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Biochemistry

Covalente La unión de anticuerpos a los discos de papel de celulosa y sus aplicaciones en-simple vista colorimétricos inmunoensayos

Published: October 21, 2016 doi: 10.3791/54111
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1School of Applied Science, Temasek Polytechnic, 2University of Applied Sciences Utrecht

Abstract

Este informe presenta dos métodos para la inmovilización covalente de anticuerpos de captura en papel de filtro de celulosa de grado N ° 1 (papel de filtro de flujo medio) y discos de grado Nº 113 (papel de filtro de flujo rápido) discos. Estos discos de papel de celulosa fueron injertados con grupos funcionales de amina a través de una técnica de acoplamiento de silano antes de que los anticuerpos se inmovilizan sobre ellos. métodos de reticulación periodato de oxidación y glutaraldehído fueron utilizados para injertar anticuerpos de captura en los discos de papel de celulosa. A fin de garantizar la capacidad de unión máxima de los anticuerpos de captura a sus objetivos después de la inmovilización, se investigaron los efectos de diversas concentraciones de peryodato de sodio, glutaraldehído, y anticuerpos de captura en la superficie de los discos de papel. Los anticuerpos que se recubrieron sobre los discos de papel de celulosa funcionalizada con amina a través de un agente de entrecruzamiento con glutaraldehído mostraron una mayor actividad de unión a la diana en comparación con el método de oxidación con peryodato. IgG (en suero de referencia de ratón) se utilizó como un objetivo de referencia en este estudio para probar la aplicación de anticuerpos inmovilizados covalentemente a través de glutaraldehído. Un nuevo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas basado en papel (ELISA) se desarrolló con éxito y validada para la detección de IgG. Este método no requiere un equipo, y puede detectar 100 ng / ml de IgG. El papel de filtro de flujo rápido era más sensible que el papel de filtro de flujo medio. El período de incubación de este ensayo fue corta y requiere volúmenes de muestra pequeños. Este simple vista, inmunoensayo colorimétrico puede extenderse para detectar otros objetivos que se identifican con ELISA convencional.

Introduction

El estudio de diagnóstico de la prueba de punto de atención (POCT) es importante para el desarrollo de nuevas estrategias para la terapéutica, la medicina personalizada y la atención domiciliaria 1. Papeles de celulosa son ampliamente utilizados como plataformas en inmunoensayos, ya que son baratos, accesible y familiar para los usuarios 2. Además, la estructura porosa del papel de celulosa posee la potencia para impulsar el flujo de líquido sin impacto adicional de energía. Los registros de bioanálisis en papel se pueden encontrar ya en el siglo 20, cuando la cromatografía en papel fue inventado por primera vez en 1952. El ejemplo más frecuente es pruebas de inmunocromatografía 3, tales como tiras de prueba de embarazo y la diabetes. Estas pruebas proporcionan tiempos de ensayo relativamente rápido y barato análisis 4. Debido a su simplicidad, estas pruebas tira de papel convencionales se han usado ampliamente en el diagnóstico POCT 5.

Los métodos de detección colorimétrica incluyendo 6, electroSe han reportado químicos 7, y 8 de electroquimioluminiscencia métodos para medir los objetivos en muestras biológicas. Además de estos métodos cuantitativos, un método fiable para la inmovilización de anticuerpos sobre papel de celulosa también es importante para el desarrollo de dispositivos de diagnóstico. La adsorción no específica es la principal estrategia para la modificación de anticuerpos en la superficie de los dispositivos basados en papel 9, 10 para asegurar la capacidad de unión máxima a sus objetivos después de la inmovilización. Sin embargo, un estudio previo mostraron que los anticuerpos que se adsorben sobre papel de celulosa pueden desorber de las fibras 11 en un 40%. Por lo tanto, la adsorción directa de anticuerpos en celulosa no puede proporcionar resultados reproducibles 12. La inmovilización covalente de anticuerpos que se injertan en las superficies de papel es un método alternativo de desarrollo de bioensayos eficaces basados en papel 13. Varios métodos han sido reportados para la modificación de celulosa 14, 15 12. Carbonildiimidazol combina con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio 16; 1-fluoro-2-nitro-4-azidobenzene a través de una estrategia de activación a base de UV 17, 18; chemoenzymatic una estrategia basada en la modificación xiloglucano 19; un agente de enlace 1,4-phenylenediisothiocyanate 20; heteropolisacárido oxidación química clic 21 22; y porfirinas catiónicas 23 se han utilizado para inmovilizar covalentemente biomoléculas sobre papel de celulosa. Papel modificado Chitosan se ha utilizado para desarrollar immunodevices en papel 24-26 ya que es abundante y biocompatible 27. El quitosano es catiónico y se adhiere fuertemente a celulosa aniónico 27. Los anticuerpos de captura se inmovilizan sobre el papel a través de revestimiento de quitosano y entrecruzamiento con glutaraldehído. La oxidación del peryodato es otro método para injertar la captanticuerpos ure en el papel de celulosa 28. En este método, peryodato de sodio es descubierto en el papel para convertir grupos 1,2-dihidroxilado (glicol) en celulosa directamente a grupos aldehído. Los grupos aldehído se utilizan entonces para formar enlaces covalentes entre polisacáridos y anticuerpos 28. Aunque la fabricación es simple, es difícil de lavar completamente fuera de peryodato de sodio. El peryodato sódico sin lavar puede causar oxidación adicional de los anticuerpos que están inmovilizados sobre el papel de celulosa, que afectan a la actividad y la estabilidad de los anticuerpos N -. (3-dimetilaminopropil) - N hidrocloruro de etilcarbodiimida y N hidroxisuccinimida reticulantes también se utilizan para covalentemente inmovilizar anticuerpos en ácido y de acetato de celulosa nanofibras de poli-L-láctico electrospun para el desarrollo de ensayos basados en nanofibras 29.

