Summary
인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 차별화 별개의 조직 패턴으로 자기 조직하는 고유 능력을 가지고; 이 공간 환경 그라데이션의 표현을 필요로하지만. 우리 hPSC 분화 패턴을 제어하기위한 생화학 적 및 기계적 그라디언트를 생성하는 간단하고 강력한 방법으로서 공판 미세 패턴을 제시한다.
Introduction
배아 줄기 세포 (hESCs는)와 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)를 포함하여 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는, 널리 모든 세포 계통으로 인해 분화 가능성의 정상 및 병에 걸린 기관 형성의 실험 모델링뿐만 아니라 재생 의학에 이용된다 삼 배엽 1, 2. hPSCs의 분화 운명은 물리적 단서 3-5에 의해 매개 분비 또는 1 신호 분비뿐만 아니라 mechanotransduction 과정을 조절할 수 지역의 환경 요인에 매우 민감하다. 셀 미세화 공간적 예컨대 세포 - 세포 상호 작용 (6) 및 세포 - 매트릭스 상호 작용 (3)로서, 로컬 셀룰러 미세 환경을 제어하는 수단으로 세포 집단의 형상과 위치를 조직하기 위해 개발 된 기술의 집합을 포함한다. hPSCs의 맥락에서, 셀의 미세화가 틈새 - 의존 방식으로 유의 한 통찰력을 얻기 위해 사용되어왔다엔트 분비 신호는 초기 배아 분화 패턴 (6)에 hESC의 다 능성 분화 결정 (7)과 조직을 변조한다. 2D 및 3D 미세 패턴 hPSCs 차례로 세 개의 배엽으로 분화 8,9 결정 영향 다세포 패턴의 콜로니의 크기를 제어하기 위해 사용되어왔다. 우리는 인테그린-E-cadherin의 누화 세포 운명 얼룩이 열을 일으킬 수 있는지 조사하는 hPSC 콜로니에서 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용의 정도를 조절하는 다세포 hPSC의 미세 패턴을 채용 하였다. 조직 또는 장기 개발 과정에서 성장 인자와 호르몬의 효과를 연구하기 위해 개발 질병 (11)에 대한 약물 독성 검사를위한 실험 모델로 hPSCs의 다세포 미세 패턴의 적용으로 위의 보고서 열려있는 새로운 길에서 데모, 그리고의 형성을 해명하기 조직 패턴.
세포 micropatter의 수많은Falconnet 등의 검토로 닝 기술이 개발되어왔다. 등. (12) 그러나 마이크로 접촉이 7,8,13 인쇄 등 소수에 불과는 마이크로 웰 문화 14, 15, 포토 패터닝은 6 microstencils (16)이 성공적으로 hPSCs로 구현되었다. 미세화의 hPSCs와 도전은 자신의 취약점과 세포 부착과 생존을위한 특정 세포 외 기질 (ECM) 및 성장 조건의 엄격한 요구 사항에 자리 잡고 있습니다. 2D hPSC 패턴의 경우, 마이크로 컨택트 프린팅 조직 배양 및 유리 기판 (13)에 hPSC에 미세 패턴을 생성하기위한 가장 일반적인 방법 중의 하나이다. 상기 방법은 마트 리겔 라미닌 및 기저막 매트릭스를 포함 hPSC 배양에서 사용 패턴 ECM 공통으로 사용될 수있다. 그러나, 일반적으로 폴리 D 라이신의 도움 두 단계의 코팅 공정이 필요하며,이 hPSCs 6,13-에 부착 안정 ECM의 미세 패턴을 특정 불활성 대기 습도 조건을 필요. 각각의 미세 가공 방법의 가장 중요한 고려 사항은 주변에 비특이적 세포 부착을 최소화하면서 표면 개질 체제 원하는 기하학적 해상도 hPSC 접착 ECM 패턴을 생성 할 수 있는지 여부이다.
