Summary
Den här artikeln beskriver hög genomströmning analys som har upprättats för att screena stora bibliotek av små molekyler för deras potentiella förmåga att manipulera cellulära nivåerna av cykliskt di-GMP i Pseudomonas aeruginosa, vilket ger en ny kraftfullt verktyg för antibakteriella läkemedelsutveckling och förening testning.
Abstract
Bakteriell resistens mot traditionella antibiotika har drivit forsknings försök att identifiera nya läkemedelsmål i nyligen upptäckt regulatoriska vägar. Regulatoriska system som utnyttjar intracellulär cyklisk di-GMP (c-di-GMP) som en andra budbärare är ett sådan klass av målet. c-di-GMP är en signalmolekyl som finns i nästan alla bakterier som verkar för att reglera ett brett spektrum av processer, inklusive antibiotikaresistens, biofilm formation och virulens. Förståelsen för hur C-di-GMP signalering kontroller aspekter av antibiotikaresistenta biofilm utveckling har föreslagit metoder där ändring av cellulära koncentrationer av nukleotid eller avbrott i dessa signaleringsvägar kan leda till minskad biofilmbildning eller ökad känslighet av biofilmer till antibiotika. Vi beskriver en enkel hög genomströmning bioreporter-protokollet, baserat på grönt fluorescerande protein (GFP), vars expression är under kontroll av c-di-GMP responspromotor CDRASnabbt att screena för små molekyler med potential att modulera c-di-GMP cellulära nivåer i Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Denna enkla protokoll kan skärmen uppemot 3.500 föreningar inom 48 timmar och har förmågan att anpassas till flera mikroorganismer.
Introduction
Den snabba utvecklingen av bakterieresistens mot kliniskt viktiga antibiotika är en av de viktigaste frågorna för närvarande står inför vårdpersonal över hela världen. Detta misslyckande av traditionella antibiotika har kört nya sökningar för kemisk materia som kan störa bakterie processer i virulens och sjukdomsprogression en. Ett sådant regleringssystem som utnyttjar den intracellulära andra budbärare cyklisk di-GMP (c-di-GMP) har nyligen blivit ett mål med lovande giltighet 2-4. Det har fastställts att detta globala andra budbärare signalmolekyl styr många funktioner, inklusive antibiotikaresistens, vidhäftning, biofilm formation och sjukdom 2-4.
Det är nu underförstått att den cellulära nivån av c-di-GMP i den bakteriella cellen styrs av syntes och nedbrytning genom vilka två molekyler av GTP används för att syntetisera c-di-GMP genom GGDEF domäninnehållande diguanylate cyclases (DGCs) whereas c-di-GMP nedbrytning katalyseras av fosfodiesteraser (PDE), som har antingen en EAL eller en HD-GYP domän (översikt i (3, 5)). Proteiner som innehåller dessa domäner innehåller ofta andra signal domäner, vilket tyder på att deras verksamhet i c-di-GMP omsättningen regleras antingen direkt eller indirekt av miljö- eller cellulära 3,5 ledtrådar. Följaktligen c-di-GMP signalering funktioner för att koppla avkänning av olika miljö ledtrådar till ändringar i bakterie fenotyp. c-di-GMP utövar sin reglerande effekt i bakterier vid nivån för transkription, post-transkription och post-translation genom olika mekanismer 4.
En stor påverkan av c-di-GMP i många bakterieceller är vid fastställandet av bakteriell "livsstil", och i synnerhet i kontrollen av övergångarna mellan rörliga planktonceller och fastsittande celler fästa till ytor eller organiserade i flercelliga strukturer av biofilmer 3,5. I allmänhet hög cellulärnivåer av c-di-GMP är förknippade med biofilm formation och sessility, medan låga cellulära nivåer uppmuntra rörlighet och virulensfaktor syntes i många bakteriella patogener 3,5. Således, en mer detaljerad kunskap om arbetet i c-di-GMP signalering hade råd strategier för inhibering av biofilmbildning och virulens i bakteriella patogener. Detta är en svår uppgift med tanke på att de flesta bakteriella genomen kodar många proteiner med GGDEF, EAL och / eller HD-GYP domäner (t ex P. aeruginosa har över 40 proteiner) och flera effektenheter 6,7.
