Abstract
Proton Transfer Reaksiyonu (PTR), Uçuş Sürüşü (ToF) Kütle Spektrometresi (MS) ile birleşince, Direkt Enjeksiyonlu Kütle Spektrometri (DIMS) teknolojilerine ait kimyasal iyonizasyona dayalı analitik bir yaklaşımdır. Bu teknikler, yüksek hassasiyet ve doğruluğu garanti eden uçucu organik bileşiklerin (VOC) hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Genel olarak, PTR-MS, numunelerin gerçek zamanlı ve non-invaziv analizine izin veren ne numune hazırlama ne de numune imha edilmesini gerektirmez. PTR-MS, çevresel ve atmosferik kimyadan tıp ve biyoloji bilimlerine kadar pek çok alanda kullanılmaktadır. Daha yakın bir zamanda, otomasyon derecesini artırmak ve sonuç olarak tekniğin potansiyelini arttırmak için PTR-ToF-MS'yi otomatik bir örnekleyiciyle ve özel veri analiz araçlarıyla birleştirmeyi temel alan bir metodoloji geliştirdik. Bu yaklaşım, biyolojik işlemlerin ( örn., Enzimatik oksidasyon, alkollü fermantasyon) izlenmesini, büyük numune setlerinin taranmasını sağladı.Örneğin farklı kökenler, tüm germoplazmalar) ve VOC içeriği açısından birkaç deneysel modu (belirli bir bileşenin farklı konsantrasyonları, spesifik bir teknolojik parametrenin farklı yoğunlukları) analiz etmektir. Burada, metodolojimizin farklı muhtemel uygulamalarını örnekleyen deney protokollerini sunuyoruz: yani , yoğurtun laktik asit fermantasyonu sırasında çevrimiçi VOC'lerin saptanması (çevrimiçi biyolojik işlem izleme), farklı elma çeşitleriyle ilişkili VOC'lerin izlenmesi (büyük ölçekli tarama) Ve kahve içimi sırasında retronasal VOC salınımının in vivo çalışması (burun boşluğu analizi).
Introduction
Direkt Enjeksiyonlu Kütle Spektrometrik (DIMS) teknolojileri, yüksek hassasiyet ve dayanıklılıkla önemli miktarda ve zaman çözünürlüğü sağlayan, uçucu organik bileşiklerin (VOC) hızlı tespiti ve miktarının belirlenmesine olanak tanıyan analitik araçsal yaklaşımların bir sınıfını temsil eder 1 . Bu enstrümental yaklaşımlar, diğerlerinin yanı sıra, MS-e-burunları, Atmosferik Basınçlı Kimyasal İyonlaşma Kütle Spektrometresi (APCI-MS), Proton-Transfer-Reaksiyon Kütle Spektrometresi (PTR-MS) ve Seçilmiş İyon Akışı-Tüp Kütle Spektrometresi SIFT-MS) 1 . Her bir yaklaşımın avantaj ve dezavantajları: numune enjeksiyonunun türü, öncü iyonların kaynağı ve kontrolü, iyonizasyon sürecinin kontrolü ve kütle analizörü 1 , 2'ye bağlıdır.
Proton-transfer-reaksiyon kütle spektrometresi (PTR-MS), gerçek zamanlı ve wi'de izlemek için yirmi yıl önce daha geliştirildiHavadaki en uçucu organik bileşikler (VOC) düşük algılama limitleri (genellikle birkaç ppbv, hacimce milyarlık kısım) 3 , 4 . PTR-MS'in güncel kullanımları tıbbi uygulamalardan gıda kontrolüne, çevre araştırmalarına kadar değişmektedir 5,6 . Bu tekniğin temel özellikleri şunlardır: Hızlı ve sürekli ölçüm imkanı, yoğun ve saf ön iyonları kaynağı ve iyonizasyon koşullarını (basınç, sıcaklık ve sürüklenme gerilimi) kontrol etme olanağı. Bu özellikler, çok yönlü kullanımları yüksek standartta standartlaştırma 1 , 4 ile birleştirmeyi mümkün kılar. Aslında bu yöntem, uçucu bileşiklerin çoğunda (özellikle sudan daha yüksek bir proton çekim gücü ile nitelendirilen) dissosiyatif olmayan proton transferini tetikleyen hidronyum iyonlarının (H3O + ) tepkimelerine, proton oluşturan nötr bileşiklere(M) tepkimesine göre: H3O + + M → H2O + MH + . Diğer tekniklerden, örneğin APCI-MS'in aksine, öncü iyon üretimi ve numune iyonlaşması iki farklı alet bölmesine ayrılmıştır (PTR-MS cihazının şematik bir gösterimi Şekil 1'de verilmiştir). Hücreli katot iyon kaynağında su buharı ile elektrik boşalması, bir hidronyum iyonu ışını üretir. Bu fazdan sonra, iyonlar, VOC'lerin iyonizasyonunun gerçekleştiği sürüklenme tüpünü geçer. İyonlar daha sonra nabız atma bölümüne girer ve TOF bölümüne hızlandırılır. Uçuş zamanları boyunca iyonların kütle / yük oranı belirlenebilir 8 . Her bir ekstraksiyon pulsu, seçilen m / z aralığının 8'sinde tam bir kütle spektrumu oluşturur. İyon spektrumları hızlı bir veri toplama sistemi 7 ile kaydedilir. Tam bir spektrum tipik olarakSinyal seviyesinin gürültü seviyesine göre daha yüksek zaman çözünürlüğüne ulaşılabilmesine rağmen, bir saniyede elde edilir ve kalibrasyon 9 , 10 olmadan bile VOC üstü boşluk konsantrasyonunun kantitatif bir tahmini yapılabilir.
