Abstract
巨大なウイルスの分離は、これらの巨大なウイルスが原生生物に関連している、特に以来、ウイルス学のこの新しい時代に大きな関心です。ジャイアントウイルスは、原生生物の多くの種のための潜在的に病原性であってもよいです。彼らはMegaviralesの最近記載された順序に属しています。下水試料から単離された新しい系統Faustovirusは、哺乳動物の病原体アフリカ豚コレラウイルスの遠縁です。このウイルスはまた、そのアメーバホスト、Vermamoeba vermiformis、ヘルスケア水システムにおける共通の原生生物に固有のものです。 その遺伝子型のコレクションを拡大し、その汎ゲノムを研究するために、新しいFaustovirus遺伝子型を単離することを継続することが重要です。我々は、アメーバの共培養の細菌および真菌の汚染を回避するために、抗生物質および抗真菌組み合わせの使用を改善し、ウイルス増殖を有利にすることによって、追加の株の単離のための新たな戦略を開発しました。我々はまた、新しいstarvatioを実装しましたV.を維持するために、n個のメディアウイルス共培養のための最適な条件でvermiformis。最後に、我々は、細胞変性効果を検出するために、時間がかかり、フローサイトメトリーではなく、顕微鏡観察を使用します。私たちは、より自分の環境、宿主特異性と遺伝的内容を理解するために、この方法の効率を証明するため、Faustovirusesのコレクションを広げ、下水試料から2つの単離を得ました。
Introduction
巨大なウイルスの発見、Megavirales順に属する特には、完全に粒子サイズおよびゲノムの複雑さの点でウイルスの世界を変えました。ウイルスは以前に小規模事業体であると考えられ、そしてミミウイルスは、すべてのルールを破るように見えた。1メタゲノムデータは、環境だけでなく、巨大なウイルスの普遍性を示唆して2-5でなく、ヒトで。6ので、必要性がまだあります大規模にこれらのウイルスを検索します。これらの巨大なウイルスの多様性は、世界的な水環境の多様性とそれに関連する堆積物だけでなくをサンプリングすることによって評価7-11だけでなく、ヒトサンプル12,13及び環境試料の様々なスクリーニングすることにより行った。7,9 アカントアメーバカブトムシ亜目のミミウイルスでした貪食原生生物を用いた共培養により単離され、主にアカントアメーバ属巨人ウイルスの14-16全体のコレクションはまた次いで科学界は、 アカントアメーバ属のための研究および単離手順を制限作られ、この指定された原生生物宿主から単離されました。明らかに、単一の宿主種で、この依存は見落とされているウイルスの大部分をもたらしました。巨大なウイルス、CroVは、非常に運動性の海洋原生動物カフェテリアroenbergensisで単離されたという事実は、17,18は、新しい系統または巨大ウイルスの家族を発見するために原生動物の広い範囲を使用する必要性を示しています。 Reteno らは以前に使用されていなかった細胞宿主として他の原生動物を選択するために管理され、巨大なウイルス（新しく名前を付けたFaustovirus）の新しいAsfar関連の系統を単離した。19
このウイルス系統のメンバーを拡大するために、新しいFaustovirus遺伝子型を分離する試みでは、我々は我々の単離手順を修正し、新しいFaustovirusesを収穫することが可能な環境サンプルをスクリーニングするためにそれらを使用しました。私たちはその後、新しい分離株を特徴づけるプロトコル全体を説明。我々はすでに最初のFaustovirusプロトタイプE12の単離に使用されているVermamoebaのvermiformis、人間の環境で見られる最も一般的な自由生活原生生物、20-22を評価した 。19この原生生物は、現在まだホスト固有Faustovirusためです。我々は、我々の研究室で他の巨大なウイルスを成長させるいかなる試みはアメーバ溶解またはウイルス増殖を示さなかったので知られている巨大なウイルスのいずれもが、このアメーバのために病原性ではなかったことを知っていました。このような理由から、私たちはそれを信じてV. vermiformisは新しいFaustovirusesを単離するために、既知の最良かつ最もユニークな細胞支持体です。
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Protocol
1.サンプルコレクション
- 異なる環境と地域から70のサンプルを収集します。サンピエールドMeyzoargues（フランス）、マルセイユ（フランス）でボレリー公園内の湖から15のサンプルの村から5汚れた水試料;：この場合は、以下を使用マルセイユのSamenaで岩の入口（フランス）、アルプスから25河川水試料（フランス）からの土砂で15海水サンプル、ラ・シオタ（フランス）で下水から最終的に、10サンプル。
- 任意の処理をせずに室温で1分間、接種前に、均質化のための渦サンプル。
2.単離操作
- ブラインド文化の手順とサンプル接種のための準備をホスト
