Abstract
이 보고서는 셀룰로오스 필터 종이 학년 1 위 (중간 흐름 여과지) 디스크 및 등급 번호 113 (빠른 흐름 여과지) 디스크에 캡처 항체의 공유 고정하는 두 가지 방법을 제시한다. 항체 그들에 고정되기 전에 이러한 셀룰로오스 종이 디스크는 실란 커플 링 기술을 통해 아민 작용기로 그래프트 하였다. 요오드 산 산화 및 글루 타르 알데히드 가교 방법은 셀룰로오스 종이 디스크에 포획 항체를 이식하는데 사용되었다. 고정화 후 목표물을 포획 항체의 최대 결합능을 보장하기 위해, 요오드 산 나트륨, 글루 타르 알데히드, 용지 디스크의 표면 상에 포획 항체의 다양한 농도의 영향을 조사 하였다. 요오 산화법에 비해 글루 타르 알데히드 가교제 통해 아민 - 작용 화 셀룰로스 페이퍼 디스크에 코팅 된 항체는 표적에 결합 활성을 강화 보였다. (마우스 혈청 참조)의 IgG는 글루 타르 알데히드를 통해 공유 적으로 고정화 된 항체의 애플리케이션을 테스트하기 위해이 연구를 기준 타겟으로서 사용 하였다. 새로운 종이 기반, 효소 면역 분석법 (ELISA)이 성공적으로 개발 및 IgG를 검출하기위한 검증 하였다. 이 방법은 장비를 필요로하지 않으며, IgG를 100 NG / ㎖를 검출 할 수있다. 고속 유동 여과지 매체 흐름 여과지보다 더 민감했다. 이 분석의 배양 기간은 짧았다 작은 샘플 볼륨이 필요합니다. 이 맨눈으로는 색채 면역 종래 ELISA로 식별되는 다른 대상을 검출하도록 확장 될 수있다.
Introduction
점의 케어 테스트 (POCT) 진단 연구는 치료제에 대한 새로운 전략의 개발, 맞춤 의학 및 홈 케어 1 중요합니다. 그들은 싼 접근, 사용자 2에 익숙한로 셀룰로오스 종이 널리 면역에서 플랫폼으로 사용됩니다. 또한 셀룰로스 종이의 다공성 구조는 추가적인 에너지에 영향을주지 않고, 액체 흐름을 유발할 수있는 능력을 가지고있다. 종이 기반 bioanalysis의 기록은 초기에 가장 널리 퍼진 예는 임신과 당뇨병 테스트 스트립과 같은 면역 크로마토 그래피 테스트 3, 1952 종이 크로마토 그래피에 처음 발명 된 20 세기, 같은 찾을 수 있습니다. 이 테스트는 상대적으로 빠른 분석 시간과 저렴한 분석 (4)를 제공합니다. 그들의 단순에, 이러한 종래의 종이 스트립 시험은 널리 POCT 진단 (5)에 사용되어왔다.
비색 6 전기 포함 검출 방법화학 (7) 및 (8) 전기 화학 발광 방법은 생물학적 샘플에서 표적을 측정하기 위해보고되었다. 이러한 양적 방법 이외에, 셀룰로오스 종이에 항체를 고정화하기위한 신뢰할 수있는 방법은 진단 장치의 개발이 중요하다. 비특이적 흡착 고정화 후 목표물을 최대 결합능을 보장하기 위해 종이 기반의 장치 (9), (10)의 표면 상에 항체를 수정하기위한 주요 전략이다. 그러나, 이전의 연구 셀룰로오스 종이에 흡착되는 항체가 40 %, 섬유 (11)로부터 탈착 될 수있는 것으로 나타났다. 따라서, 셀룰로오스 상에 항체의 직접 흡착 재현 가능한 결과 (12)를 제공하지 않을 수 있습니다. 종이 표면에 그라프 트되어 항체의 공유 고정화 효과 지필 생물 검정 (13)를 개발하는 다른 방법이다. 다양한 방법이 셀룰로오스 (14) (15)의 변형에 대해보고 된 (12) 후 원래의 기능을 유지해야한다. 카르 1- 시아 노 -4- 플루오로 보레이트 dimethylaminopyridinium 16과 결합; 18 UV 계 활성화 전략 17 내지 1- 플루오로 -2- 나이트로 -4- azidobenzene; 크 실로 글루칸 변성 (19)에 기초한 화학 효소 적 전략; 1,4- phenylenediisothiocyanate 링킹 에이전트 (20); 헤테로 다당류 산화 (21) 클릭 화학 (22) 양이온 포르피린 23은 공유 셀룰로오스 종이에 생체 분자를 고정하기 위해 사용되어왔다. 키토산 수정 용지가 풍부하고 27 생체 적합성 때문에 종이 기반 immunodevices 24-26을 개발하는 데 사용되었습니다. 키토산은 양이온과 음이온 셀룰로오스 (27)에 강력하게 준수합니다. 캡처 항체는 키토산 코팅 및 글루 타르 알데히드 가교를 통해 종이에 고정된다. 요오드 산화는 대위를 접목하는 또 다른 방법이다셀룰로오스 종이 (28)에 URE 항체. 이 방법에서, 소듐 페리오 데이트는 알데히드기 직접 셀룰로오스 1,2- 디 히드 록시 (글리콜) 그룹을 변환하는 종이 발견된다. 알데히드 그룹은 다당류 및 항체 (28) 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 사용된다. 제조가 간단하지만, 완전히 요오드 산 나트륨을 세척하는 것은 어렵다. 미세 정 요오드 산 나트륨은 항체의 활성 및 안정성에 영향을 셀룰로오스 종이에 고정화 된 항체의 추가적인 산화를 일으킬 수 N을 -. (3- 디메틸 아미노 프로필) - N 다이이 미드 하이드로 클로라이드 및 N -hydroxysuccinimide 크로스 링커들도 사용되어 공유 나노 기반 분석 (29)의 발전을위한 전기 방사 폴리 L 락트산과 셀룰로오스 아세테이트 나노 파이버에 항체를 고정시킨다.
