Abstract
巨病毒的隔离是病毒学的新时代的极大兴趣，特别是因为这些巨大的病毒都与原生生物。巨病毒可能是原生生物的许多种潜在的病原。它们属于Megavirales的最近描述的顺序。新血统Faustovirus已经从污水样品中分离是远亲哺乳动物病原体非洲猪瘟病毒。该病毒还具体到了amoebal主机，Vermamoeba vermiformis，保健水系统常见的原生生物。 这是继续以扩大其基因型收集并研究了其泛基因组中分离新Faustovirus基因型是至关重要的。我们通过改进使用抗生素和抗真菌组合以避免阿米巴共培养的细菌和真菌污染和有利于病毒增殖开发的附加菌株的分离的新策略。我们还实施了新的starvatioñ中保持V. vermiformis在病毒共培养的最佳条件。最后，我们使用流式细胞术而非显微镜观察，这是费时的，以检测细胞病变效应。我们获得了从污水样品2株，证明了这种方法的效率，从而扩大Faustoviruses的收集，以便更好地了解他们的环境，宿主特异性和遗传的内容。
Introduction
巨病毒，特别是那些属于Megavirales顺序的发现，完全在粒度和基因组的复杂性的角度改变的病毒的世界。病毒以前被认为是小的实体，以及巨病毒的出现打破所有规则。1宏基因组数据表明巨病毒不仅在环境，2-5而且在人类中的普遍存在6因此，仍然需要来搜索这些病毒大规模。这些巨型病毒的多样性进行了筛选各种人体标本12,13和环境样品抽检不仅有各种水生环境及其相关的沉积物在世界范围内，7-11也评估7,9的棘阿米巴多食巨病毒是采用原生生物吞噬，这主要是棘阿米巴属共培养分离出14-16巨病毒的整个集合当时也从这个指定的原生生物的主机，这使得科学界对限制棘阿米巴属其研究和分离过程分离出来。显然，这依赖于一个单一的宿主物种已导致被忽视病毒的很大一部分。该巨病毒，CroV，是与高度能动海洋原生动物馆roenbergensis分离的事实，17,18表明，有必要使用范围更广原生动物以发现新的谱系或巨病毒家族。 Reteno 等人成功地选择其他原生动物细胞宿主以前从未被使用的，以及分离出的病毒巨头新Asfa酒店相关谱系（新命名的Faustovirus）。19
在试图为了扩大这个病毒家族的成员来隔离新Faustovirus基因型，我们修改隔离程序，并用它们来筛选能够收获新Faustoviruses的环境样本。然后，我们描述的整个协议来表征新菌株。我们评估Vermamoeba vermiformis，最常见的自由生活的原生生物在人类环境中发现的，20-22这是已经在第一Faustovirus原型E12 19此原生生物目前仍在主机的特异性Faustovirus的分离中使用。我们知道，没有任何已知病毒巨头病原是该变形虫，因为在我们的实验室中表明阿米巴裂解或病毒生长没有尝试种植其他巨型病毒。出于这个原因，我们认为五vermiformis是众所周知的隔离新Faustoviruses最好的和最独特的电池支持。
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Protocol
1.样品采集
- 收集来自不同的环境和区域70的样品。在这种情况下，使用以下命令：5脏水样本圣徒皮埃尔·德·Meyzoargues（法国），从马赛（法国）的博雷利公园湖中15个样品的村; 15海水样品从Samena在马赛（法国），从阿尔卑斯山（法国）25河水样品的岩石口泥沙，最后，从污水中10个样品中拉西约塔（法国）。
- 涡旋样品均质接种，在室温下一分钟无任何治疗之前。
2.分离过程
- 主机准备的盲文化程序及抽样接种
- 五，使用vermiformis（株CDC19）作为共培养细胞的支持。
- 保持在28℃的阿米巴，在用30毫升的蛋白酶蛋白胨-酵母提取物-葡萄糖培养基的75cm 2的细胞培养烧瓶（PYG）。请检查PYG成分见表1。
注：48小时后，变形虫是由正常的使用次数计数的幻灯片（ 例如 ，Kovaslides）量化。 - 收获的细胞以在720×g离心10分钟的5×10 5〜10 6格/ ml，并将粒料变形虫的浓度通过离心。
- 通过抽吸除去上清液，并重新悬浮在30毫升无菌页的amoebal盐水（PAS） 表1的阿米巴沉淀。重复此漂洗过程。
- 以大约10 6变形虫/ ml的浓度重悬在30毫升饥饿培养基具有抗生素和抗真菌混合物变形虫。在饥饿培养基为变形虫生存介质，使其能够没有包囊或乘法活着。检查组合物在表1中。