- 使用V.共培養のための細胞のサポートなどvermiformis（株CDC19）。
- プロテアーゼペプトン-酵母エキス-グルコース培地30mlで75cm 2の細胞培養フラスコ中、28℃でアメーバを維持する（PYG）。 表1にPYG組成を確認してください。
注：48時間後、アメーバはカウントスライドを使用して、通常のカウント（ 例えば 、Kovaslides）によって定量化されています。 - 10分間、720×gで遠心分離することによって、5×10 5〜10 6細胞/ mlであり、ペレットアメーバの濃度で細胞を回収します。
- 吸引により上清を除去し、滅菌ページのアメーバ生理食塩水（PAS） 表1の30ミリリットルでアメーバペレットを再懸濁する。この洗浄手順を繰り返します。
- 約10 6アメーバ/ mlの濃度で抗生物質や抗真菌混合物と飢餓培地30ml中のアメーバを再サスペンド。飢餓培地は、シスト化や乗算なしで生き続けるためにそれを可能にする、アメーバの生存媒体です。 表1に組成を確認してください。
注：抗菌剤ミックスを10μg/ mlのバンコマイシン、10 / mlのイミペネム、20 / mlのシプロフロキサシン、20μを含有していましたグラム/ mlのドキシサイクリン、および20μg/ mlのボリコナゾール。この混合物は、ウイルス増殖を減少または変更することができ、細菌および真菌汚染を低減するのに役立ちました。 - 直接湿潤環境が入った袋の内側に湿布を置くことで構成され（アメーバ接着に有利な96ウェルプレート平底に200μlのアメーバの単層上に各サンプルを25μl接種し、湿潤環境で30℃でインキュベート蒸発を避けるためにプレート）。これは、プリモ・文化です。任意のサンプル接種せずにアメーバの2つのウェルを残します。これは、陰性対照として働きます。 3日間このプリモ・文化をインキュベートします。
- 三日新鮮なアメーバの最初の接種、サブカルチャープリモ培養プレートの後の顕微鏡で観察することなく、上述したように。プリモ培養と同じ条件下で3日間の新しいプレートをインキュベートします。
- インキュベーションのこれらの3日後に目の場合と同じように、最終的な培養を行います電子primo-とサブカルチャー。 2日間の最終培養をインキュベートします。そして、検出に進みます。
- 自動化フローサイトメトリーによる溶解の検出
注：フローサイトメトリーで結合されたブラインド文化は分離の前の標準的なシステムとは異なります。これは、より敏感な正確かつ自動化されています。検出目的のために、我々は、最高速度で、顕微鏡観察することなく溶解を検出するために開発された新たな技術を適用しました。この技術は、スクリーニング試料について有利で あり、より古い技術よりも優れた感度を有している。7-9- 溶解を検出するために、最終的な共培養の96ウェルプレートを使用してください。
- サイトメーターの電源をオンにし、製造業者のプロトコルに従って、より低いバックグラウンドノイズを得るために、クリーンですすぎサイクルを実行します。
- サイトメーター自動的に96ウェルプレートからサンプルをロードし、accordin 40分以内に完全に自動化された取得を実行するために、フローと組み合わせるハイスループットサンプラー（HTS）を起動製造業者のプロトコルにグラム。
- サンプル容量150μLを、体積50μLを混合速度180、ミックス5の数、各サンプルを400μl、流速2.5μL/秒、記録されたイベント万の数との間の洗濯量を混合、次のようにHTSを設定します。
- ゲートするために、第1アメーバ集団を、最終的な共培養マイクロプレートの陰性対照ウェルを評価し、それらの物理的特性に応じて、これらの細胞宿主の割合を決定します。均質なアメーバの人口と破片やノイズに対応する下のイベントの第二集団を持っているようにしてください。
注：このゲーティング手順は、前方散乱によって推定さ、サイズによって単一細胞から細胞内破片や凝集塊を区別します。正確に可能な限り最高のゲーティング手順を使用して各集団の割合を決定することが重要です。これらのパーセンテージは、原生動物の多くの種類が使用される場合は特に、変化し得るので、negativを有することが常に重要ですサンプルの残りの参照集団として使用することができる電子制御。 - サンプルを取得クリックして、ゲーティングを開始します。
- 10,000事象未満ではないイベントの数を記録します。
- 矢印を使用して、関心のアメーバ集団をローカライズします。これは、ゲートを定義する方法です。
- その後、自動的にプレート全体を実行し、ゲーティングした後、HTSスポットを聞かせまたは「ホーム」をクリックして、プレートを見つけます。サイズおよび構造パラメータに従ってデータ収集と分析を実行します（それぞれ、FSC（前方散乱）およびSSC（側方散乱））。
注：アメーバ依存性人口の損失を検出するには、アメーバ溶解を担当する病原体の存在を示します。ウイルス感染に関連原虫溶解アナライザによってゲート及び信頼陰性対照として使用したものと同じ非感染個体群と比較して、アメーバ集団の50％溶解を任意に設計しきい値を用いて検出されます。