Şekil 1: Bir PTR-MS şematik gösterimi. PTR-MS cihazının şematik gösterimi. HC: içi boş katotlu dış iyon kaynağı; SD: kaynak kayması; VI, venturi tipi giriş; EM, elektron çarpanı; FC1-2, akış kontrolörleri. Boschetti ve diğerlerinin izniyle basılır . 7 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
11 . PTR, çevresel, atmosferik, gıda, teknolojik, tıbbi ve biyolojik bilimlerde kayda değer bir ilgi 12 .
Gıda matrisleri ile ilişkili VOC'ler, koku ve lezzet algısına ve dolayısıyla gıda kabulüne bağlı biyolojik fenomenlerin moleküler temelindeki önemli rolü nedeniyle, gıda bilimi ve teknolojisinde önemli bir yere sahiptir. Dolayısıyla, gerçek zamanlı ve VOC'lerin invazif olmayan saptanması konusundaki ilgimiz ağırlıklı olarak gıda duyusal nitelikleri ile ilgilidir. Buna ek olarak, salınan VOC'ler vasıtasıyla bozulma ve patojen mikroorganizmaları tespit etme olasılığını göz önüne alırsak ve / veya uçucu organik bileşikleri, belirteç olarak izlemek için folloKanat teknolojik süreçleri ( örn. Isıl işlemler süresince Maillard yan ürünleri) 14 , gıda kalite yönetiminde VOC tanımlama ve niceleme alanları nasıl belirgin hale gelir 6 . Gıda matrislerinde VOC'lerin hızlı izlenmesi ve miktarının tespiti için PTR-MS teknolojilerinin birkaç yeni kullanımı, bu analitik yaklaşımların geniş uygulama yelpazesine değinmektedir ( Tablo 1 ).
| Gıda matrisi | Uygulama şekli | Kısa açıklama | Referans |
| Tereyağı | Eleme / karakterizasyon | Avrupa yağlarının coğrafik kökenleri | 15 |
| yoğurt | Biyoproses kontrolü | Laktik asit ferlanma | 16 |
| Tahıl barları | In vivo ölçüm | Farklı şeker kompozisyonlarına sahip hububat barlarının tüketilmesi sırasında burun boşluğu | 17 |
| Sıvı model sistemleri | Simüle oral şartlar | Bir dilin ağzında dil basıncının ve oral koşulların değerlendirilmesi | 18 |
| elma | In vivo ölçüm | Farklı genetik, dokusal ve fizikokimyasal parametrelerle tüketim esnasında burun boşluğu | 19 |
| Kahve | Eleme / karakterizasyon | Özel kahvelerin farklılaşması | 20 |
| Üzüm zorunluluğu | Eleme / karakterizasyon | Pişirme işleminin etkisi | 21 |
| Aromalı şekerler | In vivo ölçüm | Farklı kullanan panelistler üzerinde belirlemeDirekt kütle spektrometresi yöntemleri | 22 |
| jambon | Eleme / karakterizasyon | Domuz yetiştirme sisteminin etkisi | 23 |
| Ekmek | Simüle oral şartlar | Çiğneme sırasında ekmek aromasını simule etmek | 24 |
| Süt | Eleme / karakterizasyon | Sütünüzdeki fotooksidasyona bağlı dinamik değişikliklerin izlenmesi | 25 |
| Kahve | Eleme / karakterizasyon | Farklı coğrafik kökenlerden kavrulmuş kahvelerdeki çeşitlilik | 26 |
| Ekmek | Biyoproses kontrolü | Alkollü fermantasyon sırasında farklı maya başlatıcılarının etkisi | 27 |
| Kahve | In vivo ölçüm | Farklı kavrulmuş kahve müstahzarlarının tüketilmesi sırasında burun boşluğu | 28 |
| Eleme / karakterizasyon | Üretim Yerinin, Üretim Sisteminin ve Çeşitliliğin Etkisi | 29 | |
| Ekmek | Biyoproses kontrolü | Un, maya ve bunların alkollü fermantasyon sırasında etkileşimi | 30 |
| Mantarlar | Eleme / karakterizasyon | Kurutulmuş porçini mantarlarının raf ömrü | 31 |
| yoğurt | Biyoproses kontrolü | Laktik fermantasyon sırasında farklı starter kültürlerin etkisi | 32 |
| elma | Eleme / karakterizasyon | Elma germplasm koleksiyonundaki çeşitlilik | 33 |
| Kahve | Eleme / karakterizasyon | Kahve kökenli iz | 34 |
| Kahve | In vivo ölçüm | A kombinasyonuKahve algılamasını anlamak için dinamik duyu yöntemi ve canlılık içi burun boşluğu analizi | 35 |
Tablo 1: Gıda sektöründe PTR-ToF-MS kullanan bilimsel çalışmaların listesi. Gıda ile ilgili deneylerde VOC içeriğini izlemek için PTR'ye dayalı yaklaşımları kullanan bilimsel çalışmaların kapsamlı olmayan listesi.
Son araştırmalarda örnekleme otomasyonunu ve güvenilirliğini artırmak için otomatikleştirilmiş bir örnekleme sistemi ve özel veri analiz araçları ile birlikte PTR-ToF-MS'in uygulanması ve sonuç olarak bu tekniğin potansiyelini 7 , 10 ve 13 artıracağını bildirdik. Bu, çeşitli deneysel modların VOC salınımı üzerindeki etkisini analiz etmek için, VOC içeriği bakımından büyük örnek setleri ( örn. , Birçok kopya içeren farklı kökenli gıdalar, tüm germoplazmalar) taramamıza izin verildi ( örn. Farklı konsantrasyonlarBelirli bir teknolojik parametrenin çeşitli yoğunlukları) ve belirli bir biyoprosese bağlı VOC'lerin ( örn., Enzimatik oksidasyon, alkollü fermantasyon) izlenmesi. Burada, tarımsal gıda sektöründe PTR-ToF-MS'in potansiyelini örneklemek için, üç paradigma uygulaması sunuyoruz: farklı mikrobik starter kültürleri tarafından indüklenen, yoğurtta laktik asit fermantasyonu sırasında çıkan VOC'lerin tespiti (on-line bioprocess monitoring ), Farklı elma çeşitleriyle ilişkili VOC'lerin izlenmesi (büyük ölçekli tarama) ve içilen kahve (burun boşluğu analizi) sırasında retronasal VOC salımının in vivo çalışması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol, insan araştırma etiği konusundaki kurumsal komitemizin yönergelerini izlemektedir.