여기서는 hPSCs가 부착하기위한 종래 접착제 ECM 패턴의 발생을 추가로 표면 개질 단계없이 hPSC에 미세 패턴을 생성하기위한 간단한 방법으로서 공판 미세화의 사용을보고한다. 셀 스텐실 관통 구멍 물리적 ECM 코팅이어서 hPSCs 시드를 포함하는 세포 배양 용 기재 상에 밀봉 크기 밀리미터 미크론으로, 얇은 막, 예를 들면, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 시트를 포함한다. 스텐실 패턴은 물리적으로 hPSC가 기본 ECM 코팅 된 기판에 직접 액세스하여 첨부 할 수 있습니다 위치를 억제하여 작동,이 방법은 hPSC 문화를 지원할 수있는 다양한 기판과 호환됩니다. 유일한 requirement는 스텐실 재료의 선택은 기판과 가역적 시일을 형성 할 수 있다는 것이다. 이 기판은 기존의 조직 문화 폴리스티렌 (FPC 기판) (17), 리간드 결합 된 기판 (18)뿐만 아니라 가변 강성과 탄성 기판을 포함한다 (예., PDMS) 19. 이 방법은 또한, 적절한 부착 및 hPSCs 분화를 허용하는 그러한 비트로 넥틴 (VTN 또는 단백질), 라미닌 및 기저막 매트릭스 (예, 마트 리겔과 Geltrax)로 상이한 ECM의 코팅을 허용한다. 특정 hPSC 라인 그러므로 우리는 최적화 전송할 수 있습니다 ECM-기판 구성은 최적의 세포 - 매트릭스 접착, 생존 및 분화에 대한 미세 가공 스텐실합니다. 최근, 유사한 방법이 또한 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)를 사용하여 미세화 hESCs는 (PMMA) 공판 마이크로 어레이 간 (16)에 의해 분화를 유도하는 것으로보고되고있다.
셀 스텐실은 다른 재료로 제조 될 수 충족 포함루게릭 병 (20, 21), 폴리 (p- 자일 릴렌) 폴리머 22, 23, PMMA (16)과 가장 일반적으로, PDMS 24-28. 실리콘 및 폴리 (P-크실렌) 폴리머 스텐실은 생물학적 사용자에게 자신의 접근성을 제한하는 특수 장비 20-23로 관통 구멍의 직접 에칭이 필요합니다. PDMS 스텐실은 통상적으로 3 μm 인 2,000 ㎛의 범위 11,26-29 필요한 피처 크기에 따라 다른 방법에 의해 제조 될 수있다. 작은 특성이 요구되는 경우, 얇은 스텐실 시트는 미세 패턴 (28)의 릴리프를 포함하는 미세 가공 된 실리콘 템플릿에서 프레스 성형 PDMS 예비 중합체가 생성 될 수있다. 기능> 1000 μm의 들면, CO 2 레이저 커터 직접 스텐실 제조 동안에 프리 캐스트 PDMS 시트의 패턴을 절단하는 쉽고 저렴한 방법을 제공한다. PDMS 스텐실의 재활용도 충분한 일관성 일련의 실험을 수행하도록 경제적한다.
(10) 결과 방법을 조사하기 위해 E-cadherin의 응집력 hESC의 식민지 내의 유착을 중재.
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Protocol
참고 :이 프로토콜은 PDMS 스텐실을 사용하여 hESC의 라인의 레이저 절단 및 미세 가공, H9 1,000 μm의 패턴 PDMS 스텐실의 제조에 대해 설명합니다.
1. 디자인 및 미세화를위한 PDMS 스텐실의 제작
- 원하는 형상과 크기 (예를 들면 1000 ㎛의 원) 및 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어 (10)를 이용하여 공판 가스켓의 관통 구멍 스텐실 시트 디자인.
- 120-150 μm의 두께 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 시트는 각각 CO 2 레이저 커터 (10)를 사용하여 2mm의 스텐실 시트 및 가스켓을 레이저 컷.
- 미세화 용 PDMS 스텐실을 얻었다 3-4 시간 동안 60 ° C에서 액체 비경 PDMS와 베이크하여 PDMS 스텐실 시트와 함께 PDMS 개스킷 접착.
- 사용 전에 오븐에서 30 분간 건조하고, 120 ℃에서 오토 클레이 빙하여 PDMS 스텐실 소독.
2. hESCs는 홈페이지보수
- 문화 hESC의의 37 ° C에서 1 × hESC의 자격을 갖춘 지하 막 매트릭스 코팅 된 세포 배양 접시에 피더 - 무료 유지 보수 매체에 선 및 5 % CO 2.
- 항로가 약 70 %의 디스 파제 치료 37 ° C에서 3 분 배양하여 합류 기계적으로 100 ~ 200 μm의 덩어리로 hESC의 식민지를 해리있는 hESCs는. 6 분할 비율 : 1에서 기저막 매트릭스 코팅 조직 문화 폴리스티렌에 성장 지역의 9.6 cm 2 당 30 ~ 50 덩어리의 밀도에 hESCs는 대단히 짧은 플레이트.
