Abstract
במחקר על בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית, שיטת ההדבקה היא קריטית. הראשון מבין שני מסלולי זיהומיות העיקריים למוח הוא הדרך hematogenous, הכוללת זיהום של תאי האנדותל pericytes של המוח. השני הוא intracerebroventricular המסלול (ICV). לאחר מכן, בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), וירוסים עלולים להתפשט בחלל תת-העכבישים, קרומי המוח, ואת המקלעת דמתה עין באמצעות נוזל השדרה. במודלים ניסיוניים, בשלבים המוקדמים של ההפצה ויראלית CNS אינם מתאפיינים גם, ולא ברור אם תאים מסוימים רק בתחילה נגועים. הנה, יש לנו ניתחו את חלוקת ציטומגלווירוס (CMV) חלקיקים בשלב החריף של זיהום, כינה viremia העיקרי, בעקבות ICV או intravascular (IV) הזרקה לתוך המוח עכבר בילוד. במודל הזרקת ICV, 5 μl של murine CMV (MCMV) או microbeads פלורסנט הוזרקו החדר לרוחב בבית midpoiNT בין העין לאוזן באמצעות מזרק 10 μl עם מחט 27 G. במודל הזרקה IV, מזרק 1 מ"ל עם מחט 35 G היה בשימוש. Transilluminator שמש כדי להמחיש את הווריד (פנים) הזמני השטחי של העכבר בילוד. אנו חדורים 50 μl של MCMV או microbeads פלורסנט לווריד הזמני השטחי. המוח נקצרו בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה. הגנום MCMV התגלו באמצעות שיטת הכלאה באתרו. microbeads פלורסנט או חלבון פלואורסצנטי ירוק להביע חלקיקי MCMV רקומביננטי נצפה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקות אלה ניתן ליישם פתוגנים רבים אחרים לחקור בפתוגנזה של דלקת קרום המוח.
Introduction
כאשר לומדים אנצפליטיס ויראלי, חלוקת הראשונית של חלקיקים נגיפיים מאוד חשוב להבין בהיווצרות המחלה ולזהות מטרות ויראלי במוח. רוב הווירוסים טווח בגודל מ 20 כדי 300 ננומטר, למרות Pandoravirus הוא יותר מ -700 ננומטר בגודל 1. התפלגות החלקיקים הנגיפיים בשלב החריף של זיהום עלולה תלוי בגודל של החלקיקים, החלוקה קולטנית תאים, או הזיקה של קולטני התאים לאיתור וירוסים. במודלים של בעלי חיים, intracerebroventricular (ICV), intraperitoneal, שליה ישיר, ו תוך ורידי (IV) זיהומים שימשו ללמוד בפתוגנזה של דלקת המוח ויראלית. חיסון עם וירוס ICV משמש לעתים קרובות כדי להקים מערכת העצבים המרכזית (CNS) זיהומים בעכברים. מחקרים שעשה שימוש בטכניקה זו לדווח זיהום נפוץ, במיוחד של תאי אזורי periventricular וב האזורים במוח בקשר ישיר עם הנוזל השדרתי (CSF), similar להשפעות של ventriculoencephalitis ויראלי. גודלו הקטן של וירוס adeno הקשורים (AAV) חלקיקים (20 - 25 ננומטר בקוטר) הופך לפשוט תפוצתם בכל חלקי המוח זיהומים ICV 2-4. Intraperitoneal 5, שלית 6 ישירה, וזריקות IV 7 לייצג ממשל מערכתי hematogenic. חדירת חלקיקים נגיפיים דרך מחסום הדם-מוח (BBB) מאפשר להם להגיע parenchyma של המוח בילוד, המייצג גושים microglial מפוזר 8,9.
ציטומגלווירוס (CMV) הוא וירוס נפוץ שייך למשפחת וירוס ההרפס. בארצות הברית, 50% - 80% מהאנשים היו זיהום CMV לפי גיל 40. זיהומי CMV הם לעתים רחוקות מזיקים אבל יכולים לגרום למחלות בחולים ועוברים מדוכאי חיסון. מכלל הלידות, 0.2% - 2% נולדים עם CMV 10, וכתוצאה מכך תופעות חמורות כגון מיקרוצפליה, הסתיידות periventricular, hypoplasia המוח הקטן, micrדלקת העין, ואת עצב הראייה ניוון 11,12. יתר על כן, פיגור שכלי, איבוד שמיעה עצבי, פגמים חזותיים, התקף, אפילפסיה להתרחש כ -10% של אי-אנושות תינוקות CMV נגוע 13,14. תפקוד לקוי של מערכת העצבים המרכזית היא סימפטום אופייני הנפוצים ביותר של האנומליה המולדת CMV. עוד ילדים הם נכים לכל החיים בכל שנה על ידי CMV מולד מאשר תסמונת דאון, תסמונת אלכוהול עוברית, או ספינה ביפידה 15. אין חיסון נגד CMV זמין על ההווה, קוראת צורך של חיסון בטוח ויעיל. לימוד האינטראקציה של חלקיקי CMV עם קולטנים שלהם בשלב המוקדם של זיהום חשוב להבין את ההשפעה של החיסון.
