Summary
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har den iboende evne til at differentiere og selv-organisere sig i forskellige væv mønstre; selvom dette kræver præsentation af rumlige miljømæssige gradienter. Vi præsenterer stencil micropatterning som en enkel og robust metode til at generere biokemiske og mekaniske gradienter til styring hPSC differentieringsmønstre.
Introduction
Humane pluripotente stamceller (hPSCs), herunder embryonale stamceller (hESCs) og inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs), er i vid udstrækning udnyttet i regenerativ medicin samt eksperimentel modellering af normale og syge organogenese på grund af deres differentiering potentiale i cellelinier af alle tre kim lag 1,2. Differentieringen skæbner hPSCs er meget følsomme over for de lokale miljømæssige faktorer, der kan modulere autokrine eller parakrine signalering 1 samt mechanotransduction processer medieret af fysiske signaler 3-5. Celle micropatterning omfatter et sæt af teknikker, der er udviklet til rumligt organiserer geometrien og placeringen af en cellepopulation som et middel til at styre den lokale cellulære mikromiljø, såsom celle-celle interaktioner 6 og celle-matrix-interaktioner 3. I forbindelse med hPSCs har celle micropatterning været ansat til at vinde betydelige indsigt i, hvordan niche-afhængigeent autokrine signalering modulerer hESC pluripotens-differentiering beslutninger 7 og organisation i tidlige embryonale differentiering mønstre 6. 2D og 3D mikromønstrede hPSCs er blevet anvendt til at styre koloni størrelsen af flercellede mønstre, som igen påvirkes beslutninger differentiering til de tre kimlag 8,9. Vi har ansat flercellede hPSC micropatterns at modulere omfanget af celle-celle- og celle-matrix-interaktioner inden for en hPSC koloni til at probe hvordan integrin-E-cadherin krydstale kan give anledning til celleskæbne heterogenitet 10. Demonstrationerne fra ovenstående rapporter åbne nye veje mod anvendelsen af flercellede micropatterns af hPSCs som eksperimentelle modeller for lægemiddeltoksicitet screening for udviklingsmæssige sygdomme 11, for at studere effekten af vækstfaktorer og hormoner under væv eller organ udvikling, og at optrævle dannelsen af væv mønstre.
Et utal af celle micropatterning teknikker er blevet udviklet som gennemgået af Falconnet et. al. 12, men kun en håndfuld, såsom mikro-kontakt udskrivning 7,8,13, mikrobrønd kultur 14,15, photopatterning 6 og microstencils 16 er blevet gennemført med succes med hPSCs. Udfordringen med micropatterning hPSCs ligger i deres sårbarhed og en stringent krav om specifikke ekstracellulære matricer (ECM) og vækstbetingelser for cellebinding og overlevelse. For 2D hPSC mønstre, mikro-kontakt trykning er en af de mest almindelige metoder til at generere hPSC micropatterns på vævskultur og glas substrater 13. Fremgangsmåden kan anvendes til pattern fælles ECM anvendt i hPSC kultur, herunder laminin og basalmembran matricer, såsom Matrigel. Men kræver det typisk en to-trins coating proces hjulpet af Poly-D-lysin, og kræver særlige inaktive atmosfæriske og fugtighedsforhold at gøre stabile ECM micropatterns for hPSCs at vedhæfte på 6,13. Den forreste overvejelse af hver micropatterning metode er, om overfladen modifikation regime kan generere hPSC-klæbende ECM mønstre på den ønskede geometriske opløsning samtidig minimere uspecifik celle tilknytning til de omkringliggende områder.
