Abstract
Isoleringen av jätte virus är av stort intresse i denna nya era av virologi, särskilt eftersom dessa gigantiska virus är relaterade till protister. Giant virus kan vara potentiellt patogena för många arter av protister. De tillhör den nyligen beskrivna ordning Megavirales. Den nya linjen Faustovirus som har isolerats från avloppsprov är en avlägsen släkting till däggdjurs patogen afrikansk svinpest-virus. Detta virus är också specifik för sin amoebal värd, Vermamoeba vermiformis, en protist vanligt i hälso- och sjukvårds vattensystem. Det är viktigt att fortsätta att isolera nya Faustovirus genotyper för att förstora sin genotyp insamling och studera dess pan-genomet. Vi utvecklade nya strategier för isolering av ytterligare påfrestningar genom att förbättra användningen av antibiotika och svampdödande kombinationer för att undvika bakterie- och svampkontaminering av amöba co-kultur och gynnar virusförökning. Vi genomförde också en ny starvation medium för att upprätthålla V. vermiformis i optimala förhållanden för virus co-kultur. Slutligen använde vi flödescytometri snarare än mikroskopisk observation, vilket är tidskrävande, att detektera den cytopatogena effekten. Vi fick två isolat från avloppsprov, bevisar effektiviteten i denna metod och på så sätt bredda samling Faustoviruses, för att bättre förstå sin omgivning, värdspecificitet och genetiska innehåll.
Introduction
Upptäckten av jätte virus, i synnerhet de som hör till den Megavirales ordning, helt förändrade världen av virus i termer av partikelstorlek och genomet komplexitet. Virus tidigare tros vara små enheter, och Mimivirus verkade bryta alla regler. 1 metagenomic data antyder den gränslösa jätte virus inte bara i miljön, 2-5 men även hos människor. 6 Därför finns det fortfarande ett behov för att söka efter dessa virus i stor skala. Mångfalden av dessa gigantiska virus bedömdes genom provtagning inte bara en mängd olika vattenmiljöer och tillhörande sediment i världen, 7-11 men också genom att screena ett flertal humana prover 12,13 och miljöprover. 7,9 De Acanthamoeba allätarbaggar Mimivirus var isolerades genom samodling med hjälp av fagocytiska protists främst Acanthamoeba spp. 14-16 En hel samling av gigantiska virus var då ocksåisolerad från den angivna protist värd, vilket gjorde det vetenskapliga samfundet begränsa dess förfarande för Acanthamoeba spp forskning och isolering. Självklart är detta beroende av en enda värdarter har resulterat i en stor del av virus förbises. Det faktum att den gigantiska virus, CroV, isolerades med den mycket rörliga marina protozoer Cafeteria roenbergensis, 17,18 visar behovet av att använda ett bredare spektrum av protozoer i syfte att upptäcka nya linjer eller familjer av gigantiska virus. Reteno et al. Lyckades välja andra protozoer som cellvärdar som aldrig tidigare använts, och isolerade den nya Asfar relaterade härstamning jätte virus (det nya namnet Faustovirus). 19
I ett försök att isolera nya Faustovirus genotyper för att expandera medlemmarna i denna virus härstamning, ändrade vi våra isoleringsförfaranden och använde dem för att screena miljöprover kan skörda nya Faustoviruses. Vi dåbeskrev hela protokollet för att karaktärisera de nya isolaten. Vi bedömde Vermamoeba vermiformis, den vanligaste fritt levande protist återfinns i humana miljöer, 20-22 som redan används i isoleringen av den första Faustovirus prototypen E12. 19 Denna protist är för närvarande fortfarande värd-specifik för Faustovirus. Vi visste att ingen av de kända jätte virus var patogena för amöba, eftersom inga försök att odla andra jätte virus i vårt labb visade amöba lys eller viral tillväxt. Av den anledningen anser vi att V. vermiformis är den bästa och mest unika cell stöd känd för att isolera nya Faustoviruses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provtagning
- Samla 70 prover från olika miljöer och regioner. I detta fall, använd följande: 5 smutsiga vattenprover från byn Saint Pierre de Meyzoargues (Frankrike), 15 prover från sjön i Parc Borély i Marseille (Frankrike); 15 havsvatten prover med sediment från den steniga vikar på Samena i Marseille (Frankrike), 25 flod vattenprover från Alperna (Frankrike), och slutligen, 10 prover från avloppsvatten i La Ciotat (Frankrike).