Ventriculoencephalitis גושים microglial מפוזר הם שני מאפיינים פתולוגיים הראשי של CMV דלקת המוח 16. זה כבר לא ברור כיצד חלקיקי CMV (150 - 300 ננומטר) להפיץ דרך המוח בשלב החריף של זיהוםnd איך חלוקת קולטנים הסלולר זיקתם וירוסים תורמים להתפשטות ויראלית. קוואסאקי et al. הערך ICV ו- IV זיהומים מנקודת המבט של ההפצה של חלקיקים הקולטנים שלהם (integrin β1) בשלב המוקדם של זיהום. מצאנו כי הפצת חלקיקי CMV ואת הביטוי של integrin β1 מתואמת היטב בשלב המוקדם של זיהום בשני ICV ו- IV זיהומי 8. זיהום ICV הוא מודל של ventriculoencephalitis וזיהום IV הוא מודל של גושי microglial מפוזרים. לימוד הדינמיקה של חלקיקים נגיפיים או פלורסנט ייתן מידע שימושי על השפעת גודל החלקיקים, אינטראקציות ויראלי עם קולטני התאים, ואת מנגנון החדירה BBB במוח. הפרוטוקול הבא יכול לשמש כדי לחקור כל זיהום ויראלי וקטור ויראלי של מערכת העצבים המרכזי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים של Hamamatsu אוניברסיטת בית הספר לרפואה.
1. הכנת MCMV (זן סמית) ו רקומביננטי M32 משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) -MCMV
- צור רקומביננטי M32-EGFP-MCMV לפי השיטה כדלקמן (1.2 - 1.9) ו כפי שתואר לעיל 8.
- השתמש וירוסים רקומביננטי נגזרו הזן סמית של wild-type MCMV (מספר הצטרפות: U68299). הכנס EGFP (4361 זוגות בסיסים; נ"ב) בין 37,089 ו 41,450 נ"ב (M32 - מוקד M31) בגנום MCMV ידי רקומבינציה הומולוגיים.
- להגביר ידי תגובת שרשרת פולימראז M32 MCMV (41,450 - 39,286 נ"ב, עזב איגוף רצף M31 (37,089 - 39,246 נ"ב, נכון איגוף לוקוסים הגן רצף באמצעות פריימרים הבאים: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(קדימה פריימר), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 "(לאחור תחל); M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3 '(קדימה פריימר), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3' (פריימר הפוכה).
- הכנס את הלוקוס M32 לתוך וקטור להביע EGFP באמצעות אתרי הגבלה NheI ו BamHI. הכנס את הלוקוס M31 לתוך-EGFP M32 -recombinant פלסמיד בשימוש באתרי AflII ו XbaI. קליב M32 - EGFP - רצף M31 עם NheI ו AflII מן M32 - EGFP - פלסמיד רקומבינציה M31 ו להתמוסס H 2 O.
- Transfect לבנות ביקע לתוך הגרעינים של MCMV (זן סמית) -infected תאי NIH3T3 24 שעות לאחר ההדבקה (HPI) באמצעות מערכת electroporation לגרום הומולוגיים.
- בשעה 3 ימים לאחר הפגיעה, שיתוף התרבות התאים עם פיברובלסטים עובריים בעכבר נגוע (MEFs) ביחס של 1 / 1,000 בשישה-גם צלחות ומסך עבור מוקדים להביע EGFP של תאים נגועים.
- הארווירח supernatants המכיל וירוס המבארות המכילות מוקדים פלואורסצנטי ירוקים לדלל פי עשרה. עבור טיהור, לבחור בארות המציגים מוקדים פלואורסצנטי ירוק בודד.
- כאשר כל מוקדי נובעי ביטוי EGFP תצוגת זיהום הגבלת הדילול, הכנת הווירוס היא טהורה, המציין כי לא וירוס wild-type נשאר. לכמת את הנגיף בשיטת פלאק-assay כפי שתואר לעיל 17.
- פנק MCMV בארונות בטיחות ביולוגיים מוסמכים ב biosafety ברמה 2 לובשים כפפות ומסכה.
- מעבר MCMV (זן סמית) ו MCMV רקומביננטי MEFs שהוכן 12 יום בן עוברי עכברים ICR כפי שתואר לעיל 17.
- הסרת תאים מן supernatants של תרבויות MEF נגוע על ידי צנטריפוגה ב g 3,000 × במשך 20 דקות ב 16 מעלות צלזיוס.
- Ultracentrifuge את supernatants במשך 40 דקות ב 70,000 × גרם. Resuspend את הכדורים המכילים virions ב 1 מיליליטר של תמיסת מלח טריס שנאגר ולהעביר על גבי ים לינארי preformedשיפוע orbitol (25% - 70%). Ultracentrifuge שוב 70,000 x גרם במשך 60 דקות 18.