Her rapporterer vi brug af stencil micropatterning som en simpel metode til at generere hPSC micropatterns uden yderligere overfladebehandling skridt forud for generering af selvklæbende ECM mønstre for hPSCs at vedhæfte på. Cellen stencil består af en tynd membran, f.eks polydimethylsiloxan (PDMS) folie, med mikrometer til millimeter størrelse gennemgående huller forseglet på en cellekultur substrat til fysisk indeholde ECM overtræk og efterfølgende podet hPSCs. Som stencil mønster virker ved fysisk at indskrænke det sted, hvor hPSC kan få adgang til og vedhæfte direkte til den underliggende ECM substrat, denne metode er kompatibel med forskellige substrater, der kan understøtte hPSC kulturer. De eneste requirement er, at valget af stencil materiale kan danne et reversibelt tætning med substratet. Disse substrater indbefatter konventionelle vævskulturpolystyren (TCPS) 17, ligand konjugerede substrater 18, samt elastomere substrater med afstemmelig stivhed (f.eks., PDMS) 19. Denne metode giver også belægning af forskellige ECM, såsom vitronectin (eller VTN protein), laminin og kælder membran matricer (f.eks Matrigel og Geltrax) at give mulighed for en ordentlig vedhæftning og differentiering af hPSCs. Derfor kan vi overfører optimerede ECM-substrat konfigurationer til en specifik hPSC linje til stencil micropatterning for optimal celle-matrix adhæsion, overlevelse og differentiering. For nylig er også rapporteret en lignende metode til direkte hepatisk differentiering ved micropatterning hESCs anvendelse af poly (methylmethacrylat) (PMMA) mikro-stencil grupper 16.
Cell stencils kan være fremstillet af forskellige materialer, herunder opfyldtals 20,21, poly (p-xylylen) polymerer 22,23, PMMA 16 og mest almindeligt, PDMS 24-28. Silicium og poly (p-xylylengrupper) polymerer stencils kræver direkte ætsning af de gennemgående huller med specialudstyr 20-23, hvilket begrænser deres tilgængelighed for biologiske brugere. PDMS stencils kan fremstilles ved forskellige metoder afhængigt af funktionen størrelse, der kræves, hvilket typisk fra 3 um til 2.000 um 11,26-29. Hvis der ønskes små features, kan tynde stenciling ark fremstilles ved pressestøbning PDMS pre-polymer på en mikrofabrikeret silicium skabelon indeholdende relieffer af de micropatterns 28. For funktioner> 1.000 um, en CO 2 laserskærer giver en nem og billig metode til direkte skære mønstre på en præ-støbt PDMS ark under stencil opspind. Genanvendeligheden af PDMS stencils gør dem også omkostningseffektivt at gennemføre en række forsøg med tilstrækkelig konsistens.
10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol beskriver fremstillingen af PDMS stencil med 1.000 um mønstre ved laserskæring og micropatterning af hESC linje, H9 hjælp af PDMS stencil.
1. Design og Fremstilling af PDMS Stencil for Micropatterning
- Design af stenciling ark med gennemgående huller i den ønskede geometri og størrelse (f.eks, 1.000 um cirkler) og stencil pakning ved hjælp af computer-aided design software 10.
- Laser-cut stenciling plader og pakning på 120-150 um og 2 mm tyk polydimethylsiloxan (PDMS) ark henholdsvis ved hjælp af en CO 2 laser-cutter 10.
- Bond PDMS pakning med PDMS stencil ark med flydende uhærdede PDMS og bages ved 60 ° C i 3-4 timer for at opnå den PDMS stencil for micropatterning.
- Steriliser PDMS stencil ved autoklavering ved 120 ° C i 30 minutter og tørring i en ovn før brug.
2. hESCs Mainvedligeholdelse
- Kultur de hESC linjer i en feeder-fri vedligeholdelsesmedium på 1 × hESC-kvalificeret basalmembranmatrix overtrukket cellekulturplader ved 37 ° C og 5% CO2.
- Passage de hESCs når de er omkring 70% sammenflydende ved 3 minutters inkubation ved 37 ° C med dispase behandling og mekanisk dissociering af hESC kolonier i 100-200 um klumper. Plate de hESCs klumper med en densitet på 30-50 klumper pr 9,6 cm2 vækstområde på basalmembranmatrix-coatede vævskulturpolystyren ved 1: 6 opdeling ratio.