Men även med denna komplexitet, föreslår nya bevis att strategier manipulera c-di-GMP-signalering kan utvecklas antingen förhindra antibiotikaresistenta infektioner utveckla eller göra dem mottagliga för immunsystemet eller effektiv behandling av samtidig administrering av klassiska antibiotika 2. I linje med detta har det experimentellt visat att konstgjord minskningav intracellulär c-di-GMP i in vitro- -grown P. aeruginosa leder till minskad biofilmbildning och ökad känslighet för antimikrobiella medel, medan P. aeruginosa -developed biofilmer på silikonimplantat, som ligger i den peritoneala kaviteten hos möss, kan dispergeras på ett liknande sätt 11/08.
Här beskriver vi en hög genomströmning, fluorescensbaserad reporteranalys för att screena små molekyler som potentiellt kan modulera de cellulära c-di-GMP-nivåer i P. aeruginosa (Figur 1). Analysen är baserad på mätning c-di-GMP cellulära nivåer med hjälp av en tidigare utvecklad GFP reporter vars expression är transkriptionellt kopplad till c-di-GMP-responsiva CDRA promotorn 12. Detta protokoll beskriver metodologin för uttryck av reporterkonstruktion i P. aeruginosa stam av intresse, förening tallrik förberedelse, kultur ympning i 384-brunnsplattor, tillväxtbetingelser, som vill som uppgifter om insamling, hantering och analys (Figur 1). Sammantaget kommer detta protokoll att hjälpa forskare att potentiellt identifiera nya substanser som c-di-GMP signalering i bakterier, och för användning i forskning som syftar till att förstå biologi P. aeruginosa.
Protocol
Obs: Rutiner för kloning och omvandling av det renade C-di-GMP reporterplasmid diskuteras på annat håll 12.
1. Generering av GFP taggade c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Stam
- Inokulera 5 ml lysogeni buljong (LB) medium med en enda koloni av P. aeruginosa och inkubera över natten vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm.
- Överföring 2 ml av övernattskultur till 200 ml färskt LB-medium i en 1-liters kolv och inkubera vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm.
- Övervaka den optiska densiteten vid 600 nm (OD 600) var 30 min genom att ta ett 1 ml prov från kolven och undersöka användning av en spektrofotometer (som beskrivits tidigare 12).
- När OD 600 når mellan 0,3-0,5, placera 40 ml av kulturen till en 50 ml koniskt centrifugrör.
- Pellets cellerna genom centrifugering vid 8000 rpm under 10 min vid 4 ° C, kasta supernatanten och re Suspendera cellerna i 40 ml iskall, steril, 300 mM sackaros lösning.
- Pellets cellerna en andra gång genom centrifugering såsom beskrivs i steg 1,5 och återsuspendera i 20 ml iskall, steril, 300 mM sackaros lösning.
- Pellets cellerna en sista gång genom centrifugering såsom beskrivs i steg 1,5 och återsuspendera i 400 | il iskall, steril, 300 mM sackaros lösning.
Obs: Celldensiteten vid denna punkt bör vara ungefär 1 x 10 11 kolonibildande enheter per milliliter (CFU / ml). - Kyla cellerna på is i 30 min, varefter de är klara för elektroporering.
- Tillsätt 1 l av en 0,2 mikrogram / l pCdrA :: gfp C plasmid 12 lösning till 40 pl P. aeruginosa elektrokompetenta celler framställd ovan i en 1,5 ml mikrocentrifugrör som har för-kyld på is. Blanda suspensionen och överför till en i förväg kyld, 2 mm elektrodavstånd, elektroporering kyvett.
