Abstract
تعايش التصاقي الجراحي لحيوانين من خلفيات وراثية مختلفة يخلق سيناريو فريدة من نوعها لدراسة الخلية الجوهرية مقابل الأدوار خلية خارجي للجينات مرشحة للاهتمام، والسلوكيات المهاجرة من الخلايا، وإشارات يفرز في إعدادات جينية منفصلة. لأن الحيوانات التعايش الالتصاقي تتقاسم التداول المشترك، سيتم تبادل الدم أو أي عامل المنقولة عن طريق الدم من حيوان واحد مع شريكها والعكس بالعكس. وهكذا، الخلايا وعوامل الجزيئية المستمدة من خلفية وراثية واحدة يمكن دراستها في سياق الخلفية الوراثية الثانية. وقد استخدم تعايش التصاقي فئران بالغة على نطاق واسع لبحوث الشيخوخة والسرطان والسكري، والسمنة، ونمو الدماغ. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمت تعايش التصاقي الأجنة الزرد لدراسة البيولوجيا التطورية تكون الدم. وعلى النقيض من الفئران، وطبيعة شفافة من الأجنة الزرد يسمح للرؤية مباشرة من الخلايا في سياق التعايش الالتصاقي، مما يجعلها وسيلة قوية فريد للتحقيق وآليات undamental الخلوية والجزيئية. فائدة هذه التقنية، ومع ذلك، محدودة بسبب منحنى التعلم حاد لتوليد الأجنة الزرد التعايش الالتصاقي. يوفر هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة حول كيفية دمج جراحيا الأريمات اثنين من الأجنة الزرد من خلفيات وراثية مختلفة للتحقيق في دور الجينات المرشحة للاهتمام. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الأجنة الزرد التعايش الالتصاقي متسامحون إلى الصدمة الحرارية، مما يجعل السيطرة الزمانية في التعبير الجيني ممكن. لا يتطلب هذا الأسلوب المتطور انشاء وله تطبيقات واسعة لدراسة الهجرة الخلية، مواصفات مصير، والتمايز في الجسم الحي أثناء التطور الجنيني.
Introduction
إنشاء الفسيفساء الوراثية (الوهم) بين النوع البري والحيوانات المعدلة وراثيا هو استراتيجية راسخة والكلاسيكية عن التحقيق في خلية الجوهرية مقابل وظائف خلايا خارجي من الجينات المرشحة 1-6. وقد استخدمت على نطاق واسع الأريمة زرع في الزرد لتوليد أجنة خيالية للدراسات خلية الحكم الذاتي 7-9. اعتمادا على الأنسجة من الاهتمام، ومع ذلك، فإنه يمكن أن يكون تحديا لاستهداف متوقع الخلايا المانحة إلى الأنسجة المطلوب (على سبيل المثال، الدم) 1-3، 7-9. وقد استخدمت الوراثة الماوس طويلة الأساليب الجراحية التعايش الالتصاقي لتوليد الكائنات الملتصقة مع تداول المشتركة 10-14. لأن الحيوانات التعايش الالتصاقي تشترك في مجرى الدم المشترك، والتفاعلات بين الخلايا التي نشأت من حيوان واحد مع خلايا حيوان آخر من خلفية وراثية مختلفة يمكن دراستها 10-16. مؤخرا، أظهرت مجموعة كريمة كيسا بأناقة القدرة على لجنة المساواة العرقيةأكل الأجنة الزرد الملتصقة ومن ثم استخدام هذا النظام لدراسة الجذعية المكونة للدم والخلايا الاصلية (HSPC) الهجرة (15). وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام تعايش التصاقي الزرد مؤخرا للتحقيق في دور كادهيرين البطانية 5 في الخلايا الجذعية المكونة للدم (شهادة الثانوية العامة) ظهور والهجرة، 16 وإلى دراسة دور الخلايا اللحمية في محراب HSPC خلال تطوير الزرد 17.
على عكس الفئران والأجنة الزرد شفافة وتسمح لرؤية مباشرة من الخلايا خلال تطوير التعايش الالتصاقي، مما يجعل من نظام قوي بشكل فريد. فائدة تعايش التصاقي في الزرد، ومع ذلك، محدودة بسبب منحنى التعلم حاد، وجراحة التعايش الالتصاقي على الأجنة حساسة يمكن أن يكون تحديا تقنيا دون تعليمات مفصلة ومظاهرة البصرية. والهدف من هذا البروتوكول هو توفير مجموعة من تعليمات واضحة وخطوة بخطوة لمرافقة الدروس القائم على الفيديو حول كيفية توليد الأجنة الزرد التعايش الالتصاقي لدراسةالزمانية، خلية جوهري، أو وظائف خلايا خارجي من الجين مرشح (ق) عن طريق الانصهار الجراحية تطوير الأريمات. وشملت التعديلات الرئيسية والتوصيات الإضافية لزيادة البقاء على قيد الحياة معايش التصاقي والتطبيقات التجريبية الجديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان مستشفى الأطفال في بوسطن. تم تعديل هذا البروتوكول من طريقة نشرت سابقا 15.