인간 배아 줄기 세포 (3) 스텐실 미세화
- 패턴 셀하기 전에 준비
- 페트리 접시에 초순수 700 ㎕의 70 % 분석 등급의 에탄올을 분배하고 상단에 스텐실을 배치하여 60mm 페트리 접시 상에 PDMS 스텐실을 밀봉합니다.
- t 밤새도록 바이오 안전성 캐비닛 내부의 페트리 접시를 놓습니다그는 건조 에탄올.
- 더 거품이 스텐실은 페트리 접시와 좋은 물개를 형성하도록 스텐실 아래에 존재하지 않는 확인하십시오. 이는 ECM 코팅 용액의 누출을 방지한다. 이 세포 파종을위한 준비가 될 때까지 무균 조건 하에서 배양 접시 및 저장 인감.
- 분석의 인증서에 따라 hESC의 자격을 갖춘 기저막 행렬의 분취 량을 준비합니다. 영양 혼합물 F-12 (DMEM / F12) 제조 업체의 제품 시트에 따라 각각 나누어지는 수익률 1 둘 베코의 변형 이글 중간의 25 ㎖에 희석 × hESC의 자격을 갖춘 지하 막 매트릭스 솔루션이 있는지 확인하십시오.
- 1.5 × hESC의 정규화 기저막 매트릭스 용액을 만들기 위해 DMEM / F12 16.7 ㎖ 중에 hESC의 정규화 기저막 매트릭스의 한 분취 량을 첨가하여 ECM 코팅 용액을 제조 하였다. 겔화를 방지하기 위해 얼음 모든 ECM 코팅액 유지.
- 10 μM의 ROCK 저해제 (Y27632)와 hESC의 유지 보수 매체를 보충합니다.
- 90 초 동안 100 플라즈마 2 호와 페트리 접시를 취급합니다. 불임을 보장하기 위해, 단지 이전에 플라즈마 처리에 플라즈마 챔버 내부의 페트리 접시 덮개를 열고 신속하게 처리 완료 후 페트리 접시를 다시 커버. 이 표면 습윤을 촉진하고 ECM 코팅 용액의 첨가시에 관통 구멍 미세 패턴에서 기포 형성을 방지한다.
- 전체 스텐실 다루 1.5 × hESC의 자격을 갖춘 지하 막 매트릭스 솔루션의 450 μl를 추가합니다. 이러한 파라 필름 등 자기 융착 필름으로 페트리 접시를 밀봉 마르지 용액을 방지하기 위해, 사용하기 전에 37 ℃에서 5 시간 동안 배양한다.
- 스텐실 기판 상에 시드 hESCs는
- 둥근 단단히 packe의 전형적인 hESC의 형태의 손실을 보여주는 차별화 된 셀 영역을 식별하는 6 웰 플레이트에 hESC의 식민지를 검사합니다 (예를 들어, 손실D 상피 형태, 눈에 띄는 핵소체 높은 핵 / 세포질 비율). 진공 흡입기를 사용하여 차별화 된 영역을 제거합니다.
- 물론 당 2 ml의 DMEM / F12로 두 번 씻으십시오.
- 6 웰 플레이트의 웰 당, 같은 Accutase 등의 소화 효소, 1 ㎖를 추가하고 8 분 동안 37 ° C에서 품어. 기판에서 모든 식민지를 분리 부드럽게 판을 누릅니다.
- 소화 효소 1 ㎖ 당 DMEM / F12의 최소 4 ㎖로 잘 각각 씻어 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.
- 실온에서 3 분 동안 200 × g에서 세포 현탁액을 원심 분리기.
- 대기음은 상층 액을 제거하고 세포를 다시 일시 중단 ROCK 저해제 (ROCKi)로 보충 hESC의 유지 보수 매체의 400 μl를 추가합니다. 세포 현탁액을 위로 피펫 부드럽게 아래로 3 회는 하나의 세포로 덩어리를 중단 할 수 있습니다.
- 단일 세포 현탁액을 잘 혼합하고 DMEM / F12 (1시 20분 희석) 190 μL로 세포 샘플의 10 μl를 희석. hemocytome를 사용하여운이 스톡 세포 현탁액의 세포 밀도를 결정한다.
