Abstract
Isoleringen af gigantiske virus er af stor interesse i denne nye æra af virologi, især da disse gigantiske vira er relateret til protister. Giant vira kan være potentielt patogene for mange arter af protister. De tilhører den nyligt beskrevne rækkefølge Megavirales. Den nye slægt Faustovirus, som er isoleret fra spildevand prøver er fjernt beslægtet med den mammale patogen afrikansk svinepestvirus. Denne virus er også specifik for sin amoebal vært, Vermamoeba vermiformis, en protist almindelig i sundhedsvæsenet vandsystemer. Det er afgørende at fortsætte isolere nye Faustovirus genotyper for at udvide sin genotype indsamling og studere dens pan-genom. Vi udviklede nye strategier til isolering af yderligere stammer ved at forbedre brugen af antibiotika og antifungale kombinationer for at undgå bakterielle og fungale kontaminering af den amøbe co-kultur og begunstige virus multiplikation. Vi implementerede også en ny starvation medium for at opretholde V. vermiformis i optimale betingelser for virus co-kultur. Endelig brugte vi flowcytometri snarere end mikroskopisk observation, hvilket er tidskrævende, for at opdage den cytopatogene virkning. Vi opnåede to isolater fra spildevand prøver, der beviser effektiviteten af denne metode, og dermed udvide samlingen af Faustoviruses, for bedre at forstå deres omgivelser, host specificitet og genetiske indhold.
Introduction
Opdagelsen af gigantiske vira, især dem, der hører til Megavirales ordre, fuldstændig ændret verden af virus i form af partikelstørrelse og genom kompleksitet. Vira blev tidligere anset for at være mindre enheder, og mimivirus syntes at bryde alle regler. 1. metagenomisk data tyder det allestedsnærværende gigantiske vira ikke kun i miljøet, 2-5, men også hos mennesker. 6 Der er derfor stadig et behov at søge efter disse vira i stor skala. Mangfoldigheden af disse gigantiske vira blev vurderet ved prøveudtagning ikke kun en bred vifte af vandmiljøer og deres tilknyttede sedimenter på verdensplan, 7-11, men også ved at screene en lang række menneskelige prøver 12,13 og miljøprøver. 7,9 De Acanthamoeba polyphaga mimivirus var isoleret ved co-dyrkning under anvendelse af fagocytiske protister, primært Acanthamoeba spp. 14-16 En hel samling af gigantiske vira blev derefter ogsåisoleret fra den angivne protist vært, hvilket gjorde det videnskabelige samfund begrænse sin procedure for Acanthamoeba spp forskning og isolation. Klart dette afhængighed af en enkelt værtsart har resulteret i en stor del af virus bliver overset. Det faktum, at den gigantiske virus, CroV, blev isoleret med den meget bevægelige marine protozoer Cafeteria roenbergensis, 17,18 viser behovet for at bruge en bredere vifte af protozoer for at opdage nye slægter eller familier af gigantiske vira. Reteno et al. Formået at vælge andre protozoer som celle værter, der aldrig tidligere har været anvendt, og isolerede den nye Asfar-relaterede afstamning af gigantiske virus (den nyligt navngivne Faustovirus). 19
I et forsøg på at isolere nye Faustovirus genotyper for at udvide medlemmerne af denne viral afstamning, vi ændrede vores isolation procedurer og brugte dem til at screene miljøprøver i stand til at høste nye Faustoviruses. Vi derefterbeskrev hele protokollen til at karakterisere de nye isolater. Vi vurderede Vermamoeba vermiformis, de mest almindelige fritlevende protist fundet i humane miljøer, 20-22 som allerede anvendes i isoleringen af den første Faustovirus prototype E12. 19 Denne protist er i øjeblikket stadig vært-specifik for Faustovirus. Vi vidste, at ingen af de kendte gigantiske vira var patogen for denne amøbe, fordi ingen forsøg på at dyrke andre gigantiske vira i vores laboratorium viste amøbe lysis eller viral vækst. Derfor mener vi, at V. vermiformis er den bedste og mest unikke celle støtte kendt for at isolere nye Faustoviruses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvetagning
- Saml 70 prøver fra forskellige miljøer og regioner. I dette tilfælde skal du bruge følgende: 5 beskidte vandprøver fra landsbyen Saint Pierre de Meyzoargues (Frankrig), 15 prøver fra søen i Parc Borély i Marseille (Frankrig); 15 sea vandprøver med sediment fra vigen på Samena i Marseille (Frankrig), 25 river vandprøver fra Alperne (Frankrig), og endelig, 10 prøver fra spildevand i La Ciotat (Frankrig).