1. إعداد الكواشف (أيام أو أسابيع مقدما)
- تحضير 1.5٪ أطباق المغلفة الاغاروز. إضافة 1.5 غرام الاغاروز إلى 100 مل المتوسطة الزرد E3 في دورق مخروطي. الحرارة، حل الاغاروز، ثم صب حوالي 5 مل في قطر 100 ملم × 20 ملم أطباق بتري عميقة.
ملاحظة: وتستخدم هذه لdechorionation من الأجنة (الخطوة 3.1) ولعملية جراحية التعايش الالتصاقي (الخطوة 3.3). تخزين الأطباق المغلفة الاغاروز-عند 4 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع. تأخذ بها من الثلاجة ودافئة لRT صباح اليوم لعملية جراحية التعايش الالتصاقي. - إعداد 4٪ السليلوز الميثيل. حل 4 غرام من مسحوق السليلوز الميثيل في 100 مل من E3 في دورق مخروطي مع بقضيب. ضع قارورة على طبق من ضجة في 4 درجات مئوية، وضعت على أقل سرعة، والسماح لها مزيجلتصل إلى 2 أيام.
- متقطع استخدام ملعقة لتفتيت كتل بيضاء من السليلوز الميثيل. بلورات ميثيل السليلوز لا تذوب تماما في هذا التركيز. عندما يصبح حل واضح ويبدو متجانسا مع عدم وجود كتل بيضاء المتبقية، قسامة الحل في 1.5 مل أنابيب microfuge وتجميد في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: التراكيز المنخفضة من السليلوز الميثيل يمكن استخدامها. ومع ذلك، هذه النسبة أعلى، قد حقق السليلوز الميثيل أكثر لزوجة أفضل النتائج.
- متقطع استخدام ملعقة لتفتيت كتل بيضاء من السليلوز الميثيل. بلورات ميثيل السليلوز لا تذوب تماما في هذا التركيز. عندما يصبح حل واضح ويبدو متجانسا مع عدم وجود كتل بيضاء المتبقية، قسامة الحل في 1.5 مل أنابيب microfuge وتجميد في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
- إعداد ارتفاع الكالسيوم قارع الأجراس (المفوضية العليا للاجئين) حل. لجعل 400 مل من محلول المفوضية العليا للاجئين، مزيج 8 مل من كلوريد الصوديوم 5M (116 ملي النهائي)، و 400 ميكرولتر من بوكل 3M (2.9 ملي نهائي)، 800 ميكرولتر من 5M CaCl 2 (10 ملي النهائية)، ومن 2ml 1M HEPES (5 ملي النهائي) مع 390 مل من وسائل الاعلام E3.
ملاحظة: حل مخزن المفوضية العليا للاجئين في 4 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع. الحارة إلى RT صباح اليوم لعملية جراحية التعايش الالتصاقي. - إعداد 5-6 ماصات باستور المعدلة للنقلعصابة الأريمة أزواج. لفترة وجيزة تسخين نهاية ماصة على موقد بنسن. ثم، وذلك باستخدام ملقط كبيرة، ثني نهاية ماصة لحوالي 45 درجة مئوية في حين انها لا تزال ساخنة.
- لضمان عدم وجود حواف حادة قد تؤدي إلى تلف الأجنة، عقد غيض من ماصة لفترة وجيزة في اللهب لنحو 3 ثوان. وهذا ناعم / البولندية نهاية ماصة. ويستخدم هذا المعدل ماصة باستير الزجاج بالتزامن مع 10 مل ماصة مضخة (الشكل 1) في الخطوة 3.5 أدناه.
- إعداد الأدوات الزجاجية إبرة للخياطة الجراحية من أزواج الأريمة. سحب 2-3 الإبر الزجاج كما فعلت ل microinjection للأجنة الزرد. استخدام مختبر فيلم لإصلاح كل إبرة الزجاج لنهاية إبرة إغاظة wood- أو بلاستيكية ذات مقبض (الشكل 1A). باستخدام ملقط، وقطع نهاية إبرة في قطرها حوالي 20 - 30 ميكرون. استخدام ميكرومتر مرحلة لتوجيه هذه الخطوة (الشكل 1B).
ملاحظة: حجم شمال شرقغيض edle هو المهم. إذا كان رأس كبير جدا يصبح من الصعب التحكم بدقة ويمكن أن يسبب أضرارا جسيمة. إذا كان رأس صغير جدا فمن الصعب أن الجرح بما فيه الكفاية الأجنة.
2. إعداد أزواج تربية اسماك الزرد وجمع الأجنة (يوم -1 إلى يوم 0)
- إعداد أزواج تربية الزرد الكبار. إعداد الأسماك في الليلة التي سبقت عملية جراحية تعايش التصاقي هو أن تتم. استخدام فواصل لفصل الذكور والإناث. لزيادة احتمالات التي سيتم الحصول على أجنة المطلوب، وإنشاء عدة أزواج من كل سطر. نجد أن عادة 20 - سوف 50٪ من الأزواج تفرخ.
- في صباح اليوم التالي، وسحب فواصل ويسمح التزاوج. جمع أي أجنة باستخدام مصفاة الشاي غرامة شبكة، ثم نقلها إلى طبق بتري تحتوي E3 الجنين المتوسطة 18.