- Vortex prover för homogenisering före ympning, under en minut vid rumstemperatur utan någon behandling.
2. Isolering ordningen
- Värd Förberedelse för Blind Kultur procedurer och prov Ympning
- Användning V. vermiformis (stam CDC19) som en cell stöd för co-kultur.
- Bibehålla amöbor vid 28 ° C, i ett 75 cm 2-cellkulturflaska med 30 ml proteas-pepton-jästextrakt-glukos-medium (PYG). Kontrollera PYG sammanställningen i tabell 1.
Obs: Efter 48 timmar är amöbor kvantifieras av en normal räkna med räkna diabilder (t.ex. Kovaslides). - Harvest celler vid en koncentration av 5 x 10 MAJ - 10 juni celler / ml, och pelleten amöbor genom centrifugering vid 720 xg under 10 min.
- Avlägsna supernatanten genom aspiration, och återsuspendera amöbor pelleten i 30 ml steril Sidans amoebal saltlösning (PAS) Tabell 1. Upprepa denna sköljning förfarande.
- Återsuspendera amöbor i 30 ml svältmediet med ett antibiotikum och antisvampblandningen vid en koncentration av ca 10 6 amöba / ml. Svältmediet är en överlevnadsmedium för amöba, som gör det möjligt att överleva utan encystment eller multiplikation. Kontrollera kompositionen i tabell 1.
Obs: Den antimikrobiella medlet Blandningen innehöll 10 | j, g / ml vancomycin, 10 | ig / ml imipenem, 20 ug / ml ciprofloxacin, 20 μg / ml doxycyklin, och 20 ^ g / ml voriconazol. Denna blandning tjänade till att minska bakterier och svampkontaminering som kan minska eller ändra viral multiplikation. - Direkt ympa 25 pl av varje prov på 200 ul amöba monolager i en 96-brunnar plan botten gynnar amöba följsamhet och inkubera vid 30 ° C i en fuktig miljö (en fuktig miljö består av att placera en våt kompress i påsen som innehåller plattan för att undvika avdunstning). Detta är primo-kulturen. Lämna två brunnar i amöbor utan prov ympning; detta fungerar som den negativa kontrollen. Inkubera denna primo-kultur under tre dagar.
- Tre dagar efter den första inokuleringen, subkultur den primo-odlingsplatta på färsk amöbor som beskrivits ovan utan någon mikroskopisk observation. Inkubera den nya plattan i tre dagar på samma villkor som primo-kulturen.
- Utför slutliga kulturen efter dessa tre dagars inkubation på samma sätt som för the primo- och subkultur. Inkubera den slutliga kulturen i två dagar. Fortsätt sedan till upptäckt.
- Detektion av Lysis genom automatiserad flödescytometri
Obs: Blind kultur i kombination med flödet skiljer cytometry från tidigare standardsystem av isolering. Det är mer känslig, exakt och automatiserad. För detekteringsändamål, tillämpade vi en ny teknik utvecklad för att mäta lys vid den högsta hastigheten och utan mikroskopisk observation. Denna teknik är fördelaktig för screeningprover och har bättre känslighet än äldre tekniker. 7-9- Använd 96-brunnar av den slutliga sam-kultur för att detektera lys.
- Slå på cytometern och köra en ren och sköljningscykel för att erhålla lägre bakgrundsbrus enligt tillverkarens protokoll.