- 주어진 스텐실에 필요한 세포 파종 밀도를 계산합니다.
참고 : 예를 들어, 실험적 단셀 합류 단층 약 / mm이 4,444 세포 구하는 세포 접종 밀도를 결정했다. 따라서, 450mm (2)의 영역과 400 μL의 시딩 부피 스텐실는 2 백만 세포 / 400 μL의 밀도가되도록 세포 현탁액을 요구할 것이다. - ROCKi 보충 hESC의 배양 배지에 필요한 파종 밀도 (단계 3.3.8 참고 참조) 주식 세포 현탁액을 희석.
- 각 공판으로 셀의 필요한 수를 포함하는 세포 현탁액의 지정된 양을 첨가하고 세포를 정착 할 수 있도록 실온에서 5 분 동안 후드 흐트러 페트리 접시를 떠난다.
- 인큐베이터로 배양 접시를 전송하고 세포 부착을 허용하기 위해 1 시간 동안 품어. 동안 배양 접시 수준을 유지하기 위해주의세포가 스텐실에서 단일 층으로 남아 있도록 프로세스를 전송합니다.
- 스텐실 제거 및 패터닝되지 않은 기판의 보호
- 세포가 제대로 하부 기판에 부착되어 있는지 확인하기 위해 현미경 페트리 접시를 검사합니다.
- 스텐실에서 세포 현탁액을 멀리 대기음.
- 스텐실을 둘러싸는 영역에 DMEM / F12에서 0.5 % 세포 배양 호환 비이 온성 계면 활성제를 2 ㎖ / 접시를 추가한다.
- 부드럽게 스텐실을 벗겨 멸균 포셉 한 쌍을 사용합니다. 스텐실이 마르지 세포 않도록 박리 같은 비이 온성 계면 활성제 용액을 주위에 소용돌이. 시각 페트리 접시에 미세 패턴 세포를 관찰합니다.
- 37 ° C에서 10 분 동안 0.5 % 비이 온성 계면 활성제 DMEM / F12 용액 중의 미세 패턴 세포를 인큐베이션.
- 멀리 대기음 비 이온 계면 활성제-DMEM / F12 솔루션입니다. 2 ㎖ / DMEM / F12의 접시로 3 회 반복한다.
- hESC의 2 ㎖ / 요리 추가유지 매체 ROCKi 보충하고 밤새 37 ° C에서 배양한다.
- 하룻밤 동안 배양 후, ROCKi 보충 흡 hESC의 유지 배지, DMEM / F12로 한번 씻어 2 ㎖ / 100 NG / ㎖ 티빈 25 NG / ㎖ BMP4 10 NG / ㎖ FGF2 보충 분화 배지 접시를 추가 mesoendoderm 분화를 유도 .
- 위상차 이미지를 이용하여 미세 패턴을 평가하기 이전에 8 바와 같이 각 패턴에 대한 평균 Brachyury (T) 강도 프로파일을 계산한다.
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Representative Results
이 논문은 1000 ㎛의 특징을 생성하는 레이저 커터를 사용하여 셀 공판의 제조를 설명한다. 스텐실은 두 부분으로 구성되었다 : 얇은 스텐실 시트의 관통 구멍을 포함하는 미세 패턴 (두께 약 100 ~ 200 μm의) 및 ECM 코팅 용액 또는 세포 현탁액을 포함하는 PDMS 개스킷. 여기서, 127 μm의 두께 2mm 시판 PDMS 시트 각각 스텐실 시트 개스킷을 사용 하였다. 예컨대 스핀 코팅과 같은 제어 가능한 두께의 PDMS 시트를 제조하는 다른 방법은 또한 부품을 제조하는데 사용될 수있다. 두 성분은 접착제로 결합 플라즈마 액체 비경 PDMS 예비 - 가교제의 혼합물을 사용하여 접합하고, 3-4 시간 동안 60 ° C (도. 1)에서 소성 하였다.