이 연구에서, 실란 커플 링 기술은 cellulos에 아민 작용기를 접목하는 데 사용전자 종이 디스크. 이 기술은 최대 세로 관류의 면역 있도록 원래의 기공 크기, 위킹 및 셀룰로스 여과지 여과 속도를 유지하도록 돕는다. 실란 커플 링 기술은 널리 다른 변형하여 생체이어서, 2 급 아민기를 갖는 기판의 표면을 기능화하는 바이오 센서에 사용되어왔다. 매트릭스 표면에 아민 기의 그 래프팅은 -OH 능성 실란 에이전트 그룹 및 매트릭스 기판 (30) 사이의 축합 반응을 포함한다. 셀룰로오스 종이 디스크 3- 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란 (APS) 31 실란 커플 링에 의해 아민기로 작용 화 하였다. 이것은 두 가지 방법을 사용하여 공유 고정화 캡처 항체으로 이어졌습니다. 첫 번째 방법은 아민 관능 화 셀룰로스 페이퍼 디스크에 요오드 산화 캡쳐 항체의 결합을 포함했다. 두 번째 방법은 캡처 antibodi를 연결하는 가교 결합제로서 글루 타르 알데하이드를 사용아민 그룹 기능화 셀룰로오스 종이 디스크에 말이지. 포획 항체의 존재는, 형광 분자, 이미 저를 사용하여, 토끼 항 - 인간 IgG-형광 염료 (FITC)에 의해 확인 하였다. 항 - 토끼 IgG의 염소를 위해 토끼 항 - 인간 IgG-FITC의 결합 활성은 퍼 옥시 다제 기질로 평가 하였다. 과 요오드 산 나트륨, 글루 타르 알데히드 및 포획 항체의 다양한 농도의 효과를 조사 하였다. 고정화 된 포획 항체의 애플리케이션 테스트가 성공적 IgG의 혈청의 검출을 수행 하였다.
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Protocol
셀룰로오스 종이 디스크 1. 손톱 아민 기능성 그룹
- 구멍 펀치를 사용하여 6.0 mm (중간 흐름 여과지)의 직경 급 1 위 셀룰로오스 종이로 만든 1cm × 1cm, 100 종이 디스크의 차원과 정사각형 종이 한 장을 준비합니다.
- 용지에 디스크 -NH 2기를 유도 퓸 후드에서 50 ml의 유리 병에 1 ml의 APS에 10 ml의 아세톤을 혼합한다. 새롭게 준비 APS 시약 혼합물에 종이 디스크를 추가하고, 실온 (32)의 궤도 교반 (200 rpm으로) 5 시간 동안 배양한다.
주의 : 흄 후드에서 APS 및 아세톤을 처리합니다. - 유기 폐기물 용기에 50 ml의 유리 병에서 과잉 용액을 경사 분리한다.
- 유리 병에 아세톤 10 mL를 추가 잘 혼합하고 반응 APS 및 기타 불순물을 제거하기 위해 디 캔트 완전히. 이 단계를 두 번 반복합니다.
- 3 시간 동안 110 ℃로 오븐에서 종이 타월과 장소에서 용지 디스크 확산. 허용종이 디스크는 냉각합니다. 실온에서 50 mL의 원심 분리 튜브 내의 디스크 저장한다.
- 아래의 (그림 3A)에 설명 된 바와 같이, 셀룰로오스 정사각형 종이에 아민 그룹의 접목을 확인하기 위해 적외선 분광기 (FTIR)를 푸리에 변환을 사용합니다.
- 컴퓨터를 켜고 FTIR 분광 악기를 엽니 다.
- FTIR 스펙트럼을위한 소프트웨어를 엽니 다.
- '측정 → 초기화'로 이동합니다. 'BS : KBr을'의 직사각형 : 초기화가 완료되면 '램프 적외선'과 '레이저'는 녹색으로 바뀝니다.
- 사각형 아래에 '데이터'를 선택하고 '% 투과율', '햅 - 겐젤', '45', '4.0'및 '최소 400, 최대 : 4000'선택 '측정 모드'를 들어, '아포 다 이즈', ' 아니. 스캔 ','해상도 '와'범위 (cm-1) '의.
- '측정'을 클릭합니다.
- 백그라운드 데이터 '데이터 파일'을 선택합니다. 쓰다코멘트 아래로.
- 배경에 대한 기준을 얻기 위해 'BKG'을 클릭합니다.
- 필름 샘플 홀더에 정사각형 종이를 수정합니다.
- 샘플 데이터를 '데이터 파일'을 선택합니다. 주석을 기록합니다.
- 샘플의 스펙트럼을 얻기 위해 '샘플'을 클릭합니다.
- FTIR 분광학 응용 프로그램을 닫고 컴퓨터의 전원을 끄십시오.
- 위의 단계를 (1.6-1.1 단계) 아민 작용 등급 번호 (113) 셀룰로오스 정사각형 종이 및 디스크 (빠른 흐름 여과지)를 제조하는 반복 한 학년 제 113 정사각형 종이 (그림 3B)에 대한 FTIR 스펙트럼을 얻을 수 있습니다.
아민 기능화 된 셀룰로오스 종이 디스크에 항체 2. 공유 결합 고정화
두 가지 다른 방법에 의해 항체 고정화 1. 공유 결합도.를했다. 요오드 산화를 통해 아민 작용 셀룰로오스 종이 디스크에 고정 항체. 탄수화물 잔기의 알데히드 작용기를 생성하는과 요오드 산 나트륨에 의해 산화했다. 그리고, 산화 된 항체는 아민 기능화 셀룰로오스 종이 디스크 상에 로딩 하였다. B한다. 항체는 다음 글루 타르 알데히드를 통해 아민 작용 셀룰로오스 종이 디스크에 고정되었다. 아민 작용 화 셀룰로스 종이 디스크 페이퍼 디스크에 알데히드기를 도입 0.05 % 글루 타르 알데히드 수용액에 침지 하였다. 세척 후, 항체 알데히드 작용 종이 디스크에로드 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 요오드 산화 (그림 1A)를 통해 아민 작용 셀룰로오스 종이 디스크에 항체를 고정.