- الدقيقة حقن الأجنة النحو المرغوب فيه (على سبيل المثال، مع 25 خريج DNA البلازميد، 200 غ مرنا، أو مع 1-6 نانوغرام morpholino) في حدود 1 ساعة من جمعها. تسمح لهمتنمو حتى مرحلة 256 خلية. إذا وضعت بناء التعبير الحمض النووي تحت سيطرة أحد المروجين الصدمة الحرارية (على سبيل المثال، HSP70، الشكل 4B)، والسيطرة على توقيت التعبير الجيني عن طريق الحرارة صدمة للparabionts عند 37 درجة مئوية في مرحلة لاحقة (على سبيل المثال، في 36 HPF ).
ملاحظة: كبديل لالتحوير الفلورسنت، يمكن إضافة ديكستران الفلورسنت على الحمض النووي، RNA، أو مزيج حقن morpholino (على سبيل المثال، ديكستران والأزرق تتالي في 2 ملغ / مل). سوف الصبغة ديكستران لا تتداخل مع التطور الطبيعي، وسوف تسمح للجنين حقن الكشف عن هويته تحت ضوء الفلورسنت المناسب بعد الانصهار التعايش الالتصاقي. بدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم للتعايش التصاقي من سلالة المصطبغة (على سبيل المثال، AB) مع سلالة غير المصطبغة (على سبيل المثال، كاسبر) لتحديد الجنين حقن في مراحل لاحقة. - احتضان الأجنة في 28.5 درجة C.Use المجسام لمراقبة تطورها بشكل دوري لأنها بالقرب من ديف 256 خليةمرحلة elopmental (حوالي 2.5 HPF).
ملاحظة: إذا لزم الأمر، وتحول الأجنة لدرجات حرارة مختلفة لضمان مطابقة المرحلة بين الشركاء التعايش الالتصاقي (على سبيل المثال، الأجنة حقن morpholino وغالبا ما تضع أبطأ من نظرائهم حقن الامم المتحدة التحول الأجنة المحقونة الامم المتحدة لRT بينما توضع الأجنة حقن morpholino. في 28.5 درجة مئوية سيؤدي في مراحلها مواءمة بعد بضع ساعات من التنمية).
3. الجيل من التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة التي كتبها فيوجن الجراحي لتطوير الأريمات
- مع اقتراب الأجنة المرحلة 256 خلية (حوالي 2.5 HPF)، ونقل الأجنة من كل خلفية وراثية (أي، متحولة وراثية، خطوط المعدلة وراثيا و / أو التلاعب الجيني) في أطباق المغلفة الاغاروز منفصلة (على سبيل المثال، طبق واحد لmorpholino- حقن الأجنة وطبق الثاني للأجنة السيطرة). بدلا من ذلك، نقل الأجنة إلى تنظيف، الأكواب الزجاجية وخالية من الصفر أو أطباق بتري الزجاج.
ملاحظة: تجنب استخدام الأطباق البلاستيكية غير المصقول كما الأجنة ستتمسك البلاستيك وتتلف مرة واحدة من chorions بهم. - صب سائل الاعلام E3 حتى لا يبقى ما يكفي من السوائل لتغطية الأجنة (حوالي 7-10 مل). إضافة 200 ميكرولتر من 50 ملغ / مل خليط من البروتياز معزولة عن السائل خارج الخلية من السبحية سنجابي (البروتياز). دوامة الأجنة بلطف كل بضع دقائق.
- عندما 50٪ من الأجنة قد حان للخروج من chorions، والتي عادة ما يستغرق 5-10 دقيقة، شطف لهم ثلاث مرات مع حجم سخية (حوالي 15-20 مل) من جديد المتوسطة E3 الجنين.
- Dechorionate أي الأجنة المتبقية في chorions من خلال رسم بلطف لهم في ماصة باستير الزجاج المعدلة وبلطف ثم تبديد لهم. مرة واحدة وقد تم dechorionated الأجنة وغسلها، واستبدال وسائل الإعلام E3 مع حل المفوضية العليا للاجئين. كبديل للالبروتياز، وإزالة chorions يدويا باستخدام ملقط غرامة. نهدف إلى أن 60-100 dechorالأجنة ionated المتاحة لكل حالة تجريبية.
ملاحظة: هذا هو عدة أضعاف أكثر من في نهاية المطاف أن تستخدم، ولكن من المحتمل أن يكون معطوبا أثناء المناولة أو عملية جراحية للتعايش التصاقي العديد من الأجنة. بمجرد dechorionated الأجنة، والاحتفاظ بها المغمورة، وعدم السماح لهم بلمس سطح الماء، والتوتر السطحي سوف تسبب لهم ليتم تدميرها. نضع في اعتبارنا أن استخدام جرعة أعلى من البروتياز يسمح الأجنة للخروج من chorions عاجلا وبطريقة أكثر متزامنة. عند استخدام أقل جرعة من البروتياز، الأجنة يستغرق وقتا أطول للخروج من chorions وتفعل ذلك بطريقة متزامن أقل، والتي يمكن أن تؤدي في جزء من الأجنة التي تضررت جراء التعرض لفترات طويلة للالبروتياز.