- קציר את הלהקה המכיל virion עם מזרק. גלולת virions שנקטף על ידי צעד ultracentrifugation נוסף g 70,000 × במשך 40 דקות.
- Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו (PBS) ולאחסן ב -80 ° C עד הניסויים זיהום.
- לכמת את כייל הנגיף בשיטת פלאק-assay כפי שתואר לעיל 19.
- דמיינו את הביטוי EGFP של חלקיקים MCMV רקומביננטי (עירור ב 489 ננומטר, פליטה ב 508 ננומטר) על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1 א) ואת מבנה החלקיקים ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) 8 (איור 1 ב).
2. הכנת microbeads פלורסנט האדום הנילוס
- microbeads פלורסנט carboxyl רכישה הנילוס אדום ומקום 500 μl של microbeads לתוך צינורות פי קוטר (0.04- 0.06 מיקרומטר, כ 3.63 × 10 12 חלקיקים; 0.1 - 0.3 מיקרומטר, כ -5.75 × 10 10 חלקיקים; 1.7 - 2.2 מיקרומטר, כ 6.85 × 10 7 חלקיקים).
- פנקו חרוזים עם 500 μl של 0.1 M NaOH עבור כ 1 יום כדי להסיר כל אנדוטוקסינים ו resuspend את החרוזים מים סטריליים ב RT.
- לספוג את החרוזים O / N עם 10% העכבר בסרום שהתקבלו בעכברים C57BL / 6 ב RT לפני השימוש.
- כדי להפריד אגרגטים, מערבולת חרוזי sonicate ביסודיות לפני השימוש.
3. הזרקת ICV של microbeads MCMV ו פלורסנט לעכברים בילוד
- לשמור נורמלי בהריון עכברים ICR במתקן בקרת טמפרטורה תחת מחזור אור 12 שעות / חושך. הילודים מיועדים P 0.5 ביום הלידה.
- לעקר מזרק 10 μl ומחט 27 G עם אלכוהול 70%.
- טען הפתרון זריקה (5 μl) המכיל MCMV או מיקרו ניאוןחרוזים לתוך המחט על ידי משיכת הבוכנה בקפידה של המזרק.
- לרסן עכבר בילוד (P 0.5) על ידי הצבת העכבר על קרח למשך 3 - 4 דקות. לאחר שהחיה היא בהרדמה, השתמש בשיטת תגובת בוהן קמצוץ כדי לקבוע את עומק ההרדמה.
- סמן את הזריקה עם עט מעבדה רעיל בבאתר כ 0.7 - 1.0 מ"מ לרוחב תפר sagittal ו -0.7 - הזנב 1.0 מ"מ מן (איור 2 א) בילוד גבחת.
- הכנס את המחט 2 מ"מ עמוק, בניצב לפני השטח בגולגולת במקום הזרקה הניכר. לקבלת הפניה, לסמן 2 מ"מ מהקצה של מחט במכונית רעילה.
- לאט לאט להזריק 5 μl של MCMV (כ 5 × 10 5 PFU) לתוך החדר לרוחב מבלי לפתוח את הקרקפת (איור 2 ב).
- בקבוצה אחרת של עכברים, להזריק פתרון 5 μl המכיל microbeads פלורסנט (0.1 - 0.3 מיקרומטר, כ -5.75 × 10 8 חלקיקים) על ידיהשיטה זהה.
- לאט להוציא את המחט 10 - 20 שניות לאחר הפסקת תנועת הבוכנה כדי למנוע backflow.
- כדי לשחזר, לשמור על העכברים עבור 5 - 10 דקות במכל חם עד תנועה ואת ההיענות כללית משוחזרות.
- קציר את המוח כמפורט בסעיף 5 בטווח של נקודות זמן (3, 12, 24, 48, ו -72 שעות) לאחר הזרקה.
4. IV הזרקה של microbeads MCMV או פלורסנט לעכברים בילוד
- לרסן עכבר בילוד (P 0.5) על ידי הצבת העכבר על קרח למשך 3 - 4 דקות.
- השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 35 G לבצע הזרקה תוך ורידית של MCMV ב P 0.5 בילודים.
- השתמש transilluminator (Finder וריד) כדי להמחיש את הווריד (פנים) הזמני השטחי. לפני ההזרקה, לאבטח את הילוד אל transilluminator באמצעות פלסטר (איור 2 ג).
- בזמן חבישת משקפי מגדלת (1.5x), להחדיר לאט 50 μl של MCMV (כ 5.45 ×; 10 9 חלקיקים) או microbeads פלורסנט (0.04 - 0.06 מיקרומטר, כ 3.63 × 10 11 חלקיקים; 0.1 - 0.3 מיקרומטר, כ -5.75 × 10 9 חלקיקים; ו -1.7 - 2.2 מיקרומטר, כ 6.85 × 10 6 חלקיקים) לווריד הזמני השטחי (איור 2 ד).