- Starta hög genomströmning Sampler (HTS) i kombination med flödescytometer för att automatiskt ladda prover från 96-brunnar och utföra en helt automatiserad förvärv inom 40 min according till tillverkarens protokoll.
- Ställ upp HTS enligt följande: provvolym 150 l, blanda volym 50 pl, blandningshastighet 180, antalet mixar 5, tvättvolym mellan varje prov 400 pl, flödeshastighet 2,5 l / sek, antal inspelade händelser 10.000.
- Bedöma de negativa kontrollbrunnar i den slutliga samodling mikroplatta först för att gate amöba befolkningen och att bestämma andel av dessa cellvärdar i enlighet med deras fysiska egenskaper. Var noga med att ha en homogen amöba befolkning och en andra population av en lägre händelser motsvarande skräp och buller.
Obs! Denna grind förfarande skiljer subcellulär skräp och klumpar från enstaka celler efter storlek, uppskattas av framåtspridning. Det är därför viktigt att exakt fastställa den procentuella andelen av varje population med bästa möjliga grind förfarande. Dessa procentsatser kan variera, speciellt om många typer av protozoer används, så det är viktigt att alltid ha en negative kontroll, som kan användas som referenspopulationen för resten av proverna. - Starta grind genom att klicka förvärva prov.
- Registrera antalet händelser som inte mindre än 10.000 händelser.
- Lokalisera amöba populationen av intresse med hjälp av pilen. Detta är hur man ska definiera grindarna.
- Efter gating, låt HTS plats eller lokalisera plattan genom att klicka på "Start", sedan köra hela plattan automatiskt. Utför datainsamling och analys enligt de parametrar storlek och struktur (respektive FSC (ljusspridning framåt) och SSC (sidospridning)).
Obs: Upptäcka förlusten av amöba-gated befolkningen signalerar närvaron av en patogen agent ansvarig för amöba lys. Protozoer lys i samband med virusinfektion upptäcks med ett godtyckligt utformat tröskel på 50% lys av amöba befolkningen gated av analysatorn och jämfört med samma icke-infekterade populationen som en pålitlig negativ kontroll.
- Preliminär Färgning att avslöja förekomsten av Giant virus
- Efter lys upptäckt av flödescytometri, pipett de lyserade co-kulturer att avbryta de återstående amöbor. Sedan direkt cytocentrifug 50 | il av suspensionen vid 800 xg under 10 min.
- Efter centrifugering, fixa bilderna med en ren metanollösning. Stain bilderna med hjälp av en kommersiell snabb färgning av Eosin / blå Azur och DAPI färgning och observera under ett ljusmikroskop vid 1,000X förstoring för att kontrollera förekomsten av virusfabriker.
- För snabb färgning, störta objektglasen in i den första eosin-lösning (4 sek upprepades tre gånger) sedan passera direkt till störta glider in i den andra fixeringslösningen innehållande blå Azur för 6 sekund, och slutligen skölj glasen för 45 sek med en fosfatbuffertlösning pH 7,2. Låt objektglasen torka vid rumstemperatur, sedan vidare till observatipå.
- För DAPI färgning, insättning 15 pl av DAPI kommersiella stamlösning på den fasta torra bilden. Skyddas från ljus sedan vidare till observation.
- elektronmikroskopi
- Efter den första identifiering på bilderna, bedöma förekomsten av den gigantiska viruset genom elektronmikroskopi observation supernatant kulturer.
- Insättning 5 ul av positivt prov på glöd urladdat rutnät. Vänta i ungefär 20 minuter vid rumstemperatur.
- Torka gallret noggrant och insättning på det en liten droppe av en% ammoniummolybdat i 10 sek. Lämna rutnätet för att torka i 5 minuter.
- Fortsätt till elektronmikroskopi vid 200 keV.