- Vortex prøver til homogenisering før podning, i et minut ved stuetemperatur uden nogen behandling.
2. Isolation Procedure
- Vært Forberedelse til Blind Kultur Procedurer og Sample Podning
- Brug V. vermiformis (stamme CDC19) som en celle støtte til co-kultur.
- Opretholde amøber ved 28 ° C, i en 75 cm2 cellekultur kolbe med 30 ml protease-pepton-gærekstrakt-glucose-medium (PYG). Kontroller PYG sammensætningen i tabel 1.
Bemærk: Efter 48 timer er amøber kvantificeres ved en normal tæller hjælp optælling dias (f.eks Kovaslides). - Harvest celler ved en koncentration på 5 x 10 5 til 10 6 cell / ml, og pellet amøber ved centrifugering ved 720 xg i 10 min.
- Fjern supernatanten ved aspiration, og re-suspendere amøber pellet i 30 ml steril Pages amoebal saltvand (PAS) Tabel 1. Gentag denne skylning procedure.
- Resuspender amøber i 30 ml sult medium med et antibiotikum og svampedræbende blanding i en koncentration på ca. 10 6 amøbe / ml. Den sult medium er en overlevelse medium for amøbe, gør det muligt at holde sig i live uden encystment eller formering. Check sammensætningen i tabel 1.
Bemærk: Det antimikrobielle middel mix indeholdt 10 ug / ml vancomycin, 10 ug / ml imipenem, 20 ug / ml ciprofloxacin, 20 μg / ml doxycyclin, og 20 ug / ml voriconazol. Denne blanding tjente til at reducere bakterie- og svampevækst forurening, der kan reducere eller ændre viral multiplikation. - Direkte podning 25 pi af hver prøve på 200 pi amøbe monolag i en plade med 96 brønde fladbundede begunstiger amøbe adhærens og inkuber ved 30 ° C i et fugtigt miljø (et fugtigt miljø består i at placere en våd komprimere inde i posen med plade for at undgå fordampning). Dette er den primo-kultur. Lad to brønde i amøber uden prøve podning; Dette fungerer som den negative kontrol. Inkubér denne Primo-kultur i tre dage.
- Tre dage efter den første inokulering, subkultur Primo-kultur plade på frisk amøber som beskrevet ovenfor, uden nogen mikroskopisk observation. Inkubér ny plade i tre dage under de samme betingelser som primo-kultur.
- Foretage den afsluttende kultur efter disse tre dages inkubation på samme måde som for the primo- og subkultur. Inkuber den endelige kultur i to dage. Så videre til afsløring.
- Påvisning af Lysis ved automatiseret flowcytometri
Bemærk: Blind kultur kombineret med flowcytometri adskiller sig fra den tidligere standard system isolation. Det er mere følsom, præcis og automatiseret. Til detektion formål, vi anvendte en ny teknik udviklet til at detektere lyse på højeste hastighed og uden mikroskopisk observation. Denne teknik er fordelagtig for screening prøver og har bedre følsomhed end ældre teknikker. 7-9- Brug 96-brønds plade af det endelige co-kultur til påvisning lysis.
- Tænd for cytometeret og køre en ren og skylning for at opnå lavere baggrundsstøj ifølge producentens protokol.