En este estudio, se utilizó una técnica de acoplamiento de silano para injertar grupos funcionales de amina en cellulosdiscos de papel e. Esta técnica ayuda a retener el tamaño original de poros, efecto de mecha, y la tasa de filtración de los papeles de filtro de celulosa, lo que permite un máximo de inmunoensayos de flujo continuo en verticales. La técnica de acoplamiento de silano ha sido ampliamente utilizado en los biosensores para funcionalizar superficies de sustrato con grupos amina secundaria, seguido de la modificación adicional utilizando biomoléculas. El injerto de grupos amina en la superficie de la matriz comprende una reacción de condensación entre grupos -OH de los agentes de silano organofuncional y el sustrato de la matriz 30. Los discos de papel de celulosa fueron funcionalizados con grupos amino de acoplamiento de silano a través de 3-aminopropiltrimetoxisilano (APS) 31. Esto fue seguido por anticuerpos de captura covalentemente inmovilización utilizando dos métodos diferentes. El primer método implicó la unión de anticuerpos de captura oxidados con peryodato de los discos de papel de celulosa de amina funcionalizado. El segundo método usa glutaraldehído como agente de reticulación para unir el Antibodi capturaES para los discos de papel de celulosa funcionalizado grupos amina. La presencia de anticuerpos de captura fue confirmada por conejo isotiocianato de fluoresceína IgG-anti-humano (FITC), utilizando un generador de imágenes de fluorescencia molecular. La actividad de unión de conejo anti-humano IgG-FITC de IgG de cabra anti-conejo también fue evaluada por sustrato de peroxidasa. Se investigaron los efectos de diversas concentraciones de peryodato de sodio, glutaraldehído, y anticuerpos de captura. La prueba de la aplicación del anticuerpo de captura inmovilizado se realizó con éxito a través de la detección de suero IgG.

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Protocol

1. Injerto grupos funcionales amina sobre los discos de papel de celulosa

  1. Preparar una hoja de papel cuadrada con una dimensión de 1 cm x 1 cm, y 100 discos de papel hechas de papel de celulosa de grado No. 1 con un diámetro de 6,0 mm (papel de filtro de flujo medio) usando una perforadora.
  2. Para derivar grupos -NH2 en los discos de papel, mezclar 1 ml de APS y 10 ml de acetona en una botella de vidrio de 50 ml en la campana de humos. Añadir discos de papel a la mezcla de reactivo de APS recién preparado, y se incuba durante 5 horas con agitación orbital (200 rpm) a temperatura ambiente 32.
    Precaución: Manipular APS y acetona en la campana de humos.
  3. Decantar el exceso de solución de la botella de vidrio de 50 ml en un recipiente de residuos orgánicos.
  4. Añadir 10 ml de acetona a la botella de vidrio, mezclar bien y decantar completamente para eliminar cualquier APS sin reaccionar y otras impurezas. Repita este paso dos veces.
  5. Difundir los discos de papel sobre la toalla de papel y colocar en un horno a 110ºC durante 3 horas. permitir que eldiscos de papel se enfríen. Guarde los discos en un tubo de centrífuga de 50 ml a temperatura ambiente.
  6. Utilice transformada de Fourier espectroscopia infrarroja (FTIR) para comprobar el injerto de grupos amina en el papel cuadrado de celulosa, como se describe a continuación (Figura 3A).
    1. Encienda el ordenador y abra el instrumento de espectroscopia FTIR.
    2. Abra el software para la espectroscopia FTIR.
    3. Ir a "Medición → Inicializar '. Los rectángulos para 'BS: KBr', 'Lámpara: Infrared' y 'Laser' adquieren un color verde cuando haya finalizado la inicialización.
    4. Elija "Datos" por debajo de los rectángulos, y seleccione '% Transmitancia', 'Happ-Genzel', '45', '4.0', y 'Min: 400, Max: 4000 "para" Modo de medición "," Apodización', ' No. de exploraciones ',' Resolución ', y' Rango (cm-1) '.
    5. Haga clic en "Medir".
    6. Seleccione 'archivo de datos' para los datos de fondo. Escribirpor los comentarios.
    7. Haga clic en "BKG 'para obtener la línea de base para el fondo.
    8. Fijar el papel cuadrado en el soporte de muestra de película.
    9. Seleccione 'archivo de datos' para los datos de la muestra. Anote los comentarios.
    10. Haga clic en "muestra" para obtener los espectros de la muestra.
    11. Cierre la aplicación de la espectroscopia FTIR y apagar el equipo.
  7. Repita los pasos anteriores (pasos 1.1 a 1.6) para preparar grado Nº 113 de celulosa y papel (papel discos de filtro de flujo rápido) cuadrados con funcionalidad amina, y obtener los espectros FTIR para el grado Nº 113 de papel cuadrado (Figura 3B).