3. Stencil Micropatterning af humane embryonale stamceller
- Forberedelse til celle mønsterdannelse
- Forsegle en PDMS stencil på en 60 mm petriskål ved at dispensere 700 pi 70% analytisk kvalitet ethanol i ultrarent vand i petriskålen og placere stencil på toppen.
- Placer petriskålen inde biosikkerhed kabinet natten over for at lade than ethanol tør.
- Check eksisterer ingen boble under stencilen at sikre, at stencilen danner en god forsegling med petriskålen. Dette forhindrer udsivning af ECM coatingopløsning. Forsegl petriskålen og opbevares under sterile betingelser indtil den er klar til cellepodning.
- Forbered portioner af embryonale-kvalificeret basalmembranmatrix henhold til Certificate of Analysis. Sørg for, at hver alikvote udbytter 1 × embryonale kvalificerede basalmembran matrix løsning, når fortyndet i 25 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) i henhold til producentens produktblad.
- Forbered ECM overtræksopløsningen ved at tilsætte en aliquot af hESC-kvalificeret basalmembranmatrix i 16,7 ml DMEM / F12 for at gøre 1,5 × hESC-kvalificeret basalmembranmatrix opløsning. Hold alle ECM belægningsopløsningen på is for at forhindre gelering.
- Supplement hESC vedligeholdelse medium med 10 pM ROCK inhibitor (Y27632).
- Behandl petriskålen med 100 WO 2 plasma til 90 sek. For at sikre sterilitet, kun åbne petriskålen inderside plasmakammeret før plasmabehandling, og hurtigt dække tilbage petriskålen efter afsluttet behandling. Dette letter overfladebefugtning og forhindrer luft bobledannelse i micropattern gennemgående huller under tilsætningen af ECM coatingopløsning.
- Tilføj 450 pi 1,5 × embryonale kvalificerede basalmembran matrix løsning til at dække hele stencil. Forsegl petriskålen med selvtætnende film, såsom Parafilm, for at forhindre opløsningen i at tørre ud, og der inkuberes i 5 timer ved 37 ° C før brug.
- Seeding hESCs onto stenciled substrat
- Undersøg hESC kolonier i 6-brønds plade til at identificere de differentierede celle områder, der viser tab af typiske embryonale morfologi (fx tab af afrundede, stramt packed epitelial morfologi, høj kerne / cytoplasma forholdet med fremtrædende nucleoli). Fjern differentierede områder ved hjælp af et vakuum aspirator.
- Vask to gange med 2 ml DMEM / F12 per brønd.
- Der tilsættes 1 ml fordøjelsesenzymer, såsom Accutase, pr brønd af 6-brønds plade og inkuberes ved 37 ° C i 8 min. Tryk pladen forsigtigt for at frigøre alle kolonier fra underlaget.
- Skyl hver brønd med mindst 4 ml DMEM / F12 per 1 ml fordøjelsesenzymer og indsamle cellesuspensionen i 15 ml konisk rør.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 200 x g i 3 min ved stuetemperatur.
- Aspirer at fjerne supernatanten, og der tilsættes 400 pi embryonale vedligeholdelse medium suppleret med ROCK-hæmmer (Rocki) at re-suspendere cellerne. Pipette cellesuspensionen op og ned 3 gange forsigtigt at bryde klumper i enkelte celler.
- Bland enkelt cellesuspension godt og fortyndes 10 pi celleprøver i 190 pi DMEM / F12 (1:20 fortynding). Brug en hemocytometer at bestemme celletætheden i bestanden cellesuspension.
- Beregn den nødvendige cellepodning densitet for en given stencil.