- 2.5 mM의 나트륨 perioda 1 μl를 혼합0.1 mg을 2 μL와 TE / ㎖의 토끼의 IgG-FITC 항 인간 및 1.5 ㎖의 튜브를 100mm의 pH를 5.5 초산 완충액 7 μL, 30 분 동안 어두운 데에서 상기 혼합물을 배양한다.
참고 : 필요한 경우 더 산화 된 항체를 준비하기 위해이 볼륨 비율을 따릅니다. 과 요오드 산 나트륨 및 토끼 항 - 인간 IgG-FITC의 농도를 최적화하기 위해 체적 비율을 변경한다. - (이 pH 7.4 PBS) 40 μL의 최종 부피의 50 mM 인산염 완충 식염수를 30 μL로 상기 항체 용액을 희석.
- 세 아민 관능 매체 흐름 여과지 디스크 및 (섹션 1에서 설명) 세 아민 기능화 패스트 플로우 페이퍼 디스크를 준비한다.
- 로드 각 매체 흐름 여과지 디스크에과 요오드 산 나트륨으로 산화 토끼 항 - 인간 IgG-FITC 5 μL를 각각의 빠른 흐름 여과지 디스크에 8 μL. 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 이들 페이퍼 디스크를 유지한다.
- 세척 버프 0.2 ml의 종이 디스크의 각을 씻으십시오ER (50mM 트리스 0.15 M 염화나트륨 및 0.05 %의 계면 활성제, pH를 7.4로 버퍼). 세탁 세 번 반복합니다.
- 각 셀룰로스 페이퍼 디스크 (32) 상에 항체의 존재를 확인하기 형광 분자 이미 저를 통해 형광 이미지의 사진. (S3 그림도 S1)로서 제어부 (요오드 산 나트륨의 부재 하에서 항체를 동일한 농도로 처리) 빈 페이퍼 디스크를 사용한다.
참고 실험 최적화 최적화 및 기타 모든 파라미터들의 농도를 해결해야 할 하나의 파라미터의 농도를 변경. 높은 형광 강도는 셀룰로스 페이퍼 디스크에 고정화 캡쳐 항체의 양을 증가시킨다.
- 2.5 mM의 나트륨 perioda 1 μl를 혼합0.1 mg을 2 μL와 TE / ㎖의 토끼의 IgG-FITC 항 인간 및 1.5 ㎖의 튜브를 100mm의 pH를 5.5 초산 완충액 7 μL, 30 분 동안 어두운 데에서 상기 혼합물을 배양한다.
- 글루 타르 알데히드 (그림 1B)를 통해 아민 작용 셀룰로오스 종이 디스크에 항체를 고정.
- 세 APS 처리 매체 흐름 여과지 디스크 및 세 빠른 흐름 여과지 디스크를 추가 (DES실온에서 공전 교반하면서 1 시간 동안 0.05 %의 글루 타르 알데히드를 포함의 50 mM PBS (PH 7.4) 2 ㎖에 1 장)에 cribed.
주의 : 흄 후드에서 글루 타르 알데히드를 처리합니다. - 이 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 세 개의 디스크를 각각 배치합니다. 각 튜브에 탈 이온수 (DI) 물 1 ML을 추가하고 10 초 동안 튜브를 흔들. 피펫으로 흡입하여 물을 제거합니다. 어떤 반응 글루 타르 알데히드를 제거하기 위해 두 번 더 반복합니다.
- 로드 (5) 각각의 알데히드 - 관능 매체 흐름 여과지 디스크에 25 μg의 / ㎖의 토끼 항 - 인간 IgG-FITC (포획 항체)의 μL, 각각 알데히드 - 관능 빠른 흐름 여과지 디스크에 8 μL를 추가한다. 실온에서 약 20 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션. 이어서, 항체를 제거하지 않고 각각 종이 디스크로의 50 mM PBS (PH 7.4)의 10 μL를 추가 아민 알데히드 반응을 40 분 동안 배양한다.
- 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 종이 디스크를 씻으십시오. 반복두 번 씻는다.
- 각 셀룰로스 종이 디스크 (33)에 대한 항체의 존재를 확인하기 위해, 이미 저 분자량 형광을 형광 영상 사진. 대조군으로 빈 종이 디스크를 사용합니다.
참고 :도 4에서, '0'글루 타르 알데히드의 부재하에 FITC 항체를 동일한 농도로 처리 하였다 백지 디스크을 나타내며; 도 5a에서, 빈 종이 디스크는 글루 타르 알데히드로 처리되지만-FITC 항체 페이퍼 디스크에로드되지 않았다.
- 세 APS 처리 매체 흐름 여과지 디스크 및 세 빠른 흐름 여과지 디스크를 추가 (DES실온에서 공전 교반하면서 1 시간 동안 0.05 %의 글루 타르 알데히드를 포함의 50 mM PBS (PH 7.4) 2 ㎖에 1 장)에 cribed.
- 10 분 동안 37 ° C에서 (섹션 2.1 및 2.2)에서 용지 디스크를 닦아냅니다.
- 블로킹 완충액 15 μL와 페이퍼 디스크를 차단하고 실온에서 10 분 동안 (10 % 0.15 M NaCl로 50 mM 트리스 완충액, pH 7.4의 분유 탈지).
- 로드 및 5 μL의 PBS 과산화 효소 접합 염소 항 - 토끼 IgG를 8 μL (1 : 10,000) 각각 매체 흐름 및 고속 유동 여과지 디스크 상에. 알을 품다실온에서 어두운 곳에서 30 분간.
- 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 종이 디스크를 씻으십시오. 세탁 세 번 반복합니다.
주 :이 결과가 버퍼에 의해 영향을받지 않는 것처럼 세척 완충액을 제거 할 필요가 없다. - 각 디스크에 3,3 ', 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)과 과산화수소 용액 10 ㎕의 혼합물을로드.
- 배양의 5 분 후 디지털 카메라 나 스마트 폰으로 종이 디스크의 이미지를 가져 가라.