注意：抗微生物剂混合物含有10微克/毫升万古霉素，10微克/毫升亚胺培南，20微克/毫升环丙沙星，20μ微克/毫升的强力霉素和20μg/ ml的伏立康唑。这种混合有助于减少细菌和真菌污染，可以减少或改变病毒的繁殖。 - 直接接种25微升各样品到200微升变形虫单层在96孔板平底利于变形虫粘附和在潮湿环境下在30℃孵育（潮湿环境由放置湿敷包含内袋的板以避免蒸发）。这是初次 - 文化。离开没有任何样品接种变形虫的两口井;这充当阴性对照。孵育此初次 - 培养三天。
- 三天后的第一个接种，亚文化，没有任何显微镜观察上述新鲜变形虫的初次 - 培养板。孵育相同的条件作为初次 - 培养下三天的新板。
- 孵化三天后进行最后的文化方式与日同Ëprimo-和亚文化。孵育的最后培养两天。然后进行检测。
- 裂解检测自动通过流式细胞术
注：加上流动盲文化从术隔离以前的标准体系不同。它是更灵敏，准确和自动的。为了检测目的，我们应用开发以最高速度和无显微观察来检测裂解的新技术。这种技术是用于筛选的样品有利的，并且具有比旧的技术更好的灵敏度。7-9- 使用最终共培养的96孔板来检测裂解。
- 打开仪和以根据制造商的协议，以获得较低的背景噪声运行一个清洁和漂洗循环。
- 启动高通量采样（HTS）与流动相结合仪自动加载从96孔板的样品和在40分钟内执行完全自动采集according至制造商的协议。
- 成立了HTS如下：样品体积150微升，混合容积50微升，搅拌速度180，混合5号，每个样本400微升的洗涤容量，流速2.5微升/秒，记录的事件10000号。
- 评估的最终共培养微板的阴性对照孔首先以栅极变形虫人口，并根据它们的物理特性，以确定这些细胞宿主的百分比。一定要有均匀的变形虫人口和相应的碎片和噪音更低事件的第二个群体。
注：此门程序由单细胞的大小，前向散射估计区分亚细胞碎片和团块。它准确地确定使用最佳选通过程的每个种群的百分比是重要的。这些百分比可以改变，尤其是在使用多种类型的原生动物，所以重要的是总是有一个是负面e控制，其可被用作样品的其余部分的参考群体。 - 开始通过点击获取样品门。
- 记录事件不大于10000的事件较少的数量。
- 本地化使用箭头感兴趣的变形虫人口。这是如何定义的大门。
- 门后，让现场HTS或通过单击“主页”定位板，然后自动运行整个板块。根据尺寸和结构参数执行数据采集和分析（分别为，FSC（前向散射）和SSC（侧向散射））。
注意：检测阿米巴 - 门控群体的损失信号负责阿米巴裂解致病剂的存在。与病毒感染相关的原生动物裂解与由分析器控和相比用作可靠阴性对照相同的非感染人群阿米巴人口的50％溶解的任意设计阈值检测。
- 初步染色显示巨病毒的存在
- 通过流式细胞仪检测溶解后，吸取裂解共培养暂停剩下的阿米巴。然后直接cytocentrifuge 50微升悬浮液在800×g离心10分钟。
- 离心后，修复用纯甲醇溶液中的幻灯片。使用曙红/蓝色海岸和DAPI染色的商业快速染色染色的幻灯片，以检查病毒工厂的存在在1,000X倍的光学显微镜下观察。
- 为快速染色，沉浸所述滑入第一曙红溶液（4秒重复三次），然后直接传递到沉浸滑入含有蓝色海岸为6秒第二定影溶液，最后用磷酸盐缓冲溶液冲洗45秒的幻灯片pH值7.2。离开幻灯片在室温下干燥，然后进行observati上。
- 对于DAPI染色，存款15微升的DAPI商业原液到固定干燥幻灯片。避光然后进行观察。
- 电子显微镜
- 在幻灯片上的第一个经过鉴定，评估的巨型病毒，通过培养上清电子显微镜观察的存在。
- 存款5微升的阳性样品到辉光放电电网。等待在室温下大约20分钟。
- 仔细擦干电网并沉积在其1％钼酸铵为10秒的小降。离开网格干燥5分钟。
- 继续在200千电子伏电子显微镜。
- 放置在保持器的网格;引进的持有人到显微镜。通过点击相应的图标检查真空概述。关闭阀，开始观察在光点大小5，并且x 25,000放大倍数。
- 测量使用ImageJ或直接巨型病毒LY使用位于屏幕收购在显微镜测量工具显微镜。
注：分类的样品放入Faustovirus组具有大约200nm的衣壳大小。
- 分子生物学
注意：在此之后的识别，分子生物学试验是为确认，以便从Marseillevirus，其具有下式电子显微镜对相同衣壳大小和外观区分Faustovirus至关重要的，虽然它们不具有相同的宿主特异性。该Marseillevirus不能Vermamoeba增长，Faustovirus是特定于Vermamoeba和所有尝试生长它在其他阿米巴如棘阿米巴未能日期。在设计和Reteno 等人的作品中列出的特定的引物/探针系统的应用。启用的新分离出的病毒更精确的初步分类，通过病毒基因的扩增和测序。- 前根据制造商的方案使用自动提取系统从培养阳性样品道的DNA。
- 执行使用热循环仪的PCR作为Reteno 等人所述实时19