1. Numune Hazırlama ve Otomatik Örnekleyici Koşulları
- Çevrimiçi biyolojik işlem denetimi: Yoğurtun laktik asit fermantasyonu sırasında salınan VOC'lerin tespiti
NOT: Protokolün bu kısmı Benozzi ve arkadaşlarının rapor ettiği prosedürün bir bölümünü temsil eder . 32- Her flakonun (PTFE / silikon septa ile donatılmış 20 mL cam şişelere) 5 mL pastörize süt ilave edin. Kullanılan sütün türüne dikkat edin ve numuneleri 45 ° C'ye kadar çabucak ısıtın. Sıcaklık kontrollü tepsi (45 ° C) ile donatılmış çok işlevli bir GC otomatik örnekleyiciye aktarın.
- Viyalları mikrobiyal starter kültürleri ile aşılamak için otobimetrenin robot kolunu kullanın (başlangıç kültürü üreticisinin spesifikasyonlarına göre). Kuluçka süresini arzu edilen yoğurt tipolojisine ve spesifikasyona göre ayarlayınBaşlangıç kültürü üreticisi tarafından bildirildi. Oto örnekleyiciyi, bir numuneyi birbiri ardına rahatça analiz etmek için ayarlayın, böylece yoğurt hazırlama esnasında laktik asit fermantasyonunun bir çevrimiçi VOC izlemesi elde edilir.
- Büyük ölçekli tarama: farklı elma genotipleri ile ilişkili VOC'leri izleme
NOT: Protokolün bu bölümü, Farneti ve ark. Tarafından rapor edilen prosedürün bir bölümünü temsil eder . 33 , 36- Olgunlaşma / koruma ( örneğin ticari hasat aşamasında) istenilen aşamada örnek elmalar. Her bir klona görünür herhangi bir hasar vermeden en az beş homojen meyve seçin. Elmaları oda sıcaklığında (25 ° C) istenilen süre için saklayın veya soğutun (4 ° C).
- Bir el bıçağı örnekleyicisi ile her elmadan beş silindirik disk (1,7 cm çap ve 1 cm kalınlık) toplayın. Korteks dokusunun bir kısmını ekleyin ve çekirdek kısmının tohumlarla önlenmesini sağlayın.Numuneleri derhal homojenize edin ve sıvı azot içinde dondurun. Analiz edilinceye kadar -80 ° C'de saklayın.
- Analiz öncesinde, her biyolojik çoğaltmadan 2.5 g elma örneğinin üç tekrarını şişelere (PTFE / silikon septayla donatılmış 20 mL cam şişelere yerleştirin). Numuneyi 2.5 mL deiyonize su, 1 g sodyum klorür, 12.5 mg askorbik asit ve 12.5 mg sitrik asit ile karıştırın ve numuneleri analiz edilene kadar (en fazla 3 gün) 4 ° C'de tutun.
- Numuneleri 40 ° C'de inkübe edin ve daha sonra otomatik örnekleyiciyi VOC'leri otomatik olarak analiz edecek şekilde ayarlayın.
- Burun boşluğu analizi: Kahve içme sırasında VOC'lerin retronasal salınımının incelenmesi
NOT: Protokolün bu bölümü, Romano ve ark. Tarafından rapor edilen prosedürün bir bölümünü temsil eder . 28- Hazır kahve örneklerinden demlenmiş kahve hazırlayın.
- Bir kahve makinesi kullanın: su / toz oranını, kullanılan maden suyunun türünü,Kahve türünün tipi ve kahve içeceğini elde etmek için uygulanan prosedür (miktarlar kahve makinesinin boyutunun bir fonksiyonudur).
- İtalya'da bir "moka" olarak bilinen, 450 mL su ve 30 g kahve tozu kullanılarak altı fincan tezgahlı bir kahve makinesi kullanın. Demlenmiş bir kahveyi bir kaba koyun ve bir termostatik su banyosuna (60 ° C) aktarın.
- Her bir kahve demlemek için 7.5 mL'lik alikotları bir plastik kapaklı bir polistiren kapa (40 mL) aktarın. Her bir panel üyesi meşrubatın protokole göre tadına bakmasını sağlayın: i) 30 saniye serbest solunum, ii) tek bir yudum kahve, ardından hızlı bir yutmak ve iii) ergonomik cam nozone içine 3 dakika solunum yapın 28 .
- Her gün kahve örnekleri ve panelistlerin sırasını rasgele seçerek, üç gün üst üste tüm deneyleri tekrarlayın.
- Panelistlerin burnuna silikon kauçukta tek kullanımlık bir ergonomik burun parçası uygulayarak örnekleme yapın. N'yi bağlaPanelist gövdeyle temas halindeyken yalnızca birinci kısımda ısıtılmayan bir PEEK tüpü vasıtasıyla PTR-ToF-MS'ye aktarılır, daha sonra örnekleme arabirimini PTR-MS ile bağlayan bir giriş hortumunda 110 ° C'de ısıtılır Enstrüman.
NOT: Tablo 2'de , Benozzi ve diğerleri tarafından bildirilenlere benzer prosedürlerle analiz edilen ürünlerin bir listesi verilmiştir . 32 , Farneti ve ark. 33 , 36 ve Romano ve ark. 28 bildirildi.
