Introduction
Bananflugan (Drosophila melanogaster) förening ögat är en stor modell för att undersöka den funktionella organisationen av fotoreceptorer och interneuronen arrayer för neurala bild provtagning och behandling, samt för djur vision. Systemet har den mest kompletta kopplingsschemat 1,2 och är älskvärd till genetiska manipulationer och korrekt neural aktivitet övervakning (av hög signal-till-brusförhållande och tidsupplösning) 3-10.
Drosophila ögat är modulärt, innehållande ~ 750 till synes vanliga lins tak strukturer som kallas ommatidia, som tillsammans ger flyga ett panorama synfält som täcker nästan varje riktning runt huvudet. Ögat primära uppgifter provtagning enheter är dess rhabdomeric fotoreceptorer 7,8,11. Varje ommatidium innehåller åtta ljusmätare celler (R1-R8), som delar samma aspekt objektiv men är i linje med sju olika riktningar. Medan de yttre fotoreceptorer R1-R6 are mest känsliga för blått-grönt ljus, spektrala känsligheter inre cellerna R7 och R8, som ligger ovanpå varandra och pekar på samma riktning, uppvisar tre distinkta subtyper: blek, gul och dorsala kantområdet (DRA) 12- 15.
Figur 1. funktionella organisation Drosophila Eye. (A) De två första optisk ganglier, näthinnan och lamina, är markerade i grått i farten ögat. Retina R1-R6 fotoreceptorer och lamina Stora Monopolär Cells (LMC: L1-L3) är lätt tillgängliga in vivo med konventionella vassa mikroelektrod inspelningar. Den schematiska elektroden belyser den normala väg att spela in från R1-R6 i näthinnan. En väg att spela in från LMC i lamina är att skifta parallellt elektroden till vänster. (B) Lamina är en matris av retinotopically organized kassetter, vilka vardera är packad med neuroner som bearbetar information från ett visst litet område i den visuella utrymme. På grund av neural super sex fotoreceptorer från olika grann ommatidia skicka sina axoner (R1-R6) till samma lamina patronen bildar histaminerga utgångs synapser till L1-L3 och en amakrina cell (Am). (C) Spridningen av neural information mellan R1-R6 axon terminaler och visuella intern (inklusive L4, L5, Lawf, C2, C3 och T1), i en lamina patronen är komplex. (D) R1-R6 ljusmätare axoner får synaptiska återkopplingar från L2 och L4 monopolära celler. (B) och (C) modifierad från Rivera-alba et al 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Drosophila ögat är av neural super typ 16. Detta betyder thatt neurala signaler från åtta fotoreceptorer som hör till sju grann ommatidia, som tittar på samma punkt i rymden, slås samman till en neural patron under de kommande två neuropils: lamina och märgen. Medan de sex yttre fotoreceptorer R1-R6 projekt sina axon terminaler till neurala kolumner i lamina (Figur 1), R7 och R8 celler kringgå detta skikt och göra synaptiska kontakter med deras motsvarande förlängda kolumn 17-19. Dessa exakta wirings producerar den neurala substrat för retinotopic kartläggning av flyg tidiga vision, varefter varje lamell (figurerna 1A-C) och medulla-kolonn (patron) representerar en enda punkt i rymden.
Direkta insignaler från R1-R6 fotoreceptorer tas emot av Stora Monopolär Cells (LMC: L1, L2 och L3) och amakrina Cell (Am) i lamina 1,2,20. Av dessa, L1 och L2 är de största cellerna, förmedla viktiga informationsvägar (figur 1D), WHIch svara på på och utanför rörliga kanter, och på så sätt bilda beräknings grund av rörelsedetektorn 21,22. Beteendeförsök tyder på att vid mellan Däremot två vägar underlättar rörelse uppfattning om motsatta riktningar: back-to-front i L1 och främre-to-back i L2-celler 23,24. Anslutning innebär vidare att L4 nervceller kan spela avgörande roll i sidled kommunikation mellan angränsande patroner 25,26. Ömsesidiga synapser påträffades mellan L2 och L4 celler som ligger i samma och två angränsande patroner. Nedströms, varje L2 cell och dess tre tillhörande L4 celler projicera sina axoner till ett gemensamt mål, att Tm2 neuron i märgen, där ingångar från angränsande patroner tros integreras för bearbetning av front-to-back rörelse 27. Även L1 nervceller får input från samma kassett L2S via både kanalförbindelser och synapser, de är inte direkt kopplad till L4s och därmed angränsande lamina patroner.
Intracellulära spännings inspelningar från enskilda fotoreceptorer och visuella intern i nästan intakt Drosophila ger hög signal-brus-rIG data vid sub-millisekund upplösning 3,5,7-10,29, vilket är nödvändigt för att göra känsla av de snabba neurala beräkningar mellan de anslutna nervceller. Denna precisionsnivå är omöjligt med dagens optiska avbildningstekniker, som är betydligt bullrigare och vanligtvis arbetar vid 10-100 ms upplösning. På grund elektroderna har mycket små och vassa spetsar, metoden är inte begränsad till cellkroppar, men kan ge direkta inspelningar från små aktiva neurala strukturer; såsom LMC "dendritiska träd eller fotoreceptor axoner, som inte kan nås av mycket större tips av patch-clamp elektroder. Viktigt är metoden också strukturellt mindre invasiv och skadliga än de flesta patch-clamp applikationer, och så förekommer hos färre de studerade cellernas intracellulär miljö och informations provtagning. Således har konventionella skarpa mikroelektrodteknik bidragit, och hålla på att bidra, grundläggande upptäckter och original inblick i neural information bearbetning vid den lämpliga tidsskala; förbättra vår mekanistisk förståelse av synen 3-10.
Den här artikeln förklarar hur in vivo intracellulära inspelningar från Drosophila R1-R6 fotoreceptorer och LMC utförs i Juusola laboratorium. Detta protokoll kommer att beskriva hur man konstruerar en lämplig elektro rigg, förbereda flugan, och utföra inspelningarna. Några representativa data presenteras, och några vanliga problem och möjliga lösningar diskuteras som kan uppstå vid användning av denna metod.
Protocol
Följande protokoll uppfyller alla riktlinjer djurskötsel vid University of Sheffield och Beijing Normal University.
1. Reagens och utrustning Förberedelse
- Inspelning och ljus stimulering utrustning Setup
- Välj åtminstone en 2,5 x 2,5 m inspelningsområde för att utföra elektrofysiologiska experiment i ett rum som har luftkonditionering med reglerad fuktighet och medel för att ge mörka inspelningsförhållanden. Se till att detta område är tillräckligt stor för att bekvämt passa en: (i) 1 x 1 m vibrationsisolering bord som rymmer riggen [flyga stimulering och registreringsapparat], stereo och en kall ljuskälla med två gås hals, alla inneslutna i en stora> 180 cm Faradays bur; (Ii) en 38U Imstrumenthållare för bostäder en persondator med en platt LCD-skärm, mikro förstärkare, LED-förare, filter, temperaturstyrningsenheter, oscilloskop och andra nödvändiga elektriska instrument; och (iii) enlitet skrivbord och en stol för utredaren.
- Placera riggen långt borta från elektriska och mekaniska bullerkällor, såsom kylskåp, centrifuger och hissar. Använd separata spänningsskydd för att skydda riggen elektriska apparater från spänningsspikar som inträffar i elnätet. Helst ansluta riggen till sin egen avbrottsfri strömförsörjning (UPS-batteri) för att minimera buller.