참고 :도 5b에, '0'항체 HRP (홀스 래 디쉬 퍼 옥시다아제) FITC 항체의 부재 접합체를 로딩 하였다 글루 타르 알데히드로 처리 한 페이퍼 디스크, 약자.
3. IgG의 검출을위한 ELISA를 종이 기반
종이 기반의 ELISA FO 그림 2. 도식 표현R IgG의 검출. 캡처 항체는 공유 글루 타르 알데히드를 통해 알데히드 기능화 된 셀룰로오스 종이 디스크에 고정되었다. 셀룰로오스 종이 디스크 블록킹 완충액 (blocking buffer). 대상의 IgG는 HRP 컨쥬 게이트 신호 항체를 로딩 한 다음, 디스크에 첨가 하였다. 마지막으로, TMB과 과산화수소 혼합물 솔루션은 컬러 판독에 대한 각 용지 디스크에로드했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 20 ㎖의 유리 병 (50 mM의 PBS 완충액, pH 7.4의 제조) 0.05 % 글루 타르 알데히드 용액 5 mL를 추가한다. 이 솔루션 15 아민 기능화 중간 흐름 필터 종이 디스크를 담그고 실온에서 진탕 1 시간 동안 유지한다.
- 동시에, 단계를 반복 3.1 다른 15 알데히드 작용 빠른 흐름 필터 종이 디스크를 준비합니다.
주의 : 연기에 글루 타르 알데히드를 처리후드.
- 동시에, 단계를 반복 3.1 다른 15 알데히드 작용 빠른 흐름 필터 종이 디스크를 준비합니다.
- 페이퍼 디스크에서 미 반응의 글루 타르 알데히드를 제거하고, 또 다른 15 mL의 원심 분리 튜브에 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 15 중간 흐름 여과지 디스크, 15 빠른 흐름 여과지 디스크를 배치했다. 각 튜브에 DI 물 5 ㎖를 추가하고 10 초 동안 튜브를 흔들. 피펫으로 흡입하여 물을 제거합니다. 어떤 반응 글루 타르 알데히드를 제거하기 위해 두 번 반복합니다.
- 37 ° C 오븐에서 용지 디스크를 닦아냅니다.
- 5 μL를 각각 매체 흐름 및 고속 유동 여과지 디스크, 각각 0.025 ㎎ / ㎖ 마우스 IgG-Fc 단편 항체 8 μL를 추가하고, 20 분 동안 배양한다.
- 항체를 제거하지 않고 각각 종이 디스크로의 50 mM PBS (PH 7.4) 10 μl를 첨가하고 아민 알데히드 반응을 40 분 동안 배양한다.
- 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 종이 디스크를 씻으십시오. 세탁 세 번 반복합니다.
- 37 ° C의 오븐에서 페이퍼 디스크를 건조.
- w 용지 디스크를 차단실온에서 10 분간 차단 완충액 15 μL의 제 i.
- 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 각 용지 디스크를 씻으십시오. 세탁 세 번 반복합니다.
- IgG의 표준을 실행합니다.
- 로드 IgG를 다양한 농도 10 μL (예를 들어, 0, 10, 125, 250, 500 ng를 / PBS에서의 ㎖) 중으로의 각 디스크에. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션.
- 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 종이 디스크를 씻으십시오. 세탁 세 번 반복합니다.
- 로드 (10) HRP 접합 마우스 IgG-Fc 단편 항체 (1 : 10,000, 10 mM의 PBS, pH 7.4의)의 μL 및 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
- 종이 타월 위에 세척 버퍼의 0.2 ml의 종이 디스크를 씻으십시오. 세탁 세 번 반복합니다.
주 :이 결과가 버퍼의 존재에 의해 영향을받지 않는 것처럼 세척 완충액을 제거 할 필요가 없다. - 각각의 디스크 상에 TMB의 10 μl의 혼합물과 과산화수소를로드합니다.
- 티배양의 5 분 후 디지털 카메라 나 스마트 폰으로 모든 종이 디스크 아케 이미지.
참고 : 그림 6A에서 '0'캡처 항체 고정화 처리 한 종이 디스크를 의미하고, IgG의 혈청없이 항체 HRP / TMB 솔루션입니다. - J. 이미지로 이미지에서 각각 종이 디스크의 강도를 분석
- '이 .tif'형식으로 단계 3.15에서 촬영 한 이미지를 변환합니다.
- 열기 '이미지 J'소프트웨어.
- '파일 → 열기'로 이동하여 분석 할 이미지를 선택합니다.
- 모양 버튼 '타원형'를 선택합니다.
- '이미지 → 형 → 32 비트'로 이동합니다.
- '편집 → 반전'로 이동합니다.
- '→ 측정 분석'으로 이동합니다.
- 복사 및 스프레드 시트의 데이터를 분석 할 수 있습니다.