2. La inmovilización covalente de anticuerpos en los discos de papel de celulosa funcionalizados-Amina

figura 3
Figura 1. La inmovilización covalente de anticuerpos por dos métodos diferentes.A. Los anticuerpos inmovilizados sobre discos de papel de celulosa funcionalizada con amina a través de la oxidación con peryodato. Los residuos de hidratos de carbono se oxidaron por peryodato de sodio para producir grupos funcionales aldehído. Entonces, los anticuerpos oxidados se cargaron en discos de papel de celulosa funcionalizada con amina. B. Los anticuerpos fueron entonces inmovilizados sobre discos de papel de celulosa funcionalizada con amina a través de glutaraldehído. Los discos de papel de celulosa de amina funcionalizado se sumergieron en solución de glutaraldehído al 0,05% para introducir grupos aldehído a los discos de papel. Después del lavado, los anticuerpos se cargaron en los discos de papel de aldehído funcionalizado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Inmovilizar anticuerpos sobre discos de papel de celulosa funcionalizada con amina a través de la oxidación con peryodato (Figura 1A).
    1. Mezclar 1 l de sodio 2,5 mM periodate con 2 l de 0,1 mg / ml de conejo anti-humano IgG-FITC y 7 l de mM pH 5,5 tampón de acetato 100 en un tubo de 1,5 ml, y se incuba la mezcla en la oscuridad durante 30 min.
      NOTA: Siga esta relación en volumen para preparar anticuerpos más oxidado si es necesario. Cambiar la relación de volumen para optimizar la concentración de peryodato de sodio y de conejo anti-IgG humana-FITC.
    2. Diluir la solución de anticuerpo de arriba con 30 l de 50 mM solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) hasta un volumen final de 40 l.
    3. Preparar tres discos de papel de filtro de flujo medio-amina funcionalizados y tres discos de papel de flujo rápido con funcionalidad amina (como se describe en la Sección 1).
      1. Carga de 5 l de la peryodato de sodio conejo oxidado anti-humano IgG-FITC en cada disco de papel de filtro de flujo medio y 8 l sobre cada disco de papel de filtro de flujo rápido. Mantener estos discos de papel en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente.
    4. Lavar cada uno de los discos de papel con 0,2 ml de lavado de piel de anteer (50 mM de tampón Tris con 0,15 M NaCl y 0,05% de tensioactivo, pH 7,4). Repita el lavado tres veces.
    5. Fotografía de las imágenes de fluorescencia a través de un generador de imágenes de fluorescencia molecular para identificar la presencia de anticuerpos en cada disco de papel de celulosa 32. Utilice discos de papel en blanco (tratados con la misma concentración de anticuerpos en ausencia de peryodato de sodio) como control (Figura S1 a la figura S3).
      NOTA: Para la optimización experimental, cambiar la concentración de un parámetro que necesita ser optimizado y fijar las concentraciones de todos los otros parámetros. Una alta intensidad de la fluorescencia aumenta la cantidad de anticuerpos de captura que se inmoviliza sobre los discos de papel de celulosa.
  2. Inmovilizar anticuerpos sobre discos de papel de celulosa funcionalizadas de amina a través de glutaraldehído (Figura 1B).
    1. Añadir las tres de flujo medio tratado discos de papel de filtro de APS y los tres discos de papel de filtro de flujo rápido (described en la Sección 1) a 2 ml de PBS 50 mM (pH 7,4) que contiene 0,05% de glutaraldehído durante 1 hora, con agitación orbital a temperatura ambiente.
      Precaución: Manipular glutaraldehído en la campana de humos.
    2. Coloque tres discos cada uno en dos tubos de centrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 ml de agua desionizada (DI) a cada tubo y agitar los tubos durante 10 seg. Eliminar el agua por aspiración con una pipeta. Repetir dos veces más para eliminar cualquier glutaraldehído sin reaccionar.
    3. De carga 5 l de 25 mg / ml de IgG de conejo-FITC (anticuerpo de captura) anti-humano en cada flujo de medio disco de papel de filtro de aldehído-funcionalizado, y añadir 8 l en cada flujo rápido disco de papel de filtro de aldehído-funcionalizado. Incubar en la oscuridad durante aproximadamente 20 min a temperatura ambiente. A continuación, añadir 10 l de PBS 50 mM (pH 7,4) a cada disco de papel sin la eliminación de los anticuerpos y se incuba durante 40 min para la reacción de aldehído amina.
    4. Lavar los discos de papel con 0,2 ml de tampón de lavado en la parte superior de una toalla de papel. Repite ellavar dos veces.
    5. Fotografía de las imágenes de fluorescencia a través de un generador de imágenes de fluorescencia molecular para comprobar la presencia de anticuerpos en cada disco de papel de celulosa 33. Utilice discos de papel en blanco como control.
      NOTA: En la Figura 4, '0' significa que el disco de papel en blanco que se trató con la misma concentración de FITC-anticuerpo en ausencia de glutaraldehído; en la Figura 5A, los discos de papel en blanco se trataron con glutaraldehído, pero no hay FITC-anticuerpos se cargaron en los discos de papel.
  3. Se secan los discos de papel (de las secciones 2.1 y 2.2) a 37 ° C durante 10 minutos.
  4. Bloquear los discos de papel con 15 l de tampón de bloqueo (10% leche en polvo desnatada en tampón Tris 50 mM, pH 7,4, con 0,15 M NaCl) durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  5. Carga de 5 l y 8 l de conjugado con peroxidasa de cabra anti-IgG de conejo en PBS (1: 10.000) en medio-flujo y discos de papel de filtro de flujo rápido, respectivamente. incubar durante30 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
  6. Lavar los discos de papel con 0,2 ml de tampón de lavado en la parte superior de una toalla de papel. Repita el lavado tres veces.
    NOTA: No es necesario retirar el tampón de lavado ya que los resultados no son afectados por la memoria intermedia.
  7. Cargar una mezcla de 10 l de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y una solución de peróxido de hidrógeno en cada disco.
  8. Tomar imágenes de los discos de papel con una cámara digital o un teléfono inteligente después de 5 minutos de incubación.
    NOTA: En la Figura 5B, '0' significa que los discos de papel que fueron tratadas con glutaraldehído, seguido de la carga de anticuerpo-HRP (peroxidasa de rábano picante) conjugado en ausencia de FITC-anticuerpo.