- Dechorionate أي الأجنة المتبقية في chorions من خلال رسم بلطف لهم في ماصة باستير الزجاج المعدلة وبلطف ثم تبديد لهم. مرة واحدة وقد تم dechorionated الأجنة وغسلها، واستبدال وسائل الإعلام E3 مع حل المفوضية العليا للاجئين. كبديل للالبروتياز، وإزالة chorions يدويا باستخدام ملقط غرامة. نهدف إلى أن 60-100 dechorالأجنة ionated المتاحة لكل حالة تجريبية.
- عندما 50٪ من الأجنة قد حان للخروج من chorions، والتي عادة ما يستغرق 5-10 دقيقة، شطف لهم ثلاث مرات مع حجم سخية (حوالي 15-20 مل) من جديد المتوسطة E3 الجنين.
- ذوبان الجليد في ميثيل (صنع في الخطوة 1.2 أعلاه) وأجهزة الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي الطاولة على أقصى سرعة لمدة 10 دقيقة لتكوير بلورات غير منحل التي سوف تلحق الضرر الأجنة أو تمزق المح،الصورة.
- بعد الطرد المركزي، واستخدام جزء العلوي واضح (ما يقرب من 75٪ من حجم). نقل 1-1،5 سم قطرات قطر السليلوز الميثيل في طبق بتري المغلفة الاغاروز 1.5٪. الحرص على تجنب وضع أي من بلورات مكعبات من الجزء السفلي من الأنبوب.
- استخدام علامة التحديد المسبق لموقف كل قطرة على الجانب السفلي من الطبق. ضع 12-15 قطرات (2 - بقيمة 3 قسامات ') من السليلوز الميثيل في 100 مم طبق بتري قطر. إعداد العديد من لوحات حسب الحاجة في التجربة.
ملاحظة: يجب استخدام كل قطرة لصهر زوج الأريمة واحد. الجدير بالذكر أن علامة تعيين موقع كل قطرة واحدة يضاف-في وسائل الإعلام التي تشير إلى قطرات تصبح غير مرئية تقريبا.
- إعداد واحد 40 مل قسامة من حل المفوضية العليا للاجئين تستكمل المضادات الحيوية في طبق المغلفة الاغاروز أعد أعلاه في الخطوة 3.3. إلى كل قسامة 40 مل من المفوضية العليا للاجئين إضافة البنسلين ستربتومايسين في 50 U / مل، الأمبيسلين في 50 U / مل، وكانامايسين عند 0.5 ميكروغرام/ مل.
- عندما تصبح جاهزة لأداء الأريمة اندماج، وملء بعناية كل من الأطباق التي تحتوي على قطرات السليلوز الميثيل مع 40 مل من محلول المفوضية العليا للاجئين تستكمل المضادات الحيوية. وإذا أضيف إلى حل المفوضية العليا للاجئين بسرعة كبيرة جدا، يمكن أن يعطل قطرات.
- إرفاق الزجاج تعديل ماصة باستير (صنع في الخطوة 1.4 أعلاه) لمضخة ماصة 10 مل. تحت المجسام جمع الأجنة dechorionated واحد من كل خلفية (على سبيل المثال، الجنين حقن morpholino واحد واحد من النوع البري الجنين).
- قبل الاستغناء الأجنة اثنين، واستخدام ماصة باستور لجعل الاكتئاب الصغيرة في وسط انخفاض السليلوز الميثيل، ثم بلطف إيداع كل من الأجنة في الاكتئاب.
ملاحظة: أثناء عملية نقل، وتحويل ماصة باستور صعودا طفيفا بحيث الأجنة تستقر في منعطف من ماصة باستور وذلك لتجنب الاتصال صنعهم مع سطح السائل في الجزء العلوي أو السفلي من ماصة (والتي يمكن أن تؤدي لtheiتمزق ص).
- قبل الاستغناء الأجنة اثنين، واستخدام ماصة باستور لجعل الاكتئاب الصغيرة في وسط انخفاض السليلوز الميثيل، ثم بلطف إيداع كل من الأجنة في الاكتئاب.
- مباشرة بعد إيداع الأجنة في السليلوز الميثيل، واستخدام wood- أو بلاستيكية ذات مقبض إبرة إغاظة مع هلام تحميل طرف الماصة على الطرف (الشكل 1A) لإعادة بعناية الأجنة داخل السليلوز الميثيل بحيث القطبين الحيوان هم مباشرة لمس بعضهم البعض.
- الاستفادة من الاقتراحات التي تجتاح لطيف من خلال وثيقة ميثيل السليلوز إلى الأجنة إلى موضعها دون لمسها مباشرة. السماح للأجنة الجلوس لمدة 5 دقائق حتى السليلوز الميثيل سوف يستقر في من حولهم. خلال هذا الوقت، تحميل الزوج المقبل إلى آخر قطرة.
ملاحظة: تجنب الوقوع في اتصال مباشر مع الأجنة ورعاية خاصة عدم لمس أي جزء من الكيس المحي، والتي سوف تمزق بسهولة.
- الاستفادة من الاقتراحات التي تجتاح لطيف من خلال وثيقة ميثيل السليلوز إلى الأجنة إلى موضعها دون لمسها مباشرة. السماح للأجنة الجلوس لمدة 5 دقائق حتى السليلوز الميثيل سوف يستقر في من حولهم. خلال هذا الوقت، تحميل الزوج المقبل إلى آخر قطرة.