스텐실 시트의 재질은 세포 배양 물 (S)의 선택에 기초하여 선택 하였다ubstrate. 배양 기판으로서 종래 조직 배양 폴리스티렌 (FPC 기판)을 사용하는 경우, PDMS 스텐실 강성 FPC 기판 (E ~ 3 GPA) (도. 2A)와 양호한 시일을 형성 할 PDMS 스텐실 시트의 컴플라이언스 때문에 사용될 수있다. 하나는 5 kPa의 MPA는 30 (2), 강성 스텐실 재료가 사용될 수의 가변 강성 범위 엘라스토머 PDMS 기판으로서 부드럽고 세포 배양 기판에 줄기 세포의 운명 공간적 이질성을 조사하고자 실험 설계에서. 일례로서, 우리가 ~ 5 kPa의 (도. 2B)의 강성을 갖는 1mm에게 부드럽고 PDMS 기판에 마이크로 패턴 hPSC 콜로니를 생성 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET), 스텐실 (E ~ 2 GPA)의 사용을 설명했다. 애완 공판 (도.도 2b에 도시 된 바와 같이, 인셋) 시판의 PET 필름으로 이루어진 시트 스텐실 상에 PDMS 가스켓을 접착하여 제작 하였다. 우리는주의가 미세 가공시 필요한 세포 부착 시간프로세스는 더 이상 종래 FPC 기판 기판에 비해 강성 ~ 5 kPa로의 부드러운 PDMS 기판 상 (~ 3 시간)이었다.
우리는 할 수 패턴 초기 mesoendoderm 분화 세포 접착 매개 기계적 힘에 그 공간 이질성을 보여 스텐실 마이크로 패턴 hESC의 식민지를 이용했다. 우리는 이전에 H9 hESCs는이 식민지 주변에 티빈, BMP4 및 FGF2 (31) (그림으로 유도 할 때 Brachyury (T) 양성 mesoendoderm 세포에 자신의 특혜 차별화의 결과 식민지 내부에서 세포,보다 높은 인테그린 유착을 경험 한 것으로 나타났습니다. 3A ). 세포 일정한 콜로니 영역에서 다른 형상 (원형, 정사각형, 직사각형과 반원 호)으로 패터닝 될 때, 인테그린 매개 견인력의 국소 농도에지도 사각형, 직사각형, 볼록 곡률의 모서리 형상 이방성 증가 mesoend 결과oderm 차별화 (32, 33). 실제로, 하나의 식민지 내의 다른 지방에 매핑 T 발현 강도에 의해, 우리는 mesoendoderm 유도의 범위도 (정사각형과 직사각형의 식민지 (그림. 3B)의 날카로운 모서리와 반 원호의 볼록 곡률에 더 높은 것을 발견 . 이방성 형상 (32, 33)에보고 된 높은 인테그린 매개 스트레스 영역에 해당 3C). 따라서, 미세화가 계속되는 분화 과정을 조절하는 수단으로 온전한 hPSC 콜로니 내의 세포 접착 매개 기계적 힘의 공간 분포를 조절하는데 사용될 수있다.
미세화를위한 PDMS 스텐실 그림 1. 생성. 도식 (A) 스텐실 제조에서 중요한 단계를 나타내는. 127 μm의 두께 PDMS 시트 라했다설계된 패턴을 생성 SER은 컷 다른 2mm 두꺼운 PDMS 시트 개스킷을 제조하기 위해 레이저 절단 하였다. 이 두 구성 요소는 스텐실을 조립 경화 PDMS와 함께 결합 하였다. (B) 이미지가 구멍을 통해 1mm의 원형과 PDMS 스텐실을 형성하는 구성 요소의 조립을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다른 문화 기판 그림 2. 미세 패턴 hESC의 식민지 (1000 μm의 원). hESC의 미세 패턴 식민지의 현미경 이미지를 즉시 딱딱한 기판에 hESC의의 미세 패턴을 생성하는 데 사용 (A) PDMS 스텐실 (삽입)의 제거 후 예를 들어, 강성의 FPC 기판 ~ 2 GPa로하고, (B) PET 스텐실 (삽입) 예를 들어 부드러운 기판에 미세 패턴을 생성하는 데 사용, 강성 ~ 5 kPa로의 PDMS는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