Obs: pCdrA :: gfp C: pUCP22Not-P CDRA -RBSII- gfp (Mut3) -T 0 -T 1, Amp r Gm r, vilket ger en fluorescerande avläsning av den intracellulära nivån av c-di-GMP i P. aeruginosa stammar, har utvecklats och validerats av Rybtke et al. 12. - Avlägsna fukt på utsidan av kyvetten med silkespapper och placera kyvetten i provkammaren i elektroporator. Puls med en spänning på 2,5 kV, kapacitans av 25 pF och motstånd på 200 Ω.
- Ta bort kyvetten och tillsätt 1 ml av LB-medium. Då, överföra celler till en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör och inkubera i 2 h vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm.
- Sprid 10 | il, 50 | il och 100 | il alikvoter av kulturen på sterila LB-agarplattor kompletterade med ampicillin (vid en koncentration av 100 | ig / ml), och inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
- Bekräfta GFP uttryck (excitatipå vid 485 nm, emissions vid 520 nm) genom att granska plattan under ett fluorescensmikroskop med en standard GFP kanal och plocka en enda koloni för att ympa 5 ml LB. Inkubera över natten såsom beskrivs i steg 1,1. Blanda 0,5 ml av den över natten odlade kulturen med 0,5 ml 50% glycerol i en 2 ml med skruvlock rör och förvara vid -80 ° C.
2. Beredning av startkulturen för ympning
- Två dagar innan skärmen, plattan P. aeruginosa-stam (innehållande pCdrA :: gfp C plasmid) från -80 ° C mald på en LB-agarplatta (kompletterad med ampicillin vid en koncentration av 100 | ig / ml) genom att försiktigt sprida bakterierna över plattan med en steril inokulering slinga. Inkubera plattan över natten vid 37 ° C.
- Kvällen före visningen, ympa en enda koloni av P. aeruginosa från plattan i 10 ml LB-medium (kompletterat med ampicillin vid en koncentration av 100 | j, g / ml) i en tuvara och inkubera förodling över natten vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm.
- På dagen för skärmen, förbereda en subkultur från över natten förkulturen genom utspädning det först med färskt LB-medium till en OD 600 av 1,0 och därefter ytterligare utspädning med 5% LB till en OD 600 av 0,04 (01:25 förhållande) .
Obs: Den totala volymen av det inokulerade mediet beror på antalet plattor som skall testas. 5% LB beredes genom utspädning 100% LB med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att den erforderliga koncentrationen. Viktigt, media (5% LB) tillåter konstitutiv aktivering av pCdrA :: gfp C i P. aeruginosa. - Lägga till en steril magnetisk omrörare i behållaren och rör om kulturen vid minimal hastighet på en magnetomrörare under 30 minuter vid rumstemperatur, vilket gör att bakterierna att acklimatisera till media innan de dispenseras i 384-brunnsplattor.
3. Inokulation och Inkubation av 384-brunnars plattor innehållandesmå molekyler
Obs: Sterilitet och goda aseptisk teknik är av största vikt för de följande stegen.
- För att framställa den positiva kontrollen (100% inhibering), tillsätt 20 | il tobramycinsulfat (25 mg / ml) till 10 ml (tillräckliga för upp till 12 plattor) av subkulturen framställd i steg 2,3 och blanda försiktigt. Pipettera 40 | il av den positiva kontrollkulturen i brunnar A23 - P23 (fig 2).
- För att framställa den negativa kontrollen (0% hämning), tillsätt 30 | il dimetylsulfoxid (DMSO) till 10 ml (tillräckliga för upp till 12 plattor) av subkulturen framställd i steg 2,3 och blanda försiktigt. Pipettera 40 | il av den negativa kontrollkulturen i brunnar A24 - P24 (fig 2).
- För var och en av plattorna stämplade med de små molekylerna, ympa en volym av 40 | il av de utspädda övernattskulturer (beskrivna i Steg 2,3) i brunnarna A1 - P22 (fig 2).
