Abstract
El aislamiento del virus gigantes es de gran interés en esta nueva era de la virología, sobre todo porque estos virus gigantes están relacionadas con los protistas. virus gigantes pueden ser potencialmente patógenos para muchas especies de protistas. Pertenecen al orden descrito recientemente de Megavirales. El nuevo linaje Faustovirus que se ha aislado de muestras de aguas residuales está lejanamente relacionado con el virus de la peste porcina africana patógeno de mamífero. Este virus también es específico de su huésped amebas, vermiformis Vermamoeba, un protista común en los sistemas de agua para el cuidado de la salud. Es fundamental seguir aislando nuevos genotipos Faustovirus con el fin de ampliar su colección genotipo y estudiar su pan-genoma. Hemos desarrollado nuevas estrategias para el aislamiento de cepas adicionales mediante la mejora de la utilización de combinaciones de antibióticos y antifúngicos con el fin de evitar contaminaciones bacterianas y fúngicas de la ameba co-cultivo y favoreciendo la multiplicación del virus. También hemos implementado un nuevo starvation medio para mantener V. vermiformis en condiciones óptimas para el virus de co-cultivo. Por último, se utilizó citometría de flujo en lugar de la observación microscópica, que consume mucho tiempo, para detectar el efecto citopatogénico. Se obtuvieron dos aislamientos de muestras de aguas residuales, lo que demuestra la eficacia de este método y ampliando así la recogida de Faustoviruses, para entender mejor su medio ambiente, la especificidad del hospedador y contenido genético.
Introduction
El descubrimiento de virus gigantes, especialmente los que pertenecen a la orden Megavirales, cambió por completo el mundo de los virus en términos de tamaño de partícula y la complejidad del genoma. Los virus se pensaba que ser entidades pequeñas, y el Mimivirus parecieron romper todas las reglas. 1 metagenomic datos sugiere la ubicuidad de los virus gigantes no sólo en el medio ambiente, 2-5, sino también en los seres humanos. 6 Por lo tanto, todavía hay una necesidad para buscar estos virus a gran escala. La diversidad de estos virus gigantes se evaluó mediante el muestreo no sólo una variedad de ambientes acuáticos y sus sedimentos asociados en todo el mundo, 7-11, sino también por la selección de una variedad de muestras humanas 12,13 y muestras ambientales. 7,9 Los mimivirus Polyphaga Acanthamoeba fue aislado por co-cultivo usando protistas fagocíticas, principalmente Acanthamoeba spp. 14-16 Una colección completa de virus gigantes eran entonces tambiénaislado de este alojamiento protista especificado, lo que hizo que la comunidad científica restringir su procedimiento de la investigación y el aislamiento de Acanthamoeba spp. Es evidente que esta dependencia de una sola especie de acogida ha dado lugar a una gran parte de los virus que se pasa por alto. El hecho de que el virus gigante, CroV, se aisló con la gran movilidad roenbergensis protozoos marinos Cafetería, 17,18 demuestra la necesidad de utilizar una gama más amplia de protozoos con el fin de descubrir nuevos linajes o familias de virus gigantes. Reteno et al. Lograron seleccionar otros protozoos como anfitriones celulares que nunca antes se había utilizado, y se aisló el nuevo linaje relacionados con Asfar de virus gigantes (el recién nombrado Faustovirus). 19
En un intento de aislar nuevos genotipos Faustovirus con el fin de ampliar los miembros de este linaje viral, modificamos nuestros procedimientos de aislamiento y los utilizó para examinar muestras ambientales capaces de cosechar nuevos Faustoviruses. Nosotros entoncesse describe el protocolo completo para caracterizar los nuevos aislados. Se evaluó vermiformis Vermamoeba, el protista de vida libre más común encontrado en los ambientes humanos, 20-22 que ya se utiliza en el aislamiento del primer prototipo Faustovirus E12. 19 Este protista actualmente está siendo el anfitrión-específico para Faustovirus. Sabíamos que ninguno de los virus gigantes conocidos era patógena para esta ameba, porque no hay intentos de cultivar otros virus gigantes en nuestro laboratorio mostraron lisis ameba o el crecimiento viral. Por esta razón, nosotros creemos que V. vermiformis es el mejor y más exclusivo apoyo de células conocidas para aislar nuevos Faustoviruses.