- Konstruera en konisk fly-innehavare av mässing och svart plast (Figur 2). Borra ett litet avsmalnande hål genom mässingsenhet med sin förträngning yttre kant till ~ 0,8 mm diameter (matcha en typisk flugans thorax bredd).
Notera: Detta hål behöver avsmalna mot spetsen av det fly-hållaren så att en större än genomsnittet Drosophila, som projiceras underifrån av luftflödet, skulle fastna skuldra-djup i överkanten. - Design och bygga en mekaniskt robust, men ändå exakt, flyga stimulering och registreringsapparat (Figur 3). Konstruera ut of aluminium eller mässing (hög ledningsförmåga metaller) en fluga förberedelse plattform pol och runt den en Cardan-armssystem, med inbäddade kullager, för att ge jämna och exakta x, y-positionering och låsning av ljus stimulans.
Obs! Detta integrerade sammansatta minimerar mekaniska vibrationer, som annars skulle kunna rubba inspelningen elektrodspetsen ut från den studerade cellen. Det kan vidare innefatta en Peltier-elementet baserade nära loop temperaturstyrsystem, så utredarna att använda temperaturkänsliga genetiska konstruktioner, såsom shibire TS, för att bedöma synaptiska krets beräkningar 9,30. Anodize apparaten eller måla det svart för att minimera ljus stimulans spridning.- Fäst flyga stimulering och registreringsapparat på antivibrations tabellens bakbord; till exempel genom M6-bultar, med hjälp av sina metriska skruvhålen. Använd en svart bakbord eller täcka den med svart tyg för att minimera ljusspridning under experiment.
- Position och lås (med hjälp av en låsskruv) en höj- och sänkbar fluga förberedelse plattform pol i mitten av en Cardan-armssystem. Placera fly-preparatet (inom fly-hållaren, se steg 2) på plattformen stolpe så att ljuskällan ansluten till Cardan-armen pekar radiellt till flugan huvud. Se till att mitten av flugan ögon är exakt vid skärningspunkten (0, 0) av Cardan-armens x- och y-axlarna, eftersom det möjliggör korrekta x, y-positionering av ljus stimulans till någon punkt inom flugans synfältet.
Obs: Denna funktion är nödvändig för att kartlägga svars egenskaper hos enskilda celler till specifika ögon platser, till exempel när du söker efter elektro bevis för strukturella anpassningar, såsom ljusa eller akuta zoner, vilket skulle visa att öka känsligheten eller upplösning, respektive 31.
- Montera stereo bakom flugan stimulering och registreringsapparat på anti-vibrationsbord såatt det ger bekväm hög förstoring visning av flugan ögat.
- Montera kall ljuskälla på toppen av mikroskop med ljuskällans dubbla huvud halvstyva svanhals ljusledare pekar nedåt mot flugan preparatet hållaren. Fritt rörlig två balk belysning gör det lättare att visualisera inspelningen elektrodspetsen vid körning den genom en liten öppning i flugan ögat.
- Fästa den tillhörande x, y, z-mikromanipulator set (grov och fin) för inspelningen elektroden och huvudet steg på anti-vibrationsbord, på höger sida av flugan stimulering och registreringsapparat, med hjälp av M6-bultar eller magnetisk står.
Obs: I Juusola laboratorium, olika riggar utrustade med olika manipulatorer; för detaljer se tabell av material och reagens. Dessa ger alla intracellulära inspelningar av hög kvalitet. - Montera en liten handbok 3-axlig mikromanipulator för referenselektrodhållare på höj- och sänkbara fly förberedelse plattform pol. Orientera referenselektroden så att den är riktad mot flugan preparatet.
- Konstruera en fristående ljus skärmad Faradays bur av stål-paneler runt anti-vibrationsbord, som omger flyga stimulering och registreringsapparat, för att förhindra yttre elektromagnetiska störningar. Låt framsidan av buren öppen, vilket ger tillgång till transporter flyga förberedelse för experimenten. Fäst svart tyg gardiner (med koppar- eller aluminium-mesh implanterade inuti dem för jord) på framsidan för att skydda ut ljud och ljus. Måla insidan av buren svart för att minimera ljusspridning och skruva fötterna på buren på golvet för att förhindra vibrationer.
- Anslut spännings- och strömutgångar för hög impedans intracellulär mikro förstärkare till ingångarna av två separata lågpassfilter (Bessel eller liknande) med BNC-kablar. Likaså ansluter filterutgångarna i lämpliga kanaler för AD-anslutnings blo deCKS / bräder som datainsamlingssystem (DA / AD-kort). Anslut DA / AD-kort (s) i en persondator av specialiserade kablar, enligt manualer leverantörs.
- Installera lämplig förvärvs mjukvara för datainsamling valfrihetssystem på persondatorn. Se till att de datainsamlings drivrutinerna är kompatibla med operativsystemet på persondatorn.
- Ground elektriskt flugan stimulering och registreringsapparat, Faradays bur, kopparnät (inom gardiner), mikroskop, micromanipulators, kall ljuskälla, 38U Imstrumenthållare med alla sina instrument (den intracellulära förstärkare, filter, temperaturkontroll enhet, PC och LCD-skärmen etc.) till en enda central jordpunkt genom att använda utrustning jordledningen och M6 pressringjordändar. Använd en elektrisk multimeter för att testa att alla delar är i samma mark.
Obs! För att uppnå bästa möjliga låg ljudnivå inspelningsförhållanden, jordkonfigurationerna varierar vanligtvis tillbakam en set-up till en annan.- Om så behövs, ansluter den centrala jordpunkt vidare till byggnaden marken, och / eller mikroelektrodförstärkarens centrala jord. Efter att ha testat den fullt fungerande system under verkliga elektrofysiologiska experiment, vara beredd att ändra jord konfiguration som behövs för att minimera brus i inspelningarna.
- Konfigurera programvara förstärkning (1 - 10X), signalfiltrering (typiskt lågpassfilter inställda på 500 Hz, som är lämplig för både R1-R6 och LMC data), och samplingsfrekvens (minst 1 kHz). Se till att inställningarna lyder Nyquist-Shannon Samplingsteoremet 32; till exempel när insamling av data som är låg-pass-filtreras vid 500 Hz, använda en samplingsfrekvens på 1 kHz eller högre för att minimera aliasing effekter.
- Som karakteristiska spännings svaren från R1-R6 fotoreceptorer är 40-65 mV, och de av LMC 20-45 mV, ställa in förstärkning och visa skalor för att ge de högupplösta sampling och datavisualisering.
Figur 2. Conical Fly-Hållare fly-hållaren är gjord av två delar:. Central mässing enheten och dess koniska svart plast päls. Det centrala hålet inuti mässingsenheten avsmalnar till en liten diameter som knappt låter flyga genom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Översikt över Elektro Rig. Upplägget innehåller en fristående ljus skärmad Faradays bur, anti-vibrationsbord, flugan stimulering och registreringsapparat, och svart tyg gardiner med koppar- eller aluminium-nät inne för grundstötning. instrument rack är elektriskt ansluten till samma centrala marken med all utrustning inne i Faradays bur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- fabricera Mikroelektroder
- Dra referensmikro från filamented borosilikatglas (ytterdiameter: 1,0 mm, innerdiameter 0,6 mm) eller kvartsglas (ytterdiameter: 1,0 mm, inre diameter 0,5, 0,6 eller 0,7 mm) slang med en pipett avdragare instrument. Försök att uppnå en kort gradvis avsmalning.