- 巨人ウイルスの存在を明らかにするための予備染色
- フローサイトメトリーによる溶解検出した後、残りのアメーバを中断し溶解した共培養をピペット。その後、直接10分間、800×gで懸濁液50μlの細胞遠心。
- 遠心分離した後、純粋なメタノール溶液でスライドを固定します。ウイルスの工場が存在するかどうかを確認するために、エオシン/ブルーアズールとDAPI染色の商業迅速な染色を用いてスライドを染色し、1,000倍の倍率で光学顕微鏡下で観察します。
- 迅速な染色のために、第一のエオシン溶液にスライドを突入後、リン酸緩衝液で45秒間スライドをすすぎ、最終的に6秒間青色ジュールを含む第二の定着液中にスライドを突入に直接渡し、及び（4秒を3回繰り返します） pHは7.2。 observatiに進み、その後、室温で乾燥さスライドを残しますに。
- DAPI染色、預金固定乾式スライド上にDAPI商用原液15μlのために。観察に進み、その後、光から保護します。
- 電子顕微鏡
- スライド上の最初の同定後、上清を培養物の電子顕微鏡観察によって巨大なウイルスの存在を評価します。
- グロー放電したグリッド上に正のサンプルの寄託5μlの。室温で約20分間待ちます。
- その上で10秒間、1％モリブデン酸アンモニウムの小滴を慎重にグリッドと堆積物を乾燥させます。 5分間乾燥させるためにグリッドを残します。
- 200 keVので顕微鏡を電子に進みます。
- ホルダーにグリッドを配置します。顕微鏡にホルダーをご紹介します。対応するアイコンをクリックして真空の概要を確認してください。開閉弁とスポットサイズ5であり、x 25,000倍の倍率で観察を始めます。
- ImageJのか、直接を使用して巨大なウイルスを測定します取得画面上にある顕微鏡の尺度ツールを使用して、顕微鏡上LY。
注：200nm程度のカプシドサイズでFaustovirusグループ内に試料を分類します。
- 分子生物学
注：それらが同じ宿主特異性を持っていませんが、この同定した後、分子生物学的テストは、電子顕微鏡の下で同じカプシドのサイズと外観を有するMarseillevirusからFaustovirusを区別するために、確認のために非常に重要でした。 MarseillevirusがVermamoebaに成長できない、FaustovirusはVermamoebaに固有であり、そのようなアカントアメーバのような他のアメーバの上に成長するすべての試みは、これまでに失敗した。Reteno らの作品に記載されている特異的なプライマー/プローブシステムの設計とアプリケーションを。ウイルス遺伝子の増幅および配列決定を介して新たに分離されたウイルスのより正確な予備分類を可能にしました。- 例製造業者のプロトコルに従って自動抽出システムを使用して、陽性培養試料から管DNA。
- Retenoに記載されているように。19らサーモサイクラーを用いてリアルタイムPCRを行います
- 増幅に使用した同じプライマーを用いて配列。 Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '（フォワード）およびFstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3'（リバース）を持つ：DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニット1遺伝子を標的とするプライマーを使用してくださいFstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRAプローブ。
4.ウイルス産生、精製およびゲノムシーケンシング
- 終点希釈クローニングのための単一のウイルスアメーバ文化をサブカルチャー。
- 生産のために：PYGの30ミリリットルを含む20フラスコ、Vermamoebaのvermiformis、すでに小さなフラスコに井戸から転送された単離ウイルスの5ミリリットルの10ミリリットルを準備します。
- 完了するまで30℃でインキュベートアメーバの溶解。すべてのアメーバが溶解するまで倒立光学顕微鏡により毎日観察します。
- 完全に溶解した後、一人の受信者にすべてのフラスコをプール。破片を除去するために0.45μmのフィルターでフィルタリングします。
- 75分間、89,800×gで超遠心分離による精製を開始します。遠心分離を開始する前に、チューブの重量を校正することを確認します。
- 遠心分離した後、吸引によって各チューブから上清を除去し、遠心分離を繰り返す前に、キャリブレーションに使用したのと同じ量でPASでペレットを再懸濁。
- 上記のように、上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1ml中のすべてのペレットを再懸濁します。
- （0.22μmのフィルターで濾過PBS 100ml中のスクロース27.5 gで）25％のショ糖を使用して、製造されたウイルスを精製します。