- Placera gallret på hållaren; införa hållaren i mikroskopet. Kontrollera vakuum översikten genom att klicka på motsvarande ikon. Stäng ventilerna och börja observation vid en punktstorlek 5, och förstoring av x 25.000.
- Mät den gigantiska virus med hjälp av ImageJ eller direktly på mikroskopet med hjälp av mätverktyget mikroskopets ligger på förvärvs skärmen.
Notera: klassificera provet i Faustovirus grupp med ett kapsid storlek på ca 200 nm.
- Molekylärbiologi
Obs: Efter denna identifiering, molekylärbiologiska tester var avgörande för bekräftelse för att skilja Faustovirus från Marseillevirus, som har samma kapsiden storlek och utseende i elektronmikroskop, även om de inte har samma värdspecificitet. Den Marseillevirus kan inte växa på Vermamoeba är Faustovirus specifik för Vermamoeba och alla försök att växa på den andra amöba som Acanthamoeba har misslyckats hittills. Utformningen och tillämpningen av de särskilda primer / probsystem som anges i verk av Reteno et al. möjliggjort en mer exakt preliminär klassificering av de nyligen isolerade virus genom amplifiering och sekvensering av de virala generna.- Exvägarna DNA från de positiva odlingsprover med hjälp av ett automatiserat utsugsystem enligt tillverkarens protokoll.
- Utför Realtids-PCR med hjälp av en termocykler som beskrivs i Reteno et al. 19
- Sekvensen med användning av samma primrar som användes för amplifiering. Använda primrarna inriktnings DNA-styrt RNA-polymeras-subenhet en gen: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(framåt) och Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (bakåt) med den Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA-sond.
4. Virus Produktion, rening och Genome Sequencing
- Subkultur den enda virus amöba kultur för slutpunkten utspädningskloning.
- För produktion: förbereda 20 flaskor innehållande 30 ml PYG, 10 ml Vermamoeba vermiformis och 5 ml av det isolerade viruset redan överförts från brunnar till små flaskor.
- Inkubera vid 30 ° C tills fullständiglys av amöba. Observera varje dag genom inverterad optisk mikroskopi tills alla amöba lyseras.
- Efter fullständig lys, pool alla kolvar i en mottagare. Filter med en 0,45 pm filter för att eliminera skräp.
- Starta rening genom ultracentrifugering vid 89.800 xg under 75 min. Se till att kalibrera vikten av rören innan centrifugering.
- Efter centrifugering, avlägsna supernatanten från varje rör genom aspiration och återsuspendera pelleten i PAS med samma volym som används för kalibrering, innan den upprepar centrifugering.
- Som ovan, avlägsna supernatanten och återsuspendera alla pellets i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Rena det virus som produceras med användning av 25% sackaros (27,5 g sackaros i 100 ml PBS, filtrerades på ett 0,22 ^ m filter).
- Använda 8 ml sackaros och 2 ml av den virala suspensionen. Centrifugera vid 89.800 xg under 1 h 15 min. Återsuspendera pelleten i 1 ml PBS. Förvara vid -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Systemet studeras i detta manuskript validerade sin proof of concept genom att isolera två nya Faustoviruses. Av de 70 testade proverna var två episoder av lys detekteras, i motsats till våra tillförlitliga negativa kontroller. Den negativa kontrollen för lys innehöll en 86% amöba befolkningen. Däremot de positiva proven (ST1 för Saint Pierre de Meyzoargues), och (LC9 för La Ciotat Prov 9) visade en dramatisk nedgång i gated amöbor; mer än 60% av amöbor lyserades med den högsta andelen skräp. Dessa robusta resultat av upptäckten skede av vår metod är representerade i figur 1. Eosin / blå Azur och DAPI färgning bekräftade närvaron av virusfabriker inuti amöbor, som visas i figur 2. Elektronmikroskopi avslöjade typiska utseendet på Megavirales med en ikosaedrisk kapsid , 200 nm i storlek, och saknar fibriller (Figur 3). En specifik PCR för jätte virus, particularly för Faustovirus bekräftade våra tidigare fynd. Det måste kontrolleras av PCR för att eliminera tvetydiga resultat eller förorenade isoleringar. Virus klonades, producerades och renas för hela genomet sekvensering. Genomen av de nyligen isolerade Faustoviruses lämnas under följande Bioproject: PRJEB11169. Den primo-, del- och slut-kulturen visade ingen svamp eller bakteriell kontamination, gynnar denna viral multiplikation. Vermamoeba vermiformis tolereras anti-svamp och antibiotiska blandningen. Det stod klart i den negativa kontrollen av amöbor där efter tre dagar, den slutliga kulturen innehöll mer än 80% levande amöba. Vermamoeba gav också en bra cell värd för isolering, vilket ger en betydande virusbelastning efter lys.