ELISA 3. Papel de base para la detección de IgG

Figura 2
Figura 2. Representación esquemática de la ELISA basado en papel fodetección. Captura de anticuerpos IgG r se inmovilizaron covalentemente sobre los discos de papel de celulosa de aldehído-funcionalizado a través de glutaraldehído. Los discos de papel de celulosa se bloquearon con tampón de bloqueo. entonces Target IgG se añadió a los discos, seguido por la carga de anticuerpos de señal HRP-conjugados. Por último, la solución de TMB y mezcla de peróxido de hidrógeno se cargó en cada disco de papel para la lectura del color. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Añadir 5 ml de solución de glutaraldehído al 0,05% (preparado en tampón de PBS 50 mM, pH 7,4) a una botella de vidrio de 20 ml. Sumergir 15 de flujo de medio de discos de papel de filtro con amina funcionalizado en esta solución y mantener durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente.
    1. Al mismo tiempo, repita el paso 3.1 para preparar otro aldehído 15 discos de papel de filtro de flujo rápido funcionalizados.
      Precaución: Manipular glutaraldehído en el humocapucha.
  2. Para eliminar el glutaraldehído sin reaccionar de los discos de papel, colocar los discos de papel de filtro de 15 medio de flujo en un tubo de centrífuga de 15 ml, y los discos de papel de filtro 15 de flujo rápido en otro tubo de centrífuga de 15 ml. Añadir 5 ml de agua DI a cada tubo y agitar los tubos durante 10 seg. Eliminar el agua por aspiración con una pipeta. Repetir dos veces para eliminar cualquier glutaraldehído sin reaccionar.
  3. Se secan los discos de papel en un horno de 37 ° C.
  4. Añadir 5 l y 8 l de anticuerpos de fragmentos 0,025 mg / ml de IgG de ratón-Fc a cada uno de los discos de medio de flujo y de papel de filtro de flujo rápido, respectivamente, y se incuba durante 20 min.
  5. Añadir 10 l de PBS 50 mM (pH 7,4) a cada disco de papel sin la eliminación de los anticuerpos y se incuba durante 40 min para la reacción de aldehído amina.
  6. Lavar los discos de papel con 0,2 ml de tampón de lavado en la parte superior de una toalla de papel. Repita el lavado tres veces.
  7. Se secan los discos de papel en un horno a 37 ° C.
  8. Bloquear los discos de papel wITH 15 l de tampón de bloqueo durante 10 min a temperatura ambiente.
  9. Lavar cada disco de papel con 0,2 ml de tampón de lavado en la parte superior de una toalla de papel. Repita el lavado tres veces.
  10. Ejecutar estándares de IgG.
    1. Carga de 10 l de diversas concentraciones de IgG (por ejemplo, 0, 10, 125, 250, y 500 ng / ml en PBS) a cada disco por triplicado. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
  11. Lavar los discos de papel con 0,2 ml de tampón de lavado en la parte superior de una toalla de papel. Repita el lavado tres veces.
  12. Carga de 10 l de anticuerpos HRP de ratón conjugado IgG-Fc de fragmentos (1: 10.000, mM PBS 10, pH 7,4), y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
  13. Lavar los discos de papel con 0,2 ml de tampón de lavado en la parte superior de una toalla de papel. Repita el lavado tres veces.
    NOTA: No es necesario retirar el tampón de lavado ya que los resultados no se ven afectados por la presencia de tampón.
  14. Cargar una mezcla de 10 l de TMB y peróxido de hidrógeno en cada disco.
  15. Take imágenes de todos los discos de papel con una cámara digital o un teléfono inteligente después de 5 minutos de incubación.
    NOTA: En la Figura 6A, '0' significa discos de papel tratados con inmovilización anticuerpo de captura, y la solución de anticuerpo-HRP / TMB sin suero IgG.
  16. Analizar la intensidad de cada disco de papel en la imagen por imagen J.
    1. Convertir las imágenes tomadas en el paso 3.15 a formato '.tif'.
    2. software abierto 'la imagen J'.
    3. Ir a "Archivo → Abrir", seleccione la imagen a analizar.
    4. Seleccione el botón de la forma 'Oval'.
    5. Ir a "imagen → Tipo → 32 bits".
    6. Ir a "Editar → Invertir '.
    7. Ir a "Analizar → Medida '.
    8. Copiar y analizar los datos en una hoja de cálculo.

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Representative Results

figura 3
Figura 3. transformada de Fourier infrarroja (FTIR) de papel de filtro de flujo medio no tratado y tratado con APS cuadrada (A) y filtro de flujo rápido del papel cuadrado (B). A. Los espectros de papel cuadrado filtro de flujo medio sin tratar fue similar a la de APS papel cuadrado filtro de flujo medio tratado. El aumento de las intensidades en bandas de 902-1,170 cm -1 y 1,210-1,500 cm -1 para el papel cuadrado tratado con APS pertenecía a Si-O-celulosa y deformaciones de los grupos CH SiOC-H, respectivamente. El incremento de las bandas a 1.650 cm -1 y 2.885 cm-1 pertenece a la flexión de -NH 2 y CH 2 vibraciones del resto de solución salina propilo, respectivamente. B. Los picos característicos en los 972 a 1.180 cm -1 rango fueron atribuidas a los enlaces Si-O-Si y SO-cellulose bonos. El pico a 1.003 cm -1 fue causado por la superposición del enlace Si-O-Si y de la CO estiramiento de celulosa. Todos los resultados muestran que la APS se injertó con éxito sobre los papeles cuadrados de celulosa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La presencia de grupos funcionales de amina en los papeles de celulosa cuadrados se determinó por FTIR. La figura 3 muestra los espectros FTIR de,, medio de flujo sin tratar modificado y papeles cuadrados filtro de flujo rápido. Había tres etapas implicadas en la modificación química de grupos aminoalquilo, utilizando APS en las superficies de celulosa. Paso uno implicado la hidrólisis de APS para proporcionar el derivado de silanol de APS. Paso dos implicado la adsorción del derivado de APS hidrolizada sobre las fibras de celulosa a través de enlaces de hidrógeno de los grupos OH de la hydrolyzed APS derivado y las fibras de celulosa. Paso tres implicaba la condensación del derivado de APS adsorbida, que llevó a el injerto del derivado de APS a la superficie de la fibra de celulosa a través de enlaces Si-OC y la formación de enlaces Si-O-Si puentes de siloxano 34. Como se muestra en la Figura 3A, el incremento de la banda a 1.650 cm -1 se atribuyó a la flexión de grupos NH2 y un incremento de la banda a 2.885 cm -1 correspondientes al CH 2 vibraciones del resto propil silano. Para el papel cuadrado filtro de flujo medio original, las bandas a 902-1,170 cm -1 y 1,210-1,500 cm-1 corresponden a las vibraciones de los enlaces COC de puentes glicosídicos y CH vibraciones de tensión. Después de tratar el papel cuadrado con APS, el aumento de intensidad en estos dos anchos de banda indica que pertenecen a Si-O-celulosa y deformaciones de los grupos CH SiOC-H, respectivamente. Similar a medio-FLow papel de filtro cuadrado, los espectros de filtro de papel modificado con flujo rápido plaza también aumentó en intensidad a 1.650 cm-1 para -NH 2, debido a la modificación química con APS (Figura 3B). Las fuertes picos característicos en los 972 a 1.180 cm -1 rango se atribuyeron al Si-O-Si y bonos SO-celulosa; el pico más alto fue en 1.003 cm -1 debido a la superposición del enlace Si-O-Si y el CO estiramiento de celulosa 34. Los bonos característicos en el rango de longitud de onda entre 1.188 y 1.510 cm -1 para APS tratados papel cuadrado son causados por las vibraciones de los enlaces COC de puentes glicosídicos y CH vibraciones de tensión. Los bonos de vibración de estiramiento CH 2 se mostraron en 2,800-2,980 cm -1 y el pico más alto fue en 2.932 cm-1 para la APS tratada papel cuadrado. En conclusión, APS puede ser injertado covalentemente al No. 1 y No. 113 cuadrados papeles de filtro.