- לאחר הסרת המחט, השתמש גזה המכילה 70% אלכוהול כדי להפעיל לחץ על הזריקה עד שהדימום מפסיק.
- תן הילוד כ 5 דקות במיכל חם להתאושש לפני החזרתו לכלוב.
- קציר את המוח כמפורט בסעיף 5 בטווח של נקודות זמן (3, 12, 24, ו -72 שעות) לאחר ההזרקה.
5. הכנת דוגמאות מוח רקמות עבור סעיפי פרפין
- מניח את בילודים המוזרקים בצלחת פלסטיק קטנה על קרח כתוש.
- לאחר שהחיה היא בהרדמה, השתמש בשיטת תגובת בוהן קמצוץ כדי לקבוע את עומק anesthesIA.
- הפוך אחד קיצוצים בסוף מרכזיים או שניים בסוף אופקי דרך בית החזה כדי לפתוח את חלל בית החזה.
- ביצוע חתך באטריום במספריים חדים. להשרות 4% paraformaldehyde פתרון (PFA) אל המבואה. עצור זלוף כאשר תנועה ספונטנית (ריקוד PFA) ו-צבע התבהר של הכבד הם נצפו. אל ולגרום לדימום מחודש.
- לנתח הילוד (כפי שתואר לעיל 20) על ידי הסרת הראשון הראש בעזרת זוג מספריים.
- ביצוע חתך קו האמצע לאורך integument מהצוואר אל האף כדי לחשוף את הגולגולת.
- מניחים את הקצה החד של זוג מספריים איריס לתוך מגנום foramen בצד אחד, הזזה בזהירות לאורך המשטח הפנימי של הגולגולת.
- ביצוע חתך הארכה לקצה הדיסטלי של פני הגולגולת האחורית, ולעשות חתך זהה בצד הנגדי. לסלק את הגולגולת סביב המוח הקטן.
- בזהירות לקלף בחזרה את הגולגולת בצד אחד כדי למנוע נזק למוח. חזור על פעולה זוהליך בצד השני של המוח.
- בעזרת מרית, לנתק את נורות חוש הריח וקשרים עצבים על פני שטח הגחון של המוח.
- בעדינות להפריד בין המוח מהראש, זמירה כל דורה שעדיין לחבר את המוח לגולגולת באמצעות מספריים, ולהסיר את המוח.
- מניחים את המוח בבקבוקון של מקבע המכיל 4 PFA% לפחות 10 פעמים את נפח המוח למשך 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
- מייבשים את רקמת דרך סדרה של אמבטיות אתנול מדורגים לעקור את המים, ולאחר מכן לחדור עם שעוות פרפין, ויצרו גוש. חותכים את גוש פרפין עם microtome לפרוסות 4 מיקרומטר 21 עבה.
- Deparaffinize ו רעננותם השקופיות של המוח הנגוע 22. המשך ב הכלאה באתרו עבור חלקים מוטבע פרפין.
6. הכנת דוגמאות מוח רקמות עבור חלקים קפואים
- הסר את המוח בעקבות הצעדים המפורטים ב 5.1 - 5.11.
- כדי לבחון את microbeads פלורסנט M32-EGFP-MCMV, למקם את המוח כריתה על cryomolds תחתית שטוחה. להוסיף הטבעה בינונית כדי לכסות את מדגם המוח לגמרי. הצמד להקפיא את cryomolds ב -hexane n precooled (-80 ºC), באמצעות מלקחיים להחזיק את שפת cryomolds לפני הצמדתו צ'אק.
- עבור חתך, לצרף את גוש הרקמה הקפואה על צ'אק cryostat precooled. מעבירים את הרקמה הקפואה עם צ'אק לתוך תא cryostat ולהפחית את הטמפרטורה ל -10 בין לבין -20 ° C, לחתוך את פרוסות כ 8 - 10 מיקרומטר 23 עבה.
- תקן את החלקים עם cytofixative (תערובת של אלכוהול איזופרופיל פוליאתילן גליקול) על ידי ריסוס. האוויר יבש החלק למשך 30 דקות ב RT מייד לאחר הריסוס, ולאחסן אותם ב - 80 ºC עד לשימוש נוסף.
- לאזן את החלקים בחזרה RT ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
- כתם בסעיפים עם isothiocyanate והעמסה (FITC) מצומדות Gsimplicifolia riffonia isolectin B4 בריכוז של 1: 100 עבור 10 דקות ב PBS ב RT (איור 5) או עם נוגדנים CD31 PE מצומדות בריכוז של 1: 100 במשך 30 דקות ב PBS ב RT (איור 6).
- שטפו את החלקים עם שלוש פעמים PBS.