Figur 1: Lysis detektering genom automatiserad flödescytometri Data repre.t de två proven, som skördade Faustovirus och visade amöba lys. En levande amöba population användes som en negativ kontroll. Två portar utformades i FSC-SSC plot, potentiellt motsvarar cellerna och skräp. Efter den sista co-kultur, en stor population av skräp påvisat en potentiell infektion i proven (ST1 och LC9) (B), jämfört med den negativa kontrollen som visade inga väsentliga förändringar i gated populationer (A). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Virus fabriker som är typiska för några jätte virus i Eosin / blå Azur färgning och DAPI färgning Negativ kontroll visar V.. vermiformis kärnan med användning av Eosin / blå Azur-färgning(A), och DAPI-färgning (D) (pilar pekar mot kärnan hos den amöba). Förstoring vid 1,000X. (B, C): Eosin / blå Azur färgning vid 1,000X förstoring av V. vermiformis infekterade med Faustovirus LC9. Pilarna pekar mot kärnan i cirkulär infekterade amöba, är virusfabriker markerade med en asterisk. (E, F) DAPI färgning vid 1,000X förstoring av V. vermiformis infekterade med Faustovirus LC9. Pilarna pekar mot virusfabriker vid 8 h efter infektion (E), och 12 h efter infektion (F). Skala bar 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Negativ färgning micrograph. Negativ färgning av den virala suspensionen efter lys upptäckt, visar den nyligen upptäckta Faustovirus med det typiska utseendet av Megavirales, med en ikosaedriska kapsid och en totalyta på 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| PYG komposition | kvantiteter |
| proteospepton | 20 g |
| Jästextrakt | 2 g |
| MgSO 4. 7 H2O | 0,980 g |
| CaCl2 | 0,059 g |
| citrat natrium. dihydrat | 1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2 x 6 H2O | 0,02 g |
| Glukos | 18 g |
| destillerat vatten för | 1 L |
| Justera pH vid 6,8 med HCl eller KOH. | |
| Autoklavera 15 min vid 121 ° C. | |
| svält-medium | kvantiteter |
| Jästextrakt | 2 g |
| Glukos | 18 g |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2. 6 H2O | 0,02 g |
| PAS (se nedan) | 1 L |
| Filtreras på 0,22 mm | |
| PAS lösning A | kvantiteter |
| KH 2 PO 4 | 0,136 g |
| Na 2 HPO 4 | 0,142 g |
| PAS lösning B | kvantiteter |
| MgSO 4 .7H 2 O | 4,0 mg |
| CaCl2 .2H 2 O | 4,0 mg |
| NaCl | 0,120 g |
| 10 ml av varje lösning A och B, tillsätts i 1 liter destillerat vatten. | |
Tabell 1: Lösning recept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Möjligheten att Faustovirus kan vara den första medlemmen i en ny Megavirales familj nära ASFV föreslogs först av Reteno et al., 19 men vissa skillnader kan fortfarande urskiljas. Det verkar oklart om Faustovirus bör ansluta sig till Asfarviridae familjen eller om det istället bör utgöra en ny förmodad viral familj. Denna fråga kommer att kräva ytterligare utredning, framför allt en mer omfattande karakterisering av sin morfologi, värdområde, replikationscykeln och gen repertoar. Mer Faustovirus genotyper bör isoleras för att expandera den pan-genomet och för att bättre förstå ursprunget och släktingar till denna virus grupp eller familj. Tekniken vi använde tillät oss att fortsätta att isolera nya medlemmar i denna potentiella nya familj. Denna teknik är kopplad med den något modifierade sam-odlingsteknik, som fungerar som ett anrikningssteg för bättre detektering. Den tid som krävs med flödescytometri för förvärv av uppgifter för hundreds prover inte överstiger en halv timme, vilket är en stor fördel jämfört med den tidigare standarden samodlingssystemet. 9 Tekniken är mycket bättre än det tidigare standardsystemet, särskilt när det gäller dess högre känslighet och exakt kvantifiering.