- ショ糖の8ミリリットルとウイルス懸濁液の2ミリリットルを使用してください。 1時間15分間、89,800×gで遠心します。 1mlのPBSでペレットを再懸濁。 -80℃で保管してください。
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Representative Results
この原稿で研究システムは、2つの新しいFaustovirusesを単離することによって、概念の、その証拠を検証しました。テストした70サンプルのうち、溶解の2つのエピソードは、私たちの信頼性が陰性対照とは対照的に、検出されました。溶解のためのネガティブコントロールは、86％のアメーバ集団を含んでいました。これとは対照的に、正のサンプル（サンピエール・デ・MeyzoarguesためのST1）、および（ラ・シオタサンプル9用LC9）はゲーテッドアメーバの劇的な減少を示しました。アメーバの60％以上は、破片の最も高い割合で溶解しました。我々の方法の検出段階のこれらの堅牢な結果を図1に示されている。エオシン/ブルーアズールとDAPI染色は、図2に示すように、アメーバ内部のウイルス工場の存在を確認した。電子顕微鏡は、二十面体カプシドとMegaviralesの典型的な外観を明らかにしましたサイズは、200nmで、および欠く線維（ 図3）。巨大なウイルス、PAのための特異的なPCRrticularly Faustovirusため、私たちの以前の知見を確認しました。これは、あいまいな結果や汚染されたアイソレーションを排除するために、PCRによって確認されなければなりません。ウイルスを作製し、全ゲノム配列決定のために精製、クローニングしました。 PRJEB11169：新たに単離されたFaustovirusesのゲノムは、以下のBioprojectの下に提出されています。 、primo-サブ、および最終的な培養は、このウイルス増殖に有利な、全く真菌や細菌汚染を示さなかった。Vermamoebaのvermiformisは、抗真菌と抗生物質の混合物を許容しました。これは、3日後に、最終的な文化が80％以上のリビングアメーバを含まアメーバの負の制御に明らかだった。Vermamoebaも溶解後に有意なウイルス量を製造、分離のための良好な細胞宿主を提供します。
図1：自動化フローサイトメトリーによる溶解検出データrepresen。Faustovirusを回収し、アメーバ溶解を示した二つの試料を、tは。生きアメーバ集団は、陰性対照として使用しました。二つのゲートは、潜在的に細胞や破片に対応し、FSC-SSCプロットに設計されていました。最終の共培養後、破片の大集団は、ゲーテッド集団（A）に実質的な変化を示さなかった陰性対照と比較して、サンプル（ST1及びLC9）の潜在的な感染症（B）の存在を実証してください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：エオシン/ブルーアズール染色およびDAPI染色でいくつかの巨大なウイルスのウイルス工場は、典型的な Vを示すネガティブコントロール。エオシン/ブルーアズール染色を用いて核をvermiformis（A）、およびDAPI染色（D）（矢印は、アメーバの核を指します）。 1,000倍に拡大。 （B、C）：V.の1,000倍の倍率でエオシン/ブルーアズール染色Faustovirus LC9に感染しvermiformis。矢印は、ウイルスの工場はアスタリスクでマークされ、環状感染アメーバの核を指します。 V.の1,000倍の倍率で（E、F）DAPI染色Faustovirus LC9に感染しvermiformis。矢印は8時間、感染後（E）、および12時間の感染後（F）でウイルスの工場を指します。スケールバーは10μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：ネガティブ染色MICRograph。正二十面体カプシドと200nmの合計サイズMegaviralesの典型的な外観、と新たに検出されたFaustovirusを示す溶解検出後のウイルス懸濁液のネガティブ染色、。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| PYG組成 | 量 |
| プロテオースペプトン | 20グラム |
| 酵母エキス | 2グラム |
| 硫酸マグネシウム4。 7H 2 O | 0.980グラム |
| CaCl 2 | 0.059グラム |
| クエン酸ナトリウム。二水和物 | 1グラム |
| Fe（NH 4）2（SO 4）2×6 H 2 O | 0.02グラム |
| グルコース | 18グラム |
| 用蒸留水 | 1 L |
| HClまたはKOHで6.8にpHを調整します。 | |
| 121℃でのオートクレーブで15分間。 | |
| 飢餓培地 | 量 |
| 酵母エキス | 2グラム |
| グルコース | 18グラム |
| Fe（NH 4）2（SO 4）2。 6 H 2 O | 0.02グラム |
| PAS（詳細は下記） | 1 L |
| 0.22ミリメートルで濾過 | |