- לאחר הכביסה, להכתים את החלקים עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לדמיין גרעיני תאים. הר את הסעיפים מגיב אנטי לדעוך ותמונה DAPI (עירור ב 345 ננומטר, פליטה ב 455 ננומטר), EGFP (עירור ב 489 ננומטר, פליטה ב 508 ננומטר), ואדום הנילוס (עירור ב 553 ננומטר, פליטה ב 637 ננומטר) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איורים 3, 5, 6).
7. פלורסנט באתרו הכלאה (FISH) עבור סעיפים פרפין Embedded
- הכן את החללית FISH שכותרתו ישירות עם fluorophore עבור DNA הכלאה באתרו על ידי תרגום ניק באמצעות כרומוזום בקטריאלי מלאכותי המכיל את gen DNA MCMV כולושת (pSM3fr) 19. הריכוז של חללית FISH הוא 0.1 מיקרוגרם / μl.
- Deparaffinize ו רעננותם השקופיות של המוח הנגוע 22.
- פנקו את הסעיפים רקמות עם RNase (100 מיקרוגרם / מ"ל PBS) כדי לזהות DNA הנגיפי.
- בצע אחזור אנטיגן עם NP40 0.05%, 0.01 M חיץ ציטראט (pH 6.0) ב 95 - 98 ° C במשך 20 דקות. מצננים את השקופיות עד RT במשך 20 דקות.
- בצנצנת מכתים זכוכית Coplin, לשטוף את השקופיות במים טהורים שלוש פעמים במשך 2 דקות בכל פעם. בצע צעד יחזור אנטיגן נוסף עם פפסין 0.06%, 0.01 פתרון N HCl למשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף מחליק שלוש פעמים במים טהורים למשך 2 דקות בכל פעם בצנצנת מכתים זכוכית Coplin.
- מייבשים את הסעיפים רקמות שוב על ידי העברת שקופיות אתנול 70%, אתנול 85%, ולאחר מכן אתנול 100%.
- להכנת 10 מ"ל של חיץ הכלאה, לערבב 1.25 מ"ל במלחים הכלאה באתרו (3 M NaCl, 100 מ"מ טריס-HCl PH 8.0, 100 מ"מ נתרן פוספט pH 6.8, 50 mM EDTA) עם 5 מ"ל לפוראמיד deionized, 2.5 מ"ל 50% סולפט dextran, 250 μl 50x פתרון של Denhardt, 125 μl 100 מ"ג / מ"ל tRNA, ו 875 μl H 2 O.
- לדלל את חללית DNA שכותרתו ישירות עם fluorophores שמזהה הגנום MCMV השלם אקראית למאגר ההכלאה. ההיקף הסופי צריך להיות 10 μl (חיץ הכלאה 7 μl, 1 בדיקת μl (0.1 מיקרוגרם / μl), ו -2 μl מים מזוקקים).
- מוסיפים את תערובת בדיקה (10 μl) לכל שקופית ומכסים coverslip (15 × 15 מ"מ). חותם את coverslip במלט גומי. לפגל תמהיל הבדיקה במשך 5 דקות ב 85 מעלות צלזיוס, ולהשלים את O צעד הכלאה / N ב 42 מעלות צלזיוס.
- שטפו את השקופיות עם SSC 0.3% NP40, 0.4x ב 73 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; עם 0.1% NP40, SSC 0.4x ב 73 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות; ועם 2x SSC פעמיים.
- Counterstain הגרעינים עם DAPI (10 ng / ml) ומכסים את השקופית עם coverslip.
- הרהסעיפים מגיב אנטי לדעוך ו DAPI תמונה (עירור ב 345 ננומטר, פליטה ב 455 ננומטר) EGFP (עירור ב 489 ננומטר, פליטה ב 508 ננומטר) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקרים על בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית, שיטת ההדבקה חשובה. מסלול hematogenous מייצג זיהום חריף של תאי האנדותל pericytes של המוח, בעוד מסלול ICV מייצג זיהום חריף מתפשט דרך CSF בחלל תת-העכבישים, מגיע עד קרומי המוח ואת המקלעת דמתה. כדי לנתח את ההתפלגות הראשונה של חלקיקי דלקת המוח חריף, כלאה באתרו גילוי הגנום MCMV והתבוננות ישירה של חלקיקי M32-EGFP-MCMV או microbeads פלורסנט שמשו.
הדור של רקומביננטי MCMV (M32-EGFP-MCMV)
הפרוטוקול מדגים כיצד רקומביננטי M32-GFP-MCMV נוצר. EGFP הוכנס בין 37,089 ו 41,450 נ"ב (לוקוס M32-M31) בגנום MCMV ידי רקומבינציה הומולוגיים. EGFP protein הותכה עם חלבון נגיפי (M32) ו EGFP התבטאה בתוך חלקיקים נגיפיים. לאחר הומולוגי, הכנה וירוס נחשב טהור כשכל המוקדים הנובעים זיהום הגבלת הדילול מוצגים ביטוי EGFP, המציין כי לא וירוס wild-type נשאר. זה עלול לקחת נהלי דילול מרובים כדי לטהר את וירוס רקומביננטי. איור 1 א מציג אותות EGFP של MCMV רקומביננטי מזוכך (M32-EGFP-MCMV) ואיור 1B מציגה תמונת TEM של חלקיקים M32-EGFP-MCMV המכיל את הגנום וירוס בליבה ויראלי .