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Protocol
Colección 1. Muestra
- Recoge 70 muestras de diferentes ambientes y regiones. En este caso, utilice los siguientes: 5 muestras de agua sucia de la localidad de Saint Pierre de Meyzoargues (Francia), 15 muestras del lago en Parc Borély en Marsella (Francia); 15 muestras de agua de mar con los sedimentos de las calas en Samena en Marsella (Francia), 25 muestras de agua del río de los Alpes (Francia), y finalmente, 10 muestras de aguas residuales en La Ciotat (Francia).
- muestras de vórtice para la homogeneización antes de la inoculación, durante un minuto a temperatura ambiente sin ningún tratamiento.
Procedimiento 2. Aislamiento
- Preparación para albergar procedimientos de ciego Cultura y la inoculación de la muestra
- V. Uso vermiformis (cepa CDC19) como un soporte de células para el co-cultivo.
- Mantener las amebas a 28 ° C, en un 75 cm matraz de cultivo de 2 células con 30 ml de medio de extracto de glucosa-proteasa-peptona-levadura (PYGRAMO). Por favor, compruebe la composición PYG en la Tabla 1.
Nota: Después de 48 horas, las amebas se cuantifican mediante un recuento utilizando diapositivas de conteo normales (por ejemplo, Kovaslides). - Células de la cosecha a una concentración de 5 x 5 10-6 10 células / ml, y pellet amebas por centrifugación a 720 xg durante 10 min.
- Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender el pellet amebas en 30 ml de solución salina estéril amebas de Página (PAS) Tabla 1. Repita este procedimiento de enjuague.
- Vuelva a suspender amebas en 30 ml de medio de inanición con una mezcla de antibióticos y antifúngicos a una concentración de aproximadamente 10 6 amebas / ml. El medio de inanición es un medio de supervivencia para la ameba, lo que le permite mantenerse con vida y sin enquistamiento o multiplicación. Comprobar la composición en la Tabla 1.
Nota: La mezcla de agente antimicrobiano contenía 10 mg / ml de vancomicina, 10 mg / ml imipenem, 20 g / ml de ciprofloxacina, 20 μg / ml de doxiciclina, y 20 mg / ml voriconazol. Esta mezcla sirve para reducir la contaminación bacteriana y fúngica que puede disminuir o alterar la multiplicación viral. - Directamente inocular 25 l de cada muestra en el 200 l monocapa ameba en un fondo plano placa de 96 pocillos que favorece la adherencia ameba y se incuba a 30 ° C en un ambiente húmedo (un ambiente húmedo consiste en colocar una compresa húmeda dentro de la bolsa que contiene el placa con el fin de evitar la evaporación). Este es el primo-cultura. Dejar dos pozos de amebas sin ninguna inoculación de la muestra; esto actúa como el control negativo. Incubar este primo-cultivo durante tres días.
- Tres días después de la primera inoculación, sub-cultivo de la placa primo-cultura en amebas fresco como se describe anteriormente sin ninguna observación microscópica. Incubar la nueva placa durante tres días en las mismas condiciones que el primo-cultura.
- Realizar el cultivo final después de estos tres días de incubación de la misma manera como para THe primo- y sub-cultura. Incubar el cultivo final durante dos días. A continuación, proceder a la detección.
- La detección de la lisis por Automated Citometría de Flujo
Nota: la cultura Ciegos junto con el flujo de citometría difiere del sistema anterior estándar de aislamiento. Es más sensible, preciso y automatizado. Para propósitos de detección, se aplicó una nueva técnica desarrollada para detectar lisis a la velocidad más alta y sin observación microscópica. Esta técnica es ventajosa para las muestras de cribado y tiene una mejor sensibilidad que las técnicas más antiguas. 7-9- Utilice la placa de 96 pocillos de la final de co-cultivo para detectar la lisis.