Obs: De exakta inställningar pipetten avdragare programmet varierar från instrument till instrument; mer information i tabellen för material och regenter. Porstorleken vid spetsen är inte avgörande eftersom spetsen på referenselektroden kommer att brytas innan den sätts in i flugan preparatet. - Dra inspelningsmikro från filamented borosilikatglas (ytterdiameter: 1,0 mm; innerdiameter 0,6 mm) eller kvartsglas (ytterdiameter: 1,0 mm, inre diameter 0,5, 0,6 eller 0,7 mm) slang med en pipett avdragare instrument. Försök att uppnå en lång (10-15 mm) fina gradvis avsmalning.
- Kontrollera med ett ljusmikroskop som inspelningselektrod visar rätt avsmalnande. Montera elektroden på ett objektglas med form lim och använda 40X luft mål att inspektera sin spets.
Obs: En bra elektrod avsmalnar jämnt tills dess osynligt liten spets, kring vilken kontinuerlig parallell mörkare och ljusare interferensmönster kan ses. Vissa avdragare inställningar genererar höga motståndselektroder, som inte kan ge framgångsrika cellgenomföringar eftersom deras tips likna "trumpeter". Därför krävs ett visuell inspektion av elektroderna. - Fäst elektroderna horisontellt på en stor petriskål med modellera (eller liknande formbara lim) för förvaring och transport till elektrofysiologi riggen. Säkerställa att elektrodspetsarna enre alltid i luften och inte av misstag vidrör något.
- Back-fylla inspelning och referenselektroderna strax före experimentet med den lämpliga saltlösningen. Använda en liten 5 ml spruta som är ansluten till en liten partikelfiltret med en fin plastspets (såsom en micro).
- För fotoreceptorer experiment fylla inspelningen elektroden tills full (en droppe bildar i sin stora änden) med 3 M KCl som denna lösning minimerar effekten av vätske korsning potential till den inspelade spänning.
- För att undersöka histaminerga LMC, som svarar på synaptiska input från R1-R6 fotoreceptorer av klorid konduktans förändringar, fylla inspelnings elektroder med 3 M kaliumacetat och 0,5 mM KCl, eftersom denna lösning har mindre effekt på cellens klorid batteri. Fyll referenselektroden med fly Ringer, innehållande i mM: 120 NaCl, 5 KCl, 10 TES (C 6 H 15 NR 6 S), 1,5 CaCl2, 4 MgCl2, och 30 sackaros
- Testa motståndet av en nyligen drog inspelningen elektroden i registreringssystemet.
- Se till att silvertrådar inuti elektrodhållare är jämnt belagd med silverklorid (visas lila-grå - inte blanka silver) för att minimera inspelnings artefakter (såsom drift i korsningen potential). Om inte, ersätta dem med rätt chloridized trådar.
- Om det behövs, chloridize nya silvertrådar. Rengör försiktigt trådarna (genom att snabbt passera dem genom en flamma) så att dessa ljusare silver i färg. Undvik att röra vid dem med fingrarna, för att sätta på ett jämnt lager av AgCl. Blöt trådarna i full styrka blekmedel i 15 - 30 min tills de verkar lila-grå färg. Alternativt elektroplätera varje tråd (genom att göra den positiv i förhållande till en lösning innehållande 3 M KCl och passerar en ström genom den med en hastighet av 1 mA / cm 2 av ytarean) för 10-15 sek tills adekvat beläggas. Anslut återfyllas inspelning och referenselektroder till deras elektrodhållare. Placera en liten Ringers lösning bad på höj- och sänkbar flyga förberedelse plattform pol. Driva elektrodspetsarna i Ringers lösning och mät den registrerande elektroden spets motstånd.
Obs: Det här steget behövs endast när man testar de resistiva egenskaperna hos elektroder, som dras från ett nytt parti av glasrör, eller när optimera mikro avdragare instrument program genom iteration. - Innan du utför mätningarna motstånds, läs instruktionerna i förstärkaren tillverkning bruksanvisning för rätt inställningar mätnings. För en bra inspelning elektrod, har ett tips resistans ~ 100-220 MQ.
- Dra referensmikro från filamented borosilikatglas (ytterdiameter: 1,0 mm, innerdiameter 0,6 mm) eller kvartsglas (ytterdiameter: 1,0 mm, inre diameter 0,5, 0,6 eller 0,7 mm) slang med en pipett avdragare instrument. Försök att uppnå en kort gradvis avsmalning.
2. Drosophila Framställning
- Samla 5 - 10 dagar gamla flugor (efter eclosion) och placera dem i en ren fluga rör innehållande stAndard mat. Det är möjligt att uppnå goda inspelningar från yngre flyger också, även från de "nyfödda"; men på grund av deras mjukare ögon, skära en hornhinnan öppning för inspelningen elektroden är svårare.
- Konstruera en fluga fånga rör och en fluga beredning stå (Figur 4). Se figur 4 för den allmänna uppfattning om hur dessa self-made verktyg sattes ihop.
- För att göra en fluga fånga rör, avskurna spetsen av 50 ml centrifugrör av plast koniska botten. Därefter sätter och limma den stora änden av ett ml pipettspetsen på denna nya öppning.
- Slutligen, skär den smala änden av pipetten till en storlek som lätt låter en fluga att gå igenom. Konsultera en mekanisk verkstad för att montera en liten fluga och planeringsstadiet som möjliggör två-axlar rotation och låsning av svänghållaren till olika positioner.
Figure 4. Verktyg och Devises behövs för att tillverka den Fly Preparation. Fly fånga röret är tillverkat genom limning en 1 ml plast pipettspetsen till ett 50 ml centrifugrör av plast. Skräddarsydda flyga förberedelse stand möjliggör fri rotation och låsning av flugan hållaren i ett föredraget läge för att förbereda flugan. Flugan är fixerad med bivax, med hjälp av elektriska vax-värmare. Vaselin appliceras med en liten applikator gjord genom att ansluta en tjock slags hår på ett handtag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Samla en fluga för experimentet i en 1 ml pipettspets, som knappt gör en fluga för att passa igenom. Fäst flyga fånga röret med pipettspetsen på det, till flugan röret. I att fånga en fluga, dra nytta av deras inneboende tendens att klättra uppåt (antigravitaxis) in i pipettspetsen. Företrädesvis väljer den största kvinnliga, som storlek materiasi elektrofysiologi.
Obs: Ju större farten, desto större dess celler och desto större chans för intracellulära inspelningar av hög kvalitet. Mindre flugor (både honor och hanar) kan också ge utmärkta inspelningar, men preparatet är svårare att göra. När flugan är fångade i en stor pipettspets, kom ihåg att stänga flyga röret för att stoppa andra flugor från att fly. - Ansluta en 100 ml spruta med en flexibel plastslang till den större öppningen av pipettspetsen - med fluga fortfarande i den.
- Placera den smala änden på den stora pipettspetsen, som förstoras bara för att låta en Drosophila genom att öppningen i botten på fly-hållaren och pressa en liten mängd luft från sprutan för att mata ut flugan i farten hållaren .
- Titta igenom stereo och försiktigt administrera mer luft tills flugan huvud sticker ut från den koniska änden av fly-hållaren. Se till att flugan är ordentligt instängd från sin bröstkorgen till den lilla OPEning på toppen av fly-hållaren.
- Använd ett vax värmare för att fästa flugan med bivax från sina "axlar" till fly-hållaren. Justera temperaturen för vaxet värmaren för att vara så låg som möjligt men ändå rent smältning av vax.