הזרקת intracerebroventricular הזרקת intravascular
איור 2 מציג את המוזרקים של עכבר בילוד (P 0.5) שבו וירוס או microbeads הוזרקו דרך ציר ICV או תוואי IV. בשנת ICV, הזריקה היא בנקודת האמצע ביןהאוזן והעין, בבאתר כ 0.7 - 1.0 מ"מ לרוחב תפר sagittal ו -0.7 - הזנב 1.0 מ"מ מן גבחת בילוד (איור 2 א). המחט צריכה להיות מוזרקת לתוך החדר לרוחב 2 מ"מ עמוק, בניצב לפני שטח הגולגולת (איור 2 ב). איור 2 ג ו 2D מראה כי MCMV או microbeads מוזרק לתוך וריד הפנים הזמני של עכברים בילוד. משקפי transilluminator ואת המגדלת הם כלים שימושיים לדמיין ורידים קטנים בבירור.
התפלגות חלקיקים נגיפיים / הגנומים ו microbeads פלורסנט
התמונות הבאות מציגות את התפלגות חלקיקים נגיפיים / הגנום ו microbeads פלורסנט בשלב החריף. איור 3 מציג את אותות microbead של חלקים קפואים של המוח. איור 3 א ו 3 ב מראים אתהפצה של 0.1 -. microbeads אדום הנילוס ניאון 0.3 מיקרומטר המצויה בתחום השולי (MA) (איור 3 א) ואת מקלעת דמית העין אזור subventricular (SVZ) (איור 3B) בשעה הזרקת ICV 2 שעות שלאחר איור 3C ו 3D מציגים את התפלגות של 0.1 - microbeads אדום הנילוס 0.3 מיקרומטר ניאון MA ואזור וסקולרית (איור 3 ג) ואת מקלעת דמית העין SVZ (איור 3D) ב הזרקה IV פוסט 2 hr. סביר להניח כי בעקבות ICV הזרקת IV, חלקיקים לא מיד להתפשט באופן אחיד בכל parenchyma. במקום זאת, הם נשארו SVZ, MA, והאזור וסקולרית בשלב הזיהום החריף. הגודל של חלקיקים הוא הגורם העיקרי המשפיע תפוצתם במוח בשלב החריף בעקבות ICV הזרקת IV. איור 4 מראה את הדגים של הגנום MCMV על הסעיפים מוטבע פרפין של המוח. הגנום MCMV (כתמים ירוקים) זוההSVZ ב הזרקת 3 שעות שלאחר ICV (איור 4B). הגנום MCMV (כתמים ירוקים) אותרו MA ואזור וסקולרית ב הזרקת 3 שעות שלאחר IV (איור 4C). חלוקת MCMV (איור 4) ו microbeads (איור 3) היו דומות למדי. איור 5 מראה את דפוסי התפוצה תלויה בגודל של microbeads בסעיפים קפוא של המוח לאחר ההזרקה IV. Microbeads בקטרים 1.7 - 2.2 מיקרומטר (איור 5), 0.1 - 0.3 מיקרומטר (איור 5D), ו 0.04 - 0.06 מיקרומטר (5E איור) מוצגים בהתאמה. Microbeads הקטן היה נטייה להיות extravasated מחוץ לאזור וסקולרית ב parenchyma. איור 6 מציג את התפלגות חלקיקי M32-EGFP-MCMV בסעיפים קפואים של המוח. אותות נקודת GFP (חלקיקי M32-EGFP-MCMV) נצפו בעיקר MA (איור 6 א) ו מקלעת דמתה עין SVZ (
איור 1:. הדור של רקומביננטי M32-EGFP-MCMV (א) Ultracentrifuged חלקיקים M32-EGFP-MCMV נתפסים כתמים ירוקים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה:. 2.4 מיקרומטר (ב) במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים מגלה כי חלקיקי M32-EGFP-MCMV להחזיק מבנה וירוס טיפוסי. סרגל קנה מידה: 77 ננומטר.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מוזרקים של העכבר בילוד. (A, B) הזרקת ICV 5 μl MCMV (כ 5 × 10 5 PFU) או 5 microbeads μl (כ -5.75 × 10 9 חלקיקים). (א) הזריקה הוא בנקודת האמצע בין האוזן והעין (ב כ במיקום 0.7 - 1.0 מ"מ לרוחב תפר sagittal ו -0.7 -. הזנב 1.0 מ"מ מן גבחת בילוד) (B) מחט G 27 עם מזרק 10 μl משמש הזרקה לתוך החדר לרוחב 2 מ"מ עמוק, בניצב לפני השטח הגולגולת. (C, D) MCMV או microbeads מוזרקים לתוך וריד הפנים הזמני של עכברים בילוד. (C) (ד) 1 מ"ל מזרק עם מחט 35 G משמש לביצוע הזרקה IV של MCMV. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 3: ויזואליזציה של הנילוס פלורסנט האדום microbeads במוח (A, B) 0.1 - 0.3 מיקרומטר אותות microbeads אדום הנילוס ניאון (אדום) הם נצפו MA (א) ו מקלעת דמית העין SVZ (ב) בשעה 2 שעות לאחר הזרקת ICV (C, D) 0.1 -. 