- Hazır kahve örneklerinden demlenmiş kahve hazırlayın.
| Gıda matrisi | Örneklerin sayısı ve türü | Referans |
| elma | Yazarlar, hem eski hem de yeni elma çeşitlerinden oluşan 190 katılımla temsil edilen bir koleksiyonu taradı | 33 |
| yoğurt | Dört başlayanlar, yoğurtun laktik fermantasyonu sırasında salınan VOC'ler açısından analiz edildi (A, FD-DVS YF-L812 Yo-Flex, Chr Hansen; B, FD-DVS YC-380 Yo-Flex, Chr Hansen; C, FD -DVS YC-X11 Yo-Flex, Chr Hansen; D, YO-MIX 883, Danisco) | 32 |
| Kahve | Saf bir Arap kahve karışımından elde edilen üç farklı öğütülmüş kahve kullanıldı: Orta kızartma, koyu küp ve kafeinsiz orta kızartma | 28 |
Tablo 2: Analiz edilen ürünlerin listesi. Benozzi ve diğerleri tarafından bildirilenlere benzer prosedürlerle analiz edilen ürünlerin listesi . 32 , Farneti ve ark. 33 , 36 ve Romano ve ark. 28
2. Deneysel Tasarım ve Pratik Önlemler
- En az üç günlük biyolojik çoğaltma gerçekleştirinTes, her biri üç teknik kopyayla, her deney modu için.
- Örnek inkübasyon ve analiz öncesinde, üst boşluğu her şişe için 1 dakika 200 sccm temiz havayla yıkayın.
- Her deney modu için boşluk hazırlayın, örnekleri aynı koşullar altında boşaltın ve analiz edin.
- Analiz için örneklerin / boşlukların sırasını rastgele oluşturun.
- VOC'leri tespit etmek için kullanılan diğer yöntemlere benzer şekilde, cihazı kullanmadan önce parfümlü kişisel bakım ürünlerinin yanı sıra sakız ve sigara kullanımını sınırlandırın. Laboratuardaki tüm uçucu kimyasalları iyice örtün ve test sırasında hava taslaklarını olabildiğince kontrol edin 37 .
3. PTR-MS Enstrüman Optimizasyonu ve Analizi
NOT: Enstrümental koşullar referanslarda açıklanmıştır ( örneğin, Makhoul ve diğerleri, 27 ).
- Bir commerci ile numunelerin tepe noktası ölçümlerini yapınAl PTR-ToF-MS cihazında standart konfigürasyon modunda.
- Herhangi bir işlem yapılmaksızın PTR-MS sürükleme tüpü üst boşluğuna hava akışı doğrudan enjekte edin. PTR-MS üzerinden sürekli bir örnek havası akışı vardır, böylece enjeksiyon, PTR-MS girişinin ucunu örnek başlığının içine sokarak gerçekleştirilir.
- Sürükleme tüpünde aşağıdaki iyonizasyon koşullarını ayarlayın ve sürekli olarak doğrulayın: 110 ° C sürüklenme tüp sıcaklığı, 2.30 mbar sürüklenme basıncı, 550 V sürüklenme gerilimi. Bu yaklaşık 140 Td (1 Td = 10 -17 cm 2 V - 1 s - 1 ) E / N oranına neden olur. Giriş hattı, 110 ° C'ye ısıtılmış bir PEEK kılcal borudan (iç çap 0.04 inç) oluşur. Varsayılan olarak, giriş akışını 40 sccm olarak ayarlayın.
- ToF alım kanal başına örnekleme süresini 0.1 ns olarak ayarlayın, m / z = 400'e kadar bir kütle spektrumu için 350.000 kanal. Her tek spektrum, 35'lik süren toplam 28.600 satın almanın toplamıdırΜs her biri, 1 saniyelik bir zaman çözünürlüğü ile sonuçlanır.
NOT: Spektrum daha sonra sürekli olarak saklanır. Spektrometrik sinyaller, arka plan seviyesinden istikrarlı bir değere birkaç saniyede (giriş hatlarındaki gazın değiştirilmesi için gereken süre) artar ve yalnızca bu geçici değerden sonra elde edilen spektrumlar, daha ileri analizlerde değerlendirilir.
4. Özelleştirilmiş Veri Analizi
NOT: Özelleştirilmiş veri analizi MATLAB'da bir prosedür kullanılarak geliştirilmiştir.
- Cappellin ve arkadaşları tarafından açıklandığı gibi Poisson istatistiğine dayanan bir metodoloji yardımıyla iyon dedektörü ölü zamanına bağlı sayım kayıplarını düzeltin . 10 .
- Cappellin ve ark. Tarafından açıklanan prosedüre göre dahili kalibrasyon gerçekleştirin . 38 (0.001 Th'ye kadar) iyi bir kütle doğruluğu elde etmek için.
- Elde edilen spektral verileri karşılaştırma standartlarının parçalanma verileriyle ve veri r ile karşılaştırarak bileşik açıklama gerçekleştirin.Bilimsel literatürde itiraz etti.
- Cappellin ve diğerlerine göre gürültü azaltma, temel kaldırma ve pik yoğunluğu çıkarma gerçekleştirin . 39 , doruklarına sığması için değiştirilmiş Gauss kullanıyor.
- Lindinger ve ark. Tarafından açıklanan formül vasıtasıyla ppbv cinsinden pik yoğunluğunu (hacimce milyar başına parça) hesaplayın . 5'de , reaksiyon hızı katsayısı için (k = 2.10 - 9 cm 3 s - 1 ) uygun reaksiyon hızı katsayısı veya sabit bir değer kullanılarak, altta yatan bileşik bilinmiyorsa. İkincisi, gerçek katsayı biliniyorsa, hesaplanabilen% 30'a varan bir sistematik hata getiriyor 40 .