- Encienda el citómetro y ejecutar un ciclo de limpieza y aclarado con el fin de obtener menor ruido de fondo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Poner en marcha el Sampler de alto rendimiento (HTS) combinado con citómetro de flujo para cargar automáticamente las muestras de la placa de 96 pocillos y realizar una adquisición completamente automatizada dentro de 40 min according con el protocolo del fabricante.
- Configurar el sistema de cine de la siguiente manera: 150 l volumen de la muestra, mezclando volumen de 50 l, 180 de velocidad, número de mezclas de mezcla 5, el volumen de lavado entre cada muestra de 400 l, caudal de 2,5 l / seg, el número de eventos registrados 10.000.
- Evaluar los pocillos de control negativo de la co-cultivo de micro-placa final de primera con el fin de puerta de la población ameba y para determinar el porcentaje de estas células huésped de acuerdo a sus características físicas. Asegúrese de tener una población homogénea ameba y una segunda población de unos acontecimientos inferiores correspondientes a los desechos y el ruido.
Nota: Este procedimiento compuerta distingue restos subcelular y cúmulos de células individuales por tamaño, estimados por dispersión hacia adelante. Por tanto, es importante determinar con precisión el porcentaje de cada población usando el mejor procedimiento gating posible. Estos porcentajes pueden variar, especialmente si se utilizan muchos tipos de protozoos, así que es importante siempre tener un negativde control electrónico, que puede ser utilizado como la población de referencia para el resto de las muestras. - Iniciar la compuerta haciendo clic en la muestra de adquisición.
- Registrar el número de eventos no menos de 10.000 eventos.
- Localizar la población ameba de interés utilizando la flecha. Esta es la forma de definir las puertas.
- Después de bloquear, dejar que el punto de HTS o localizar la placa haciendo clic en "Inicio", a continuación, ejecutar toda la placa automáticamente. Realizar adquisición y análisis de datos de acuerdo con los parámetros de tamaño y estructura (respectivamente, FSC (dispersión hacia adelante) y SSC (dispersión lateral)).
Nota: La detección de la pérdida de la población de ameba cerrada señala la presencia de un agente patógeno responsable de la lisis ameba. lisis Protozoa asociado con infección por el virus se detecta con un umbral arbitrariamente diseñada de 50% de lisis de la población ameba cerrada por el analizador y en comparación con la misma población no infectada utilizado como control negativo fiable.
- La tinción preliminar para revelar la presencia de virus gigantes
- Después de la detección de lisis por citometría de flujo, pipetear los co-cultivos lisadas a suspender las amebas restantes. Entonces citocentrífuga directamente 50 l de la suspensión a 800 xg durante 10 min.
- Después de la centrifugación, fijar los portaobjetos con una solución de metanol puro. Manchar las diapositivas utilizando una tinción rápida comercial de Eosina / azul Azul y tinción DAPI y observar con un microscopio óptico con un aumento de 1.000X con el fin de comprobar la presencia de fábricas de virus.
- Para tinción rápida, sumergirse las diapositivas en la primera solución de eosina (4 sec repitió tres veces) y luego pasa directamente a sumergirse diapositivas en la segunda solución de fijación que contiene azul Azul durante 6 s, y finalmente enjuagar las diapositivas de 45 segundos con una solución tampón de fosfato pH 7,2. Deje secar los portas a temperatura ambiente, a continuación, proceder a observatien.
- Para la tinción DAPI, depósito de 15 l de la solución madre comercial DAPI sobre el portaobjetos seco fijo. Proteger de la luz a continuación, proceder a la observación.
- Microscopio de electrones
- Después de la primera identificación en las diapositivas, evaluar la presencia del virus gigante través de la observación de microscopía electrónica de las culturas sobrenadante.
- Depósito de 5 l de la muestra positiva sobre la rejilla descargada brillan. Esperar aproximadamente 20 min a temperatura ambiente.
- Se seca la rejilla con cuidado y depósito en él una pequeña gota de molibdato de amonio al 1% durante 10 seg. Deje la rejilla para secar durante 5 minutos.
- Continúe con Microscopía Electrónica a 200 keV.