0.3 מיקרומטר microbeads אדום הנילוס פלורסנט מוחדר מוח העכבר בילוד בזריקת IV ב הזרקת 2 hr. microbeads אדום הנילוס הם נצפו הדואר MA ואזור וסקולרית (C) ואת המקלעת דמה עין SVZ (D). כיכר לבנה מוגדל להכניס מוגדל, בפינה הימנית העליונה של (ד) (A, C) בר סולם:. 50 מיקרומטר (B, D) בר סולם:. 150 מיקרומטר. החצים מצביעים microbeads אדום הנילוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: התפלגות הגנום MCMV במוח העכבר בעקבות הזרקת ICV הזרקת IV (א) ההשקפה בהגדלה נמוכה.. הריבוע הלבן מציין היכן התמונה המוגדלת (B) נתפס. (ב) הגנום MCMV (כתמים ירוקים) מזוהה הראשונה SVZ ב הזרקת 3 שעות שלאחר ICV. DAPI (4 ';, 6-diamidino-2-phenylindole) משמש חומצה גרעינית (גרעינית) מכתים. סרגל קנה מידה:. 30 מיקרומטר (C) הגנום MCMV (כתמים ירוקים) מזוהה באזור כלי הדם ואת קרומי המוח על הזרקת 12 שעות שלאחר IV. DAPI משמש מכתים חומצה גרעינית. סרגל קנה מידה: 30 מיקרומטר. החצים מצביעים על הגנום MCMV נציג (כתמים ירוקים). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. הקשר בין קוטר של microbeads ואת התפלגות microbeads microbeads אדום הנילוס פלורסנט (50 μl) מוכנסים מוח עכבר בילוד בזריקה IV. בקטעים קפואים מוכנים הזרקת 2 שעות שלאחר, אותות אדום הנילוס (אדום, שמסומן על ידי חיצים) הם נצפו בתוך ומסביב vascular באזור של parenchyma. האזור וסקולרית מוכתמת לקטינים ניאון (ירוק) (A, B) 1.7 -.. 2.2 מיקרומטר microbeads (א) ההשקפה בהגדלה נמוכה. הריבוע הלבן מציין היכן התמונה המוגדלת (B) נלכדה (ב) הכיכר הלבנה מוגדלת כמו להכניס המוגדל, בפינה הימנית העליון של (B) (C, D) 0.1 -... 0.3 מיקרומטר microbeads (ג) נוף בהגדלה נמוכה. הריבוע הלבן מציין היכן התמונה המוגדלת (D) נלכד (ד) ריבוע לבן מוגדל כמו להכניס מוגדל, בפינה הימנית העליונה של (ד) (E, F) 0.04 -... 0.06 מיקרומטר microbeads (ה) נוף בהגדלה נמוכה. הריבוע הלבן מציין היכן התמונה המוגדלת (F) נתפסה. (F) הכיכר הלבנה מוגדלת כמו להכניס המוגדל, בפינה הימנית העליון של
איור 6: תצפית של נגיפים בגוף שלב הזיהום החריף. (A, B) אותות נקודת EGFP (חלקיקי M32-EGFP-MCMV) הם נצפו בעיקר MA (מסומן בחצים; א), מקלעת דמתה עין, ואת SVZ (מסומנת בחצים; B) בשעה 2 שעות שלאחר הזרקת ICV. הריבועים הלבנים מוגדלים כפי מחדיר מוגדל, בפינה הימנית העליונה של (א) ו- (ב). סרגל קנה מידה:. 20 מיקרומטר (C, D) בשעה הזרקת 3 שעות שלאחר IV, החלקיקים MCMV (ירוק, שמסומן על ידי חיצים) נמצאים בתוך ומחוץ לאזור וסקולרית שלparenchyma (C), מקלעת דמתה עין, ואת SVZ (ד) (אדום: תאים חיוביים CD31). הריבועים הלבנים מוגדלים כפי מחדיר מוגדל, בפינה הימנית העליונה של (ג) ו- (ד). סרגל קנה מידה:. 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במודלים של בעלי חיים, ICV, intraperitoneal, שליה ישירה, וזיהומי IV שמש ללמוד בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית. התמקדנו דגמי ICV ו- IV הזרקה של עכברים בילוד עבור הפשטות של הנהלים לטובת הזרקה ישירה של חלקיקים לתוך אזור היעד. למרות זיהום intraperitoneal הוא שיטה קלה, חלקיקים נגיפיים להפיץ מערכתי באמצעות 5,24 תהליך עקיף. זיהום שליה ישיר הוא שיטה טובה ללמוד זיהום מערכתי עוברי. עם זאת, שיטה זו דורשת הכשרה מיוחדת כדי להניב תוצאות יציבות ויש לו שיעור הצלחה נמוך. שיטת הזיהום היא גם תהליך עקיף דרך ההשליה וקשה לשלוט בכמות ההזרקה לתוך העובר בכל משפט 6. כמו העכבר בילוד מאוד רגיש וירוסים כמו CMV, במחקר זה נוכל להשוות את התפלגות חלקיקים נגיפיים וכי של תאים נגועים על PHAs מוקדם מאודדואר של זיהום. מודל הזרקת ICV הוא מועיל ללמוד את התנהגות הזיהום שעוקפת את BBB 25, ואילו מודל זיהום IV הוא מודל זיהום מערכתי דומת זיהום טבעי כוללים את האינטראקציה של הנגיף עם BBB.