Figura 4. Respuestas de fluorescencia para diferentes concentraciones de glutaraldehído en la inmovilización de IgG-FITC en los discos de papel (Método B) Ajustes de fluorescencia de imágenes molecular:. Excitación, 488 nm, emisión, 530 nm, resolución, 100 micrómetros A:. Fluorescencia respuesta a 0, 0,001%, 0,005%, 0,01% y 0,050% de glutaraldehído B:. respuesta de fluorescencia a 0, 0,050%, 0,100%, 0,250% y 0,500% de glutaraldehído. La concentración de IgG-FITC en cada disco fue de 0,01 mg / ml. Un aumento en la concentración de glutaraldehído a un máximo de 0,05% dio como resultado una cantidad de carga mayor de IgG-FITC. Las concentraciones de glutaraldehído por encima de 0,05% disminuyó la cantidad de carga de IgG-FITC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura.

Figura 5
Figura 5. Respuesta de fluorescencia (A) y el resultado colorimétrico (B) de diferentes concentraciones de IgG-FITC en el medio de flujo inmovilizada-IgG-FITC y discos de flujo rápido de papel de filtro (Método B) Ajustes para generador de imágenes de fluorescencia molecular: excitación. , 488 nm, emisión, 530 nm, la resolución, de 100 micrómetros. # 1 representa grado No. 1, el flujo de medio de disco de papel de filtro, y # 113 representa grado No. 113-flujo rápido disco de papel de filtro. discos de papel de APS-modificado se trataron con 0,05% de glutaraldehído primero. Entonces, diferentes concentraciones de IgG-FITC se cargaron en los discos de papel modificado glutaraldehído. El aumento de la concentración de carga de IgG-FITC aumentó la cantidad de la inmovilizado IgG-FITC en los discos de papel. Sin embargo, el aumento de las concentraciones de IgG inmovilizada-FITC no mejoró la capacidad de unión al antígeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El flujo de trabajo básico para la inmovilización covalente de anticuerpos sobre discos de papel de celulosa funcionalizada con amina se muestra en la Figura 1. El conejo anti-humano IgG-FITC se inmovilizó covalentemente sobre los discos de papel de celulosa. La fluorescencia de los discos de papel se indica la inmovilización de anticuerpos frente a los discos de papel, y la intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos inmovilizados. Cabra conjugado con peroxidasa anti-IgG de conejo fue aplicado para determinar la capacidad de unión de los anticuerpos inmovilizados a continuación. Grupos amina secundaria y grupos aldehído pueden reaccionar entre sí para formar una base de Schiff, que se ha utilizado en bioconjugación 35. También fueron utilizados aquí para inmovilización covalente de la capturaanticuerpos. En el método A (Figura 1A), -NH 2 se introdujo a los discos de papel de celulosa y -CHO se deriva de la de conejo anti-IgG humana-FITC mediante la oxidación de la región Fc de los anticuerpos con peryodato de sodio. De la misma manera, también se analizaron los efectos de diversas concentraciones de peryodato de sodio y anticuerpos IgG-FITC. Como se muestra en la Figura S1 y Figura S2, peryodato de sodio a partir de concentraciones de 0 a 1 mM y el conejo anti-humano IgG-FITC 0,016 a 0,16 mg / ml tuvieron poco efecto sobre la oxidación de IgG 0,08 mg / conejo ml anti-humana FITC. La cantidad de anticuerpos que se une covalentemente a los discos de papel se incrementó con una concentración creciente de anticuerpos de captura de 0 a 0,075 mg / ml (Figura S3A).

Se observó un cambio de color débil cuando la capacidad de unión se determinó mediante el ensayo de peroxidasa. Esto podría ser debido a la utilización deel exceso de peryodato de sodio, que reacciona con los anticuerpos de captura y causa una pérdida de actividad de unión. Es probable que el peryodato de sodio no se puede lavar completamente lejos de los discos de papel. Esto fue confirmado por el simple principio de que la solución de peryodato de sodio proporciona un color amarillo cuando se mezcla con una solución de Purpald. Por lo tanto, los anticuerpos oxidada con peryodato se cargaron en los discos de papel y se incubaron durante 1 hora. Los discos de papel se lavaron tres veces con PBS (que contiene 0,05% de Tween-20), y después se añadió solución Purpald a estos discos. Los discos de papel mostraron un color púrpura inmediatamente, indicando la presencia de grupos aldehído a partir de anticuerpos oxidado con peryodato. Este color púrpura cambiado a amarillo dentro de los 10 minutos, lo que confirmó la presencia de peryodato de sodio en los discos de papel.

