一种利用Vermamoeba vermiformis从环境样本中快速分离新型福斯托病毒的策略

摘要

本文介绍了病毒分离技术的最新进展，用于表征福斯托病毒（Faustovirus）的新基因型，该病毒属于与非洲猪瘟病毒相关的一类新型巨大病毒谱系。本方案可应用于病毒的高通量分离，尤其适用于感染阿米巴原虫的巨大病毒。

摘要

巨型病毒的分离在病毒学的新时代具有重要意义，尤其是因为这些巨型病毒与原生生物相关。巨型病毒可能对多种原生生物具有潜在致病性。它们属于最近描述的巨病毒目（Megavirales）。从污水样本中分离出的新谱系法斯托病毒（Faustovirus）与哺乳动物病原体非洲猪瘟病毒具有较远的亲缘关系。该病毒也对其阿米巴宿主具有特异性。 Vermamoeba vermiformis一种在医疗用水系统中常见的原生生物。 继续分离新的福斯托病毒（Faustovirus）基因型对于扩大其基因型库并研究其泛基因组至关重要。我们开发了新的策略以分离更多毒株，通过优化抗生素和抗真菌剂的组合使用，避免阿米巴共培养过程中细菌和真菌的污染，同时促进病毒的增殖。此外，我们还建立了一种新的饥饿培养基以维持 V. vermiformis 在病毒共培养的最佳条件下进行实验。最后，我们采用流式细胞术而非耗时的显微镜观察来检测细胞病变效应。我们从污水样本中成功分离出两个毒株，证明了该方法的有效性，从而扩展了福斯托病毒（Faustoviruses）的收集范围，有助于更好地理解其生态环境、宿主特异性及基因组内容。

引言

巨大病毒的发现，尤其是属于巨病毒目（Megavirales）的病毒，在病毒颗粒大小和基因组复杂性方面彻底改变了病毒世界。此前，病毒被认为是一类微小的实体，而拟菌病毒（Mimivirus）似乎打破了所有这些规则¹。宏基因组数据表明，巨大病毒不仅广泛存在于环境中^2-5，也存在于人体内⁶。因此，仍有必要大规模地寻找这类病毒。这些巨大病毒的多样性评估不仅依赖于对全球多种水生环境及其相关沉积物的采样^7-11，还包括对多种人体样本^12,13和环境样本的筛查^7,9。Acanthamoeba polyphaga 拟菌病毒是通过与吞噬性原生生物共培养分离得到的，主要使用的宿主为Acanthamoeba属原生生物^14-16。随后，大量巨大病毒均从这一特定的原生生物宿主中被分离出来，导致科学界在研究和分离过程中局限于使用Acanthamoeba属物种。显然，对单一宿主物种的依赖导致了大量病毒被忽视。巨大病毒CroV是利用高度运动性的海洋原生动物Cafeteria roenbergensis成功分离的^17,18，这一事实表明，有必要采用更广泛的原生动物宿主，以发现新的巨大病毒谱系或家族。Reteno et al. 成功筛选出此前从未被用作细胞宿主的其他原生动物，并从中分离出与非洲猪瘟病毒相关的....

方案

1. 样品采集

1. 从不同环境和区域采集70份样品。本实验中使用以下样品：5份来自法国圣皮埃尔德梅佐阿尔格村（Saint Pierre de Meyzoargues）的污水样品，15份来自法国马赛博雷利公园（Parc Borély）湖泊的样品，15份来自法国马赛萨梅纳（Samena）岩石海湾含沉积物的海水样品，25份来自法国阿尔卑斯山区的河水样品，以及最后10份来自法国拉西约塔（La Ciotat）的污水样品。
2. 接种前将样品在室温下涡旋振荡1分钟，以实现均质化，无需任何预处理。

2. 分离步骤

1. 盲法培养操作的宿主准备及样本接种
   1. 使用 V. vermiformis （菌株 CDC19）作为共培养的细胞载体。
   2. 将阿米巴在28 °C、75 cm²培养瓶中培养² 含30 ml蛋白胨-多肽-酵母提取物-葡萄糖培养基（PYG）的细胞培养瓶。PYG的成分请见 表1.
      注意：48 小时后，使用计数板通过常规计数法对阿米巴进行定量例如，Kovaslides）
   3. 以 5 x 10 的浓度收集细胞⁵ 至 10⁶ 细胞/ml，720 × g 离心 10 分钟沉淀阿米巴。
   4. 吸除上清液，将阿....