자신의 mesoendoderm 차별화 8 다른 기하학적 모양의 hESC의의 미세 패턴의 그림 3. 효과. (A) 다른 기하학적 모양 만 같은 식민지 영역은 PDMS 스텐실을 사용하여 생성 하였다 hESC의의 미세 패턴. mesoendoderm 차별화의 24 시간 후 T 식 (하단 패널)의 위상 이미지 (상단 패널)와 강도지도. (B) 평균 T 강도 프로파일 (흰색 점선을 따라 (A))에 아이소 메트릭 원형 식민지 또는 비등 축성 광장과 직사각형의 식민지에서 . 모든 식민지 같은 지역의 예를 가지고 있었다 콜로니의 면적의 절반을 한 50 % 원형. (C) 반 원호 콜로니 내부로 오목 또는 볼록 가장자리의 평균 T 강도 프로파일, 흰 점선 (A)으로 나타낸 바와 같이 CEPT. 각 강도 프로파일 (BC)는 4 식민지에서 얻은 16 세기 프로파일의 평균입니다. 이미지는 토 등의 허가를 다시 인쇄됩니다. 알., 8. 스케일 바 = 200 μm의 RFU 상대 형광 단위입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. hESC의 식민지를 미세 패턴 및 분화를 유도 할 수있는 워크 플로우의 도식 표현. hESC의의 미세 패턴의 성공적인 세대를위한 중요한 단계는 회색 상자에 강조 표시되어 있습니다..COM / 파일 / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
미세 패턴 스텐실의 제작
스텐실 미세화 틈새 매개 분화 패턴을 조사하기위한 hPSC의 미세 패턴을 생성 할 수있는 이상적인 방법을 제공한다. 이러한 마이크로 콘택트 인쇄, 포토 패터닝과 같은 다른 미세 가공 기술 위에 스텐실 패턴의 주요 장점은 표면 개질을 필요로하지 않고, 종래의 FPC 기판의 기판 상에 구현 될 수 있다는 것이다. 따라서, 다른 hPSC 라인을위한 최적화 된 배지와 ECM 코팅 용이 미세화 스텐실로 전송 될 수있다.
좋은 미세 패턴의 생성에 기여하는 셀 공판의 제조시 주요 단계들이있다. hPSC의 미세 패턴의 설계 형상 재생의 충실도가 스텐실 시트의 품질과 관통 구멍 가공의 일관성에 의존한다. 다세포 micropat 관련된 연구> 1000 ㎛, 제비, 관통 구멍에 직접 프리 캐스트 PDMS 시트에 레이저 가공에 의해 제조 될 수있다. 레이저 가공의 해상도는 상기 레이저 빔의 스폿 크기는 레이저 빔의 경로를 제어하는 기계적 스테이지의 정밀도에 의존한다. 기존의 CO 2 레이저 절단기를 들어, 우리는 (예., 사각형) 원형 또는 곡선 좋은 충실도와 기능을하지만 날카로운 모서리 형상을 생성 할 수 있음을 발견했다. 소형 또는 예리한 특징이 요구되는 애플리케이션에서는, 관통 구멍 스텐실 시트의 미세 패턴 (28)의 릴리프를 포함하는 미세 가공 된 실리콘 템플릿에 PDMS를 성형함으로써 제조 할 수있다. 성형 방법의 문제는 관통 홀 실리콘 템플릿 릴리프 아무런 잔류 PDMS와 PDMS 박막 시트에 마이크로 크기를 생성한다. 리 등에 의해 기술 된 바와 같이 몇 가지 전략이 문제를 해결하기 위해 개발되었다. 등. (28)
는 AS시sembly 스텐실 시트 셀 스텐실을 생산하는 가스켓 하나는 스텐실 시트가 스텐실 누출을 방지하기 위해 접착 프로세스 중에 평탄하고 먼지없는 것을 보장한다. 본딩 공정 중에 스텐실 시트 좌굴 ECM 셀 솔루션 관통 구멍 미세 패턴으로부터 누출 원인 배양 기판에 스텐실의 밀봉을 손상시킬 수있다. 스텐실은 오토 클레이브 (120 ℃로, 30 분)에 의해 멸균되어야하고 철저하게는 배양 용 기재와 양호한 시일을 형성 할 수 있도록 오븐에서 건조 될 수있다.
다른 중요한 요인은 스텐실 시트 재료의 선택이다. PDMS 스텐실은 1 ~ 2 GPa의의 강성 등의 FPC 기판 등의 엄격한 문화 기판 위에 미세 패턴의 hPSCs에 이상적이다. 그러나, 하나는 일반적으로 조정 셀 기판 강성 (34), PDMS의 준수하는 데에 PDMS 기판 등의 기판 상 소프 hPSCs을하고자하는 경우 미세 패턴스텐실 시트가 곤란하므로 hPSC 미세 패턴의 파괴, 세포 시딩 후의 스텐실을 박리 할 것이다. 이 경우에, 스텐실 스텐실 시트 용 재료의 선택은 배양 기판과 시일을 형성 할 수 있지만 쉽게 박리 될 수 있도록 선택되어야한다.