BEMÆRK: For eksempel har vi bestemt eksperimentelt cellen podningstæthed at opnå et sammenflydende monolag af enkelte celler er ca. 4.444 celler / mm2. Således vil en stencil med et areal på 450 mm2 og såning volumen på 400 pi kræve en cellesuspension at være ved en densitet på 2 millioner celler / 400 pi. - Fortynd bestanden cellesuspensionen til den ønskede seeding tæthed (se trin 3.3.8 OBS) med embryonale dyrkningsmedium suppleret med Rocki.
- Tilføj et udpeget volumen af cellesuspension indeholdende det nødvendige antal celler i hver stencil og efterlade petriskålen uforstyrret i hætte i 5 minutter ved stuetemperatur for at tillade cellerne at sætte sig.
- Overfør petriskålen i inkubator og inkuberes i 1 time for at tillade cellevedhæftning. Vær omhyggelig med at holde fadet niveau Petri underoverføre proces, således at cellerne forbliver som et monolag i stencilen.
- Stencil fjernelse og passivering af unpatterned substrat
- Undersøg petriskålen under et mikroskop for at kontrollere, om celler er korrekt fastgjort på det underliggende substrat.
- Aspireres væk cellesuspension fra stencilen.
- Tilsæt 2 ml / skål af 0,5% cellekultur kompatibel nonionisk overfladeaktivt middel i DMEM / F12 til området omkring stencil.
- Brug et par autoklaveres pincet til forsigtigt skrælle stencilen. Swirl det ikke-ioniske overfladeaktive opløsning rundt som stencilen skrælles for at forhindre cellerne i at tørre ud. observere visuelt mikromønstrede-celler i petriskålen.
- Inkubér mikromønstrede-cellerne i 0,5% ikke-ionisk overfladeaktivt-DMEM / F12-opløsning i 10 minutter ved 37 ° C.
- Aspirer væk det ikke-ioniske overfladeaktive-DMEM / F12-opløsning. Vask 3 gange med 2 ml / skål af DMEM / F12.
- Tilsæt 2 ml / skål af embryonale menneskelige stamcellervedligeholdelsesmedium suppleret med Rocki og inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Efter inkubation natten over, aspireres hESC vedligeholdelsesmedium suppleret med Rocki, vaskes en gang med DMEM / F12 og inducere mesoendoderm differentiering ved tilsætning af 2 ml / skål af differentiering medium suppleret med 100 ng / ml activin, 25 ng / ml BMP4 og 10 ng / ml FGF2 .
- Vurdere micropatterns hjælp fase kontrast imaging og beregne de gennemsnitlige Brachyury (T) intensitet profiler for hvert mønster som tidligere 8 beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne artikel beskriver vi fremstilling af en celle stencil ved hjælp af en laser cutter til at generere 1.000 um funktioner. Stencilen bestod af 2 dele: en tynd stenciling ark (ca. 100-200 um tyk) indeholdende micropattern gennemgående huller, og en PDMS pakning til at indeholde ECM overtræksopløsningen eller celle suspension. Her blev 127 um og 2 mm tykke kommercielt tilgængelige PDMS plader anvendt som stenciling ark og pakning henholdsvis. Andre fremgangsmåder til fremstilling af PDMS ark styrbar tykkelse, såsom spin-coating, kan også anvendes til at fremstille delene. De to komponenter blev bundet sammen ved hjælp af flydende uhærdede PDMS præpolymer-tværbinder blanding som klæbemiddel eller plasma binding, og bagt ved 60 ° C i 3-4 timer (fig. 1).