Notera: Detta kan uppnås med användning av en vätskehanterare robot. På grund av de heterogena egenskaperna hos bakteriekulturer, är det viktigt att upprätthålla en kontinuerlig och måttlig omröring för att hålla bakterier konsekvent fördelade i media medan dispensering. För att göra detta, hålla omrörning acklimatiserad kultur från steg 2,4 magnetiskt under dispensering. - Försegla plattorna med ett luftpermeabelt överdragstätningen och inkubera i 6 h vid 37 ° C.
Obs: luftgenomträngliga tätningen är avgörande för att bibehålla oföränderliga förhållanden i alla 384 brunnar och kringgå den potentiella utvecklingen av syre gradienter över plattan.
4. Mätning av tillväxt (OD 600) och Intracellulär c-di-GMP Level (GFP)
- Ca 30 minuter innan spektrofotometrisk mätning, för-värma plattavläsare till 37 ° C för att undvika kondensering.
- Försiktigt bort luftgenomträngliga täcktätningen innan behandlingen. Mät den optiska tätheten vid en våglängd av 600 nm med en inställning av 10 blixtar per brunn ochen insvängningstid av 0,2 sek.
- Före mätning av fluorescens, gör en automatisk förstärknings och fokal justeringen baserad på väl A24 (negativ kontroll) och ställ in målvärdet vinst på 75% (Figur 2).
- Från plattläsaren styrprogram, klicka på Starta mätningen och klicka på "Focus och förstärkningsjustering / Plate ID fliken '.
- Välj '' skärpeinställning '' och '' Channel A '' till höger i fönstret.
- Välj '' Gain justering '' och '' Selected väl '', och skriv in '' 75 '' som '' Målvärde ''. Slutligen, plocka väl A24 i plattan layouten innan du klickar på '' Starta Justering ''. När justeringen utförs, klicka på '' Starta mätningen ''.
- Mäta fluorescensen från GFP reporter vid en excitationsvåglängd / emissionsmaximum av 485/520 nm med en inställning av 10 blixtar per brunn och en settling tid av 0,2 sek.
- Samla in data från alla plattorna undersöktes. Obs: Data avläsningar sparas automatiskt som standard med plattläsaren styrprogram.
- Se avläsningar genom att klicka på "Mars" -ikonen i styrprogram för att öppna den statistiska paketet analys.
- Hämta data från "dubbelklicka" på plattan antalet intresse att få tillgång till data för analys.
5. Dataanalys
- Utvärdera likformighet och reproducerbarhet av analysen med hjälp av robusta z "analys, som är de vanligaste kvalitetsmått som rapporteras för hög genomströmning skärmar. Beräkna robust z "med formeln:
Där MAD (Median absolut avvikelse) är en uppskattning av standardavvikelse, p är den positiva kontrollen (100% hämning) och n är den negativa kontrollen (0% hämning) för både OD 600 och GFP values. Notera: En analys med en robust z 'värde (beräknad för både OD 600 och GFP rådata) som är större än eller lika med 0,5 anses som en utmärkt analys. - Beräkna% hämning av tillväxt under användning av formeln:
Där Xi OD600 är itererad OD 600 värdet för varje provbrunn. % Inhibition OD600> 0, tillväxthämmare; % Inhibition OD600 <0, tillväxtbefrämjande medel. - Bedöma% hämning av den intracellulära nivån av c-di-GMP med hjälp av formeln (förändringen i godtyckliga fluorescensintensitetsenheter är korrigerade för förändringen i celltäthet):
Där Xi GFP är itererad GFP värdet för varje provbrunn. % Inhibition GFP> 0, c-di-GMP-hämmare; % &# 160; Inhibition GFP <0, c-di-GMP-promotorn. - Ställ en tröskel för träff detektering vid 3 MAD från medianen (median ± 3 MAD), beräknat från prov beläst-outs av varje platta, under antagande av en normalfördelning av datapunkter. Obs: Däremot kan en ± 50% hämning cut-off väljas för mer reproducerbara och exakta dos responsanalyser om det behövs.