Obs: När temperaturen är korrekt visas transparent vax. Alltför hög temperatur gör vaxet "bränna bort"; för låg håller vaxet stel. Vid fastställandet fluga, vara korrekt och kort som långvarig värmeexponering kan skada den. Med ljus cured tandvård lim rekommenderas inte här som dess tillämpning är för långsam.
Figur 5. Förbereda Fly för in vivo. Vänster, A Drosophila huvud är placerat rakt i fly-hållaren och fixeras från sin snabel, höger öga och axlar till fly-hållaren med uppvärmd vareeswax. Höger, En liten öppning skärs i den tjockaste delen av ögat, precis ovanför ekvatorn och endast ett fåtal ommatidia bort från baksidan nagelband, med hjälp av en vass rakkniv kant. En bit av hornhinnan är försiktigt bort och hålet tätas med vaselin för att förhindra ögat från att torka upp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Immobilisera flugan huvud. Applicera bivax till snabel (Figur 5) och i hörnet av det högra ögat, undvika hornhinnan, och fixera huvudet från dessa punkter till fly-hållaren.
- Producera en mikro-kniv. Klämma en icke-rostfritt stål rakblad med två bladhållare / brytare (båda med platt grepp) och knäcka en liten remsa av dess skarpa kant. För hälsa och säkerhet, använder glasögon för ögonskydd (även om det är högst osannolikt att bitar skulle studsa när rakhyveln är sprucken). Helstproducera en skarp rakkniv kant som liknar en spira. Se till att detta "spiran" är fast förbunden med bladhållaren, men var noga med att undvika skada sig själv!
- Använda mikro kniv, förbereda en liten öppningsstorlek av få ommatidia i farten vänstra öga - på cirka 4-5 ommatidia från rygg nagelbanden strax ovanför ögats ekvator att ge passage för inspelning mikroelektrod. Utför under ett stereomikroskop, tittar preparatet med hög förstoring.
Obs! Eftersom flugan ögat känns elastisk och motståndskraftiga mot sondering, är hålet bästa snittet med en "spira" -knife. Skärtekniken är ganska krävande, så ägna uppmärksamhet åt videodemonstration. Att hålla farten hållaren i vissa orienteringar (i farten förberedelse stativ) kan göra dissektion lättare. Inledningsvis kan mikro kännas svårt att lära sig, men när begåtts, neurala anpassning gradvis förbättras utredarens 3D-uppfattning och fingerfärdighet. - REFlytta noggrant liten bit av hornhinnan från den öppning som bara klipptes, utsätta näthinnan under. Snabbt täcka hålet i ögat med en liten klump av vaselin med hjälp av fint hår av vaselin applikator.
Obs: Vaselin tjänar flera roller här. Det förhindrar vävnads uttorkning och koagulering av hemolymfa som skulle bryta den infogade inspelningen elektroden. Det är också för övrigt rockar mikroelektroden, vilket minskar dess intramural kapacitans. Detta kan förbättra frekvenssvaret hos registreringssystemet, och så den temporala upplösningen av de inspelade neurala signaler. Undvika smetning vaselin över resten av ögat som detta suddar optiken.
3. Inspelning från R1-R6 Fotoreceptorer eller LMC
- Alltid vara jordad vid drift av mikro förstärkare (till exempel genom att trycka på metallytan av Faradays bur eller anti-vibrationsbord), eftersom detta hindrar en från att oavsiktligt levereraing en statisk laddning till huvudet steg, vilket kan skada kretsen.
- Belysa flyga förberedelse plattform pol från ovan av två svanhals ljusledare (figur 6A) (med den kalla ljuskällan inuti Faradays bur) så att flugan innehavaren kan placeras på stolpen i önskad position under noggrann visuell kontroll .
Figur 6. Placering av Fly-hållaren och elektroderna för experimenten (ab) fly-hållaren placeras på inspelnings plattform som också ger temperaturkontroll via ett Peltier-element (A: vit rund plattform i mitten).. Den Cardan-armen möjliggör exakt positionering av Ijusstimulus på samma avstånd (via x, y-rotation) runt i farten, med ljuskällan (en vätska eller kvartsfiberoptisk bunt ände) direkt pekar på dess öga. I många av our riggar är lätt stimulering genereras av lysdioder (med linjära ström-förare) eller genom en monokromator. Således, deras stimuli bära en viss (band passerat) spektrala innehåll, vald mellan 300-740 nm och täcka 4-6 log intensitet enhet intervall (som dämpas av separata neutrala täthetsfilter). (C) Två mikroelektroder, som kontrolleras av separata micromanipulators, är placerade i farten huvudet: referenselektroden (ovan) genom ocelli; inspelningen elektroden (till vänster) genom den lilla öppningen i vänster öga. (D) För att erhålla ett maximalt antal fotoreceptor inspelningar, är inspelningsmikro drivs in i hålet, parallellt med snabel-ocellus axel. När elektrodspetsen penetrerar och tätningar till en ljusmätare, är fritt roterbara ljuskälla fixerad till den position där cellen producerar den maximala spänningen svar på en given Ijusstimulus. Denna punkt i rymden ligger i centrum av cellens receptiva fält. Om hålet is nära nagelbanden, LMC genomföringar kan dessutom åstadkommas med samma elektrod vinkel (till vänster). Om hålet är längre bort från nagelbanden, till en annan användbar elektrod vinkel erhålla LMC inspelningar visas också (till höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Montera fly-hållaren (med flugan i det!) I farten förberedelse plattform pol. Vrid fly-hållaren så att flugan vänstra öga är direkt inför utredaren (Figur 6B).
- Sätt den trubbiga referenselektrod försiktigt genom flugans Occelli i huvudet kapseln med hjälp av en liten grov mikromanipulator med iakttagande preparatet genom stereomikroskop (Figur 6C). Skjut inte elektroden för djupt, eftersom det kan skada flugan hjärnan.
- Alternativt inför referens elektroden i baksidan av bröstkorgen. Alltid se till att flugan verkar heathy (flyttar sitt antenner) och dess ögon är intakta; inte av misstag skadas. Om beredningen ser mindre än immaculate, förbereda en ny fluga för experimenten.
- Kör den kraftiga inspelningsmikro i vänster öga genom vaselin täckt liten öppning beredd tidigare. Använd hög förstoring i stereomikroskop och flytta ljusledarna och fokalplanet så att elektrodspetsen läge blir tydligt i 3D av dess reflektionsmönster.
Obs: Figur 6D visar hur flugan huvud bör placeras något annorlunda (i förhållande till vinkeln inspelningsmikro in i ögat) för ljusmätare och LMC inspelningar. Drivning av elektroden in i ögat utan att bryta det är den svåraste fasen av experimentet. Om elektrodspetsen missar den lilla öppningen i ögat, slå i hornhinnan, det bryter typiskt. - Slå på mikroförstärkarenNär båda elektroderna är ordentligt inne i beredningen, i elektrisk kontakt med flugans kroppsvätskor.
- Stäng av kalljuskällan (inuti Faradays bur) och koppla bort den från elnätet. Anslut kontakten till den centrala marken för att minimera markslinga inducerad elektriskt brus, och flytta svanhalsljusledare bort så att Cardan-armsystemet kan fritt flyttas runt i farten. Släck rummet ljus för att säkerställa att flyga preparatet är nu i relativ mörker.
- Mät motståndet i inspelningen elektroden i ögat (enligt instruktionerna i förstärkarens bruksanvisning). Använd endast inspelning elektroder där motståndet är 100-250 MQ.