- Coloque la rejilla en el soporte; introducir el soporte en el microscopio. Compruebe el resumen de vacío haciendo clic en el icono correspondiente. Cierre las válvulas y comienzan observación en un tamaño de punto 5, y el aumento de x 25.000.
- Medir el virus gigante usando ImageJ o directaLy en el microscopio utilizando la herramienta de medida del microscopio se encuentra en la pantalla de adquisición.
Nota: Clasificar la muestra en el grupo Faustovirus con un tamaño de la cápside de aproximadamente 200 nm.
- Biología Molecular
Nota: Después de esta identificación, pruebas de biología molecular fueron cruciales para la confirmación con el fin de distinguir Faustovirus de Marseillevirus, que tiene el mismo tamaño de la cápside y la apariencia bajo el microscopio electrónico, aunque no tienen la misma especificidad de huésped. El Marseillevirus no puede crecer en Vermamoeba, el Faustovirus es específico para Vermamoeba y todos los intentos de hacer crecer en otras amebas como Acanthamoeba han fracasado hasta la fecha. El diseño y la aplicación de los sistemas de cebadores / sondas específicas enumeradas en las obras de Reteno et al. permitido una clasificación preliminar más precisa de los virus recién aislados a través de la amplificación y secuenciación de los genes virales.- ExADN tracto partir de las muestras de cultivo positivo usando un sistema de extracción automatizada de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Realizar PCR en tiempo real utilizando un termociclador como se describe en Reteno et al. 19
- Secuencia usando los mismos cebadores que se usaron para la amplificación. Usa los cebadores dirigidos dirigida por ADN polimerasa de ARN de la subunidad 1 gen: CAT Fstv_S2F 5'-CCA GGA GAT CAC ATA GGT G-3 '(hacia adelante) y Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT AAT A-3' (inverso) con la sonda Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA.
4. Virus de Producción, purificación y secuenciación del genoma
- Subcultura de la misma cultura ameba virus para el punto final clonación de dilución.
- Para la producción: preparar 20 matraces que contenían 30 ml de PYG, 10 ml de vermiformis Vermamoeba y 5 ml del virus aislado ya transferido de pozos a los pequeños frascos.
- Se incuba a 30 ° C hasta su completala lisis de la ameba. Observar todos los días por microscopía óptica invertida hasta que todas las amebas son lisadas.
- Después de la lisis completa, en común todos los frascos en un solo recipiente. Filtro con un filtro de 0,45 micras para eliminar los desechos.
- Iniciar la purificación mediante ultracentrifugación a 89.800 xg durante 75 min. Asegúrese de calibrar el peso de los tubos antes de iniciar la centrifugación.
- Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante de cada tubo por aspiración y resuspender el sedimento en PAS con el mismo volumen utilizado para la calibración, antes de repetir la centrifugación.
- Como el anterior, eliminar el sobrenadante y volver a suspender todos los gránulos en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Se purifica el virus que se produce, con el 25% de sacarosa (27,5 g de sacarosa en 100 ml de PBS, se filtró sobre un filtro de 0,22 micras).
- Utilice 8 ml de sacarosa y 2 ml de la suspensión viral. Centrifugar a 89.800 xg durante 1 h 15 min. Volver a suspender el sedimento en 1 ml de PBS. Almacenar a -80 ° C.