- باستخدام أداة زجاج إبرة، الجرح بعناية كل جنين في وجهة نظرهم من الاتصال. مع حركة الخياطة لطيف، وخلايا من الجنين الأول يمكن سحبها إلى الجنين الثاني، ثم العودة مرة أخرى.في نهاية هذه الحركة، وعقد إبرة في مكان 2-3 ثانية ومن ثم استدراجه بعيدا ببطء شديد.
ملاحظة: هناك فترة حوالي 2-3 ثانية بعد اصابة الأجنة حيث يبدو أن الأنسجة اثنتين هما أكثر المواد اللاصقة وأكثر عرضة لنعلق على بعضها البعض. وبالتالي، فإننا نعتقد أن عقد الإبرة في المكان لفترة وجيزة بعد اصابة يساعد على إبقاء أنسجة جرحى من كل جنين في الاتصال لفترة أولية من الوقت على الفور بعد اصابة. - تسمح هذه الأجنة إلى الجلوس لمدة 10-15 دقيقة في RT. في هذه الأثناء، تواصل غرزة أزواج جديدة في قطرات أخرى من السليلوز الميثيل. بعد 10-15 دقيقة، وتقييم ما إذا كان الزوج الأول ظلت المرفقة (الشكل 2A).
ملاحظة: في حالة تعد تعلق الأجنة، كرر عملية خياطة لطالما الأجنة أعمارهم أقل من حول المرحلة اكتفار 30٪. عادة هذا يسمح لمدة تصل إلى ثلاث محاولات لغرزة الأجنة معا. إذا يبدو أن الأجنة قد حافظ على مرفق ولكن جonnection ليست كبيرة، تنفيذ خياطة إضافية على حافة الاتصال لتعزيز ذلك. تجنب اهتزاز أو نقل أطباق أثناء الجراحة والحضانة فترات التعايش الالتصاقي.
ملاحظة: على الرغم من مرحلة التطوير الأولى، وينظر هشاشة، ويمكن للجماهير خلية من خلايا الأجنة تحمل قدرا كبيرا من التلاعب (أي جرح وخياطة)، ومازالت تتطور بشكل طبيعي. صفار البيض، ومع ذلك، يمكن أن تمزق فقط مع لمسة، وقتل الجنين. عندما خياطة الأريمات مع اثنين من الإبرة الزجاج، لا لاجراء اتصالات مع واجهة بين كتلة الخلايا وصفار البيض من كل جنين. - احتضان الأجنة O / N عند 28.5 درجة مئوية في نفس الطبق وسائل الإعلام (لا تغيير وسائل الإعلام). وبحلول صباح اليوم التالي، سيكون قد نقل الأجنة من قطرات ميثيل السليلوز حل معظمها. إزالة أي الأجنة التي لم تنصهر بنجاح. صب سائل الإعلام واستبدالها مع 25 مل الطازجة E3.
ملاحظة: إذا كان يعمل معسلالة المصطبغة، إضافة 500 ميكرولتر 0.15٪ (50X) الفنيل (PTU) إلى تركيز النهائي من 0.003٪ لمنع تصبغ. سوف تحتاج الأجنة أن تبقى مستمرة في PTU للحفاظ على قمع تصبغ.
4. إعداد مجهر، الحصول على الصور ومعالجتها وتحليلها
- إعداد 0.8٪ نقطة انصهار منخفضة (آخر دورة شهرية) الاغاروز: إضافة 0.8 غرام من آخر دورة شهرية الاغاروز إلى 100 مل E3 والحرارة حتى يذوب تماما. في حين الساخنة، قسامة 1 مل من آخر دورة شهرية الاغاروز إلى 1.5 مل أنابيب microfuge في 37 درجة مئوية كتلة التدفئة. ستبقى الاغاروز LMP المنصهر عند 37 درجة مئوية. إضافة 40 ميكرولتر من 4 ملغ / مل (25X)، ودرجة الحموضة 7.0 تريكين إلى كل قسامة 1 مل من آخر دورة شهرية الاغاروز عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: إذا كان يعمل مع سلالة المصطبغة، إضافة 20 ميكرولتر من 0.15٪ (50X) PTU إلى كل قسامة 1ML.
- تخزين LMP الاغاروز المتبقية لعدة أشهر في مختومة 50 مل أنابيب في 4 درجات مئوية.
- تخدير الأجنة التعايش الالتصاقي للتصوير عن طريق إضافة 1 مل من 4 ملغ / مل (25X)، ودرجة الحموضة 7.0 تريكينإلى 25 مل من E3 أن الأجنة هي بالفعل في.
- دوامة بلطف الطبق بحيث الأجنة سوف تجمع في الوسط. ثم، وذلك باستخدام يميل اسعة نقل البلاستيك ماصة وضع الأجنة في السائل أقل قدر ممكن. تحويل ماصة تستقيم وترتد بلطف الأجنة بحيث تستقر في قاع ماصة.