- Ana Bileşen Analizi, Varyans Analizi, Tukey'nin post-hoc testi ve R'yi kullanarak geliştirilen mevcut paketleri adapte eden diğer istatistiksel test / analiz gerçekleştirerek verileri inceleyin ( örn. Cappellin ve ark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uçucu numune profili, her saniyede elde edilen arzu edilen kitle aralığı için eksiksiz bir kütle spektrumu oluşturdu. Şekil 2'de , çevrimiçi yoğurt biyoprosesindeki edinilmiş ortalama spektrumlara bir örnek verilmektedir 32 . Her spektrumda 250Th'ye kadar m / z aralığında 300'den fazla kütleli tepe noktası tanımlanabilir 32 .
Şekil 2: Yoğurt imalatı sırasında aşılanmış bir süt örneğinin ortalama PTR-ToF-MS spektrumu. Yoğurt üretiminde aşılanmış bir süt örneğinin ortalama PTR-ToF-MS spektrumunun düşük kütlesi bölgesi: 250 Tama kadar m / z aralığında 300'den fazla yığın doruk noktası tespit edilmiştir. Benozzi ve diğerlerinin izniyle basılır . 32 .Ove.com/files/ftp_upload/54075/54075fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız .
Aşağıdaki durumlarda, protokolde açıklanan üç uygulama için önerilen özel veri analizini kullanarak elde edilen sonuçları rapor ederiz. Tüm veri analizinin laboratuarımızda geliştirilen uyarlanmış yazılımla bir veya birkaç gün içinde yapılabileceğini vurguluyoruz 10 , 40 . Şekil 3'te , yoğurtun laktik asit fermantasyonu sırasında (çevrim içi biyolojik işlem izlemesi) VOC tespiti ile ilgili olarak, dört farklı ticari başlatıcı kültürü 32'ye karşılık gelen dokuz seçilmiş kütle tırnağının farklı fermantasyon kinetiğini göstermektedir. Moleküler zirve doymuşsa, bu örnekte asetaldehit için olduğu gibi, ilgili 13 C izotopolojisi, konsantrasyonun tahmin edilmesi için kullanılabilirkala biliyor.
Bu uçucu maddelerin çoğu, klasik mikrobiyal benzeri kinetik göstermiş ve ilk gecikme evresi izlemiş ve onu büyüme evresi ve post-log evresi 32 izlemiştir. İlginçtir ki, çevrimiçi analiz, ilk defa dört kükürt içeren bileşiklerin belirli bir tükenme kinetiğini vurgulamamızı sağladı ( örn . Metanetiyol için rapor edilen kinetik, Şekil 3e ).
Şekil 3: Dört farklı başlatıcı kültür kullanılarak yoğurt fermantasyonu sırasında dokuz seçilmiş yığın doruğunun fermantasyon kinetiği. Dokuz seçilmiş yığın doruğunun fermantasyon kinetiği: ( a ) asetaldehit, ( b ) diasetil, ( c ) 2-hidroksi-3-pentanon / pentanoik asit, ( d ) benzaldehit, ( e ) met( F ) asetoin, ( g ) butanoik asit, ( h ) 2-bütanon, ( i ) heptanoik asit (üç tekrarlama aracı ± standart sapma) (geçici belirleme). Açık daire (○), inoküle edilmemiş süt; Doldurulmuş üçgen (▲) ve dolu rhombi (♦), tek tek yoğurt fermantasyonunda kullanılan dört farklı mikrobiyal başlatıcıya karşılık gelir. Yıldızlar ticari başlayanlar arasında istatistiksel olarak önemli farklılıkları (ANOVA, p <0.05) göstermektedir. Benozzi ve diğerlerinin izniyle basılır . 32 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Son zamanlarda, geniş bir elma koleksiyonuyla ilişkili VOC'lerin 190 accessio tarafından temsil edildiğini tespit ettikNs (büyük ölçekli tarama için olası başvuru örneği) 33 . Koleksiyonla ilişkili tanımlanan VOC stok envanterine dayanan yatay dendrogram, esasen esterler ve alkoller tarafından belirlenen altı ana kümenin varlığını vurgulamaktadır ( Şekil 4 ). Bu bulgular, bir Alcohols / Esters indeksi tanımlamamıza ve onu elmaların ek bir karakterizasyonu olarak uygun yeni bir meyve kalitesi tanımlayıcısı olarak önermemize yol açtı 33 .
Şekil 4: PTR-ToF-MS'in 190 elma erişiminde değerlendirilen VOC kalıplarının ısı haritası ve iki boyutlu hiyerarşik dendrogramları. Isı haritası ve VOC kalıplarının iki boyutlu hiyerarşik dendrogramları, 190 elma erişiminde PTR-ToF-MS (25 ppbv eşiğinde) kullanılarak değerlendirildi. Elma çeşitleri sıralar halinde gruplanır ve kümelenirken, VOCBileşikler sütunlarla organize edilir. Çeşit kümeler 1'den 6'ya kadar numaralarla tanımlanır ve bileşik grupları A'dan D'ye harflerle tanımlanır. Farneti ve diğerlerinin izni ile yayımlanır . 33 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Bu bölümü, retronasal VOC salımının (burun boşluğu analizi) in vivo çalışmasında PTR-ToF-MS'in muhtemel uygulamasını kanıtlayan sonuçlar ile sonuçlandırıyoruz. Şekil 5 (sol taraf), radyasyon arsa vasıtasıyla temsil edilen beş kahve deneycisinin kümülatif profillerini, duyusal analiz için tipik bir grafiksel çözümü 28 açıklar. Bu çalışmada, tek bir saf Arap karışımı orta kızartılmış, koyu küp ve kafeinsiz orta öğütülmüş kahve örnekleri hazırlandı ve submBeş paneliste itiraz etti 28 . Sonuçlar, Şekil 5 (sağ taraf) 28 panelistler p1 ve p2 için açıkça görüldüğü üzere, panelistler arasında tekrarlanabilir ve ilgili farklılıklar olduğunu gösterdi.