Representative Results
Tillvägagångssättet som beskrivs här tillåter en enda forskare att effektivt och framgångsrikt screena ett genomsnitt på 3.500 föreningar inom en 48-timmarsperiod. En översikt av high-throughput screening-protokollet illustreras som ett flödesschema i figur 1. För den aktuella artikeln, skärmad vi en regel-of-fem-kompatibel föreningsbibliotek för potentiella c-di-GMP modulerande föreningar vid en slutlig koncentration av 600 | iM . Men det finns många kommersiellt tillgängliga läkemedelsliknande och icke-läkemedel som sammansatta uppsättningar som kunde användas i analysen. Dessa uppsättningar kan vara bakterie fokuserade föreningar eller slumpmässiga poolade föreningar men varje bibliotek skulle ha förut fysikalisk-kemiska egenskaper och kännetecken som tilldelats såsom uppsättningen screenas här, som hade polära funktionella grupper och flera stereogena centra. I detta protokoll är bakterier ympades in i plattan tillsammans med föreningar, ett antibiotikum positiv kontroll och en DMSO-vehikelkontroll, enligt den layout som visas i figur 2. Figur 3 visar resultaten av den primära screeningen exemplifieras av ett enda bibliotek platta. Representativ OD 600 och GFP rådata är visade i fig 3A och 3B, respektive. En färgtoning värmekarta, med varm (röd) för att kyla (grön) färger som indikerar lågt till högt OD 600 / GFP värden har använts till brunnen värdena. Värme kartor genererades i ett kalkylprogram genom att tillämpa en 3-Color skala villkorsstyrd formatering som spänner från den lägsta OD 600 / GFP utläsning upp till den högsta OD 600 / GFP utläsning. Låg OD 600 och GFP värden i förhållande till DMSO negativ kontroll motsvarar en hämning i tillväxt och c-di-GMP nivåer respektive medan höga värden i förhållande till DMSO negativ kontroll motsvarar en befordran i tillväxt och c-di-GMP nivåer respektive . Den robusta z "värden för OD 600 och GFP are beräknas enligt den formel som anges i protokollet (5,1). Eftersom de är båda över 0,5 (0,694 och 0,761 respektive), var analysen kvalitet bedöms robust och data analyserades ytterligare. Den% tillväxthämning (OD 600) och intracellulär c-di-GMP nivå (GFP) beräknas med formlerna som i protokollet (5,2, 5,3). Representativa data visas i figur 4A och 4B respektive. En färgtoning värmekarta, med varm (röd) för att kyla (grön) färger som indikerar lågt till högt% hämning, har tillämpats på brunnsvärdena. En spridningsdiagram av% inhibition (OD600 / GFP) från enskilda brunnar baserade på den primära skärmen ritas i Figur 5A och 5B för OD 600 och GFP uppgifter respektive. A ± 50% cut-off (indikerat med streckade linjer) har valts för träff detektering. Potentiella träffar baserade på denna cut-off indikeras med röda prickar. Två typer av föreningar av intresse kan vara discerned från analysen. Träffar som identifieras i figur 5A är föreningar som inhiberar bakterietillväxt, medan hits som identifieras i figur 5B är föreningar som potentiellt besitter förmågan att modulera intracellulära nivåerna av c-di-GMP. Två föreningar har identifierats som representativa träffar för denna analys. Dessa är förening A, en potentiell tillväxtinhibitor och förening B, ett potentiellt c-di-GMP-inhibitor. Förening A motsvarar väl F8 i fig 3 och 4 och hade en 72,5% inhibering i tillväxt. Det fanns en förväntad motsvarande hämning i cykliska di-GMP nivåer. Förening B motsvarar väl K3 i fig 3 och 4 och hade en 61% inhibering i cykliska di-GMP nivåer utan någon förändring i tillväxt. Väljer träff föreningar testades ytterligare genom en 10-punkters dos-respons-analysen med en toppkoncentration av 2 mM och två-faldig utspädningsserie. IC 50-värden beräknas utifrån dos-responskurvor (figur 6A och B).