- 序列采用了用于扩增的相同的引物。使用的引物靶向DNA指导的RNA聚合酶亚基1基因：Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3'（正向）和Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3'（反向）与在Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA探针。
4.病毒生产，纯化和基因组测序
- 继代培养的终点稀释克隆的单个病毒变形虫文化。
- 为生产：制备装有30ml PYG，10毫升Vermamoeba vermiformis和5ml从井中已经转移到小瓶中分离的病毒的20烧瓶中。
- 孵育在30℃，直到完全阿米巴溶解。倒置光学显微镜观察每一天，直到所有的阿米巴裂解。
- 完成裂解后，全部集中到瓶一个收件人。用0.45微米的过滤器过滤，以消除碎屑。
- 在89800 XG 75分钟开始通过超速离心提纯。确保在开始离心前校准管的重量。
- 离心后，通过抽吸除去从每个管的上清液，用用于校准相同体积重悬浮在PAS沉淀，重复离心前。
- 如上述，取出上清液并重新悬浮在1ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的所有颗粒。
- 纯化所产生，用25％的蔗糖（27.5在100ml PBS中的蔗糖，上过滤0.22微米过滤器）的病毒。
- 使用8毫升蔗糖和2ml病毒悬浮液。离心89800 XG为1小时15分钟。重新悬浮于1ml PBS中的沉淀。存储在-80℃。
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Representative Results
在这个手稿研究该系统通过隔离两个新的验证Faustoviruses的概念证明。测试的70个样本中，有检测裂解的两集，而相比之下，我们的可靠阴性对照。用于裂解阴性对照含86％人口的阿米巴。相比之下，阳性标本（ST1为圣徒皮埃尔·德·Meyzoargues）和（LC9的拉西约塔样品9）显示门变形虫的大幅下降;变形虫的60％以上，用碎片的比例最高裂解。这些我们的方法的检测级的健壮的结果在图1中表示。曙红/蓝海岸和DAPI染色证实病毒工厂的阿米巴内部存在下，在图2中所示的电子显微镜显示Megavirales的典型外观与二十面体衣壳在大小，200nm，并且缺乏原纤维（ 图3）。具体PCR巨病毒，PArticularly为Faustovirus，证实了我们先前的调查结果。它必须通过PCR，以消除不明确的结果或污染隔离检查。病毒进行克隆，生产和全基因组测序纯化。新分离Faustoviruses的基因组是根据以下Bioproject提交：PRJEB11169。的primo-，分，和最终培养均未见真菌或细菌污染，有利于该病毒繁殖。Vermamoeba vermiformis耐受抗真菌和抗生素混合物。这在三天后，最终的培养物含有80％以上的活阿米巴变形虫的阴性对照是清楚的。Vermamoeba还提供了良好的细胞宿主隔离，产生裂解后一个显著病毒载量。
图1：裂解检测由自动化流式细胞仪的数据represen。t是两个样本，其收获Faustovirus并显示变形虫裂解。一条活阿米巴人口作为阴性对照。两个门被设计在FSC-SSC图，潜在地对应于细胞和碎片。最后共培养后，碎片人口众多表现出潜在感染的样品中是否存在（ST1和LC9）（B）所示，相比于阴性对照，其显示该门控群体没有实质性的变化（A）中。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：病毒典型的工厂在某些曙红巨病毒/蓝色海岸染色和DAPI染色阴性对照显示五 。使用曙红/蓝色海岸染色vermiformis核（A）和DAPI染色（D）的（箭头指向变形虫的核）。在放大1000倍。 （B，C）：曙红/蓝色海岸五时的1000倍放大倍率染色vermiformis感染Faustovirus LC9。箭头指向各位变形虫感染的细胞核，病毒工厂都标有星号。在五 ，1,000X放大倍率（E，F）DAPI染色vermiformis感染Faustovirus LC9。箭头指向病毒工厂在8小时后感染（E）和12小时后的感染（F）。比例尺10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：负染色MICRograph。裂解检测后的病毒悬液，显示了Megavirales的典型外观，与二十面体衣壳和200nm的总规模新检测Faustovirus负染色。 请点击此处查看该图的放大版本。