| PAS溶液A | 量 |
| KH 2 PO 4 | 0.136グラム |
| Na 2 HPO 4 | 0.142グラム |
| PAS溶液B | 量 |
| MgSO 4・7H 2 O | 4.0 mgの |
| CaCl 2・2H 2 O | 4.0 mgの |
| NaClを | 0.120グラム |
| 各溶液A及びBの10mlを、蒸留水1リットルに添加します。 | |
表1：ソリューションのレシピ。
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Discussion
FaustovirusがASFVに近い新しいMegaviralesファミリーの最初のメンバーであるという可能性はまずReteno ら、19によって示唆されたが、いくつかの違いがまだ区別することができます。 Faustovirusがアスファウイルス科ファミリーに参加する必要があるかどうかではなく、新しい推定されるウイルスのファミリーを形成する必要があるかどうかは不明で表示されます。この問題はさらに調査、その形態、宿主範囲、複製サイクルおよび遺伝子レパートリーの特により包括的な特性評価が必要になります。もっとFaustovirus遺伝子型は、汎ゲノムを拡大すると、より良い、このウイルスのグループや家族の起源や親戚を理解するために分離する必要があります。我々が使用される技術は、私たちは、この潜在的な新しいファミリーの新しいメンバーを単離継続させます。この技術は、より良好な検出のための濃縮工程として働くわずかに変更共培養技術を用いて結合されています。 HUのためのデータを取得するためのフローサイトメトリーによって必要とされる時間サンプルのndredsは、以前の標準の共培養系に比べて大きな利点である、半時間を超えていない。9技術は、特にその高い感度と正確な定量の点で、以前の標準のシステムよりもはるかに優れています。
打ち上げ70サンプルのうち、私たちは、このウイルスの環境特異性や生態系についての情報を提供することができる下水からさらに2つのFaustovirusesを、単離しました。確かに、原生生物VermamoebaのvermiformisためFaustovirusの特異性、19だけでなく、アスファウイルス科23の間でHcDNAVの新しい分類と、このウイルスは渦鞭毛藻ヘテロカプサ属の多くの株に感染するが、植物プランクトンの他のタイプに感染することができないという事実は、24示唆していますAsfarvirusまたはその近親者間のホスト特異性が存在します。
これらの知見は、演技の新しい携帯支持体の使用を暗示しますウイルスのこれらの種類を抱くことができ、特定または不特定のホストを、です。我々の技術は、異なる条件で原生生物の他のタイプに適合させることができます。我々の方法は、ウイルス分離と文化技術の面で進歩をマーク。要約すると、最も適切な抗菌・防カビ混合物との濃縮ステップは、任意の可能な細菌または真菌汚染の除去のために非常に重要です。高速シスト形成は、インキュベーションの24時間後に観察されたため、ルーチン培養に用いられるPAS媒体は、Vermamoeba属には不適切であるように見えるしながら、私たちの飢餓培地は、共培養のための最高の条件でアメーバを維持するために最善の解決策でした。これは、以前の技術は、これまでに失敗した最適な培養条件に向けた大きな一歩でした。ここで説明する培養プロトコルを使用して最良の結果を得るためには、食作用が可能な新鮮なアメーバを使用することをお勧めします。抗生物質および抗真菌混合物原生生物に対して非毒性であるべきです ;したがって、混合物に使用される原生動物の生存能力をテストすることをお勧めします。すべての使用される材料は、滅菌されるべきです。作業は、任意の可能性の汚染を避けるために微生物学的に確保ポストクラスIIに行われるべきです。記載されているようインキュベーション時間と文化の3つの段階が尊重されるべきです。フローサイトメトリー検出のための処理時間は、研究の生物に応じて較正することができます。元ゲーティングからの人口の小さなシフトが観察され得るが、これは参照集団として使用する信頼性の負の制御に依存します。
文化の中で見つかり、アメーバのための病原体であることができるマルチ耐性菌は何とか我々はウイルス「乗算をマスキング細菌の増殖を持つことができ、当社のウイルス分離法を、制限することができます。抗生物質の混合物を変化させるか、時にはこの制限を管理する必要がありますサイズの200nm以上の細菌を除去するために文化を濾過。
">これらのすべての適応条件は、ウイルス増殖をサポートする新しい最適な単離方法を、提供しています。この技術は、より自分の多様性、起源、および潜在的な病原性を理解するために、新しいウイルスの発見にかなりの利点、特にMegaviralesを提示します。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
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