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Representative Results
도 3 푸리에 치료 및 APS 처리 매체 흐름 필터 사각형 용지 (A) 및 고속 유동 필터 정사각형 종이 (B). (A)의 적외선 (FTIR) 스펙트럼을 변환. 미처리 매체 흐름 필터 사각형 종이의 스펙트럼은 APS 처리 매체가 흐르는 필터 사각형 종이의 것과 유사 하였다. 902-1,170 cm -1 1,210-1,500 cm -1 APS 처리 된 사각형 종이의 밴드에서 강도의 증가는 각각 SIOC-H 그룹의 Si-O-셀룰로오스 및 CH 변형를 지배했습니다. 1,650cm -1과 2,885cm -1에서 밴드의 증가는 각각 식염수 프로필 부분에서 -NH 2, CH 2 진동의 굽힘에 속한다. B. 972 1180에 cm의 특성 피크 -1 범위는시-O-Si 및 SO-CE에 기인했다llulose 결합. 1,003cm에서의 피크는 -1 Si-O-Si 결합과 셀룰로오스의 스트레칭 CO의 중첩에 의해 발생했다. 모든 결과는 APS 성공적으로 셀룰로오스 광장 논문에 이식 한 것으로 나타났습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
셀룰로오스 광장 논문에 아민 작용기의 존재는 FTIR에 의해 측정 하였다. (3) 치료, 수정, 중간 흐름과 빠른 흐름 필터 광장 논문의 FTIR 스펙트럼을 보여줍니다. 셀룰로오스 표면 APS를 이용하여 아미노 알킬 그룹의 화학적 변형에 관련된 세 가지 단계가 있었다. 단계 중 하나는 APS의 실란 유도체를 제공하는 APS의 가수 분해를 포함했다. 두 번째 단계는 H의 OH 기의 수소 결합을 통해 셀룰로스 섬유로 가수 분해 APS 유도체의 흡착을 포함ydrolyzed APS 유도체 및 셀룰로스 섬유. 세 번째 단계의 Si-OC 결합을 통해 셀룰로스 섬유의 표면에 APS 유도체의 그 래프팅 및 Si-O-실리콘 실록산 브리지 (34)의 형성으로 이끄는 흡착 APS 유도체의 축합을 포함했다. 도 3a, 1,650cm에서 밴드의 증가에 나타낸 바와 같이 -1 2,885cm -1 CH로 실란 프로필 부분의 2 진동 대응에 NH 2 그룹의 굽힘 밴드의 증가에 기인했다. 원래 중간 흐름 필터 정사각형 종이를 들어, 902-1,170 cm -1 1,210-1,500 cm의 밴드 -1 글리코 시드 다리와 CH 스트레칭 진동의 COC 채권의 진동에 맞습니다. APS이 사각형 용지를 처리 한 후,이 두 밴드 폭에서의 강도의 증가는 각각 SIOC-H 그룹의 Si-O-CH 셀룰로오스 및 변형에 속하는 것을 나타낸다. 중간 FL 유사흐름 정사각형 종이, 인해 APS (그림 3B)과 화학적 변형에, -NH 2 1,650cm -1에서 강도 증가 수정 빠른 흐름 필터 정사각형 종이의 스펙트럼을 필터링 할 수 있습니다. 972 1180로 cm에 강한 특성 피크 -1 범위는시-O-시에 기인 하였다 SO-셀룰로오스 결합; 가장 높은 봉우리는 1,003cm -1 인해 Si-O-Si 결합과 셀룰로오스 (34)의 스트레칭 CO의 중복에 있었다. 정사각형 종이를 처리 cm 1188 내지 1510 -1 APS의 파장 범위의 특성 채권은 글리코 시드 다리와 CH 스트레칭 진동의 COC 결합의 진동에 의해 발생합니다. CH 2 신축 진동 채권은 APS가 정사각형 종이를 처리 2,932cm에서 -1 위해 2,800-2,980 cm -1 가장 높은 봉우리에 표시 하였다. 결론적으로, APS는 공유 제 1 호 및 제 113 필터 광장 논문에 이식 할 수 있습니다.
종이 디스크 (방법 B)에서의 IgG-FITC의 고정화에 글루 타르 알데히드의 다른 농도에 그림 4. 형광 반응 형광 분자 화상 카메라에 대한 설정 :. 여진, 488 nm의, 방출, 530 nm의, 해상도, 100 마이크로 미터 A :. 형광 . 0 형광 반응, 0.050 %, 0.100 %, 0.250 %와 0.500 %의 글루 타르 알데히드 : 0, 0.001 %, 0.005 %, 0.01 % 및 0.050 % 글루 타르 알데히드 B에 대응. 각 디스크의 IgG-FITC의 농도는 ㎖ / 0.01 mg을했다. 0.05 %에서 최대 글루 타르 알데히드의 농도의 증가의 IgG-FITC 증가 담지량 결과. 0.05 % 이상 글루 타르 알데히드의 농도는 IgG의-FITC의 담지량 감소했다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.
. IgG에-FITC 고정화 매체 흐름 및 고속 유동 여과지 디스크 (방법 B)의 형광 분자, 이미 저를위한 설정에의 IgG-FITC 다른 농도도 5 형광 응답 (A) 및 색채 결과 (B) : 여진 , 488 nm의, 방출, 530 nm의, 해상도, 100 마이크로 미터. 1 등급은 제 1, 중간 유동 여과지 디스크를 나타내고, # 113 등급 번호 113 빠른 흐름 여과지 디스크를 나타낸다. APS 변성 종이 디스크는 제 0.05 % 글루 타르 알데히드로 처리되었다. 이어서, IgG의 FITC-다른 농도는 글루 타르 알데히드 변성 종이 디스크 상에 로딩 하였다. 의 IgG-FITC의 담지 농도를 높이면 페이퍼 디스크에 고정화의 IgG-FITC의 양이 증가 하였다. 그러나, 고정화의 IgG-FITC의 농도 증가는 항원에 대한 결합 능력이 향상되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
아민 - 작용 화 셀룰로스 페이퍼 디스크의 항체의 공유 고정화 기본적인 흐름은도 1에 도시되어있다. 토끼 항 - 인간 IgG-FITC는 공유 셀룰로오스 종이 디스크 상에 고정화시켰다. 페이퍼 디스크에서 형광 페이퍼 디스크에 대한 항체의 고정화를 표시하고, 형광의 세기는 고정화 된 항체의 농도에 비례했다. 퍼 옥시 다제에 접합 된 염소 항 - 토끼 IgG를 다음이었다 고정화 된 항체의 결합 능력을 결정하기 위해 적용 하였다. 2 차 아민 기 및 알데히드기는 바이오 콘쥬 게이션 (35)에 사용 된 쉬프 염기를 형성하기 위해 서로 반응 할 수있다. 그들은 또한 캡처 공유 고정화 여기를 사용 하였다항체. 방법 A (도 1a)에있어서, -NH 2 셀룰로스 페이퍼 디스크에 도입하고, -CHO는 요오드 산 나트륨과 항체의 Fc 영역을 산화함으로써 토끼 항 - 인간 IgG-FITC로부터 유도 하였다. 동일한 방식으로, 요오드 산 나트륨과의 IgG-FITC 항체의 다양한 농도의 영향도를 분석 하였다. 도 S1도 S2, 0.16 ㎎ / ㎖ 1 mM 내지 0.016의 토끼 항 - 인간 IgG-FITC 0 농도의 요오드 산 나트륨에 도시 된 바와 같이 0.08 ㎎ / ㎖의 토끼 항 - 인간 IgG의 산화에 거의 영향을 미치지 -FITC. 공유 페이퍼 디스크에 결합 된 항체의 양이 0 0.075 밀리그램 / ㎖ (도 S3A)에서 캡쳐 항체의 농도 증가와 함께 증가 하였다.