- Start højt gennemløb Sampler (HTS) kombineret med flowcytometer til automatisk at indlæse prøver fra 96 brønde og udføre en fuldstændig automatiseret erhvervelse inden 40 min according til producentens protokol.
- Opsæt HTS som følger: prøvevolumen 150 pi, blanding volumen 50 pi, blanding hastighed 180, antal blandinger 5, vask volumen mellem hver prøve 400 pi, strømningshastighed 2,5 ul / sek, antal optagne begivenheder 10.000.
- Vurdere negative kontrolbrønde i den endelige co-kultur mikro-plade først for at gate amøbe befolkning og til at bestemme den procentdel af disse celle værter efter deres fysiske egenskaber. Vær sikker på at have en homogen amøbe befolkning og en anden population af en lavere hændelser svarende til snavs og støj.
Bemærk: Denne gating procedure adskiller subcellulær snavs og klumper fra enkelte celler ved størrelse, anslået af forward scatter. Det er derfor vigtigt præcist at bestemme procentdelen af hver population ved hjælp af den bedst mulige gating procedure. Disse procentsatser kan variere, især hvis der anvendes mange typer af protozoer, så det er vigtigt altid at have en negative kontrol, som kan bruges som reference population for resten af prøverne. - Start gating ved at klikke erhverve prøve.
- Notér antallet af begivenheder, som ikke mindre end 10.000 begivenheder.
- Lokalisere den amøbe befolkning af interesse ved hjælp af pilen. Dette er, hvordan at definere portene.
- Efter gating, lad HTS stedet eller finde pladen ved at klikke på 'Hjem', derefter køre hele pladen automatisk. Udføre indsamling og analyse af data i henhold til størrelse og struktur parametre (henholdsvis FSC (forward scatter) og SSC (side scatter)).
Bemærk: Registrering af tab af amøbe-gated population angiver tilstedeværelsen af et patogent agens, der forårsager amøbe lysis. Protozoer lysis associeret med virus infektion påvises med en vilkårligt udformet tærskel på 50% lyse af amøbe befolkning gated af analysatoren og sammenlignes med de samme ikke-inficerede population anvendes som en pålidelig negativ kontrol.
- Indledende Farvning at afsløre tilstedeværelsen af Giant Vira
- Efter lysis påvisning ved flowcytometri, pipette de lyserede co-kulturer til at suspendere de resterende amøber. Derefter direkte cytocentrifuge 50 pi af suspensionen ved 800 xg i 10 min.
- Efter centrifugering, fastsætte dias med en ren methanol løsning. Farv dias ved hjælp af en kommercielt hurtig farvning af eosin / blå Azur og DAPI farvning og observere under et lysmikroskop ved 1.000X forstørrelse for at kontrollere for tilstedeværelsen af virus fabrikker.
- For hurtig farvning, springet objektglassene i den første eosin-opløsning (4 sek gentaget tre gange) og derefter passere direkte at styrte glider ind i den anden fikseringsopløsning indeholdende blå Azur i 6 sekunder, og endelig glassene skylles i 45 sekunder med en phosphatpufferopløsning pH 7,2. Lad objektglassene tørre ved stuetemperatur, og derefter gå videre til observatipå.
- For DAPI farvning, depositum 15 pi af DAPI kommercielle stamopløsning på den faste tør dias. Beskyt mod lys derefter gå videre til observation.
- Electron Microscopy
- Efter den første identifikation på dias, vurdere tilstedeværelsen af den gigantiske virus gennem elektronmikroskopi observation af supernatant kulturer.
- Depositum 5 ul af positiv prøve på glød-afladet gitter. Vent i ca. 20 minutter ved stuetemperatur.
- Tør gitteret omhyggeligt og deponering på en lille dråbe 1% ammoniummolybdat i 10 sek. Efterlad nettet for at tørre i 5 min.
- Fortsæt til elektronmikroskopi ved 200 keV.
- Placer gitteret på holderen; indføre holderen i mikroskopet. Tjek oversigten tomrum ved at klikke på det tilsvarende ikon. Luk ventiler og begynde observation på et sted størrelse 5 og forstørrelse på x 25.000.