Alternativamente, se utilizó un entrecruzamiento con glutaraldehído método (método B, Figura 1B) para enlazar la amina groups a partir de los discos y los anticuerpos de papel APS-tratada. Se optimizaron las concentraciones de glutaraldehído (Figura 4) y de conejo anti-IgG humana-FITC (Figura 5A) que se cargaron en los discos de papel de celulosa. Como se muestra en la Figura 4, la intensidad de la fluorescencia alcanzó un máximo de 0,05% de glutaraldehído, lo que significa que la carga de conejo anti-humano IgG-FITC se saturó en el disco de papel de celulosa a esta concentración; un aumento en la concentración de glutaraldehído al 2,5% no mostró un aumento en la cantidad de conejo anti-humano IgG-FITC en los discos de papel de celulosa (Figura S4). La intensidad de fluorescencia también aumentó con concentraciones crecientes de IgG de conejo-FITC anti-humana que se cargaron en los discos de papel (Figura 5A). Un color azul desarrollado inmediatamente después de la adición de la solución de sustrato y peróxido de hidrógeno mezcla de TMB a los discos de papel, que contenía los peroxidasanticuerpos e conjugados de detección (Figura 5B). Además, el tampón de bloqueo que contenía 10% de leche desnatada en polvo se muestra para retener la eficiencia de bloqueo después de 15 lavados (Figura S5). Método B fue seleccionado para probar la aplicación de los anticuerpos inmovilizados, como lo demostró mejora la actividad de unión a su diana. Por lo tanto, se utilizó una concentración / ml 0,025 mg de anticuerpos de captura para la detección de IgG.

Figura 6
Figura 6. Las curvas de calibración para la determinación de IgG por ELISA basado en papel. # 1 representa grado No. 1, el flujo de medio de disco de papel de filtro, y # 113 representa grado No. 113-flujo rápido disco de papel de filtro. El panel A superior presenta la lectura de color para-medio de flujo (# 1) y de flujo rápido (# 113) discos de papel de celulosa con diferentes concentraciones de IgG. El panel inferiorB se presenta el resultado de ELISA para diferentes concentraciones de IgG. Triplicados se utilizaron para determinar la desviación estándar (SD). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

De cabra anti-IgG de ratón-Fc anticuerpo de captura fragmento, suero IgG, y de cabra anti-IgG de ratón-Fc fragmento de anticuerpo conjugado con HRP se usaron para el ensayo de sandwich. Como se muestra en la Figura 6 y la Figura S6, la concentración de suero IgG de 0 a 500 ng / ml tenía una relación lineal con la intensidad colorimétrica cuando cada paso se incubó durante 1 hora. En la Figura S6, la variación de color con diferentes concentraciones de IgG era obvio para 1 hora de incubación. Sin embargo, los resultados de la 10 min de incubación no mostraron un cambio obvio en la intensidad de color con diferentes concentraciones de IgG. Así, el sensitivity de este ELISA basado en el papel era adecuado para el desarrollo de las pruebas prácticas de punto de cuidado.

Figura S1. Respuestas de fluorescencia para diferentes concentraciones de peryodato de sodio (Método A). Concentraciones variables de peryodato de sodio se mezclaron con conejo anti-IgG humana-FITC a una concentración de 0,016 mg / ml y se utiliza para el estudio de la actividad de oxidación de anticuerpos. Al aumentar la concentración de peryodato de sodio, la cantidad de carga de IgG-FITC aumentó y alcanzó un máximo a 0,25 mM. Se observó que las concentraciones de peryodato de sodio que eran más altos que esta no aumentaron la cantidad de inmovilizado IgG-FITC. Triplicados se utilizaron para determinar la desviación estándar (SD). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S2. respuesta de fluorescencias a diferentes concentraciones de conejo anti-humano IgG-FITC (Método A). La concentración de peryodato de sodio fue de 0,25 mM en la solución para el estudio actividad de oxidación de anticuerpos, y la concentración final de conejo anti-humano IgG-FITC en cada disco fue 0,016 mg / ml. Cuando se fijó la concentración de peryodato de sodio, la concentración de IgG-FITC tuvo poco efecto sobre la oxidación de IgG-FITC. Triplicados se utilizaron para determinar la desviación estándar (SD). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S3. Se han usado respuesta de fluorescencia y el resultado colorimétrico de la carga de diferentes concentraciones de conejo oxidado anti-humano IgG-FITC en los discos de papel (Método A). Para la oxidación con peryodato de sodio, 0,08 mg / ml de peryodato de sodio IgG-FITC y 0,25 mM. La dilución de IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa fue1: 50.000. El aumento de la concentración de carga de la IgG-FITC en los discos de papel de celulosa aumento de la cantidad de IgG-FITC inmovilizada, pero no tendrá un efecto en unión a la diana. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S4. Respuesta de fluorescencia a altas concentraciones de glutaraldehído en la inmovilización de IgG-FITC en los discos de papel de celulosa (Método B). La concentración de IgG-FITC en cada disco fue de 0,01 mg / ml. Las concentraciones de glutaraldehído que fueron superiores a 0,25% no aumentó la cantidad de IgG-FITC inmovilizada sobre los discos de papel de celulosa. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S5. Efecto del número de tiempos de lavado. A: estaba. Hing tres veces B: lavado 15 veces. Los anticuerpos de captura inmovilizados sobre el papel cuadrado de celulosa todavía tenían buena capacidad de unión a sus objetivos, a pesar de que el papel cuadrado se sometió a vórtice 15 veces. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S6. Resultado de ELISA para IgG basado en papel. Para las concentraciones de IgG a partir de 0 a 500 ng / ml, los resultados de una hora de incubación son mejores que los resultados de 10 minutos de incubación. Para altas concentraciones de IgG, 10 minutos es tiempo suficiente para la incubación. Triplicados se utilizaron para determinar la desviación estándar (SD). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S7. La microscopía electrónica de barrido (SEM) imágenes de papel de filtro de flujo medio a diferentes aumentos. R: 85X y B: 20.000X. Se empleó campo de microscopía electrónica de barrido de emisión (FE-SEM) que opera a 5 kV para determinar la morfología de las partículas. Las fibras de celulosa son al azar reticulado. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S8. Imágenes de SEM de papel filtro de flujo rápido a diferentes aumentos. R: 100X y B: 20.000X. Se empleó campo de microscopía electrónica de barrido de emisión (FE-SEM) que opera a 5 kV para determinar la morfología de las partículas. Las fibras de celulosa son al azar reticulado. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El recubrimiento directo de afinidad purificada de cabra anti-ratón de anticuerpo de captura IgG-Fc sobre discos de papel de celulosa no modificada se realizó para detectar concentraciones de IgG. Los resultados indicaron que, se requiere más la fijación de los anticuerpos de captura para la reproducibilidad. La técnica de silano fue utilizado con éxito para introducir grupos funcionales de amina a los discos de papel de celulosa 34. La concentración de APS afecta a la inmovilización de anticuerpos. Por lo tanto, también se optimizó la cantidad de APS en acetona. 1 ml de APS en 10 ml de acetona fue una concentración óptima para injertar el grupo amina para la inmovilización de anticuerpos a través de un agente de reticulación glutaraldehído. Los anticuerpos fueron injertadas en los discos de papel de celulosa por oxidación con peryodato y glutaraldehído métodos de reticulación. Nuestros resultados revelaron que la capacidad de unión de anticuerpos inmovilizados a través del método de reticulación glutaraldehído era mejor que el método de oxidación con peryodato para medium-flujo y discos de papel de filtro de flujo rápidos. Además, los anticuerpos de captura, que se inmovilizan sobre discos de papel de celulosa a través de un método de entrecruzamiento con glutaraldehído, conservan su función y se forma estable inmovilizan a pesar de que el papel se somete a la tensión mecánica de 15 lavados por agitación. El diez por ciento de la memoria intermedia de bloqueo de leche desnatada en polvo se encontró para conservar su eficacia de bloqueo después de 15 lavados (Figura S5).