결합 능력은 퍼 옥시 다제 분석에 의해 측정되었을 때 은은한 색의 변화가 관찰되었다. 이것의 사용에 기인 할 수도포획 항체와 반응하여 결합 활성의 손실을 야기 과잉 요오드 산 나트륨. 요오드 산 나트륨이 완전히 떨어져서 페이퍼 디스크에서 세척 될 수없는 것으로 보인다. 이것은 요오드 산 나트륨 용액 purpald 용액과 혼합하여 황색을 제공하는 간단한 원리에 의해 확인 하였다. 따라서, 요오드 산화 항체 페이퍼 디스크에 로딩하고, 1 시간 동안 배양 하였다. 페이퍼 디스크를 PBS (0.05 % 트윈 -20 함유)으로 3 회 세정 한 후, purpald 용액이 디스크에 첨가 하였다. 종이 디스크 요오드 산화 항체에서 알데하이드 그룹의 존재를 나타내는 즉시 보라색을 나타냈다. 페이퍼 디스크에과 요오드 산 나트륨의 존재를 확인 10 분 이내에 노란색으로 변경이 자색.
대안 적으로, 글루 타르 알데히드 가교 방법 (방법 B,도 1b) 아민 GROU을 연결하는 데 사용APS의 처리 용지 디스크 항체로부터 PS. 셀룰로스 페이퍼 디스크에로드 된 글루 타르 알데히드 농도 (도 4), 토끼 항 - 인간 IgG-FITC (도 5a)를 최적화 하였다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 형광 강도는 토끼 항 - 인간 IgG-FITC의 로딩이 농도로 셀룰로오스 종이 디스크 포화되었다는 것을 의미 글루 타르 알데히드 0.05 %의 최대 도달; 2.5 %의 글루 타르 알데히드의 농도의 증가는 셀룰로오스 종이 디스크 (도 S4)의 토끼 항 - 인간 IgG-FITC의 양의 증가를 나타내지 않았다. 형광 강도는 종이 디스크 (도 5a)에 탑재 된 토끼 항 - 인간 IgG-FITC 농도의 증가와 함께 증가 하였다. peroxidas 포함 페이퍼 디스크에 TMB 기질과 과산화수소 혼합 용액의 첨가시 바로 개발 된 청색즉 접합 된 검출 항체 (도 5B). 또한, 블로킹 완충액 10 % 분유 15 세제 (도 S5) 이후에 차단 효율을 유지하기 위해 도시 한 탈지 수록된. 그것의 표적에 결합 활성을 강화 있듯이 방법 B는 고정화 항체의 애플리케이션을 테스트하기 위해 선택되었다. 따라서, 포획 항체는 0.025 ㎎ / ㎖ 농도의 IgG 검출을 위해 사용되었다.
종이 기반 ELISA. # 1에 의해 IgG를 결정하기위한도 6 교정 곡선 등급 제 1 중간 흐름 여과지 디스크를 나타내고, # 113 등급 번호 113 빠른 흐름 여과지 디스크를 나타낸다. 상부 패널 (A)은 중간 유동 IgG를 다양한 농도 (# 1) 및 고속 유동 (# 113) 셀룰로오스 종이 디스크의 색 판독을 제공한다. 바닥 패널B는 IgG를 다양한 농도의 ELISA 결과를 제공합니다. 삼중가 표준 편차 (SD)를 결정하는 데 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
HRP 접합 된 염소 항 - 마우스 IgG-FC 단편 캡쳐 항체 IgG의 혈청 및 염소 항 - 마우스 IgG-Fc 단편 항체 샌드위치 분석에 사용 하였다. 도 6 및도 S6 0 ng를 500 / ㎖의 IgG의 혈청 농도에 도시 된 바와 같이 각 단계에서 1 시간 동안 배양되었을 때 색채 강도가 선형 관계를 가지고 있었다. 도 S6에서, IgG를 다양한 농도의 색 변화는 배양을 1 시간 동안 분명했다. 또, 10 분의 인큐베이션 결과 IgG를 다양한 농도의 정색의 명백한 변화를 보이지 않았다. 따라서, SENS이 종이 기반의 ELISA의 itivity 실제 현장 진료 테스트를 개발하기에 적합했다.