생성 hPSC의 미세 패턴
여기에 제시 PDMS 스텐실을 사용하여 FPC 기판 기판에 H9 hESCs는을 미세 가공을위한 프로토콜은 좋은 세포 생존 및 패턴 충실도와 합류 식민지를 달성하기 위해 최적화되었습니다. hPSCs 한 기하학 종속 인자 분화 운명에 영향을 미치는 방법을 조사 할 수 있도록 미세 패턴에 의해 정의 된 특정 형상의 공간 내에 한정 적절한 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 형성하는 것이 필수적이다. 우리는 성공적으로 hPSC의 미세 패턴을 생성하기위한 몇 가지 중요한 단계 확인했다 (그림. 4)다음과 같이 그들은 논의된다.
첫째, hPSC 문화의 품질이 중요. 차별화 된 영역을 제거하는 동안 미분화 hPSC 형태를 보여주는 식민지의 대부분으로 70 ~ 80 %의 합류에 hPSC 식민지를 수확하는 것이 중요하다. 오버 합류 hPSC 배양 물은 일반적으로 자연 분화를 일으키지 차별화 영역이 세포 시딩 이전에 제거되지 않은 경우, 분화 세포는 정상적인 분화 패턴 형성을 방해한다.
이것은 주로 세포가 초기에 부착 할 수 있더라도 밤새 배양 한 후 세포 사멸을 초래하기 때문에 둘째, 소화 효소를 통해 처리 회피 단일 세포 현탁액 hPSC 콜로니를 채취하는 경우에 중요하다. 우리는 효소 치료의 8 분 우리 실험실에서 배양 H9 hESC의 라인에 최적입니다 것으로 나타났습니다; 우리는 세포 분리 처리 시간이 상이한 세포주에 대해 개별적으로 최적화되어야하는 것이 좋지만.
마지막으로, 증식 또는 미세 패턴 내에서 세포 분화를 제한하기 위해서가 아닌 세포 접착 분자와 hPSC의 미세 패턴을 둘러싸는 기판을 패시베이션 할 필요가있다. 이것은 hPSC의 미세 패턴의 정확도를 유지하는 것이 필수적이며, 차례로, 분화 패턴의 생화학 적 및 기계적 환경 구배 개발. 예컨대 플루로 닉 F-127 세포 배양 호환 비 이온 계면 활성제는 패시 제로서 사용할 수있다. 계면 활성제 패시 때, 처리 시간과 농도로 인해 긴 노출에서 계면 활성제의 세포 독성에 최적화되어야한다. 우리는 상술 한 바와 같이, 제시된 프로토콜은 PDMS 스텐실을 사용 hPSCs을 미세 패턴하기위한 세부 지침을 제공하지만, 특히 위의 중요한 단계에 대해이 프로토콜의 최적화는 SU에 권장ccessfully hPSC의 미세 패턴을 생성합니다.
스텐실 미세화의 한계 중 하나는 100-1,500 ㎛의 범위보다 큰 미세 패턴을 생성하기에 더 적합하다는 것이다. 앞서 언급 한 바와 같이 단일 세포 패터닝위한 아주 작은 기능 <50 ㎛의 관통 구멍 스텐실 시트의 제조를 생성하는 것은 매우 어려운 것이다. 따라서, 우리는 스텐실 hPSCs 미세 패턴의 사용은 다른 발달 과정 (예 neuroepithelium 폴딩 또는 내배엽 패턴 화) 동안 다세포 조직 패턴 형성을 조사 적합 것으로 예상된다.
기하학적 hPSC 인구를 한정하는 미세 패턴을 사용함으로써, 우리는 세포 접착 성을 제어하고, 생성 된 분화 운명의 공간적 구성을 이해하는 기계 (10) 및 주변 분비 신호의 기울기 (6)을 매개로 설정할 수있다. 공간적으로 조직 differentiatio 이러한 미세 패턴 hPSC 모델n을 차례로 선천성 기형아 출산에 대한 인간의 특정 질병이나 기형 검사 모델 (11)로 변환 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 그랜트를 시작 NUS에 의해 (R-397-000-192-133) 및 ETPL 간격 기금 (R-397-000-198-592)를 지원합니다. GS는 NUS 연구 학자이다. 저자는 셀의 미세화에 그녀의 기술 지원을위한 박사 Jiangwa 싱에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