Obs: Det är praktiskt taget omöjligt att uppnå intracellulära inspelningar av hög kvalitet med <70 Mohm elektrod. Om resistansen är <80 Mohm, är det sannolikt att elektrodspetsen är bruten. I detta fall, stänga av förstärkaren och ändra inspelningen elektroden.- När elektrodenbyts ut och i ögat, slå på förstärkaren för att mäta dess motstånd. Ibland kan elektrodspetsen blockeras av några detritus när den kommer in i vävnaden. Detta kan avhjälpas genom att använda förstärkarens kapacitiva surr och strömpuls funktioner som normalt klart det genom snabb resonans eller repulsion.
- Ställ förstärkaren till strömklämma (CC) eller bro inspelningsläge. Neutralisera någon godtycklig spänningsskillnad mellan tagnings- och referenselektrod, eftersom båda av dem är nu vilar i elektriskt förbundna extracellulära utrymmet, genom att ställa in signalen offset (inspelning spänning) till noll. Följ signal offset ändringarna med förstärkarens display avläsning eller ett oscilloskop skärm.
- Vänta 2-3 minuter för flugan ögat till mörk anpassa sig.
- Kör inspelningen elektrodspetsen gradvis djupare in i ögat med små 0,1 till 1 mikron steg. Gör detta med ett x-axeln piezo-steg av en fjärrstyrd mikromanipulator eller by försiktigt vrida fin upplösning knoppen på en manuell manipulator.
- Stimulera flugan ögat med kort (1-10 ms) blinkar som inspelnings elektrod förs fram i vävnaden.
Obs: Om inspelningen elektroden är placerad i näthinnan och ögat fungerar normalt, kommer varje ljusblixt orsaka en kort och liten droppe i spänning (0,2-5 mV hyperpolarisering), kallad elektroretinogram (ERG). Denna förändring i fältpotentialen av det extracellulära utrymmet är orsakad av de retinala celler 'gemensam reaktion på ljus. Men när elektrodspetsen in i lamina, stängning på LMC, ERG vänder, visar depolariserande svar. - Flytta ljuskällan runt flugan ögat med hjälp av Cardan-armssystem och hitta positionen där ljuset väcker den största ERG svar.
Obs: Denna position markerar det lilla området i den visuella utrymme där fotoreceptorer (eller LMC), som är belägna intill spetsen på inspelningen elektroden, Prova deras ljus ingång. - Penetrera en cell med inspelningen elektroden.
Obs: Penetrationen kan uppstå spontant eller när elektroden är mikro steg fram. Det kan underlättas ytterligare genom att försiktigt trycka på mikromanipulator systemet eller genom att använda telefonen-funktion på förstärkaren; dessa åtgärder resonans elektrodspetsen i vävnaden. När elektroden spetsar fotoreceptorn membranet, in i sitt intracellulära utrymme, spänningsskillnaden mellan inspelningen och referenselektroden faller plötsligt från 0 mV till ~ -65 mV (mellan -55 och -75 mV); medan under LMC genomföringar är typiskt mindre (mellan -30 och -50 mV) denna minskning. Dessa spänningsskillnader representerar de negativa vila potentialer de givna cellerna. Beroende på kvaliteten på inspelningen elektroden (skärpan) och cellulär process det trängde kan spänningsavläsningen från inspelningen elektroden stabilisera snabbt eller gradvis till vilopotential, såsom cellmembranettätningar till det yttre lagret av elektroden. Men om penetrationen är endast delvis eller dålig, glider elektroden typiskt ut ur cellen med den inspelade potentiella klättring tillbaka mot noll. - Lokalisera mitten av penetrerade cellens receptiva fält när elektroden visas korrekt förseglad, visar stabil membranpotential (mörk vilopotential). Flytta blinkande ljus stimulans runt flugan ögat med hjälp av Cardan-armsystemet, att hitta den punkt i visuell rymd, där ljusblixt väcker cellens maximala spänningssvar. Lås Cardan-armen när ljuset stimulans ansikten direkt (punkter) den receptiva fält centrum.
Obs: I mörker, Drosophila fotoreceptorer svara på ljusa ljuspulser med 40 - 65 mV depolariserande spänningssvar 4,5, medan stabila LMC inspelningar visar 20 till 45 mV hyperpolariserande svar 9,10,14. Glia genomföringar kan inträffa sällan, vilket indikeras av <-80 mV vila potentialer och mycket långsammareoch mindre (~ 5 mV) mättade ljus inducerade depolarisationer. Fotoreceptorer i Drosophila med olika ögonpigmenteringar, såsom vit-eye 7 och cinnober, visar jämförbara responsstorlekar till vildtyp. - Använda förstärkarens strömklämma (CC) läget kompensera inspelningen elektroden kapacitans genom att injicera små 0,1 nA och kort (100-200 ms) strömpulser i den studerade cellen för att minimera inspelning artefakter under dess membran laddning.
Obs: Denna viktiga proceduren förklaras i detalj i förstärkarens instruktionsboken, och bör praktiseras med en elektrisk cell modell innan den verkliga experiment. - Spela spännings svar på ljuspulser och andra stimuli av intresse, med varierande statistiska eller fysiska egenskaper (t.ex. naturljusintensitet tidsserier eller slumpmässiga kontrastmönster). Test, till exempel hur de inspelade svaren förändras med ljus- eller mörk anpassning.
Obs: Man kan exakt light-anpassa den studerade cellen genom kontinuerlig ljus förvalda intensitet genom att tillsätta neutrala täthetsfilter på ljusvägen 4,5. Alternativt, för långvarig mörk anpassning släcka ljuset stimulans under en förinställd tid. På grund av den mekaniska stabiliteten hos registreringssystemet, den höga kvaliteten på inspelningen elektrod och intactness av preparatet, stabila inspelningsförhållanden kan ibland pågå i många timmar. Således, på en bra dag, är det möjligt att samla in en stor mängd data vid olika Anpassning av villkor från en enda cell. När elektroden glider ut ur cellen, de inspelade svar minskar och den genomsnittliga spänningen börjar att närma sig noll. - Advance noggrant inspelningen elektroden med den fina x-axeln styrning av mikromanipulator tills elektroden kontakt och tränger nästa cell (detta är vanligtvis den närmaste neurala granne). Flytta inte elektroden längs y eller z-axeln eftersom dessa manövrar skulle göra elektroden "plgrundlig vävnaden "i sidled, skadar ögat strukturer!
Obs: Med en bra elektrod och en hälsosam beredning kan en spela in höga responser kvalitet från många fotoreceptorer (men sällan från många LMC) i samma farten under en period av flera timmar; ibland under hela arbetsdagen (> 8 timmar) utan tydlig signal försämras. - Spara datafiler med jämna mellanrum med identifierande information, såsom datum, genotyp och den inspelade celltyp. På grund av den stora mängd data som kan samlas i en lyckad inspelning, hålla bra skriftliga anteckningar i ett labb-bok för framtida dataanalys.
Representative Results
Den kraftiga mikroinspelningsmetod, anpassad här för Drosophila ögat, kan användas för att på ett tillförlitligt sätt mäta neurala informations provtagning och behandling i näthinnan och lamina celler och kommunikation mellan dem 4,5,7,8,10,33. Genom att använda den för att studera kodning i olika vildtyp lager, mutanter eller genetiskt manipulerade flyga stammar har metoden visat sitt värde; inte bara i att kvantifiera effekterna av en mutation, temperatur, kost eller valda uttryck 3,4,6,9,10,14,30,34, men också i att avslöja mekanistiska skäl för förändrade visuella beteenden 14,34. Metoden är också lätt tillämpas på andra insektspreparat 35,36, bemyndiga neuroethological visionsstudier. Nästa vi visa några exempel på dess framgångsrika tillämpningar.