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Representative Results
El sistema estudiado en este manuscrito validado su prueba de concepto mediante el aislamiento de dos nuevas Faustoviruses. De las 70 muestras analizadas, se detectaron dos episodios de lisis, a diferencia de nuestros controles negativos fiables. El control negativo para la lisis contenía una población ameba 86%. Por el contrario, las muestras positivas (ST1 de Saint Pierre de Meyzoargues), y (LC9 para la muestra La Ciotat 9) mostraron una disminución dramática en las amebas cerrada; más de 60% de las amebas se lisaron con el mayor porcentaje de los residuos. Estos resultados robustos de la etapa de detección de nuestro método se representan en la Figura 1. Eosina / azul Azul y DAPI tinción confirmó la presencia de fábricas de virus dentro de las amebas, que se muestra en la Figura 2. La microscopía electrónica reveló la apariencia típica de Megavirales con una cápside icosaédrica , 200 nm de tamaño, y que carecen de fibrillas (Figura 3). Una PCR específica para los virus gigante, particularly para Faustovirus, confirma nuestros resultados anteriores. Debe comprobarse por PCR con el fin de eliminar resultados ambiguos o aislamientos contaminados. Los virus se clonaron, producido y purificado para la secuenciación de todo el genoma. Los genomas de los Faustoviruses recién aisladas se presentan en la siguiente Bioproject: PRJEB11169. El primo-, sub, y última, la cultura no mostró hongos o la contaminación bacteriana, favoreciendo esta multiplicación viral. Vermiformis Vermamoeba toleran la mezcla de anti-hongos y antibióticos. Esto estaba claro en el control negativo de amebas donde después de tres días, el cultivo final contenía más de 80% ameba vivo. Vermamoeba también proporcionó un buen anfitrión celular para el aislamiento, la producción de una carga viral significativa después de la lisis.
Figura 1: Detección de la lisis por citometría de flujo automatizado El represen datos.t las dos muestras, que cosechan Faustovirus y mostraron lisis ameba. Una población ameba vivir se utilizó como control negativo. Dos puertas fueron diseñados en la trama FSC-SSC, potencialmente correspondiente a las células y los residuos. Después de la final de co-cultivo, una gran población de escombros demostró la presencia de una infección potencial en las muestras (ST1 y LC9) (B), en comparación con el control negativo que no mostró cambios sustanciales en las poblaciones cerradas (A). Por favor clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Virus fábricas típicos para algunos virus gigantes en eosina / tinción con azul Azul y tinción DAPI Control negativo que muestran la V.. vermiformis núcleo mediante la tinción de eosina / azul Azul(A), y tinción DAPI (D) (las flechas apuntan al núcleo de la ameba). Poder observar 1.000X. (B, C): Eosina / tinción con azul de Azur en 1.000X ampliación de V. vermiformis infectado con Faustovirus LC9. Las flechas apuntan al núcleo de la ameba infectada circularized, fábricas de virus están marcados con un asterisco. (E, F) DAPI en 1.000X ampliación de V. vermiformis infectado con Faustovirus LC9. Las flechas apuntan a las fábricas de virus en 8 horas después de la infección (E), y después de la infección 12 h (F). La barra de escala 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Negativo micr tinciónograph. tinción negativa de la suspensión viral después de la detección de lisis, que muestra el Faustovirus recién detectado con el aspecto típico de Megavirales, con una cápside icosaédrica y un tamaño total de 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| composición PYG | cantidades |
| peptona proteosa | 20 g |
| Extracto de levadura | 2 g |
| MgSO 4. 7H 2 O | 0,980 g |
| CaCl 2 | 0,059 g |
| citrato de sodio. dihidrato | 1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO 4) 2 x 6 H2O | 0,02 g |
| Glucosa | 18 g |
| agua destilada para | 1 L |
| Ajustar el pH a 6,8 con HCl o KOH. | |
| Autoclave 15 minutos a 121 ° C. | |
| medio de inanición | cantidades |
| Extracto de levadura | 2 g |
| Glucosa | 18 g |
| Fe (NH4) 2 (SO 4) 2. 6 H2O | 0,02 g |
| PAS (detallado a continuación) | 1 L |
| Se filtra sobre 0,22 mm | |
| PAS solución A | cantidades |
| KH 2 PO 4 | 0,136 g |
| Na 2 HPO 4 | 0,142 g |
| PAS solución B | cantidades |
| MgSO4 .7H 2 O | 4.0 mg |
| CaCl 2 • 2H 2 O | 4.0 mg |
| NaCl | 0,120 g |
| 10 ml de cada solución de A y B, se añaden en 1 L de agua destilada. | |
Tabla 1: Solución de recetas.