그림 S1. 과 요오드 산 나트륨 (방법 A)의 상이한 농도로 형광 반응. 요오드 산 나트륨 다양한 농도는 0.016 ㎎ / ㎖ 항체의 산화 활성에 대한 연구에 사용되는 농도의 토끼 항 - 인간 IgG-FITC와 함께 혼합 하였다. 과 요오드 산 나트륨의 농도를 증가시킴으로써,의 IgG-FITC의 담지량이 증가 0.25 밀리미터에서 최대에 도달했다. 그것은이보다 높았다 요오드 산 나트륨의 농도는 고정화의 IgG-FITC의 양이 증가하지 않았 음이 관찰되었다. 삼중가 표준 편차 (SD)를 결정하는 데 사용되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S2. 형광 반응토끼 항 - 인간 IgG-FITC (방법 A)의 다양한 농도들. 요오드 산 나트륨의 농도는 항체 산화 활성 연구를위한 용액에 0.25 ㎜이고, 각 디스크의 토끼 항 - 인간 IgG-FITC의 최종 농도 ml의 0.016 밀리그램 /이었다. 과 요오드 산 나트륨의 농도가 고정되었을 때의 IgG-FITC의 농도의 IgG-FITC의 산화에 거의 영향을 미쳤다. 삼중가 표준 편차 (SD)를 결정하는 데 사용되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S3. 형광 반응 용지 디스크 (방법 A)에 산화 된 토끼 항 - 인간 IgG-FITC의 상이한 농도를로드에서 비색 결과. 요오드 산 나트륨 산화 0.08 밀리그램 /의 IgG-FITC 및 0.25 mM의과 요오드 산 나트륨의 ml를 위해 사용 하였다. 퍼 옥시 다제 - 접합 된 항 - 토끼 IgG를 희석했다1 : 50,000. 셀룰로오스 종이 디스크에의 IgG-FITC의 로딩 농도의 증가는 고정의 IgG-FITC의 양을 증가하였으나. 바인딩 대상에 영향을하지 않은 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S4. 셀룰로오스 종이 디스크 (방법 B)에서의 IgG-FITC의 고정화에서 글루 타르 알데히드의 높은 농도로 형광 반응. 각각의 디스크의 IgG-FITC의 농도는 0.01 ㎎ / ㎖이었다. 셀룰로오스 종이 디스크에 고정의 IgG-FITC의 양을 증가하지 않았다보다 높은 0.25 %였다 글루 타르 알데히드의 농도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S5. 세척 횟수의 효과. A :이었다. 힝 세 번 B : 세탁 15 회. 셀룰로오스 정사각형 종이에 고정화 캡처 항체가 여전히 정사각형 종이 15 번 와동에도 불구하고, 자신의 목표에 좋은 바인딩 용량을 가지고 있었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S6. 지필 IgG에 대한 ELISA 결과. 0 ng를 500 / ㎖의 IgG에서의 농도에 관한이 배양 한 시간에서 배양 한 결과 10 분의 결과보다 더 낫다. IgG의 높은 농도를 들어, 10 분 배양을위한 충분한 시간이다. 삼중가 표준 편차 (SD)를 결정하는 데 사용되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S7. 주사 전자 현미경 (SEM) 다른 배율로 매체 흐름 여과지 이미지. A : 85X 및 B : 20,000X. 5 kV의 작동 전계 방사형 주사 전자 현미경 (FE-SEM)는 입자 형태를 결정하는 데 사용 하였다. 셀룰로오스 섬유는 무작위로 가교 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S8. 다양한 배율에서의 빠른 흐름 여과지의 SEM 이미지. A : 100X 및 B : 20,000X. 5 kV의 작동 전계 방사형 주사 전자 현미경 (FE-SEM)는 입자 형태를 결정하는 데 사용 하였다. 셀룰로오스 섬유는 무작위로 가교 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
변성 셀룰로오스 종이 디스크의 친 화성 정제 된 염소 항 - 마우스 IgG-FC 캡쳐 항체의 직접적인 코팅은 IgG의 농도를 검출 하였다. 결과는 포획 항체의 추가 고정은 재현성이 요구되는 것으로 나타났다. 실란 기술이 성공적 셀룰로오스 종이 디스크 (34)에 아민 작용기를 도입하는 데 사용 하였다. APS의 농도는 항체의 고정화에 영향을 미친다. 따라서, 아세톤 APS의 양도 최적화 하였다. 아세톤 10 ㎖ 중의 APS 1 ㎖ 글루 타르 알데히드 가교 결합제를 통해 항체의 고정화 아민기를 이식을위한 최적의 농도였다. 항체는 요오드 산화 및 글루 타르 알데히드 가교 방법에 의해 셀룰로오스 종이 디스크 상에 그래프트 하였다. 우리의 결과는 글루 타르 알데히드 가교 방법에 의해 고정화 된 항체의 결합 능력은 메드 대한 요오드 산화법보다 것을 알았다IUM 흐름 빠른 흐름 여과지 디스크. 또한, 글루 타르 알데히드 가교 방법으로 셀룰로오스 종이 디스크에 고정 된 포획 항체는 자신의 기능을 보유하고 용지 텍싱 15 세제의 기계적 응력을 실시 하였다하더라도 안정적조차 고정화 하였다. 탈지 분유 블로킹 버퍼의 10 %가 15 세제 (도 S5) 이후에 그 차단 효율을 유지하는 것으로 밝혀졌다.
공유 적으로 고정화 된 항체는 IgG를 검출하여 샌드위치 ELISA를 수행 하였다. 100ng의 / ㎖ 농도의 IgG에이 페이퍼 디스크 기반 분석법을 이용하여 육안으로 검출되었다. 0 내지 500 ng를 / ㎖의 IgG의 혈청 농도는 각 단계에 1 시간 동안 인큐베이션 하였다 색채 강도와 선형 관계를 보였다. ELISA 기반이 논문 디스크에 대한 면역 검사는 적은 샘플 시약이 필요하고 기존의 면역 (36)를보다 더 효율적으로 등장 각각도도 S7 S8에 나타낸다. 이들 도면에 도시 된 바와 같이, 섬유는 무작위로 가교 된 여과지 디스크 (25)의 두 종류이다. 이러한 고감도의 이유는 종이 디스크의 두께가 될 수있다. 빠른 플로우 여과지 디스크의 두께는 매체 흐름 여과지를 180 ㎛, 420 ㎛, 비교. 따라서, 더 많은 포획 항체는 상기 분석의 민감도를 증가시킬 빠른 흐름 여과지 디스크에 고정 될 가능성이 있었다. 동시에, 고속 유동 여과지 디스크 (30 μm의)에 대한 공극 크기는 (11 # 매체 흐름 여과지 디스크보다 크다181; m). 지면 차단 한 후, 이전의 공경은 여전히 여분의 전력 시스템이없는 액체 흐름을 유도하기에 충분히 크다. 그러나, 후자의 버퍼 유량은 느렸다. 따라서, 빠른 흐름 여과지 면역 적용 중간 흐름 여과지보다 더 좋았다.