Los anticuerpos covalentemente inmovilizados fueron utilizados para realizar un ELISA sándwich con la detección de IgG. IgG en una concentración de 100 ng / ml fue detectada a simple vista el uso de este ensayo basado en disco de papel. La concentración de IgG en suero de 0 a 500 ng / ml mostró una relación lineal con la intensidad colorimétrica, cuando cada paso se incubó durante una hora. La prueba de inmunoensayo para este disco de papel basado en ELISA requiere menos reactivo de muestra y parecía ser más eficaz que los inmunoensayos convencionales 36 Figura S7 y S8 Figura, respectivamente. Como se ilustra en estas figuras, las fibras son al azar reticulado para ambos tipos de discos de papel de filtro de 25. La razón de esta alta sensibilidad podría ser el espesor del disco de papel. Para discos de papel de filtro de flujo rápido el espesor era de 420 micras en comparación con 180 m para papel de filtro de flujo medio. Por lo tanto, más anticuerpos de captura era probable que se inmovilizada sobre discos de papel de filtro de flujo rápido, lo que aumentaría aún más la sensibilidad del ensayo. Al mismo tiempo, el tamaño de poro para los discos de papel de filtro de flujo rápido (30 mM) era más grande que la de los discos de papel de filtro de flujo medio (11 & #181; m). Después de bloquear la superficie de papel, el tamaño de poro de la primera era todavía lo suficientemente grande como para conducir el flujo de líquido sin un sistema de energía extra. Sin embargo, la velocidad de flujo para el búfer en el último era más lento. Por lo tanto, el papel de filtro de flujo rápido era mejor que el papel filtro de flujo medio en la aplicación de inmunoensayos.

La reproducibilidad de los anticuerpos en los discos de papel de filtro inmovilizados se evaluó por incubación adicional de los discos de papel con IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa y detección del resultado colorimétrico después de cargar la solución de mezcla de sustrato TMB y peróxido de hidrógeno. La desviación estándar fue menor de 10% para este dispositivo basado en papel. La estabilidad de conejo anti-humano IgG-FITC en los -NH 2 discos de papel de celulosa modificados se probó para un máximo de dos meses. Los discos de papel que fueron almacenados a 4 ° C mantienen su actividad de unión a peroxidasa conjugada con IgG de cabra anti-conejo con una ligera disminución en su biNding actividad. Sin embargo, cuando se almacenaron los discos de papel de anticuerpo inmovilizado a temperatura ambiente o 60 ° C, perdieron su actividad de unión debido a la sequedad y alta temperatura. Los anticuerpos capturados podrían haber desestabilizado y desnaturalizado en estas condiciones.

Hay algunos pasos críticos en la inmovilización de anticuerpos de captura en los discos de papel de celulosa utilizando glutaraldehído como agente de reticulación. Etapa 1.2 para injertar grupos amina sobre los discos de papel es un paso crítico en el éxito de la inmovilización covalente de anticuerpos de captura. Si este paso falla, todo el proceso de inmovilización fallará. FTIR se utilizó para determinar si los grupos amina se inmovilizaron con éxito en los discos de papel (paso 1.6). En segundo lugar, el injerto de grupos aldehído en los discos de papel de celulosa es un paso crítico (Paso 2.2.1 y el Paso 3.1). Los anticuerpos se inmovilizaron covalentemente sobre los discos de papel de celulosa a través de la formación de una base de Schiff. Finalmente, La etapa de inmovilizar anticuerpos de captura en los discos de papel de filtro es importante (Paso 2.2.3, paso 3.4 y 3.5 Paso). Los grupos amino de los anticuerpos de captura de reaccionar con los grupos aldehído de los discos de papel de celulosa para fijar los anticuerpos en los discos de papel. Si este paso no tuvo éxito, anticuerpos de captura no se inmovilizan en los discos de papel y todas las pruebas de aplicación de ELISA sería negativo. Podemos utilizar un generador de imágenes de fluorescencia molecular para determinar la presencia de anticuerpos de captura. Y conjugado con peroxidasa IgG de cabra anti-conejo y reacciones colorimétricas a base de peroxidasa se puede utilizar para confirmar la capacidad de unión de los anticuerpos inmovilizados.