Figur 1. Översikt: hög kapacitet Setup för screening av små molekyler för deras potential att modulera cellulära nivåerna av c-di-GMP i P. aeruginosa. Denna översikt visar en steg-för-steg-representation av det protokoll som används i denna analys. En bakteriell koloni av P. aeruginosa odlas över natt i ett LB-startkultur. Med användning av en reagensfördelaren är cellerna ympades i 384-brunnsplattor innehållande de utvalda föreningarna. Plattorna inkuberas under 6 timmar, varefter de OD 600 och GFP-värden mäts. Med hjälp av dessa avläsningar, föreningar som påverkar de cellulära nivåerna av c-di-GMP kan identifieras. Klicka här för att se enstörre version av denna siffra.
. Figur 2. En 384-brunnar Map Används för Small Molecule Screening Analys Föreningarna från biblioteket (ljusblå) alikvoteras i brunnar A1 - P22. Den "positiv kontroll" (röd) som består av en slutkoncentration av 50 | ig / ml tobramycinsulfat sättes till brunnar A23 - P23 och "negativ kontroll" (grön) innehållande en slutlig koncentration av 1% DMSO tillsätts till brunnarna A24 - P24. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa resultat för en 384 brunnar silplåt. Representative rådata är för OD 600 (A) och GFP (B). En färgtoning värmekarta, med varm (Röd: OD 600 = 0,65 eller GFP = 250.000) för att kyla (Grön: OD 600 = 0,10 eller GFP = 40000) färger som indikerar låga till höga värden, har tillämpats på såväl värdena. Brunnar som har lägre OD 600 / GFP avläsningen i förhållande till DMSO negativa kontrollen tenderar att vara i rött medan brunnar som har högre OD 600 / GFP avläsningar i förhållande till DMSO kontroll tenderar att vara grön. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa resultat för procentuell inhibering Beräknat för en 384-brunnar. Det analyserade% inhibition data representeras både av OD 600 (A) och GFP (B) avläsningar. En färgtoning värmekarta, med varm (Röd: OD 600 = -150% eller GFP = -20%) för att kyla (Grön: OD 600 = 100% eller GFP = 100%) färger som indikerar låga till höga hämningsvärden har varit appliceras på såväl värdena. Små molekyler, som potentiellt hämmar tillväxt och intracellulär c-di-GMP tenderar att vara i grönt medan små molekyler som potentiellt främjar tillväxt och intracellulära c-di-GMP nivåer tenderar att vara i rött. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Representativa Scatter Tomter för% inhibition (OD600 / GFP) som erhållits från varje testad Small Molecule. Varje liten molekyl representeras av en punkt och fördelningen% inhibitionför var och en av OD 600 (A) och GFP (B) läs-outs visas. A ± 50% cut-off ut för hit identifiering. Potentiella träffar markeras med rött. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Representativa resultat från en dos -. Response-analys Två föreningar (potentiella tillväxthämmare A och potentiella c-di-GMP-hämmare B) identifierade från tidigare skärmar testas vidare i en 10 punkt dos-responsanalys med en övre koncentration av 2 mM och två-faldig utspädningsserie. Montering av fyra parameters logistisk funktion till data gav IC 50-värden av 158 iM och 193 ^ M respektive. Pleas klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I syfte att förbättra behandlingen av bakteriella infektioner, är det tydligt att en bättre förståelse av bakteriell beteende på molekylär regleringsnivå krävs. Det förfarande som beskrivs här kommer att vara till nytta för mikrobiologer, biokemister och kliniker som vill upptäcka små molekyler som har potential att manipulera eller störa cellulära koncentrationer av c-di-GMP i bakterier. Metoden utnyttjar en nyligen utvecklad GFP bioreporter att övervaka cellulära nivåerna av c-di-GMP i P. aeruginosa 12. Denna bioreporter har godkänts och visat allt inte att påverka tillväxten av stammen används vid odling i 5% LB i PBS. Användningen av en helcells-skärmen för att identifiera små molekyler som förändrar c-di-GMP nivåer in vivo övervinner de stora svårigheterna med mål-baserade läkemedelsupptäckt i termer av molekyl penetration genom de bakteriella membranen, särskilt genom de av gramnegativa bakterier . Viktigare, tHan analys verkar mycket robust som en robust z "värde ligger över 0,5 observerades i alla skärmar hittills. Screening med hjälp av detta protokoll kommer att avslöja ett antal små molekyler som hämmar och / eller främja intracellulära c-di-GMP-nivåer i P. aeruginosa. Dessutom har denna analys också potential att identifiera bakteriedödande eller bakteriostatiska föreningar resulterar i en minskning av OD 600 avläsning.