结果

本研究中所采用的系统通过分离出两种新的法斯托病毒（Faustoviruses）验证了其概念可行性。在测试的70个样本中，检测到两次裂解事件，而我们的可靠阴性对照则未出现裂解。裂解的阴性对照样本中， amoeba 细胞比例保持在86%。相比之下，阳性样本（ST1，来自Saint Pierre de Meyzoargues）和（LC9，来自La Ciotat样本9）中门控的 amoeba 细胞数量显著下降，超过60%的 amoeba 细胞发生裂解，并伴随最高比例的细胞碎片。本方法检测阶段的这些有力结果如图1所示。伊红/蓝色美兰（Eosin/blue Azur）染色和DAPI染色证实了病毒工厂存在于 amoeba 细胞内，如图2所示。电子显微镜观察显示病毒具有典型的巨病毒目（Megavirales）形态特征：二十面体衣壳，直径约200 nm，无纤维结构（图3）。针对巨型病毒特别是法斯托病毒（Faustovirus）的特异性PCR检测进一步证实了我们先前的结果。必须通过PCR检测.......

讨论

Reteno 首次提出，Faustovirus 可能是与非洲猪瘟病毒（ASFV）亲缘关系较近的一个新 Megavirales 科的首个成员 等人，¹⁹ 但仍然可以区分出一些差异。目前尚不明确法斯托病毒（Faustovirus）是否应归入非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae），还是应建立为一个新的假定病毒科。这一问题需要进一步研究，特别是对其形态学、宿主范围、复制周期以及基因组成进行更全面的表征。应分离更多法斯托病毒基因型，以扩展其泛基因组，并更深入地理解该病毒类群或科的起源及其亲缘关系。我们所采用的技术使我们能够持续分离这一潜在新病毒科的更多成员。该技术结合了稍加改良的共培养方法，作为富集步骤以提高检测效率。流式细胞术在获取数百个样本数据时所需时间不超过半小时，相较于以往的标准共培养系统，具有显著优势。⁹ 该技术远优于先前的标准系统，尤其在灵敏度更高和定量更精确方面。

在启动的70个样本中，我们从污水中又分离出两种福斯托病毒（Faustoviruses），这可能为了解该病毒的环境特异性或生态系统提供信息。事实上，福斯.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LSR FORTESSA 流式细胞仪	BD Biosciences	法国	649225B4
TECNAI G2 F20	FEI	德国	5027/11
倒置光学显微镜	leica	法国	72643
DNA 提取	Qiagen EZ1 Advanced XL 提取机器人	法国	L106A0452
PCR 循环仪 CFX96	Bio rad	法国	785BR06298
PYG 培养基、PAS、饥饿培养基	实验室自制	马赛 URMITE	x
阿米巴菌株 CDC-19	ATCC	法国	50237
培养板	Cellstar	法国	655180
PCR 材料、引物	eurogentec	法国	引物见文稿中列出
带网格的 Glasstic 载玻片 10	Kova	美国	H899871441F
伊红/蓝色阿祖蓝-血染色剂（Eosin/blue Azur-Hemacolor 染色）	Merck milipore	法国	111955,6,57,109468
真空驱动滤器	Thermo scientific	法国	BPV4550 / 20170115
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher scientific	法国	10010-023
DAPI 染色剂	Life Technologies	法国	D1306
细胞离心涂片机 Cytospin 4	Thermo Fisher scientific	法国	10522013JT184-31
单细胞学隧道	Biomedical polymers inc.	法国	BMP-cyto-S50
碳支持膜铜网	Euromedex	法国	FCF400NI
钼酸铵	VWR internationanl	法国	21276185
培养瓶	SARSTEDT	德国	833911
0.22 μm 滤膜	Milex millipor	法国	SE2M229104
超速离心机 Sorval WX 80	Thermo scientific	法国	9102448
快速流动滤器	Nalgene	法国	450-0020