Figur 7. SpänningSvaren från en fruktfluga R1-R6 fotoreceptorn till en ljuspuls vid 20 och 25 ° C. Eftersom de skarpa mikroelektrodgenomföringar är ofta mycket stabil, är det möjligt att registrera spänningssvar av samma R1-R6 fotoreceptorn till en given ljus stimulus vid olika omgivningstemperaturer genom att värma eller kyla i farten. I våra uppställningar, är fly-hållaren placeras på en nära-loop Peltier-elementet baserad temperaturstyrsystem. Detta gör det möjligt för oss att ändra flugans huvud temperatur på bara några sekunder. Högre temperatur accelererar spännings svaren och karakteristiskt sänker vilopotential av R1-R6 fotoreceptorer (som indikeras med röda pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Att studera effekten av temperaturen på fotoreceptor utgång
° C (Figur 7). Som kvantifieras före 4,9, sänker uppvärmningen en ljusmätare för vilopotential i mörker, och accelererar dess spänning svar.
Figur 8. Signaling Performance en fruktfluga R1-R6 ljusmätare Förbättrar med ljusintensitet (A) ljusmätare utgång till dim (nedan) och ljusa. (Ovan, 10.000 gånger starkare ljus) upprepade naturljusintensitet tidsserier registrerats av samma mikroelektrodeni samma cell vid 20 ° C Svar på den ljusa stimulans är större, eftersom de integrerar fler prover, elementära svar (stötar) till enskilda fotoner 4,5,7,8. (B) 20 på varandra följande en sekund långa spännings svar överlagras. Individuella svar (ljusgrå) togs efter de adaptiva trender (pil i A) hade dragit sig tillbaka (streckad ruta i A). Motsvarande svarsorgan (signalerna) är mörkare spår. Skillnaden mellan signalen och de individuella responser är bullret. (C) Cellerna 'signaleringsprestanda kvantifierades genom de inspelningar' Signal-till-brusförhållanden (SNR) med användning av de standardmetoder 4,5,7,8. Ljusmätare utgång har ca 64 Hz bredare tillförlitlig signalering på den ljusa stimulering (SNR "Bright ≥1, upp till 84 Hz) än vid dim (SNR" Dim ≥1, upp till 20 Hz), med signal-brus-förhållande förbättras avsevärt; från SNR Dim MAX = 87 till SNR Bright MAX = 1868. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Studera Anpassning och Neural Encoding genom upprepad stimulering
Den noninvasiveness av metoden, vilket orsakar relativt lite skador i näthinnan och lamina strukturer, gör den idealisk för att studera signalering prestanda för individuella celler till olika ljusstimuli i deras nära naturliga fysiologiska tillstånd in vivo. I figur 8 visas spänningssvaren från en R1- R6 fotoreceptorn till en mörk och ljus upprepas naturalistiska ljusintensitet tidsserier stimulans vid 20 ° C, medan figur 9 ° C Pre- och postsynaptiska inspelningar utfördes separat från två olika flugor, eftersom samtidiga intracellulära inspelningar av två skarpa microelectrodes i samma fluga, en i näthinnan och den andra i lamina, är alltför svårt att vara livskraftig 30.
Figur 9. Spännings svar av en fruktfluga R1-R6 ljusmätare och LMC till Upprepad Naturalistic stimulering vid 25 ° C (A) R1-R6 (grå) och LMC (svart) utgångar registreras av olika mikroelektroder från olika flugor. (B) Helt lätt anpassas 20 i rad före (ovan) och postsynaptiska (nedan) svar på samma natur stimulans mönster med individuella svar, som visas i ljusgrå end motsvarande svarsorganet (signalerna) som de mörkare spåren. Skillnaden mellan signalen och de individuella responser är bullret. (C) Cellerna 'signaleringsprestanda kvantifierades genom de inspelningar' Signal-till-brusförhållanden (SNR). LMC utgång har cirka 10 Hz bredare tillförlitlig signalering (SNR 'LMC ≥1, upp till 104 Hz) än R1-R6-utgång (SNR' R ≥1, upp till 94 Hz). Både signal-brusförhållanden är höga (SNR LMC MAX = 142, SNR Rmax = 752), och som inspelnings buller var låg, deras skillnader återspeglar faktiska kodningsskillnader mellan cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter stimulans debut, inspelningarna typiskaly visar snabbt anpassa trender som till stor del avta inom 5-6 sek. Från och med då, cellerna producerar mycket konsekvent svar på varje 1 sekund lång stimulans presentation (varje prickad låda omsluter 20 av dessa). Repeterbarheten av svaren blir uppenbart när dessa överlagras (Figur 8B och figur 9B). Individuella svar är de tunna grå spår, och deras betyder tjockare mörkare spår. Den genomsnittliga reaktionen tas som den neurala signalen, medan den neurala brus är skillnaden mellan medelvärdet och varje individuellt svar 4,5,9,37,38. Respektive signal-brusförhållanden i frekvensdomänen (figur 8C och figur 9C) erhölls genom Fourier-transformering signal- och brus data bitar i effektspektra, och dividera den genomsnittliga signaleffekten spektrum med motsvarande medelbruseffektspektrumet 4, 5,9,37,38. Karakteristiskt de maximala signal-till-brusförhållanden of inspelade neurala utgångar till natur stimulering är höga (100 - 1000), och i de mest stabila preparat med mycket låg inspelnings buller kan nå värden >> 1000 (t.ex. figur 8C.). Lägg också märke till att uppvärmningen expanderar cellernas bandbredd tillförlitlig signalering 4 (SNR "Bright ≥ 1); till exempel, den relativa skillnaden mellan de två R1-R6s i fig 8 och 9, respektive, är 10 Hz (84 vid 20 ° C och 94 Hz vid 25 ° C).
Man kan vidare uppskatta varje cells hastigheten för informationsöverföringen från dess signal-brusförhållande med hjälp av Shannon ekvation 32, eller genom att beräkna skillnaden mellan de svar 'entropi och brus entropi hastigheter genom trippelextrapoleringsmetoden 39. Mer information om informations teoretiska analyser, och deras användning och begränsningars speciellt med denna metod ges i tidigare publikationer 7,8,39.