Även om det inte diskuteras i protokollet avsnitt, finns det flera viktiga överväganden för framställning av experimentet. Det är viktigt att komma ihåg att GFP bioreporter baseras på en plasmid. Även reporterplasmiden är känd för att vara mycket stabil i P. aeruginosa, kan den gå förlorad efter kontinuerlig re-plating, därav behovet av att använda färska pläterade stammar från en -80 ° C glycerol lager och kontroll fluorescens uttryck är kritisk. Det är också mycket värdefullt att behålla enhetliga tillväxtbetingelser hela skärmeneftersom eventuella förändringar i dessa förhållanden kan ha en dominoeffekt på skärmen. Detta skulle inkludera att göra vissa att media och antibiotika är färdiga i parti och används under hela skärmen. Bakteriekulturer inte växer (baserad på OD 600 avläsningar) på ett enhetligt sätt är ett vanligt problem för de flesta med hög kapacitet för skärmar av detta slag. Detta kan vara på grund av kanteffekter eller dispensera en icke-homogen bakteriekultur in i plattorna. För de förstnämnda, att se till att ett gaspermeabelt tätning används under inkubationstiden är avgörande. Medan för den senare, priming vätskehanteraren rör med en volym av kulturen minst tre gånger dödvolymen av slangen själv rekommenderas. Det är mycket viktigt att hålla den magnetiska omrörare vid minimal hastighet under utportionering. Medan övervakning och lagring av 384-brunnsplattor för en stabil tillväxt under loppet av experimenten är av största vikt, en situation för att undvika är stapling av plattorna under inkubation eftersom det kan orsaka unville syre gradienter leder till en skev i tillväxtmönstret. Det är också viktigt att se till att DMSO-vehikel användes som en negativ kontroll inte att negativt påverka tillväxten av stammen av intresse. Många av dessa frågor är associerade med tillväxt kan undvikas genom att utföra en mock skärm med den bakteriella stammen av intresse före screening. Tolkning av data också förtjänar hänsyn att c-di-GMP inhibitions resultaten beräknas av förändringen i godtyckliga fluorescensintensitetsenheter som måste korrigeras för förändringen i celltätheten. Med detta i åtanke olika matematiska formler för att bedöma utgångsdata från dessa experiment bör också övervägas. Till exempel kan en förening visas som en c-di-GMP-inhibitor men faktiskt vara en tillväxtinhibitor eller vice versa, vilket kräver en försiktig tolkning av identifierade träffar.