- مع الأجنة في الجزء السفلي من ماصة، نقلها إلى قسامة 1 مل من آخر دورة شهرية الاغاروز عن طريق لمس طفيفة طرف ماصة لسطح الاغاروز. تجنب نقل السوائل الزائدة لأن هذا سوف يخفف من الاغاروز.
- بعد طرد السوائل الزائدة من ماصة، واستخدام ماصة لخلط بلطف الأجنة داخل الاغاروز، ثم استخدم ماصة لنقل كل من الاغاروز والأجنة إلى بئر من الزجاج السفلي (رقم 1.5 ساترة)، 6- جيدا لوحة.
ملاحظة: تأكد من تجاهل ماصة بعد نقل الأجنة إلى لوحة التصوير. سوف الاغاروز المتبقية تعيين داخل ماصة، renderinز انها غير فعالة لاستخدامها مرة أخرى. بدلا من ذلك، استخدام ماصة جديدة في كل مرة. - تحت المجسام، واستخدام ماصة هلام التحميل الثابتة في نهاية إغاظة إبرة التعامل مع الخشب لوضع الأجنة أسفل نحو الغطاء الزجاجي (للتأكد من أنها ضمن مسافة العمل من الهدف المجهر) وفي الاتجاه المطلوب للتصوير.
ملاحظة: تغيير موضع مستمر حتى وضعت الاغاروز تماما. احرص على جبل الأجنة التعايش الالتصاقي التي تنص على الجنين من هذا الزوج للتصوير. وبالنظر إلى التوجه عشوائية من الأجنة الملتصقة، بالنسبة لبعض الأزواج قد يكون من الصعب على صورة كل من الأجنة. في هذا السيناريو، واستعادة الأجنة من الاغاروز باستخدام ملقط ويميل اسعة نقل البلاستيك ماصة ثم قم بإعادة تحميل للتصوير من وجهة نظر مختلفة. - مرة واحدة وضعت الاغاروز، مع تغطية 2-3 مل من E3 تستكمل مع تريكين (وPTU إذا لزم الأمر).
- صورة الأجنة باستخدام مقلوب واسعة المجال برنامج التحصين الموسع ومضان، لاسإيه-مسح متحد البؤر، أو الغزل القرص مجهر متحد البؤر. حدد الهدف الأنسب للتصوير المطلوب. لحقل كامل الجنين نظر، استخدم هدف 4x و. حدد التكبير العالي، مثل الهدف 20X، إلى صورة الأنسجة محددة 16 و 19.
ملاحظة: في حالة استخدام المجهر تستقيم، جبل في آخر دورة شهرية الاغاروز (على غرار أعلاه) على زلة غطاء زجاجي. عكس ساترة الزجاج على شريحة المجهر والزجاج يحتوي على حلقة من الشحوم فراغ مليئة نفس E3-تريكين-PTU 16، 19. - اكتسبت عملية الصور باستخدام حزم برمجيات تحليل الصور المجانية مثل المعاهد الوطنية للصحة صورة J / فيجي 16 و 19.
ملاحظة: عدد أرقام الهواتف المحمولة وقياس ديناميكية مثل الهجرة الخلية والانقسام الخلوي باستخدام تجزئة وتتبع خوارزميات 16 و 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتمشيا مع الدراسات التي نشرت سابقا 15، نجاح الانصهار التعايش الالتصاقي الأجنة الزرد يعتمد على التنظيم والتوجيه من الأجنة اثنين وتركيز ميثيل. مع عدد قليل من البساطة، وأدوات غير مكلفة، تم إنشاء الأريمات تطوير تنصهر جراحيا التي نمت في الأجنة التعايش الالتصاقي مع تداول المشتركة. وتشمل هذه الأدوات لتعديل ماصة باستير، 10 مل مضخة ماصة، والخشب التعامل مع الإبر إغاظة التي كانت تستخدم إما وحدها أو مع طرف جل التحميل أو حقن مكروي الزجاج إبرة مثبتة في نهاية بواسطة مختبر فيلم (الشكل 1).
بعد وضع الأريمات اثنين في 4٪ ميثيل السليلوز وباستخدام طرف جل التحميل لتوجيههم مع أقطاب حيواناتهم متقابلين (الشكل 2A)، وأصيب الأجنة بعناية في وجهة نظرهم من الاتصال مع الزجاج حقن مكروي نeedle (الشكل 2B). وهناك درجة أكبر من اصابة (قارن الشكل 2B إلى الشكل 2C)، وإعادة النظر في أزواج الجنين لدعم اتصال أولي مع جرح إضافية، زاد احتمال الأجنة الحفاظ على الاتصال الذي أدى إلى اندماج الناجح (الشكل 3A-C، فيلم 1) ، وخالية من العيوب الشكلية إضافية أو تأخر التنمية. عندما تنتهي من ذلك بعناية، وتنصهر فيها ما يقرب من 100٪ من أزواج الجنين، على الرغم من أن جزء من هذه الأجنة (حوالي 25٪) أبدا وضع صحي التداول في كل شطر. بتوجيه من الأريمات مع اثنين من أقطاب حيواناتهم الانحياز مباشرة، تم إنشاؤها من الرأس إلى الرأس أو صفار اندماج كيس كيس موثوقة إلى صفار البيض مع تداول المشتركة. في معظم الحالات، كان للأجنة اثنين من قلوب ضخ الدورة الدموية شيوعا المشتركة (الشكل 3D).