| PYG组成 | 数量 |
| 蛋白胨 | 20克 |
| 酵母抽提物 | 2克 |
| 硫酸镁 。 7H 2 O | 0.980克 |
| 氯化钙 | 0.059克 |
| 柠檬酸钠。二水 | 1克 |
| 铁（NH 4）2（SO 4）2×6 H 2 O | 0.02克 |
| 葡萄糖 | 18克 |
| 蒸馏水 | 1升 |
| 在6.8用HCl或KOH调整pH值。 | |
| 在121℃高压釜15分钟。 | |
| 饥饿中 | 数量 |
| 酵母抽提物 | 2克 |
| 葡萄糖 | 18克 |
| 的Fe（NH 4）2（SO 4）2。 6 H 2 O | 0.02克 |
| PAS（下面详述） | 1升 |
| 过滤的0.22毫米 | |
| PAS液A | 数量 |
| KH 2 PO 4 | 0.136克 |
| 的 Na 2 HPO 4 | 0.142克 |
| PAS溶液B | 数量 |
| 硫酸镁4·7H 2 O | 4.0毫克 |
| 氯化钙2·2H 2 O | 4.0毫克 |
| 氯化钠 | 0.120克 |
| 各10ml溶液A和B的，加入到1升的蒸馏水中。 | |
表1：溶液配方。
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Discussion
该Faustovirus可能是一个新Megavirales家族接近非洲猪瘟病毒的第一个成员的可能性首先由Reteno。等，19建议，但有些差别仍可以区分。这似乎不清楚Faustovirus是否应该加入非洲猪瘟病毒科的家人或是否应该将形成一个新的公认的病毒家族。这个问题将需要进一步调查，特别是它的形态有更全面的描述，寄主范围，复制周期和基因剧目。更多Faustovirus基因型应以扩大泛基因组，并更好地理解这个病毒的团体或家庭的起源和亲人进行隔离。我们所采用的技术允许我们继续隔离这一潜在的新家族的新成员。这种技术加上略微修改共培养技术，其作为用于更好的检测富集步骤。通过流式细胞仪获取数据的胡所需的时间样品ndreds不超过半小时，这是比以前的标准共培养系统的主要优点。9的技术是远远大于以前的标准系统更好，尤其是在其较高的灵敏度和精确定量的条款。
推出的70个样本中，我们分离污水另外两个Faustoviruses，这可能会提供有关此病毒的特异性环境或生态系统的信息。事实上，Faustovirus为原生生物Vermamoeba vermiformis的特殊性，19以及HcDNAV的非洲猪瘟病毒科23间新的分类，这种病毒会感染甲藻Heterocapsa属多株，但不能感染其他类型的浮游植物的事实24暗示宿主特异性存在Asfarvirus或其近亲。
这些发现意味着使用行事的新型蜂窝支持的具体或非特异性的主机，其可以怀有这些种类的病毒。我们的技术可适应于其它类型的在不同条件下的原生生物的。我们的方法标志着病毒分离培养技术方面取得进展。总之，用最合适的抗菌和抗真菌混合物的富集步骤是为消除任何可能的细菌或真菌污染的关键。我们的饥饿培养基维持在用于共培养的最佳条件的变形虫的最佳解决方案，而在常规培养中使用的PAS介质似乎是不合适的Vermamoeba菌属，因为被后培养24小时，观察到快速包囊。这是朝着在以前的技术迄今未能最佳培养条件的一大步。为了获得使用此处描述的培养协议的最佳结果，建议使用能够吞噬新鲜变形虫。抗生素和抗真菌混合物应该是无毒的用于原生生物 ;因此，建议以测试该混合物的使用原虫的生存能力。所有使用的材料应灭菌。这项工作应在微生物固定岗位II类进行，以避免任何可能的污染。所描述的孵育时间和文化的三个阶段应该得到尊重。对于流式细胞术检测的处理时间可以根据所研究的生物体进行校准。在从原始门控人口的小的移位可能会观察到的，但是这取决于用作参考群体中可靠阴性对照。
可以在培养物中发现的，并且是阿米巴病原体多重耐药菌能以某种方式限制我们的病毒分离的方法，在这里我们可以有细菌生长掩蔽病毒'乘法。改变抗生素的混合物，甚至过滤的文化，以消除大小应时而管理这种限制超过200nm的细菌。
“>所有这些改编条件提供新的最佳分离过程中，支持病毒繁殖。该技术存在的新病毒，特别是Megavirales发现一个相当大的优势，更好地了解他们的多样性，起源，和潜在的致病性。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
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