Este protocolo puede encontrar algunos problemas, tales como un alto fondo a la señal, ninguna señal o una señal débil, y un informe de color desigual. Las posibles causas de estos problemas y métodos de solución de problemas para superar estos problemas se discuten a continuación. señales de alta fondo por lo general se producen due para un tiempo de bloqueo corto. Esto se puede resolver mediante el aumento del tiempo de incubación de bloqueo, lavar los discos de papel de fondo, y evitando la adición de la enzima conjugado de anticuerpo de detección en exceso para eliminar las señales de fondo. Las posibles causas incluyen una ausencia de antígeno diana, a lo largo de bloqueo, tiempo de incubación suficiente, y un anticuerpo de detección conjugado enzima no funcional. Para superar estos problemas, los antígenos diana deben añadirse y se incubaron durante un período de tiempo adecuado, usando un nuevo conjugado de anticuerpo y su almacenamiento como se sugiere por el fabricante. Es conveniente incluir un control positivo para la detección. lecturas de color desigual se deben a el apilamiento de discos de papel durante el proceso de injerto. Para evitar este problema, los discos de papel deben estar separados durante el proceso de injerto APS, y la enzima conjugado de anticuerpo de antígeno y detección deben ser distribuidas de manera uniforme en el disco de papel en cada paso.

Aunque el ensayo basado en papel es un simpley un método rentable, hay limitaciones. La orientación de los anticuerpos en la superficie del sustrato es crítica para el rendimiento del inmunoensayo, como el agente de reticulación glutaraldehído reacciona con los grupos amino de la región Fab y la región Fc de los anticuerpos de captura. Por lo tanto, los anticuerpos inmovilizados no se producen de una manera altamente orientado. Puesto que hay más grupos de amina de la región Fab que de la región Fc de los anticuerpos IgG, la actividad de unión de los anticuerpos inmovilizados es todavía lo suficientemente alta para su aplicación.

Diferentes métodos de funcionalización superficial de papel de celulosa se resumieron en un informe reciente 37. Reactivos tales como divinil sulfona; 1,4-phenylenediisothiocyanate; 4-azido-bencenodiazonio; epiclorhidrina; 4-azido-a-fluoro-2-nitrocyclohexane; y 4-mercapto-bencenodiazonio, podría ser utilizado para inmovilizar covalentemente biomoléculas sobre papel de celulosa. también se utilizaron adsorción y atrapamientopara recubrir el papel de celulosa con biomoléculas. En comparación con los otros métodos, la combinación de la técnica de silano y el agente de entrecruzamiento con glutaraldehído para la inmovilización covalente de anticuerpos sobre papel de celulosa es un método simple. Además, esta combinación puede tener poco efecto sobre el rendimiento térmico y mecánico del papel de celulosa, lo que permite el máximo flujo a través vertical en inmunoensayos. Esta estrategia podría extenderse a inmovilizar otras biomoléculas en el papel de celulosa.

La metodología ha demostrado aquí potencialmente podría extenderse a la detección de cualquier analito, siempre que los anticuerpos directos contra que están disponibles. Este método también puede ser utilizado para desarrollar la detección multiplex. Por ejemplo, en un papel cuadrado, diferentes zonas se pueden distinguir por varias metas. Los anticuerpos de captura para los objetivos se pueden inmovilizar a través de un agente de reticulación glutaraldehído en su área específica. Esto puede ser seguido por los ELISUn procedimiento para detectar diversos objetivos. Por lo tanto, el método propuesto hace que el ELISA una herramienta versátil basado en papel para la detección de otros objetivos utilizando el ojo desnudo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) GE Healthcare Pte Ltd Singapore  1001 110
Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) Sigma-Aldrich, Singapore 1113-320
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich, Singapore G6257 Grade II, 25% in H2O
Surfactant Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore P2287
Bovine serum album  Sigma-Aldrich, Singapore A2153
Skimmed milk powder Louis François  Packed by Kitchen Capers, Singapore
Tris base Promega H5135
Sodium periodate Merck 106597
Na2HPO4 Merck 106585
KH2PO4 Merck 104873
NaCl CALBIOCHEM 567441
NaOH Merck 106462
HCl Merck 100317
phosphate buffer saline (PBS) N/A N/A PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol⁠/⁠L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl
Acetone Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore 9005-68
Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution  1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce 34029 1 L
Rabbit anti-human IgG-FITC TWC/Bio Pte Ltd Singapore sc-2278
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG TWC/Bio Pte Ltd Singapore sc-2030
Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody Bethyl Laboratories, Inc A90-131A
Mouse reference serum Bethyl Laboratories, Inc RS10-101-5 9.5 mg/ml
HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody Bethyl Laboratories, Inc A90-131P
Equipment
Fourier transform infrared spectrophotometer Shimadzu IR Prestige-21  N/A
Fluorescence molecular imager Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore N/A
Oven NUVE FN500 N/A
Turbo mixer VM-2000 MYC LTD N/A
ImageJ RGB, free download N/A

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References

  1. Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
  2. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
  3. Lode, P. V. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).
  4. Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. Perspectives for on-site monitoring of progesterone. Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).
  5. Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).
  6. Li, X., Tian, J., Shen, W. Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors. Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).
  7. Nie, Z., et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 10, 477-483 (2010).
  8. Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors. Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).
  9. Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).
  10. Cheng, C. M., et al. Paper-based ELISA. Angew. Chem. 122 (28), 4881-4884 (2010).
  11. Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper. Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).
  12. Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes. J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).
  13. Kong, F., Hu, Y. F. Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication. Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).
  14. Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation. Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).
  15. Yu, A., et al. Biofunctional paper via covalent modification of cellulose. Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).
  16. Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors. Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).
  17. Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules. J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).
  18. Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface. J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).
  19. Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan. J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).
  20. Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport. Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).
  21. Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides. ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).
  22. Filpponen, I., et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).
  23. Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties. Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).
  24. Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).
  25. Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing. Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).
  26. Wang, S., et al. Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing. Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).
  27. Koev, S. T., et al. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
  28. Wang, S. M., et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).
  29. Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein. Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).
  30. Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications. J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).
  31. Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).
  32. Fernandes, S. C. M., et al. Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).
  33. Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460. , (2005).
  34. Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M. Aminosilane-grafted cellulose. BioResourses. 8 (3), 4468-4483 (2013).
  35. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).
  36. Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk. Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).
  37. Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects. Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).

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