- Mål gigantiske virus ved hjælp af ImageJ eller direktely på mikroskopet med måleværktøjet af mikroskopet placeret på skærmen erhvervelse.
Bemærk: Klassificere prøven i Faustovirus gruppe med en kapsid størrelse på ca. 200 nm.
- Molekylærbiologi
Bemærk: Efter denne identifikation, molekylærbiologiske tests var afgørende for bekræftelse for at skelne Faustovirus fra Marseillevirus, der har samme capsid størrelse og udseende under elektronmikroskopi, selv om de ikke har den samme værtsspecificitet. Den Marseillevirus kan ikke vokse på Vermamoeba, er Faustovirus er specifik for Vermamoeba og alle forsøg på at vokse det på andre amøbe såsom Acanthamoeba har undladt at dato. Udformningen og anvendelsen af de specifikke primer / probe, der er opført i værker af Reteno et al. muliggjort en mere præcis foreløbig klassificering af de nyligt isolerede virus gennem amplifikation og sekventering af de virale gener.- ExDNA-tarmkanalen fra de positive kulturprøver anvendelse af et automatiseret ekstraktion ifølge fabrikantens protokol.
- Udfør Real-time PCR under anvendelse af en thermocycler som beskrevet i Reteno et al. 19
- Sekvens under anvendelse af de samme primere, der blev anvendt til amplifikation. Brug primerne rettet mod DNA-dirigeret RNA-polymerase-underenhed 1-genet: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(fremad) og Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (revers) med den Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA probe.
4. Virus Produktion, Rensning og Genome Sequencing
- Subkultur enkelt virus amøbe kultur for endepunkt fortynding kloning.
- Til produktion: forberede 20 kolber indeholdende 30 ml PYG, 10 ml Vermamoeba vermiformis og 5 ml af den isolerede virus allerede overført fra brønde til små kolber.
- Inkuber ved 30 ° C indtil fuldstændiglyse af den amøbe. Overhold hver dag af inverteret optisk mikroskopi, indtil alle amøbe lyseres.
- Efter fuldstændig lyse, pool alle kolber i én modtager. Filter med en 0,45 um filter for at fjerne debris.
- Start oprensning ved ultracentrifugering ved 89.800 xg i 75 min. Sørg for at kalibrere vægten af rørene, før du starter centrifugering.
- Efter centrifugering, supernatanten fjernes fra hvert rør ved aspiration og re-suspendere pillen i PAS med samme volumen anvendes til kalibrering, før du gentager centrifugering.
- Som ovenfor, supernatanten fjernes og re-suspendere alle pellets i 1 ml phosphatpufret saltvand (PBS).
- Oprens den virus, der er produceret ved anvendelse af 25% saccharose (27,5 g saccharose i 100 ml PBS, filtreret på et 0,22 um filter).
- Anvende 8 ml saccharose og 2 ml af viral suspension. Centrifuger ved 89.800 x g i 1 time 15 min. Re-suspendere pellet i 1 ml PBS. Opbevar ved -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den undersøgt i dette manuskript systemet valideret sin proof of concept ved at isolere to nye Faustoviruses. Af de 70 testede prøver blev to episoder af lysis detekteret, i modsætning til vores pålidelige negative kontroller. Den negative kontrol for lysis indeholdt en 86% amøbe befolkning. Derimod er de positive prøver (ST1 for Saint Pierre de Meyzoargues), og (LC9 for La Ciotat prøve 9) viste en dramatisk nedgang i gated amøber; mere end 60% af amøber blev lyseret med den højeste procentdel af snavs. Disse robuste resultater af detekteringstrin af vores metode er repræsenteret i figur 1. Eosin / blå Azur og DAPI-farvning bekræftede tilstedeværelsen af virus fabrikker inde i amøber, vist i figur 2. Elektronmikroskopi afslørede typiske udseende Megavirales med et tyvefladet capsid , 200 nm i størrelse, og mangler fibriller (figur 3). En specifik PCR for giant vira, particularly for Faustovirus, bekræftede vores tidligere fund. Det skal kontrolleres ved PCR for at fjerne tvetydige resultater eller forurenede isoleringer. Vira blev klonet, produceret og oprenset for hele genomet sekventering. De genomer de nyligt isolerede Faustoviruses indsendes under følgende Bioproject: PRJEB11169. Den primo-, sub-, og sidste-kultur viste ingen svampe- eller bakteriel forurening, begunstige denne viral multiplikation. Vermamoeba vermiformis tolereret anti-svampe og antibiotisk blanding. Dette var klart i den negative kontrol af amøber hvor efter tre dage, slutkulturen indeholdt mere end 80% levende amøbe. Vermamoeba også en god celle vært til isolering, der producerer en signifikant viral belastning efter lyse.