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Discussion
La posibilidad de que Faustovirus podría ser el primer miembro de una nueva familia Megavirales cerca de VPPA se sugirió por primera vez por Reteno et al., 19 pero algunas diferencias todavía se puede distinguir. Parece claro si Faustovirus debe unirse a la familia Asfarviridae o si debería en cambio formar una nueva familia viral putativa. Este problema será necesario estudiar más detalladamente, en particular, una caracterización más completa de su morfología, la gama de huéspedes, ciclo de replicación y el repertorio de genes. Más genotipos Faustovirus deben ser aislados con el fin de ampliar el pan-genoma y para comprender mejor los orígenes y los familiares de este grupo viral o familiar. La técnica que utilizamos nos permitió continuar aislar nuevos miembros de esta potencial nueva familia. Esta técnica está acoplada con la técnica de co-cultivo ligeramente modificada, que actúa como una etapa de enriquecimiento para una mejor detección. El tiempo requerido por citometría de flujo para la adquisición de datos para hundreds de las muestras no supera la media hora, lo cual es una gran ventaja en comparación con el sistema de co-cultivo estándar anterior. 9 La técnica es mucho mejor que el sistema estándar anterior, sobre todo en términos de su mayor sensibilidad y cuantificación precisa.
De las 70 muestras lanzados, se aislaron otros dos Faustoviruses de aguas residuales, que podrían proporcionar información sobre la especificidad del medio ambiente o ecosistema de este virus. De hecho, la especificidad de Faustovirus para los protistas vermiformis Vermamoeba, 19, así como la nueva clasificación de HcDNAV entre la Asfarviridae 23 y el hecho de que este virus infecta a muchas cepas de dinoflagelado Heterocapsa spp pero es incapaz de infectar a otros tipos de fitoplancton 24 sugiere la presencia de huésped-especificidad entre Asfarvirus o sus parientes cercanos.
Estos hallazgos implican el uso de nuevos soportes celulares que actúan de unas hosts específicos o no específicos, que pueden albergar este tipo de virus. Nuestra técnica se puede adaptar a otros tipos de protistas en diferentes condiciones. Nuestras marcas método progreso en términos de técnicas de aislamiento y cultivo viral. En resumen, los pasos de enriquecimiento con la mezcla antibacteriana y antifúngica más adecuado son cruciales para la eliminación de cualquier posible contaminación bacteriana o fúngica. Nuestro medio de inanición era la mejor solución para mantener la ameba en las mejores condiciones para el co-cultivo, mientras que el medio PAS usada en cultivo de rutina parece ser inadecuado para Vermamoeba spp, ya que se observó rápida enquistamiento después de 24 horas de incubación. Este fue un gran paso hacia unas condiciones óptimas de cultivo donde las técnicas anteriores habían fracasado hasta ahora. Con el fin de obtener los mejores resultados utilizando los protocolos de cultivo descritas aquí, se recomienda utilizar amebas fresco capaz de fagocitosis. La mezcla de antibiótico y antifúngico debe ser no tóxico para los protistas ; por lo tanto, se recomienda para poner a prueba la viabilidad del protozoo utilizado en la mezcla. Todos los materiales utilizados deben ser esterilizados. El trabajo debe llevarse a cabo en un microbiológica asegurado clase II del poste para evitar cualquier contaminación probable. Los tiempos de incubación y las tres etapas de la cultura deben ser respetados como se ha descrito. El tiempo de procesamiento para la detección de citometría de flujo puede ser calibrado en función de los organismos estudiados. Un pequeño cambio en la población de la gating original puede ser observado, pero esto depende del control negativo fiable utilizado como una población de referencia.
bacterias multirresistentes que se pueden encontrar en la cultura y son patógenos para las amebas pueden de alguna manera limitar nuestro método de aislamiento viral, donde podemos tener crecimiento bacteriano enmascarar la multiplicación de los virus. La variación de la mezcla de antibióticos o incluso filtrando la cultura con el fin de eliminar las bacterias de más de 200 nm de tamaño debe gestionar esta limitación veces.
"> Todas estas condiciones adaptados ofrecen un nuevo procedimiento de aislamiento óptimo, lo que es compatible con la multiplicación viral. Esta técnica presenta una ventaja considerable en el descubrimiento de nuevos virus, particularmente Megavirales, para comprender mejor su diversidad, los orígenes y la patogenicidad potencial.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
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