Det finns flera nackdelar och begränsningar som måste beaktas under utvecklingen och resultatet av dettahög genomströmning cellbaserad screen. Till exempel, de bio-reporter funktioner på ett indirekt mått på cellulära c-di-GMP nivåer med hjälp av en fluorescerande sond, vars detekteringsegenskaper skulle potentiellt påverkas av små molekyler som används i en skärm. Ett tangentiellt fråga är det faktum att cellbaserad analys ger ingen information om mekanismen bakom förändringar i nivåerna av intracellulär c-di-GMP. Därför måste viktiga observationer från försök bekräftas med användning av en HPLC-masspektrometri tillvägagångssätt, som anses vara den "gyllene standard" -metoden för mätning av intracellulära c-di-GMP fluktuationer i bakterier. Vidare kan vårt förfarande endast ge information om beteendet hos bakterier som odlas in vitro, såsom bakterieceller odlas i samband med värden (in vivo) snabbt ändra sin verksamhet på grund av denna miljö. Dessutom innebär processen med hjälp av en GFP bioreporter skärmen tar intehänsyn till den fysiologiska status av bakteriecellerna. Emellertid skulle det protokoll anpassas till mikroskopisk övervakning av enskilda brunnar under loppet av skärmen.
Även med dessa överväganden och begränsningar, är det hög genomströmning analys fortfarande en robust skärm för små molekyler med förmåga att störa intracellulära c-di-GMP nivåer. Eftersom många mikrobiella arter, inklusive många bakteriella patogener har studerats i syfte att karakterisera den modulering av intracellulära c-di-GMP nivåer, kunde våra protokoll appliceras till olika bakteriearter och expanderas till studiet av mer komplexa flerartsbakteriemodeller. Analysen kan lätt optimeras för andra bakteriearter genom att ändra tillväxtbetingelserna som används, eller kan anpassas för att läsa andra utgångar med hjälp av olika bioreporters. Olika inkubationstider kan appliceras beroende på tillväxtfasen av intresse. Emellertid, när uppskalning eller öka genom-put, är det importan t att hålla i minnet att bakterierna fortfarande kommer att växa under plattpreparat och läs-mätningar. Därför rekommenderas att screena maximalt 15 plattor på en gång med hjälp av detta protokoll. Dessutom, med hjälp av plattor med mer än 384 brunnar inte tillåter en enhetlig tillväxt, vilket kräver ytterligare optimering. När nedskalning antalet plattor, kan det vara lämpligare att manuellt ympa med hjälp av en elektronisk pipett i stället för en vätskehanteringsrobot. Det är tydligt att detta protokoll kan användas för att undersöka små molekyler som dispergerar biofilmer, med tanke på att anti-biofilm föreningar interfererar med c-di-GMP-signalering. Protokollet skulle också kunna byggas om för att förstå olika aspekter av bakteriell fysiologi. Med tanke på att c-di-GMP signalering är utbredd i de flesta bakterier, genom att studera physiologies av dessa organismer med hjälp av detta protokoll vi kan identifiera olika kemiska stimuli för att avgöra huruvida deras arbetsmekanismer kräver c-di-GMP-signalering.
_content "> Sammanfattningsvis kommer robust och mångsidigheten hos den metod som anges i detta protokoll underlätta identifiering av kemiska modulatorer av c-di-GMP signalering i många biologiska system.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG | |
| Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG | |
| Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 | |
| Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML | |
| Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 | |
| 2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 | |
| BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 | |
| Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA | |
| 384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 | |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 | |
| VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 | |
| 100 ml sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 | |
| AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 | |
| Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |
References
- Lewis, K. Recover the lost art of drug discovery. Nature. 485, 439-440 (2012).
- Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation? Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).
- Hengge, R.
- Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. When the PilZ don't work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria. Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).
- Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger. Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).
- Boyd, C. D., GA, O. 'T. oole Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems. Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).
- Ryan, R. P., et al. HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).
- Christensen, L. D., et al. Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria. Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Comm. 5, (2014).
- Sambanthamoorthy, K., et al. Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation. Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).
- Sambanthamoorthy, K., et al. Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development. Biofouling. 30, 17-28 (2014).
- Rybtke, M. T., et al. Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa. App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).