Şekil 5: Seçilen bir parametre ( örn. Alan) ve üç kahve tipi için serbest bırakma profillerini temsil eden radyal arılar. Seçilen bir parametre ( örn. Alan) ve üç kahve türü (tek bir saf Arabica harmanından kaynaklanan orta kızartma, karanlık kızartma ve kafeinsiz orta kızartma) için serbest bırakma profillerini temsil eden radyal arılar. Solda: beş panelist için birikimli profiller; Sağdaki: İki seçilmiş panelist için bireysel profiller (yani p1 ve p2). Değerler, ilgili standart sapmalara bölünerek ölçeklendirildi. Üzerine yarım daire bantları Dış kenar boşlukları, geçici peak tanıma dayalı kimyasal sınıfları temsil eder. Çemberler kahve türleri arasında önemli farklılıkları göstermektedir (ANOVA ve Tukey testi, p <0.05). Romano ve diğerlerinin izni ile yayımlanmaktadır . 28 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: Hızlı GC PTR-ToF-MS kromatogramlarına örnek. Kırmızı bir şaraptan elde edilen kromatogramlar (altı tekrarlama) ve seçilen dört doruk noktası, geçici olarak esterlere atfedildi. Romano ve diğerlerinin izni ile yayımlanmaktadır . 45 .Et = "_ blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uçuş zamanına (TOF) bağlı kütle spektrometrisi (PTR-MS), uçucu organik bileşiklerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi ve hızlı analitik profillemenin gerekliliği arasında geçerli bir uzlaşmayı temsil eder. TOF kütle özümleyicisini karakterize eden yüksek kütle çözünürlüğü, önemli bilgi içeriğiyle ilgili duyarlılık ve kütle spektrumu verir / sağlar. Ayrıca, otomatik örnekleyiciyle birleştirilmiş PTR-ToF-MS uygulaması ve otomasyon derecesini arttıran uyarlanmış veri analiz araçları bu tekniğin potansiyellerini arttırır.
Uçucu bileşik tespitinin önemli olduğu birçok araştırma ve teknolojik alanda özellikle gıda bilimi ve teknolojisi hassasiyet, yüksek çözünürlük ve doğrudan analiz gerektirir. Bir taraftan, VOC analizi için referans yöntemler, daha spesifikliği sağlayan gaz kromatografisine dayanmaktadır; ancak,Ntrinsically daha yavaş ve benzer önlem veya konsantrasyon prosedürleri sadece fiyata benzer duyarlılık elde edebilirsiniz. Burun-boşluk gibi bazı hızlı analiz, GC tabanlı yöntemlerle gerçekleştirilemez. Diğer çalışmalar PTR-MS ve GC'yi tamamlayıcı yaklaşımlar olarak kullanan çok sayıda örneği ekrana getirir: PTR_MS, çok büyük örnek kümelerinin ölçümüne izin verirken, azaltılmış alt kümelerin GC analizi, PTR-MS verisinin daha iyi bir yorumu için ek bilgi sağlar 40 . Öte yandan, VOC analizi için, örneğin e-burun veya MS-e-burun veya belirli sensörlere dayalı olanlar gibi diğer hızlı yaklaşımlar önerilmiştir. Bunlar PTR-MS'e kıyasla çok daha ucuzdur, ancak genellikle çok düşük duyarlılık sağlarlar.
PTR-ToF-MS analizi gözlemlenen spektrometrik zirvelerin kütlesi hakkında bilgi sağlar, bu genellikle kesin bileşik tanımlaması için yeterli değildir. Üstelik, yumuşak kimyasal iyonizasyona rağmen proton trAnferreden kaynaklanan parçalanma her zaman önemsiz değildir. Bazı durumlarda, parçalanma paterni, geçici belirlemede yardımcı olabilir 41 . Bununla birlikte, PTR-ToF-MS'in analitik kabiliyetini geliştiren teknolojik çözümlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu noktada, tekniğin ilginç bir gelişimi, H 3 O + dışındaki birincil parent iyonların kullanılması ile temsil edilmektedir. Değiştirilebilir reaktif iyonu (SRI) sistemi 4 alternatif olarak aynı boşluklu katot kaynağında NO + ve O2 + gibi farklı ana iyonları üretebilir. Bu yaklaşım, iyonizasyon koşullarını ve dolayısıyla parçayı ve küme oluşumunu değiştirerek, saptanabilen ve bazı izomerik bileşiklerin 42 , 43 ayrılmasını sağlayan bileşik sayısını arttırır. Gıda bilimi ve teknolojisindeki birkaç uygulama mevcuttur, örneğin VOC detKurutulmuş jambonda 23 , kahve 34'te filizlenme ve meyvelerde etilen tayini 43 . Doğru bileşik tanımlamadaki güçlüklerle baş etmek için uygun olan bir diğer teknolojik çözüm, hızlı GC / PTR-TOF-MS metodolojisi 44 ile temsil edilmektedir. İndirgenmiş ayırma süreleri nedeniyle, hızlı GC, PTR-ToF-MS 44'ün analitik verimliliğinden ödün vermeksizin analitik kabiliyetleri genişletir. Tekniğin katma değeri, Şekil 6'da iyi bir şekilde gösterilmiş olup, kırmızı şarap 45'in baş boşluğundan geçici olarak ester parçaları olarak tanımlanan dört pik için elde edilen kromatogramlar gösterilmektedir. Aynı pik içerisindeki farklı izomerik parçacıkların önemli bir ayrışmasının yanı sıra, hızlı bir kromatografik ayırma basamağının ilginç bir arzu edilen yan etkisi, hızlı elüsyon ile (ve dolayısıyla önemli oranda ortadan kaldırılarak) temsil edildiN) etanol. Aslında, etanol, hidronyum iyonlarının azaltılması ve sonuçta dimerler ve trimerler (etanol kümeleri, etanol ve su kümeleri ve bunlara karşılık gelen fragmanlar) oluşumuna neden olarak, alkollü matrislerin PTR'ye dayalı analizinde istenmeyen bir etkiyi tetikler ve varlığa yol açar Doğru spektrum yorumlamasını büyük ölçüde tehlikeye atan dorukların 46'sı . Son zamanlarda gıda bilimi ve teknolojisinde henüz test edilmemiş PTR-MS cihazlarının duyarlılığını arttırmak için diğer gelişmeler önerilmiştir 47,48.