للتأكد من أن الأجنة مشترك فيها في الواقع تداولها، كان ديكستران الفلورسنت ينجECTED للتداول، والتي يمكن أن ينظر إليها في وقت لاحق من خلال تعميم كل من الأجنة (فيلم 2). بالإضافة إلى ذلك، الأجنة وراثيا التي كان GFP + الكريات الحمراء (LCR: EGFP) كانت تنصهر إلى الأجنة التي كان mCherry + الأوعية الدموية الخلايا البطانية (flk1: الجمعية قضائيا-mCherry). 48 HPF، لوحظ GFP + كريات الدم الحمراء من خلال تعميم flk1: الجمعية قضائيا-mCherry شريك الجنين (الشكل 4A وفيلم 3). لتوسيع فائدة نظام التعايش الالتصاقي، وأضيف السيطرة الزمانية في التعبير الجيني. قبل الانصهار، واحدة من الأجنة اثنين تم حقن مع HSP70: EGFP الحمض النووي بناء 20. في حين أن الأجنة تنصهر كانت تنمو في 28.5 درجة مئوية، لم يلاحظ أي مضان. في المقابل، وبعد 30 دقيقة الصدمة الحرارية وجيزة عند 37 درجة مئوية، وكانت إشارة GFP واضحة وضوحا في واحد من اثنين من الأجنة (الشكل 4B). في بعض الحالات كانت GFP + الخلايالاحظ المتداولة في شريك الجنين حقن الامم المتحدة. وهكذا، وضع الجين تحت سيطرة أحد المروجين الصدمة الحرارية يوفر سيطرة الزمنية إضافية لدراسات التحقيق وظائف خلايا الجوهرية أو خلية خارجي من الجينات المرشحة.
الشكل 1. أدوات لتوليد التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة.
(أ) تبين صورة المشروح الأدوات المستخدمة في الانصهار الجراحية تطوير الأريمات. وتشمل أدوات معدلة ماصة باستير (أعلى)، والذي يستخدم جنبا إلى جنب مع مضخة ماصة 10 مل (الخضراء). التعامل مع الخشب وتستخدم الإبر إغاظة إما وحدها أو مع البلاستيك طرف ماصة هلام التحميل أو حقن مكروي الزجاج سحبت اذعا ثابتة إلى النهاية مع مختبر الفيلم. معارض (ب) صورة نهايات ثلاثة الزجاج حقن مكروي الحاجةليه التي تم كسر مع ملقط في أقطار مختلفة. الإبر يكذبون على رأس ميكرومتر. متباعدة أصغر خطوط 10 ميكرون على حدة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. فيوجن الجراحي لتطوير الأريمات.
تظهر الصور عالية التكبير اثنين من الأجنة الزرد في مرحلة عالية من التنمية، المنحى مع أقطاب حيواناتهم متقابلين، قبل خياطة الجراحية (A)، وعلى الفور بعد الحد الأدنى من جرح (B)، وبعد جرح أكثر جوهرية (C). 20 دقيقة في وقت لاحق أنه من الواضح أن الأجنة قد تنصهر بنجاح على أساس الجسر دون انقطاع من الخلايا بين الأريمات اثنين (D). مقياسيمثل شريط 250 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تطوير التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة.
(AC) الصور تظهر وجهة نظر كامل معايش التصاقي من التنمية في وقت مبكر بعد اصابة (أ) و مع استمرار الأجنة لتطوير وتخضع اكتفار (B و C) هذه الصور تتوافق مع الفيلم 1. (D) صورة يظهر الزوج الجنين التعايش الالتصاقي في 36 HPF. وترتبط الأجنة في كيس المح،، واثنين من قلوب ومشاركة التداول المشترك. تمثل الحانات مقياس 250 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. تصور تعايش التصاقي مع البروتينات الفلورية مشفرة وراثيا.
(A) الصور (مضان وحدها، حق، تراكب مع الضوء المرسل، يسار) تظهر منطقة الرأس الأجنة الملتصقة في 48 HPF. الجنين السفلي من هذا الزوج المعدلة وراثيا لمركز ابحاث: EGFP (erythroctyes والأخضر)، بينما شريكها (أعلى) هو المعدلة وراثيا لflk1: الجمعية قضائيا-mCherry، التي تصف خلايا بطانة الأوعية الدموية (الحمراء). ويمكن رؤية كريات الدم الحمراء الخضراء من خلال تعميم الجنين شريك. هذه الصورة يناظر فيلم 3. (ب) تم حقن الجنين الأيسر في هذا الزوج مع HSP70: EGFP بناء في مرحلة خلية واحدة ثم تنصهر فيها إلى شريك برنامج الأمم المتحدة للحقن (يمين). عندما كانت الحيوانات الحرارة صدمت عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 36 HPF، وقد لوحظ مضان أخضر من GFP في لو جنين قدم في 60 HPF. تمثل الحانات مقياس 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1. تنمية في وقت مبكر من الأريمات الزرد تنصهر جراحيا. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
ويظهر الفيلم التطور المبكر للزوج من الأريمات الزرد تنصهر جراحيا. يمكن أن ينظر إليه اكتفار التي تحدث في وقت واحد في كل جنين. ويرتبط هذا الفيلم إلى الشكل 3A-C.