Figur 1: Lysis påvisning ved automatiseret flowcytometri Dataene repræsen.t de to prøver, der høstes Faustovirus og viste amøbe lyse. En levende amøbe population blev anvendt som en negativ kontrol. To porte blev udformet i FSC-SSC plot, potentielt svarer til cellerne og debris. Efter den sidste co-kultur, en stor population af affald viste tilstedeværelsen af en potentiel infektion i prøverne (ST1 og LC9) (B), sammenlignet med den negative kontrol, som viste ingen væsentlige ændringer i de gatede populationer (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Virus fabrikker typiske for nogle gigantiske vira i eosin / blå Azur-farvning og DAPI-farvning Negativ kontrol viser V.. vermiformis kerne under anvendelse eosin / blå Azur-farvning(A), og DAPI-farvning (D) (pile peger til kernen af amøbe). Forstørrelse på 1.000X. (B, C): eosin / blå Azur-farvning ved 1.000X forstørrelse på V. vermiformis inficeret med Faustovirus LC9. Pile peger på kernen i den cirkulariseres smittet amøbe, er virus fabrikker markeret med en stjerne. (E, F) DAPI-farvning ved 1.000X forstørrelse på V. vermiformis inficeret med Faustovirus LC9. Pile peger på virus fabrikker i 8 timer efter infektion (E), og 12 timer efter infektion (F). Scale bar 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: negativ farvning MICRO:. Negativ farvning af den virale suspension efter lyse afsløring, der viser den nyligt opdaget Faustovirus med den typiske udseende Megavirales, med en tyvefladet capsid og en samlet størrelse på 200 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| PYG sammensætning | mængder |
| proteosepepton | 20 g |
| gærekstrakt | 2 g |
| MgSO4. 7H 2 O | 0.980 g |
| CaCl2 | 0,059 g |
| citrat natrium. dihydrat | 1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2 x 6 H2O | 0,02 g |
| Glucose | 18 g |
| destilleret vand til | 1 L |
| Juster pH til 6,8 med HCI eller KOH. | |
| Autoklave 15 minutter ved 121 ° C. | |
| sult medium | mængder |
| gærekstrakt | 2 g |
| Glucose | 18 g |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6 H2O | 0,02 g |
| PAS (beskrevet nedenfor) | 1 L |
| Filtreret på 0,22 mm | |
| PAS opløsning A | mængder |
| KH 2 PO 4 | 0,136 g |
| Na 2 HPO 4 | 0,142 g |
| PAS-opløsning B | mængder |
| MgSO4 .7H 2 O | 4,0 mg |
| CaCl2 .2H 2 O | 4,0 mg |
| NaCl | 0,120 g |
| 10 ml af hver opløsning A og B, sættes til 1 liter destilleret vand. | |
Tabel 1: Solution opskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muligheden for, at Faustovirus kunne være det første medlem af en ny Megavirales familie tæt på ASFV blev først foreslået af Reteno et al., 19, men nogle forskelle kan stadig skelnes. Det ser uklart, om Faustovirus bør tilslutte sig Asfarviridae familien, eller om det i stedet skal danne en ny formodet viral familie. Dette spørgsmål vil kræve yderligere undersøgelser, især en mere omfattende karakterisering af dets morfologi, værtsspektrum, replikation cyklus og gen-repertoire. Flere Faustovirus genotyper skal isoleres for at udvide den pan-genom og for bedre at forstå baggrunden for og slægtninge til denne viral gruppe eller familie. Den teknik, vi brugte tilladt os at fortsætte med at isolere nye medlemmer af denne potentielle nye familie. Denne teknik er kombineret med den lidt modificeret co-kultur teknik, der fungerer som en berigelse skridt for bedre detektion. Den tid, der kræves ved flowcytometri for erhvervelse af data for hundreds af udtagne prøver ikke overstiger en halv time, hvilket er en stor fordel i forhold til den tidligere standard co-dyrkningssystem. 9 Teknikken er langt bedre end den tidligere standard systemet, især i form af dens højere følsomhed og nøjagtig kvantificering.