Sonuç olarak, otomatik örnekleme ve özel veri işleme ve analiz ile birleşen uçucu bileşiklerin hızlı ve non-invaziv PTR-ToF-MS analizi, gıda bilimi ve teknolojisindeki çeşitli temalara etkili bir şekilde hitap etmesini sağlayan ve diğer tekniklerle elde edilen sonuçları tamamlayan yeni bir araç sağlamaktadır .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTR-TOF 8000 High-Resolution PTR-TOF-MS | Ionicon Analytik Ges.m.b.H. | PTR-TOF 8000 | An detector for volatile organic compounds (VOCs) that allows for continuous VOC quantification with a very high mass resolution |
| GERSTEL MPS 2XL | Gerstel | A multifunctional autosampler | |
| Gas Calibration Unit | Ionicon Analytik Ges.m.b.H. | GCU-s / GCU-a | A dynamic gas dilution system that provides variable but known quantities of different standard compounds in a carrier gas stream |
| TofDaq | Tofwerk AG | free available at http://soft.tofwerk.com/ | A data acquisition software (for spectra acquisition) |
| MATLAB | MathWorks | http://it.mathworks.com/products/matlab/ | A technical computing language and interactive environment for algorithm development, data visualization, and data analysis |
| R | The R Foundation | free available at https://cran.r-project.org/mirrors.html | A language and environment for statistical computing and graphics |
References
- Biasioli, F., Yeretzian, C., Märk, T. D., Dewulf, J., Van Langenhove, H. Direct-injection mass spectrometry adds the time dimension to (B)VOC analysis. Trends Analyt Chem. 30 (7), 1003-1017 (2011).
- Berchtold, C., Bosilkovska, M., Daali, Y., Walder, B., Zenobi, R. Real-time monitoring of exhaled drugs by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 33 (5), 394-413 (2014).
- Hansel, A., et al. Proton transfer reaction mass spectrometry: on-line trace gas analysis at the ppb level. Int J Mass Spectrom Ion Process. 149, 609-619 (1995).
- Jordan, A., et al. An online ultra-high sensitivity Proton-transfer-reaction mass-spectrometer combined with switchable reagent ion capability PTR + SRI - MS). Int J Mass Spectrom. 286 (1), 32-38 (2009).
- Lindinger, W., Hansel, A., Jordan, A. On-line monitoring of volatile organic compounds at pptv levels by means of proton-transfer-reaction mass spectrometry (PTR-MS) medical applications, food control and environmental research. Int J Mass Spectrom Ion Process. 173 (3), 191-241 (1998).
- Biasioli, F., Gasperi, F., Yeretzian, C., Märk, T. D. PTR-MS monitoring of VOCs and BVOCs in food science and technology. Trends Analyt Chem. 30 (7), 968-977 (2011).
- Campbell-Sills, H., et al. Advances in wine analysis by PTR-ToF-MS: Optimization of the method and discrimination of wines from different geographical origins and fermented with different malolactic starters. Int J Mass Spectrom. , 42-51 (2016).
- Jordan, A., et al. A high resolution and high sensitivity proton-transfer-reaction time-of-flight mass spectrometer (PTR-TOF-MS). Int J Mass Spectrom. 286 (2-3), 122-128 (2009).
- Lindinger, W., Hansel, A., Jordan, A. Proton-transfer-reaction mass spectrometry (PTR-MS): on-line monitoring of volatile organic compounds at pptv levels. Chem Soc Rev. 27 (5), 347-375 (1998).
- Cappellin, L., et al. On data analysis in PTR-TOF-MS: From raw spectra to data mining. Sens Actuators B Chem. 155 (1), 183-190 (2011).
- Ellis, A. M., Mayhew, C. A. Proton Transfer Reaction Mass Spectrometry: Principles and Applications. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex. (2012).
- Blake, R. S., Monks, P. S., Ellis, A. M. Proton-Transfer Reaction Mass Spectrometry. Chem Rev. 109 (3), 861-896 (2009).
- Romano, A., Capozzi, V., Spano, G., Biasioli, F. Proton transfer reaction-mass spectrometry: online and rapid determination of volatile organic compounds of microbial origin. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (9), 3787-3795 (2015).
- Pollien, P., Lindinger, C., Yeretzian, C., Blank, I. Proton transfer reaction mass spectrometry, a tool for on-line monitoring of acrylamide formation in the headspace of maillard reaction systems and processed food. Anal Chem. 75 (20), 5488-5494 (2003).
- Maçatelli, M., et al. Verification of the geographical origin of European butters using PTR-MS. J Food Compost Anal. 22 (2), 169-175 (2009).
- Soukoulis, C., et al. Proton transfer reaction time-of-flight mass spectrometry monitoring of the evolution of volatile compounds during lactic acid fermentation of milk. Rapid Commun Mass Spectrom. 24 (14), 2127-3134 (2010).
- Heenan, S., et al. PTR-TOF-MS monitoring of in vitro and invivo flavour release in cereal bars with varying sugar composition. Food Chem. 131 (2), 477-484 (2012).
- Benjamin, O., Silcock, P., Beauchamp, J., Buettner, A., Everett, D. W. Tongue pressure and oral conditions affect volatile release from liquid systems in a model mouth. J Agric Food Chem. 60 (39), 9918-9927 (2012).
- Ting, V. J. L., et al. In vitro and in vivo flavor release from intact and fresh-cut apple in relation with genetic, textural, and physicochemical parameters. J Food Sci. 77 (11), 1226-1233 (2012).