Materialet til stenciling ark blev udvalgt baseret på valget af den cellekultur substrate. Når anvendelse af konventionel vævskulturpolystyren (TCPS) som kulturen substrat, kan PDMS stencils anvendes, da overholdelse af PDMS stenciling arket vil danne en god forsegling med stive TCPS (E ~ 3 GPa) (fig. 2A). I eksperimentelle design, hvor man ønsker at undersøge rumlig uensartethed stamceller skæbne på blødere cellekultur substrater, såsom elastomere PDMS substrater med en afstemmelig stivhed området fra 5 kPa til 2 MPa 30, kan stivere stenciling materialer anvendes. Som et eksempel, demonstrerede vi brug af en polyethylenterephthalat (PET) stencil (E ~ 2 GPa) for at frembringe 1 mm mikromønstrede hPSC kolonier på blødere PDMS substrat med en stivhed på ~ 5 kPa (fig. 2B). PET stencil blev fremstillet ved at lime en PDMS pakning på et stenciling ark lavet af kommercielt tilgængelige PET-film (fig. 2B, indsat). Vi bemærker, at den krævede cellebinding tidspunkt under micropatterningprocessen var længere (~ 3 timer) på blødere PDMS substrat af stivhed ~ 5 kPa sammenlignet med konventionelle TCPS substrater.
Vi udnyttede stencil mikromønstrede hESC kolonier at vise, at rumlig heterogenitet i celle-vedhæftning medierede mekaniske kræfter kunne mønster tidligt mesoendoderm differentiering. Vi har tidligere vist, at H9 hESCs på kolonien periferien oplevet højere integrin sammenvoksninger end celler på kolonien interiør, hvilket resulterede i deres præferentielle differentiering i Brachyury (T) -positive mesoendoderm celler, når induceret med activin, BMP4 og FGF2 31 (fig. 3A ). Når cellerne blev mønstret i forskellige geometrier (cirkel, firkant, rektangel og halvcirkelformet ARC) ved en konstant koloni område, geometriske anisotropi ved hjørnerne af kvadrater, rektangler og konvekse krumninger førte til en lokal koncentration af integrin-medieret trækkræfter og resulterede i øget mesoendoderm differentiering 32,33. Ved kortlægning T ekspression intensitet på forskellige lokaliteter inden for en enkelt koloni, rent faktisk konstateret, vi, at graden af mesoendoderm induktion var højere i skarpe hjørner af kvadratiske og rektangulære kolonier (fig. 3B) og ved konvekse krumninger af en halvcirkelformet bue (Fig . 3C), hvilket svarede til rapporterede høje integrin-medieret stress regioner i en anisotrop geometri 32,33. Derfor kan micropatterning anvendes til at modulere den rumlige fordeling af celleadhæsion medieret mekaniske kræfter inden en intakt hPSC koloni som et middel til at kontrollere den efterfølgende differentiering proces.
Figur 1. Generering af PDMS stencil for micropatterning. (A) Skematisk repræsenterer de kritiske trin i stencil opspind. En 127 um tyk PDMS ark var laser-cut at frembringe de designede mønstre, og yderligere 2 mm tyk PDMS ark laserskåret for at fremstille pakningen. Disse to komponenter blev bundet sammen med uhærdede PDMS at samle stencil. (B) Billeder af montering af komponenterne til at danne en PDMS stencil med 1 mm cirkulære gennem huller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. mikromønstrede hESC kolonier (1.000 um cirkler) på forskellige kultur substrater. Mikroskopiske billeder af embryonale micropattern koloni umiddelbart efter fjernelsen af (A) PDMS stencils (indsat), der bruges til at generere hESC micropatterns på stive substrater, f.eks TCPS stivhed ~ 2 GPa, og (B) PET stencils (indsat), Der anvendes til at generere micropatterns på blødere underlag, fx PDMS af stivhed ~ 5 kPa. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Effekt af hESC micropatterns af forskellige geometriske former på deres mesoendoderm differentiering 8. (A) hESC micropatterns af forskellige geometriske former, men samme koloni område blev genereret ved hjælp af PDMS stencils. Fase billeder (øverste panel) og kort intensitet af T-ekspression (nederste panel) efter 24 timer af mesoendoderm differentiering. (B) Gennemsnitlig T intensitet profiler (langs hvide stiplede linjer i (A)) i isometrisk cirkulære kolonier eller anisometric firkantede og rektangulære kolonier . Alle kolonier havde samme område ex cept cirklen 50%, som havde halvdelen af kolonien område. (C) Gennemsnitlig T intensitetsprofiler fra den konkave eller konvekse kanter i kolonien interiør i en halvcirkelformet bue, som angivet ved hvide punkterede linier i (A). Hver intensitet profil i (BC) er et gennemsnit på 16 intensitetsprofiler opnået fra 4 kolonier. Billeder er re-trykt med tilladelse fra Toh et. al., 8. Scale bar = 200 um og RFU er relativ fluorescens enhed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Skematisk fremstilling af arbejdsgangen at micropattern hESC kolonier og inducerer differentiering. Vigtige skridt for en vellykket generation af hESC micropatterns er fremhævet i grå bokse..com / filer / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fabrikation af micropatterning stencils
Stencil micropatterning giver en ideel metode til at generere hPSC micropatterns til undersøgelse niche-medieret differentiering mønster. Den vigtigste fordel ved stencil mønster i forhold til andre micropatterning teknikker, såsom microcontact udskrivning og photopatterning, er, at det ikke kræver overfladebehandling og kan implementeres på konventionelle TCPS substrater. Derfor kan optimerede dyrkningsmedier og ECM belægninger til forskellige hPSC linjer let overføres til stencil micropatterning.
Der er en række vigtige trin under fremstillingen af cellen stencil, der bidrager til frembringelsen af gode micropatterns. Den troskab gengive de designede geometrier i hPSC micropatterns afhænger af kvaliteten og sammenhængen i gennemgående hul fabrikation i stenciling ark. For undersøgelser med flercellede micropatterner af> 1000 um, den gennemgående huller kan fremstilles direkte ved laserskæring på en pre-støbt PDMS ark. Opløsningen af laserskæring er afhængig af punktstørrelse af laserstrålen og præcisionen af mekaniske bord kontrollere udviklingen i laserstrålen. Ved konventionelle CO 2 laserskærer, fandt vi, at det kan producere cirkulære eller krumme funktioner med god nøjagtighed, men ikke geometrier med skarpe hjørner (f.eks., Firkant). Ved anvendelser, hvor små eller skarpe træk der ønskes, de gennemgående huller i stenciling ark kan fremstilles ved at støbe PDMS på en mikrofabrikeret silicium skabelon indeholdende relieffer af de micropatterns 28. Udfordringen i støbning metode er at producere mikro-størrelse gennemgående huller i tynde PDMS ark uden resterende PDMS over silicium skabelon relieffer. Adskillige strategier er blevet udviklet til at løse dette problem, som beskrevet af Li et. al. 28
Under den somde monteres i stenciling ark og pakning til frembringelse cellen stencil, bør man sørge for, at stenciling arket er fladt og fri for støv under bindingsprocessen for at undgå lækager fra stencilen. Krølning af stenciling arket under bindingsprocessen kan kompromittere forseglingen af stencil til kulturen substrat, forårsager ECM og celle-løsninger til at lække fra micropattern gennemgående huller. Stencilen bør steriliseres ved autoklavering (120 ° C, 30 min) og grundigt tørret i en ovn for at sikre, at den kan danne en god forsegling med kultur substrat.
En anden vigtig faktor er udvælgelsen af stenciling plademateriale. PDMS stencil er ideel til micropatterning hPSCs onto stive kultur substrater, såsom TCPS med en stivhed på ~ 2 GPa. Men hvis man ønsker at micropattern hPSCs onto blødere underlag, såsom på PDMS substrater almindeligvis anvendes til at tune celle substrat stivhed 34, hvorvidt en PDMSstenciling ark vil gøre det vanskeligt at skrælle stencilen efter cellepodning proces, derfor ødelægge de hPSC micropatterns. I dette tilfælde skal udvælges således, at materialet valg for stenciling ark af stencil at den kan danne en forsegling med kultur substratet, men kan skrælles problemer.