고정화 된 여과지 디스크에 대한 항체의 재현성은 TMB 기질과 과산화수소 혼합 용액을 넣은 후 비색 결과 퍼 옥시 다제 - 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 검출하도록 용지 디스크를 더 배양함으로써 평가 하였다. 표준 편차는이 종이 - 기반 장치에 대한 10 % 미만이었다. -NH 2 변형 셀룰로스 페이퍼 디스크의 토끼 항 - 인간 IgG-FITC의 안정성은 최대 두 달 동안 시험 하였다. 39 ° C에서 저장 하였다 페이퍼 디스크는 BI 약간 감소와 함께 염소 항 - 토끼 IgG와 접합 된 퍼 옥시다아제를 그들의 결합 활성을 유지활동을 찾아내는. 그러나, 항체 고정화 페이퍼 디스크를 실온에서 저장되거나 60 ° C 때, 그들은 때문에 건조 및 고온 그들의 결합 활성을 잃었다. 캡처 된 항체는 불안정하고 이러한 조건에서 변성 수 있었다.
가교제로서 글 루타 알데히드를 사용하여 셀룰로스 페이퍼 디스크에서 캡쳐 항체의 고정화 일부 중요한 단계가있다. 페이퍼 디스크에 아민기를 그래프트 단계 1.2하면 포획 항체의 성공적인 공유 고정화하는 중요한 단계이다. 이 단계가 실패하면, 전체 고정화 처리는 실패한다. FTIR 아민 기가 성공적 페이퍼 디스크 (단계 160)에 고정되었는지 여부를 결정하는 데 사용되었다. 둘째, 셀룰로스 페이퍼 디스크에 알데히드기의 그라프 다른 중요한 단계 (단계 2.2.1 단계 3.1)이다. 항체는 공유 쉬프 염기의 형성을 통해 셀룰로스 페이퍼 디스크에 고정화 하였다. 최종적으로상기 여과지 디스크에 포획 항체를 고정화하는 단계는 중요 (단계 2.2.3, 3.4 단계 3.5 단계)이다. 포획 항체로부터의 아민 기는 페이퍼 디스크에 항체를 고정하는 셀룰로스 페이퍼 디스크에서 알데하이드 그룹과 반응시켰다. 이 단계가 실패한 경우, 포획 항체는 페이퍼 디스크에 고정 않을 및 ELISA 애플리케이션 테스트 모두 제외 할 것이다. 우리는 포획 항체의 존재를 결정하기 위해, 형광 분자, 이미 저를 사용할 수있다. 퍼 옥시 다제 - 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 퍼 옥시다아제 및 기반 비색 반응은 고정화 된 항체의 결합능을 확인하는데 사용될 수있다.
이 프로토콜은 신호에 높은 배경, 아니 신호 또는 약한 신호 및 얼룩 판독과 같은 몇 가지 문제를 발생할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기위한 이러한 문제 및 문제 해결 방법의 가능한 원인은 아래에 설명되어 있습니다. 높은 배경 신호는 일반적으로 뒤 발생할짧은 차단 시간에 전자. 이것은 차단 배양 시간을 증가 충분히 페이퍼 디스크를 세척하고, 높은 배경 신호를 제거하기 위해 과량의 검출 항체 복합체의 효소의 첨가를 회피함으로써 해결 될 수있다. 가능한 원인은 블로킹 통해 표적 항원의 유무, 불충분 배양 시간 및 비 기능적 검출 항체 효소 복합체를 포함한다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 목표 항원을 첨가하고, 새로운 항체 접합체를 사용하여 제조사가 제시로 저장 적절한 기간 동안 배양해야한다. 검출을위한 긍정적 인 컨트롤을 포함하는 것이 바람직하다. 얼룩 판독은 이식 과정에서 종이 디스크의 적층에 기인한다. 이 문제를 피하기 위해, 종이 디스크는 APS 이식 과정에서 분리되어야하며, 항원 및 검출 항체 복합체의 효소를 각 단계에서 용지 디스크에 균일하게 분산되어야한다.
종이 기반 분석은 단순하지만비용 효과적인 방법, 제한 사항이 있습니다. 글루 타르 알데하이드 가교제는 팹 영역과 포획 항체의 Fc 영역에서 아민 그룹과 반응 된 기판 표면에 항체의 방향은 면역의 성능에 중요하다. 따라서, 고정화 된 항체는 고도로 배향 방식으로 발생하지 않는다. 이상의 아민 기가의 IgG 항체의 Fc 영역에서보다 팹 영역에서 존재하기 때문에, 고정화 된 항체의 결합 활성은 여전히 애플리케이션에 충분하다.
셀룰로오스 종이에 대한 다른 표면 기능화 방법은 최근 보고서 (37)에 요약 하였다. 디 비닐 술폰과 같은 시약; 1,4- phenylenediisothiocyanate; 4- 아지 benzenediazonium; 에피 클로로 히 드린; 4- 아지 A-플루오로 -2- nitrocyclohexane; 및 4- 머 캅토 benzenediazonium은 공유 셀룰로오스 종이에 생체 분자를 고정하기 위해 사용될 수있다. 흡착 및 함정 수사도 사용되었다생체 분자와 코트에 셀룰로오스 종이. 다른 방법에 비해, 실란 기술 셀룰로오스 종이에 항체의 공유 고정화 글루 타르 알데히드 가교제의 조합은 간단한 방법이다. 또한,이 조합은 면역 최대 수직 관류를 허용 셀룰로오스 종이의 열적 및 기계적 성능에 거의 영향을 가질 수있다. 이 전략은 셀룰로오스 종이에 다른 생체 분자를 고정하기 위해 확장 될 수있다.
여기에서 입증 된 방법은 잠재적 것이면 대해 직접적인 항체를 사용할 수있는 한 임의의 피검 물의 검출에 확장 될 수있다. 이 방법은 멀티 플렉스 검출을 개발하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 정사각형 종이에, 다른 영역은 다양한 대상에 대해 구별 할 수 있습니다. 대상에 대한 포획 항체는 특정 영역에서의 글루 타르 알데히드 가교 에이전트를 통해 고정 될 수있다. 이것은 ELIS 다음에 할 수있다수순은 다양한 대상을 검출한다. 따라서, 제안 된 방법은 육안을 이용하여 다른 표적의 검출을위한 ELISA 지필 다용도 공구를 만든다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, free download | N/A |
References
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