2.JPG "/>
فيلم 2. حقن ديكستران الفلورسنت ينير تداول المشترك. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
ويظهر الفيلم ديكستران الفلورسنت يتم حقنه في الوريد الكاردينال المشترك من زوج الجنين التعايش الالتصاقي في 60 HPF. ويمكن رؤية صبغة الفلورسنت المتداولة في وقت لاحق من خلال كل من الأجنة.
فيلم 3. الدم الأخضر التي تتدفق من خلال الأوعية الحمراء.وسائل التحقق "> (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
ويظهر الفيلم منطقة الرأس الأجنة الملتصقة في 48 HPF. الجنين السفلي من هذا الزوج المعدلة وراثيا لمركز ابحاث: EGFP (erythroctyes والأخضر)، بينما شريكها (أعلى) هو المعدلة وراثيا لflk1: الجمعية قضائيا-mCherry، التي تصف خلايا بطانة الأوعية الدموية (الحمراء). وينظر إلى الكريات الحمراء الخضراء من خلال تعميم الجنين شريك. ويرتبط هذا الفيلم إلى الشكل 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكان الانصهار التعايش الالتصاقي أداة قوية لتحقيق الوظائف الخلوية من الجينات المرشحة في نماذج الفئران الكبار وافراخ الدجاج 10-14. وفي الآونة الأخيرة، وقد وصفت طريقة الأريمة الانصهار لتوليد الأجنة الزرد الملتصقة 15. في هذا البروتوكول، وتستخدم الدروس القائم على الفيديو لإثبات ووصف منهجية لخلق الأجنة الزرد التعايش الالتصاقي من خلفيات وراثية مختلفة من أجل دراسة الأدوار الزمنية، خلية الجوهرية، وخلايا خارجي من الجينات المرشحة للاهتمام في تطوير المكونة للدم بشكل أفضل وبعده.
وقد استخدمت الأسلوب هو موضح في هذه الورقة مؤخرا لمتابعة شهادة الثانوية العامة ظهور في جنين واحد، والهجرة عن طريق الدم الدورة الدموية للجنين من خلفية وراثية مختلفة، وengraftment اللاحق وتمايز 16. بالاتفاق مع مجموعة كيسا من النتائج، التدريج والجنين لتحديد المواقع وجدت لتحديد معدل النجاحوالطبيعة التشريحية للانصهار التعايش الالتصاقي. مع بضعة تعديلات أساسية على البروتوكول، تم إنشاء parabionts مع بقاء معدل أعلى بكثير. وتشمل هذه جرح الأريمات إلى درجة أكبر، وعقد إبرة في مكان 2-3 ثانية بعد اصابة، ومن ثم إعادة النظر الأريمة أزواج بعد 15 دقيقة لتعزيز اتصال أولي مع جرح إضافية إذا لزم الأمر. مع هذه التوصيات الإضافية، نجا ما يقرب من 100٪ من parabionts وظلت المرفقة، و 75٪ منهم تقاسم التداول المشترك.
لإدراج عنصر إضافي من السيطرة التجريبية للطريقة، وأظهرت الأجنة التعايش الالتصاقي هنا لنكون متسامحين للحرارة صدمة، السماح للسيطرة الزمانية في التعبير الجيني في إطار التعايش الالتصاقي 20. وجود قيود على هذا الأسلوب هو أنه في بعض الحالات الأجنة شريك التعايش الالتصاقي ليست في نفس الطائرة بعد الانصهار التعايش الالتصاقي. هذا يمكنهتجعل من الصعب على جبل الأجنة في آخر دورة شهرية الاغاروز لتعقب خلايا في كل من الأجنة في وقت واحد باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري. للتحايل على هذه المسألة المحتملة، ينبغي للمرء أن تخطط لتوليد متعددة الأجنة التعايش الالتصاقي لضمان تحقيق الاتجاه المطلوب. بدلا من ذلك، الأجنة يمكن استردادها من آخر دورة شهرية باستخدام ملقط غرامة وماصة باستير وإعادة تركيبه للتصوير من وجهة نظر مختلفة. وكان الهدف من هذا البروتوكول إلى توفير مجموعة من، تعليمات موجزة واضحة لمرافقة الدروس القائم على الفيديو حول كيفية جراحيا فتيل تطوير الأريمات لتوليد الأجنة الزرد التعايش الالتصاقي.
مع التعديلات الرئيسية والتوصيات الإضافية لزيادة البقاء على قيد الحياة معايش التصاقي، وهذا البروتوكول تمكين نأمل المحققين الذين يرغبون في الاستفادة من الأجنة الملتصقة للتحقيق في العوامل تنظيم الهجرة الخلية، مواصفات مصير، والتمايز في مجموعة من الأنسجة والسياقات الخلوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | ||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| Antibiotics: | |||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 | |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 | |
| Name | Company | Catalog Number | |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 | |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 | |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 | |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU. working stock is 0.003% (50x is 0.15%). for 500 ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 | |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM | |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 | |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | |||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 | |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