- Özdestan, Ö, et al. Differentiation of specialty coffees by proton transfer reaction-mass spectrometry. Food Res Int. 53 (1), 433-439 (2013).
- Dimitri, G., et al. PTR-MS monitoring of volatiles fingerprint evolution during grape must cooking. LWT-Food Sci Technol. 51 (1), 356-360 (2013).
- Déléris, I., et al. Comparison of direct mass spectrometry methods for the on-line analysis of volatile compounds in foods. J Mass Spectrom. 48 (5), 594-607 (2013).
- Sánchez del Pulgar, J., et al. Effect of the pig rearing system on the final volatile profile of Iberian dry-cured ham as detected by PTR-ToF-MS. Meat Sci. 93 (3), 420-428 (2013).
- Onishi, M., Inoue, M., Araki, T., Iwabuchi, H., Sagara, Y. A PTR-MS-based protocol for simulating bread aroma during mastication. Food Bioproc Tech. 5 (4), 1228-1237 (2010).
- Beauchamp, J., Zardin, E., Silcock, P., Bremer, P. J. Monitoring photooxidation-induced dynamic changes in the volatile composition of extended shelf life bovine milk by PTR-MS. J Mass Spectrom. 49 (9), 952-958 (2014).
- Yener, S., et al. PTR-ToF-MS characterisation of roasted coffees (C. arabica) from different geographic origins. J Mass Spectrom. 49 (9), 929-935 (2014).
- Makhoul, S., et al. Proton-transfer-reaction mass spectrometry for the study of the production of volatile compounds by bakery yeast starters. J Mass Spectrom. 49 (9), 850-859 (2014).
- Romano, A., et al. Nosespace analysis by PTR-ToF-MS for the characterization of food and tasters: The case study of coffee. Int J Mass Spectrom. 365, 20-27 (2014).
- Muilwijk, M., Heenan, S., Koot, A., van Ruth, S. M. Impact of production location, production system, and variety on the volatile organic compounds fingerprints and sensory characteristics of tomatoes. J Chem. 2015, 981549 (2015).
- Makhoul, S., et al. Volatile compound production during the bread-making process: effect of flour, yeast and their interaction. Food Bioproc Tech. 8 (9), 1925-1937 (2015).
- Aprea, E., et al. Volatile compound changes during shelf life of dried Boletus edulis: comparison between SPME-GC-MS and PTR-ToF-MS analysis. J Mass Spectrom. 50 (1), 56-64 (2015).
- Benozzi, E., et al. Monitoring of lactic fermentation driven by different starter cultures via direct injection mass spectrometric analysis of flavour-related volatile compounds. Food Res Int. 69, 235-243 (2015).
- Farneti, B., et al. Comprehensive VOC profiling of an apple germplasm collection by PTR-ToF-MS. Metabolomics. 11 (4), 838-850 (2014).
- Yener, S., et al. Tracing coffee origin by direct injection headspace analysis with PTR/SRI-MS. Food Res Int. 69, 235-243 (2015).
- Charles, M., et al. Understanding flavour perception of espresso coffee by the combination of a dynamic sensory method and in-vivo nosespace analysis. Food Res Int. 69, 9-20 (2015).
- Farneti, B., et al. Untargeted metabolomics investigation of volatile compounds involved in the development of apple superficial scald by PTR-ToF-MS. Metabolomics. 11 (2), 341-349 (2014).
- Bean, H. D., Zhu, J., Hill, J. E. Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS). J Vis Exp. (52), e2664 (2011).
- Cappellin, L., et al. Extending the dynamic range of proton transfer reaction time-of-flight mass spectrometers by a novel dead time correction. Rapid Commun Mass Spectrom. 25 (1), 179-183 (2011).
- Cappellin, L., et al. On Quantitative Determination of Volatile Organic Compound Concentrations Using Proton Transfer Reaction Time-of-Flight Mass Spectrometry. Environ Sci Technol. 46 (4), 2283-2290 (2012).
- Cappellin, L., et al. PTR-ToF-MS and data mining methods: a new tool for fruit. Metabolomics. 8 (5), 761-770 (2012).
- Yeretzian, C., Jordan, A., Lindinger, W. Analysing the headspace of coffee by proton-transfer-reaction mass-spectrometry. Int J Mass Spectrom. 223, 115-139 (2003).
- Sulzer, P., et al. From conventional proton-transfer-reaction mass spectrometry (PTR-MS) to universal trace gas analysis. Int J Mass Spectrom. 321, 66-70 (2012).
- Cappellin, L., et al. Ethylene: Absolute real-time high-sensitivity detection with PTR/SRI-MS. The example of fruits, leaves and bacteria. Int J Mass Spectrom. 365, 33-41 (2014).
- Ruzsanyi, V., Fischer, L., Herbig, J., Ager, C., Amann, A. Multi-capillary-column proton-transfer-reaction time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1316, 112-118 (2013).
- Romano, A., et al. Wine analysis by FastGC proton-transfer reaction-time-of-flight-mass spectrometry. Int J Mass Spectrom. 369, 81-86 (2014).
- Aprea, E., Biasioli, F., Märk, T. D., Gasperi, F. PTR-MS study of esters in water and water/ethanol solutions: Fragmentation patterns and partition coefficients. Int J Mass Spectrom. 262 (1-2), 114-121 (2007).
- Sulzer, P., et al. A Proton Transfer Reaction-Quadrupole interface Time-Of-Flight Mass Spectrometer (PTR-QiTOF): High speed due to extreme sensitivity. Int J Mass Spectrom. 368, 1-5 (2014).
- Barber, S., et al. Increased Sensitivity in Proton Transfer Reaction Mass Spectrometry by Incorporation of a Radio Frequency Ion Funnel. Anal Chem. 84 (12), 5387-5391 (2012).