Av de 70 prover som lanseras, isolerade vi ytterligare två Faustoviruses från avloppsvatten, vilket skulle kunna ge information om miljö specificitet eller ekosystem av detta virus. Faktum är att 24 antyder specificitet Faustovirus för protist Vermamoeba vermiformis, 19 samt den nya klassificeringen av HcDNAV bland Asfarviridae 23 och det faktum att detta virus infekterar många stammar av dinoflagellaten Heterocapsa spp men är oförmögen att infektera andra typer av fytoplankton den närvaro av värd specificitet bland Asfarvirus eller dess nära släktingar.
Dessa fynd antyder användningen av nya cellulära stöd agerar enär specifika eller icke-specifika värdar, som kan hysa dessa typer av virus. Vår teknik kan anpassas till andra typer av protister i olika förhållanden. Vår metod märken framsteg i fråga om virusisolerings och odlingstekniker. Sammanfattningsvis, anriknings steg med den mest lämpliga antibakteriella och svampdödande blandning är avgörande för att eliminera eventuella bakterie- eller svampkontamination. Vår svält mediet var den bästa lösningen att upprätthålla amöba i de bästa förutsättningarna för co-kultur, medan PAS medium som används vid rutinmässig kultur verkar vara olämpligt för Vermamoeba spp, eftersom snabb encystment observerades efter 24 timmar av inkubation. Detta var ett stort steg mot optimala odlingsbetingelser där tidigare tekniker hade hittills misslyckats. För att uppnå bästa resultat med hjälp av kultur protokoll som beskrivs här, är det rekommenderat att använda färsk amöbor kan fagocytos. Den antibiotika och svampdödande blandning bör vara icke-toxiska för protists ; Därför är det rekommenderat att testa livskraft används protozoon på blandningen. Alla material som används ska steriliseras. Arbetet ska bedrivas i en mikrobiologisk säkrad post klass II för att undvika sannolika föroreningar. Inkubationstider och de tre stadierna av kultur bör respekteras som beskrivs. Handläggningstiden för flödescytometri upptäckt kan kalibreras beroende på organismerna studerade. En liten förskjutning i populationen från den ursprungliga gating kan observeras, men detta beror på den tillförlitliga negativa kontrollen används som en referenspopulation.
Multiresistenta bakterier som kan hittas i kultur och är patogener för amöba kan på något sätt begränsa vår virusisoleringsmetoden, där vi kan ha bakterietillväxt maskering virus "multiplikation. Variation av antibiotiska blandningen eller filtrering av kultur för att eliminera bakterier av mer än 200 nm storlek bör hantera denna begränsning ibland.
"> Alla dessa anpassade villkor erbjuda en ny optimal isoleringsförfarande, som stödjer viral multiplikation. Denna teknik ger en avsevärd fördel i upptäckten av nya virus, särskilt Megavirales, för att bättre förstå deras mångfald, ursprung och potentiella patogeniciteten.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al.
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3 (0), 737-742 (2010).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