Generering hPSC micropatterns
Protokollen for micropatterning H9 hESCs på TCPS substrater ved hjælp af en PDMS stencil præsenteres her er optimeret til at opnå et sammenflydende koloni med god cellelevedygtighed og mønster troskab. Det er vigtigt, at hPSCs danner korrekte celle-celle- og celle-matrix-interaktioner inden den rumlige indeslutning af en særlig geometri defineret af micropatterns så man kan undersøge, hvordan geometri-afhængige faktorer har indflydelse differentieringsfaktorer skæbne. Vi har identificeret et par kritiske skridt til succes generere hPSC micropatterns (fig. 4)og de behandles på følgende måde.
Det første er kvaliteten af hPSC kultur betyder noget. Det er vigtigt at høste hPSC kolonier ved 70-80% konfluens, med størstedelen af kolonier viser udifferentieret hPSC morfologi og samtidig fjerne de differentierede områder. Over-sammenflydende hPSC kulturer normalt forårsage spontan differentiering, og hvis de differentierede områder ikke er fjernet før cellepodning, vil de differentierede celler forstyrre normal differentiering mønsterdannelse.
For det andet, når der høstes hPSC kolonier til enkelt cellesuspension, undgå overdreven behandling med fordøjelsesenzymer er kritisk, fordi dette ofte resulterer i celledød efter inkubation natten over, selv om cellerne kan vedhæfte indledningsvist. Vi fandt, at 8 minutter af enzymatisk behandling er optimal for H9 hESC linje dyrket i vores laboratorium; selvom vi anbefaler, at cellen løsgørelse behandlingstid bør optimeres separat for forskellige cellelinier.
Endelig er der et behov for at passivere substratet omgiver hPSC micropatterns med ikke-celleadhæsive molekyler for at begrænse prolifererende eller differentierende celler til inden for micropattern. Det er vigtigt at opretholde den troskab af hPSC micropattern, og til gengæld, at den biokemiske og mekaniske miljø gradient for differentiering mønstre udvikle sig. Cellekultur kompatible nonioniske overfladeaktive midler, såsom Pluronic F-127 kan anvendes som et passiverende middel. Når passivering med overfladeaktive bør behandlingen tid og koncentration optimeres grund overfladeaktivt s cytotoksicitet ved lang eksponering. Som vi diskuterede ovenfor præsenterede protokol giver en detaljeret vejledning til micropattern hPSCs ved hjælp af en PDMS stencil, men optimering af denne protokol, især for de ovennævnte kritiske trin, opfordres til successfully generere hPSC micropatterns.
En begrænsning ved stencil micropatterning er, at det er mere egnet til at generere større micropatterns spænder fra 100-1,500 um. For at generere meget små features bestemt til enkelt celle mønsterdannelse, fremstilling af stenciling ark med <50 um gennemgående huller er meget udfordrende som tidligere nævnt. Vi forventer derfor, at brugen af stencil mikromønstrede hPSCs er velegnet til at undersøge flercellede væv mønster dannelse under forskellige udviklingsmæssige processer (f.eks neuroepithelium folde eller endoderm mønsterruller).
Ved at bruge micropatterning til geometrisk begrænse en hPSC befolkning, kan vi etablere celle-vedhæftning medieret mekaniske 10 og parakrine signalsystemer gradienter 6 for at styre og forstå den rumlige organisering af de resulterende differentiering skæbner. Disse mikromønstrede hPSC modeller med rumligt organiserede differentiation kan igen omsættes til human-specifik sygdoms- eller teratogen screening modeller 11 til medfødte fosterskader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af NUS Start tilskud (R-397-000-192-133) og ETPL Gap Fund (R-397-000-198-592). GS er en NUS Research lærd. Forfattere vil gerne takke Dr. Jiangwa Xing for hendes teknisk support på celle micropatterning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