Figur 10. Spännings svar av en Killer Fly R1-R6 ljusmätare och LMC till Upprepad Naturalistic stimulering vid 19 ° C (A) R1-R6 (grå) och LMC (svart) matar in av samma mikroelektroden från samma fly; första postsynaptiskt och senare presynaptiskt, som elektroden fördes fram i ögat. (B) 20 i rad före (ovan) och postsynaptiska (nedan) svar (ljusgrå spår) till samma natur stimulans mönster fångades efter initial anpassning (streckad ruta i A). Deras sätt är signalerna (de mörkare spår på toppen), medan deras respektive skillnader i de enskilda svaren ger buller. (C) Motsvarande Signal-till-brusförhållanden (SNR) beräknades som i figurerna 8C och 9C. LMC utgång har ungefär en 100 Hz bredare utbud av tillförlitlig signalering (SNR 'LMC MAX ≥1, upp till 234 Hz) än R1-R6-utgång (SNR' R MAX ≥1, upp till 134 Hz). Både signal-brusförhållanden är höga (SNR LMC MAX = 137, SNR Rmax = 627), och som samma mikroelektroden användes i inspelningarna, deras skillnader återspeglar faktiska skillnader i pre-och postsynaptiska nervutgångar. Dessa resultat antyder att registreringssystemet hade lågt brus, och dess inverkan på de analyser som var marginell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Neuroethological Vision Studier Metoden kan också användas för att spela pre-och postsynaptiska spännings svar från de sammansatta ögonen på olika insektsarter 7,8,35,36 (Figur 10), som möjliggör jämförande neuroethological studier av visuell information bearbetning. För den presenterade registreringssystemet är det enda som krävs anpassning nya beredningsinnehavare, var och en med en lämplig storlek öppning för de studerade arterna. Dessa exempel på inspelningar är från en kvinnlig mördare flyga (coenosia attenuata). De visar intracellulära spänningssvaren från en R1-R6 fotoreceptorn och LMC till identiska repetitiva ljus stimulering, som används för de Drosophila-motsvarigheter i fig 9, men vid 19 ° C I detta fall var både pre- och postsynaptiska uppgifter som registrerats från samma fluga; en efter den andra, med samma inspelningen elektroden (fylld med 3 M KCl) först framåt genom den laterala lamina innan angeing front näthinnan. I jämförelse med de Drosophila-data vid 25 ° C, den Coenosia Data - även vid den svalare temperatur - visar svar med snabbare dynamik; utöka antalet instrument för tillförlitlig signalering (signal-brusförhållande >> 1) över ett bredare frekvensområde. Sådana funktionella anpassningar i neurala kodning av naturalistiska stimuli är förenliga med Coenosia s rovdjurs livsstil 36, som kräver hög precision Spatiotemporal information uppnå snabba flygjaktbeteenden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope for making the fly preparation | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN30x-H/22 | Capable of ~150X magnification with long working distance; bespoke heavy steel table mount stand |
| Stereomicroscope in the intracellular set-up | · Olympus | Olympus SZX7; eyepieces: WHN30x-H/22 | 30X eyepieces are needed for seeing the electrode tip reflections well when driving it through the small corneal hole into the eye |
| Nikon microscope | Nikon SMZ645; eyepieces: C-W30x/7 | ||
| Anti-vibration Table | Melles Griot | With metric M6 holes on the breadboard | Our bespoke rigs have a large hole drilled through the thick breadboard that lets in the fly preparation platform pole (houses a copper heatsink with electronics) from below |
| Newport | |||
| Micromanipulators | Narishige | Narishige NMN-21 | In our intracellular set-ups, different micromanipulator systems are used for driving the shap recording electrodes into the fly eye. All the listed manipulators are succesfully providing long-lasting stable recordings from Drosophila photoreceptors and LMCs. |
| Huxley Bertram | Huxley xyz-axis with fine manual control | ||
| Sensapex | Sensapex triple axis | ||
| Märzhäuser | Märzhäuser DC-3K with additional x-axis piezo stepper and MS 314 controller | ||
| Magnetic Stands | Any magnetic base with on/off switch will do | For example, to manage cables inside the Faraday cage | |
| Electrode Holders | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3 - 0.5 mm diameter; needs to be chloridized for the electrode holders |
| Fiber Optic Light Source | Many different, including Olympus | ||
| Fiber Optic Bundles | UltraFine Technology | To deliver the LED light stimulus to the Cardan arm system. We use both liquid and quartz light guides (range from UV to IR) | |
| Thorn Labs | |||
| Fly Cathing Tube | P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Pack of 100 Pcs | Cut the conical bottom off from 50 ml Plastic Centrifuge Tube and glue a 1 ml pipette tip on it. | |
| Digital Acquisition System | National Instruments | ||
| Single-electrode current/voltage-clamp microelectrode amplifier | npi SEC-10LX | http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html | Outstanding performer! |
| Head-stage | Standard (+/- 150 nA) | For npi SEC-10LX | |
| LED light sources and drivers | 2-channel OptoLED (Cairn Research Ltd., UK) | Many of our stimulus systems are in-house built | |
| Self-designed and constructed | |||
| Acquisition and Analyses Software | Many companies to choose from | Biosyst; custom written Matlab-based system for experimental and theoretical work in the Juusola laboratory | |
| Personal Computer or Mac | Ensure that PC or Mac is compatible with data acquisition system and software | ||
| Cardan arm system | Self-designed and constructed | Providing accurate x,y,z-positioning of the light stimuli | |
| Peltier temperature control system | Self-designed and constructed | ||
| Faraday Cage | Self-constructed | Electromagnetic noise shielding | |
| Filamented Borosilicate Glass Capillaries | Outer diameter: 1 mm | ||
| Inner diameter: 0.5 - 0.7 mm | |||
| Filamented Quartz Glass Capillaries | Outer diameter: 1 mm | ||
| Inner diameter: 0.5 - 0.7 mm | |||
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-2000 laser Flaming/Brown Micropipette Puller | For borosilicate reference electrodes, use the preset program #11 (patch electrodes): Heat = 350; Filament = 4; Velocity 36; Delay = 200).1.2.1). For borosilicate recording electrodes, use the preset program #12 (this typically pulls good conventional sharps for photoreceptor recordings): Heat = 355; Filament = 4; Velocity 50; Delay = 225; Pull = 150. For LMC recordings, which require electrodes with finer tips, these values need to be adjusted. For pulling quartz capillaries, P-2000 manual suggests programs for fine tipped microelectrodes. These programs’ preset parameters serve as useful starting points for systematic modifications to generate electrodes with good penetration success and low recording noise. |
| Extracellular Ringer Solution for the reference electrode | Chemicals from Fisher Scientific | 10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sucrose | See the recipe in the protocol section |
| 3 M KCl solution for filling the filamented recording microelectrode | Salts from Fisher Scientific | 10010310, KCl | |
| Petroleum jelly | Vaselin | ||
| Non-stainless steel razor blades | |||
| Blade holder/breaker | Fine Science Tools By Dumont | 10053-09 | 9 cm |
| Blu-tack | Bostik | Alternatively, use molding clay | |
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
References
- Meinertzhagen, I. A., O'Neil, S. D. Synaptic Organization of Columnar Elements in the Lamina of the Wild-Type in Drosophila-Melanogaster. J Comp Neurol. 305, 232-263 (1991).
- Rivera-Alba, M., et al. Wiring Economy and Volume Exclusion Determine Neuronal Placement in the Drosophila Brain. Curr Biol. 21, 2000-2005 (2011).
- Abou Tayoun, A. N., et al. The Drosophila SK Channel (dSK) Contributes to Photoreceptor Performance by Mediating Sensitivity Control at the First Visual Network. J Neurosci. 31, 13897-13910 (2011).
- Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosphila photoreceptors: II. Rising temperature increases the bandwidth of reliable signaling. J Gen Physiol. 117, 27-41 (2001).
- Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosophila photoreceptors: I. Response dynamics and signaling efficiency at 25 degrees. C. J Gen Physiol. 117, 3-25 (2001).
- Pantazis, A., et al. Distinct roles for two histamine receptors (hclA and hclB) at the Drosophila photoreceptor synapse. J Neurosci. 28, 7250-7259 (2008).
- Song, Z., Juusola, M. Refractory sampling links efficiency and costs of sensory encoding to stimulus statistics. J Neurosci. 34, 7216-7237 (2014).