Af de 70 prøver lanceret, vi isoleret yderligere to Faustoviruses fra spildevand, som kan give oplysninger om de miljømæssige specificitet eller økosystem af denne virus. Faktisk specificitet Faustovirus for protist Vermamoeba vermiformis, 19 samt den nye klassificering af HcDNAV blandt Asfarviridae 23 og det faktum, at denne virus inficerer mange stammer af dinoflagellaten Heterocapsa spp men er ude af stand til at inficere andre typer af planteplankton 24 foreslår tilstedeværelse af host-specificitet blandt Asfarvirus eller dets nære slægtninge.
Disse resultater indebærer brugen af nye cellulære understøtter handler ens specifikke eller ikke-specifikke værter, som kan havnen disse former for virus. Vor teknik kan tilpasses til andre typer af protister i forskellige forhold. Vores metode mærker fremskridt i form af virale isolation og kultur teknikker. Sammenfattende berigelse trin med den mest hensigtsmæssige antibakterielle og svampedræbende blanding er afgørende for afskaffelse af eventuel bakteriel eller svampeangreb. Vores sult medium var den bedste løsning til at opretholde amøber i de bedste betingelser for co-kultur, mens PAS medium, der anvendes i rutinemæssig kultur synes at være uhensigtsmæssigt for Vermamoeba spp, fordi hurtig encystment blev observeret efter 24 timers inkubation. Dette var et stort skridt i retning af optimale dyrkningsbetingelser, hvor tidligere teknikker havde hidtil mislykkedes. For at opnå de bedste resultater ved hjælp af kultur protokoller, der er beskrevet her, anbefales det at bruge frisk amøber i stand til fagocytose. Antibiotikummet og antifungale blanding bør være ikke-toksiske for protister ; Derfor anbefales det at afprøve holdbarheden af det anvendte protozo på blandingen. Alle anvendte materialer skal steriliseres. Arbejdet bør udføres i et mikrobiologisk sikret indlæg klasse II for at undgå enhver sandsynlig forurening. Inkubationstider og de tre faser af kultur skal respekteres som beskrevet. Behandlingstiden for flowcytometri detektion kan kalibreres afhængigt de undersøgte organismer. En lille forskydning i befolkningen fra den oprindelige gating kan observeres, men dette afhænger af den pålidelige negative kontrol bruges som reference population.
Multi-resistente bakterier, der kan findes i kultur og er patogener for amøbe kan en eller anden måde begrænse vores viral isolation metode, hvor vi kan have bakterievækst maskering virus 'multiplikation. Varierende den antibiotiske blanding eller endda filtrering kulturen for at fjerne bakterier på mere end 200 nm størrelse bør forvalte denne begrænsning tider.
"> Alle disse tilpassede betingelser tilbyde en ny optimal isolation procedure, der understøtter viral multiplikation. Denne teknik giver en betydelig fordel i opdagelsen af nye vira, især Megavirales, for bedre at forstå deres mangfoldighed, oprindelse, og potentielle patogenicitet.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al.
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3 (0), 737-742 (2010).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
