy. Med. Sci. Sports Exerc. 33 (5), 718-723 (2001).
- Butler, J. M., et al. A phase III, double-blind, placebo-controlled prospective randomized clinical trial of d-threo-methylphenidate HCl in brain tumor patients receiving radiation therapy. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 69 (5), 1496-1501 (2007).
- Jean-Pierre, P., et al. A phase 3 randomized, placebo-controlled, double-blind, clinical trial of the effect of modafinil on cancer-related fatigue among 631 patients receiving chemotherapy: a University of Rochester Cancer Center Community Clinical Oncology Program Research base study. Cancer. 116 (14), 3513-3520 (2010).
- Mar Fan, H. G., et al. A randomised, placebo-controlled, double-blind trial of the effects of d-methylphenidate on fatigue and cognitive dysfunction in women undergoing adjuvant chemotherapy for breast cancer. Support. Care Cancer. 16 (6), 577-583 (2008).
- Moraska, A. R., et al. Phase III, randomized, double-blind, placebo-controlled study of long-acting methylphenidate for cancer-related fatigue: North Central Cancer Treatment Group NCCTG-N05C7 trial. J. Clin. Oncol. 28 (23), 3673-3679 (2010).
- Schwartz, A. L., Thompson, J. A., Masood, N. Interferon-induced fatigue in patients with melanoma: a pilot study of exercise and methylphenidate. Oncol. Nurs. Forum. 29 (7), E85-E90 (2002).
- Coletti, D., et al. Substrains of inbred mice differ in their physical activity as a behavior. Sci. World J. , 237260 (2013).
- Mahoney, S. E., Davis, J. M., Murphy, E. A., McClellan, J. L., Gordon, B., Pena, M. M. Effects of 5-fluorouracil chemotherapy on fatigue: role of MCP-1. Brain Behav. Immun. 27 (1), 155-161 (2013).
- Moriya, J., Chen, R., Yamakawa, J., Sasaki, K., Ishigaki, Y., Takahashi, T. Resveratrol improves hippocampal atrophy in chronic fatigue mice by enhancing neurogenesis and inhibiting apoptosis of granular cells. Biol. Pharm. Bull. 34 (3), 354-359 (2011).
- Sheng, W. S., Hu, S., Lamkin, A., Peterson, P. K., Chao, C. C. Susceptibility to immunologically mediated fatigue in C57BL/6 versus Balb/c mice. Clin. Immunol. Immunopathol. 81 (2), 161-167 (1996).
- Weymann, K. B., Wood, L. J., Zhu, X., Marks, D. L. A role for orexin in cytotoxic chemotherapy-induced fatigue. Brain. Behav. Immun. 37, 84-94 (2014).
- Wood, L. J., Nail, L. M., Perrin, N. A., Elsea, C. R., Fischer, A., Druker, B. J. The cancer chemotherapy drug etoposide (VP-16) induces proinflammatory cytokine production and sickness behavior-like symptoms in a mouse model of cancer chemotherapy-related symptoms. Biol. Res. Nurs. 8 (2), 157-169 (2006).
- Zombeck, J. A., Fey, E. G., Lyng, G. D., Sonis, S. T. A clinically translatable mouse model for chemotherapy-related fatigue. Comp. Med. 63 (6), 491-497 (2013).
- Lightfoot, J. T., et al. Strain screen and haplotype association mapping of wheel running in inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 109 (3), 623-634 (2010).
- Bartolomucci, A., et al. Individual housing induces altered immuno-endocrine responses to psychological stress in male mice. Psychoneuroendocrinology. 28 (4), 540-558 (2003).
- Martin, A. L., Brown, R. E. The lonely mouse: verification of a separation-induced model of depression in female mice. Behav. Brain Res. 207 (1), 196-207 (2010).
- Võikar, V., Polus, A., Vasar, E., Rauvala, H. Long-term individual housing in C57BL/6J and DBA/2 mice: assessment of behavioral consequences. Genes Brain Behav. 4 (4), 240-252 (2005).
- Salem, G. H., et al. SCORHE: a novel and practical approach to video monitoring of laboratory mice housed in vivarium cage racks. Behav. Res. Methods. 47 (1), 235-250 (2015).
- Courtney, S. M., Massett, M. P. Identification of exercise capacity QTL using association mapping in inbred mice. Physiol. Genomics. 44 (19), 948-955 (2012).
- Jørgensen, S. B., et al. Effects of alpha-AMPK knockout on exercise-induced gene activation in mouse skeletal muscle. FASEB J. 19 (9), 1146-1148 (2005).
- Knab, A. M., Bowen, R. S., Moore-Harrison, T., Hamilton, A. T., Turner, M. J., Lightfoot, J. T.
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debate, K. A., Kleeberger, S. R.
- Lightfoot, J. T., et al. Quantitative trait loci associated with maximal exercise endurance in mice. J. Appl. Physiol. 103 (1), 105-110 (2007).
- Azzinnari, D., et al. Mouse social stress induces increased fear conditioning, helplessness and fatigue to physical challenge together with markers of altered immune and dopamine function. Neuropharmacology. 85, 328-341 (2014).
- Kisiel-Sajewicz, K., et al. Myoelectrical manifestation of fatigue less prominent in patients with cancer related fatigue. PloS One. 8 (12), e83636 (2013).
- Smets, E. M. A., Garssen, B., Bonke, B., De Haes, J. C. J. M. The multidimensional Fatigue Inventory (MFI) psychometric qualities of an instrument to assess fatigue. J. Psychosom. Res. 39 (3), 315-325 (1995).
- Vercoulen, J. H. M. M., Swanink, C. M. A., Fennis, J. F. M., Galama, J. M. D., van der Meer, J. W. M., Bleijenberg, G. Dimensional assessment of chronic fatigue syndrome. J. Psychosom. Res. 38 (5), 383-392 (1994).
- Tsujimoto, H., et al. Tolerability of adjuvant chemotherapy with S-1 after curative resection in patients with stage II/III gastric cancer. Oncol. Lett. 4 (5), 1135-1139 (2012).