- Song, Z., et al. Stochastic, Adaptive Sampling of Information by Microvilli in Fly Photoreceptors. Curr Biol. 22, 1371-1380 (2012).
- Zheng, L., et al. Feedback network controls photoreceptor output at the layer of first visual synapses in Drosophila. J Gen Physiol. 127, 495-510 (2006).
- Zheng, L., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye I Dynamics. Plos One. 4, (2009).
- Hardie, R. C., Juusola, M.
- Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35, 827-841 (2002).
- Wernet, M. F., et al. Homothorax switches function of Drosophila photoreceptors from color to polarized light sensors. Cell. 115, 267-279 (2003).
- Wardill, T. J., et al. Multiple Spectral Inputs Improve Motion Discrimination in the Drosophila Visual System. Science. 336, 925-931 (2012).
- Hardie, R. C. Progress in Sensory Physiology. Ottoson, D. 5, Springer. 1-79 (1985).
- Borst, A. Drosophila's View on Insect Vision. Curr Biol. 19, 36-47 (2009).
- Kirschfeld, K. Die Projektion Der Optischen Umwelt Auf Das Raster Der Rhabdomere Im Komplexauge Von Musca. Exp Brain Res. 3, 248-270 (1967).
- Morante, J., Desplan, C. Photoreceptor axons play hide and seek. Nat Neurosci. 8, 401-402 (2005).
- Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R.
- Shaw, S. R.
- Joesch, M., Schnell, B., Raghu, S. V., Reiff, D. F., Borst, A. ON and OFF pathways in Drosophila motion vision. Nature. 468, 300-304 (2010).
- Clark, D. A., Bursztyn, L., Horowitz, M. A., Schnitzer, M. J., Clandinin, T. R. Defining the Computational Structure of the Motion Detector in Drosophila. Neuron. 70, 1165-1177 (2011).
- Rister, J., et al. Dissection of the peripheral motion channel in the visual system of Drosophila melanogaster. Neuron. 56, 155-170 (2007).
- Vogt, N., Desplan, C. The first steps in Drosophila motion detection. Neuron. 56, 5-7 (2007).
- Strausfeld, N. J., Braitenberg, V. Compound Eye of Fly (Musca-Domestica) - Connections between Cartridges of Lamina Ganglionaris. Z Vergl Physiol. 70, 95-104 (1970).
- Strausfeld, N. J., Campos-Ortega, J. L4-Monopolar Neuron - Substrate for Lateral Interaction in Visual System of Fly Musca-Domestica (L). Brain Res. 59, 97-117 (1973).
- Takemura, S. Y., et al. Cholinergic Circuits Integrate Neighboring Visual Signals in a Drosophila Motion Detection Pathway. Curr Biol. 21, 2077-2084 (2011).
- Shaw, S. R., Frohlich, A., Meinertzhagen, I. A. Direct Connections between the R7/8 and R1-6 Photoreceptor Subsystems in the Dipteran Visual-System. Cell Tissue Res. 257, 295-302 (1989).
- Wolfram, V., Juusola, M. Impact of rearing conditions and short-term light exposure on signaling performance in Drosophila photoreceptors. J Neurophysiol. 92, 1918-1927 (2004).
- Nikolaev, A., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye II Mechanisms. Plos One. 4, (2009).
- Land, M. F. Compound eye structure: Matching eye to environment. Adaptive Mechanisms in the Ecology of Vision. , Springer. Netherlands. (1999).
- Shannon, C. E.
- Niven, J. E., et al. The contribution of Shaker K+ channels to the information capacity of Drosophila photoreceptors. Nature. 421, 630-634 (2003).
- Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. J Neurosci. 35, 2731-2746 (2015).
- Faivre, O., Juusola, M.
- Gonzalez-Bellido, P. T., Wardill, T. J., Juusola, M. Compound eyes and retinal information processing in miniature dipteran species match their specific ecological demands. P Natl Acad Sci USA. 108, 4224-4229 (2011).
- Juusola, M., Kouvalainen, E., Järvilehto, M., Weckström, M. Contrast Gain, Signal-to-Noise Ratio, and Linearity in Light-Adapted Blowfly Photoreceptors. J Gen Physiol. 104, 593-621 (1994).
- Juusola, M., Uusitalo, R. O., Weckstrom, M. Transfer of Graded Potentials at the Photoreceptor Interneuron Synapse. J Gen Physiol. 105, 117-148 (1995).
- Juusola, M., de Polavieja, G. G. The rate of information transfer of naturalistic stimulation by graded potentials. J Gen Physiol. 122, 191-206 (2003).
- Weckstrom, M., Kouvalainen, E., Juusola, M. Measurement of Cell Impedance in Frequency-Domain Using Discontinuous Current Clamp and White-Noise-Modulated Current Injection. Pflug Arch Eur J Phy. 421, 469-472 (1992).
- Juusola, M. Measuring Complex Admittance and Receptor Current by Single Electrode Voltage-Clamp. J Neurosci Meth. 53, 1-6 (1994).
- Juusola, M., Seyfarth, E. A., French, A. S. Rapid coating of glass-capillary microelectrodes for single-electrode voltage-clamp. J Neurosci Meth. 71, 199-204 (1997).
- Haag, J., Borst, A. Neural mechanism underlying complex receptive field properties of motion-sensitive interneurons. Nat Neurosci. 7, 628-634 (2004).
- Rien, D., Kern, R., Kurtz, R. Synaptic transmission of graded membrane potential changes and spikes between identified visual interneurons. Eur J Neurosci. 34, 705-716 (2011).
- Muller, A., et al. Switched single-electrode voltage-clamp amplifiers allow precise measurement of gap junction conductance. Am J Physiol-Cell Ph. 276, C980-C987 (1999).
- Polder, H. R., Swandulla, D., Konnerth, A., Lux, H. D. An Improved, High-Current Single Electrode Current Voltage Clamp System. Pflug Arch Eur J Phy. 402, R35-R35 (1984).
- Richter, D. W., Pierrefiche, O., Lalley, P. M., Polder, H. R. Voltage-clamp analysis of neurons within deep layers of the brain. J Neurosci Meth. 67, 121-131 (1996).
- Juusola, M., French, A. S. The efficiency of sensory information coding by mechanoreceptor neurons. Neuron. 18, 959-968 (1997).
- Vähäsöyrinki, M., Niven, J. E., Hardie, R. C., Weckström, M., Juusola, M. Robustness of neural coding in Drosophila photoreceptors in the absence of slow delayed rectifier K+ channels. J Neurosci. 26, 2652-2660 (2006).
- Friederich, U., Coca, D., Billings, S., Juusola, M. Data Modelling for Analysis of Adaptive Changes in Fly Photoreceptors. Lect Notes Comput Sc. 5863, 34-48 (2009).
- Asyali, M. H., Juusola, M. Use of Meixner functions in estimation of Volterra kernels of nonlinear systems with delay. Ieee T Bio-Med Eng. 52, 229-237 (2005).
- French, A. S., et al. The Dynamic Nonlinear Behavior of Fly Photoreceptors Evoked by a Wide-Range of Light Intensities. Biophys J. 65, 832-839 (1993).
- Juusola, M., French, A. S. Visual acuity for moving objects in first- and second-order neurons of the fly compound eye. J Neurophysiol. 77, 1487-1495 (1997).
- Juusola, M., Weckstrom, M., Uusitalo, R. O., Korenberg, M. J., French, A. S. Nonlinear models of the first synapse in the light-adapted fly retina. J Neurophysiol. 74, 2538-2547 (1995).