בשיטת הזרקת ICV, דאגנו לחדור לפחות 2 מ"מ עמוק לתוך הגולגולת. המחט הוחזקה בתוך חדרי המוחין כ 10 - 20 שניות כדי למנוע זרימה חוזרת מן החדרים 26. כאשר נעשה בזהירות, הזרקת ICV הוא מהיר וקל שיטת vivo. עם זאת, לפעמים זריקות מדויקות כולל backflow הרצויה או עמוקה / חדירה לא עמוקה של המחט אל המוח עלול לקרות. נהלים זהירים ותצפיות לאחר הזרקה נדרשים לבצע פרוטוקול זה בהצלחה. בהתחשב שגיאות הזרקת, התמקדנו רק על דפוסי התפוצה של חלקיקים ולא על כמות, ולא לבחון את השפעות הטיפול של התרופהים או נוגדנים פונקציונליים במחקרנו.
ישנם נהלים כמה המטפלים לבצע הזרקת IV בילוד בעכברים, דרך כמה אתרים כמו ורידים זמניים שטחיים, וריד צוואר חיצוני, ובסינוסים מסלולית-רטרו. הווריד הזמני השטחי של ילוד היא דמיינה בקלות באמצעות עדשת transilluminator וגדלה. הזרקה ניתן להשלים על ידי אדם מנוסה יחיד עם הצלחה גבוהה rate.We בוחרת את הווריד הזמני השטחי כאתר של הזרקת IV. שיטת הזרקת IV דורשת קצת אימון כגון מיצוב העכבר בילוד ואת הליך ההזרקה. ראש העכבר בילוד יש למקם עם קלטת עבור הווריד הזמני להיות על גבי ושטוח. 35 G המחט צריכה להיות מוכנסת לתוך הכלי רחוק מספיק כי קצה המחט מוקף לחלוטין על ידי כלי השיט. משקפי transilluminator ואת המגדלת הם כלים שימושיים לדמיין ורידים קטנים בבירור. הזרקה של כמויות גדולות עד 100μl צריך להיות חדור לאט כדי לאשר את הזרימה של התוכן. במקרה של כשל של הזריקה במשפטו הראשון, בצד השני של הווריד הזמני זמין למשפט אחר. לאחר הזרקה, גורים לחוות מצוקה מינימאלית להתאושש במהירות. לא ברור מדוע בממוצע אחת מתוך 20 גורים לחוות מצוקה גדולה לא מחלים. עם זאת, השיעור הנמוך של התרחשות של אירוע זה ניזקים מינימאליים תכנון הניסוי כולו.
כשיטת הזרקת IV יש שיעור הצלחה גבוה (יותר מ -80%), נוכל להשוות את הדפוס וההפצה עם ובלי טיפולים מערכתיים כגון סמים או נוגדנים פונקציונליים. ערכנו בעבר ניסוי שבו עכברים בילוד הוזרקו integrin אנטי-β1 נוגדנים חוסמים פונקציונליים (50 μl ב 20 מיקרוגרם / g) או נוגדנים לשלוט אלוטיפ (50 μl ב 20 מיקרוגרם / g) לווריד הזמני השטחי של עכברים בילוד. הזרקת נוגדנים פוסט שעה אחת, 5 × 106 PFU (50 μl) של MCMV היו החדיר לתוך הצד השני של הווריד הזמני. מספר MCMV חיובי תאים לכל סעיף של CD29 אנטי עכברוש אוגר (שרשרת integrin β1, לשבט Ha2 / 5) המוח -treated היו נמוכים משמעותית כאשר משווים עם זה של המוח שטופלו נוגדן אלוטיפ 8. שימוש באותה השיטה בחקירות בעתיד, את ההשפעות של תרופות או נוגדנים מנטרלים נגד וירוסים עשויות להיקבע על ידי התבוננות ההפצה של חלקיקים נגיפיים תאים נגועים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
References
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D.
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
