Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

Summary

הפרוטוקול המובא במחקר זה מתאר שיטות לניטור בזמן אמת של התקדמות מחדש באמצעות מדידת הקינטית של סמנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים באמצעות ניתוח תזרים cytometry. הפרוטוקול גם כולל את הערכה המבוססת על הדמיה של מורפולוגיה, סמן או ביטוי הכתב במהלך הדור iPSC.

Introduction

החולה שמקורם בתאי גזע מושרים (iPSCs) הם כלים מבטיח טיפול בתא ההקרנה התרופה. הם מספקים מקור עצמי של תאים לטיפול. בנוסף, הם כוללים סט רחב מאוד של רקע גנטי, מה שמאפשר ניתוח במבחנה מפורט של מחלות גנטיות מעבר למה תאי גזע עובריים נוכחיים (ESC) קווים ייאפשרו. ההתקדמות שחלה באחרונה הוביל לפיתוח של מספר שיטות להפקת iPSCs, כולל תכנות מחדש בנגיף סנדאי, פלסמידים episomal או mRNAs 1,2. יש לציין, שיטות תכנות מחדש שונות קשורות עם רמות משתנות של יעילות ובטיחות, וכן צפויים שונים באופנים אחרים המשפיעים והתאמתו ליישומים שונים. עם הזמינות של מגוון רחב של טכנולוגיות תכנות מחדש, זה הפך להיות חשוב לפתח שיטות להערכת תהליך תכנות מחדש. רוב השיטות הקיימות להסתמך על בדיקה איכותית של מורפולוגיה או מכתיםעם צבעים ונוגדני תא ספציפי גזע. שיטה שפותחה לאחרונה אחת עושה שימוש לכתבי קרינת lentiviral רגישים miRNAs PSC ספציפי או mRNAs תא ספציפי בדיל 3. שיטות מעקב כזה להקל על הבחירה ואופטימיזציה של טכניקות תכנות מחדש למצבים שונים. לדוגמא, CDy1 שמש בדיקת ניאון עבור iPSCs מוקדם כדי למסך מאפנני תכנות מחדש 4. היכולת להתבונן ולהשוות ניסויים תכנות מחדש שונים הינה עניין מהותי, להבנה טובה יותר של התהליך עצמו. למשל, כיום ידוע כי סוגים מסוימים תא סומטי קלים יותר לתכנת מחדש מאחרים 5, וכי תאים לעבור מצבי ביניים במהלך תכנות מחדש 6-8. למרבה הצער, את המנגנונים העומדים בבסיס תהליך תכנות מחדש עדיין אינם מובנים לחלוטין וכתוצאה מכך, ההבדלים המדויקים בין שיטות תכנות מחדש להישאר גם כדי להיות Defined. לפיכך, שיטות לניטור, שמאות והשוואת אירועי תכנות מחדש להמשיך להיות קריטי עבור השדה התא גזע.

השיטות שתוארו בפרוטוקול זה לאפשר הניטור והערכה של תהליך תכנות מחדש ותדגמנה טכניקות אלה יכולים לשמש כדי להשוות קבוצות שונות של ריאגנטים תכנות מחדש. נקודת המבט הראשון הוא cytometry זרימה מנתח באמצעות שילובים של נוגדנים נגד תאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים סמנים (PSC). הדמיה בזמן אמת זוגות הגישה השנייה ומדידת מפגש הכולל (שטח הפנים אחוזים מכוסה על ידי תאים) ואת המפגש של אותות סמן (שטח הפנים אחוזים מכוסה על ידי אותות ניאון).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.Solution והכנה בינוני

  1. מטריקס ממברנה מרתף (מטוהרים מן הגידול Engelbreth-הולם-נחיל)
    1. לאט להפשיר המטריצה ​​קרום במרתף (5 מ"ל) על הקרח על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. לדלל את פתרון מניות 1: 1 עם 5 מיליליטר של קר כקרח, DMEM סטרילי / בינוני F-12 צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי, מראש צונן. לוותר aliquots לתוך מראש צונן, צינורות 1.5 מ"ל צנטריפוגות מיקרו סטרילי ולאחסן מיד ב -20 ° C.
    3. לפני השימוש, להפשיר את 1 קפוא: aliquot מטריקס 1 מרתף קרום לילה ב 4 מעלות צלזיוס. בעת השימוש, נוסף לדלל את 1: aliquot 1 50 אחר לקפל עם קרים כקרח, DMEM סטרילי / F-12 בינוני עד דילול סופי של 1: 100.
    4. מוסיף את הכמות המתאימה של 1: פתרון מטריקס קרום 100 מדולל המרתף אל בתרבית הרקמה המתאימה (TC) כלי לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. בדרך כלל, השתמש 3 מ"ל של הפתרון מטריקס קרום במרתף מדולל מעיל o צלחת TCf 20 ס"מ שטח הפנים 2, מעיל כל שאר סוגי מאכלים TC / צלחות לפי יחס של 0.15 מ"ל של מטריקס המדולל ס"מ 2 של שטח הפנים. לשאוב את הפתרון הנותרים לפני תוספת של כל מדיום ותאי תרבות.
  2. פיברובלסטים בינוניים
    1. להפשיר בקבוק 100 מ"ל של מוסמך ES עוברית שור סרום (ES-FBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הוסף 50 מ"ל של FBS-ES מופשר 5 מ"ל של ממ שאינם חיוניים פתרון חומצות אמינו (1x) 445 מ"ל של מדיום DMEM. לעקר את הרכיבים בשילוב דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן המדיום ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
  3. iMEF בינוני
    1. להפשיר בקבוק 100 מ"ל של ES-FBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הוסף 50 מ"ל של FBS מופשר, 5 מ"ל של ממ שאינם חיוניים אמינו חומצה פתרון (1x), ו -500 μl של 2-mercaptoethanol כדי 445 מ"ל של מדיום DMEM.
    3. לעקר את הרכיבים בשילוב דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן את ליdium ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
  4. פתרון פקטור גדילה בסיסי פיברובלסטים (ב-FGF)
    1. הוסף 10 μl של החלפת סרום 990 μl של D-PBS ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    2. מוסיפים את 1 מ"ל של 1% (v / v) פתרון החלפת סרום בקבוקון אחד של 10 מיקרוגרם lyophilized ב-FGF. לערבב ביסודיות על ידי pipetting מעלה מטה בעדינות.
    3. Aliquot הפתרון 10 מיקרוגרם / מ"ל-FGF b לתוך 200 aliquots μl צינורות מיקרו צנטריפוגות ולאחסן ב -20 ° C עד הצורך עד 4 שבועות.
  5. תאים אנושיים גזע פלוריפוטנטיים (hPSC) בינוני
    1. להפשיר בקבוק 100 מ"ל של החלפת סרום על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הוספת 100 מ"ל של החלפת סרום מופשר, 5 מ"ל של ממ שאינם חיוניים אמינו חומצה פתרון (1x), ו -500 μl של 2-mercaptoethanol כדי 395 מ"ל של מדיום DMEM / F-12.
    3. לעקר את הרכיבים בשילוב דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן המדיום בבית4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
    4. בעת השימוש, מראש לחמם את המדיום hPSC ל -37 מעלות צלזיוס, להשלים עם 4 ng / ml של bFGF.
  6. iMEF אוויר בינוני (CM)
    1. להוסיף 18 מ"ל של 0.1% ג'לטין בקבוק תרבות T-175 ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. הסר את פתרון ג'לטין 0.1% אחרי שעה אחת של דגירה. להוסיף 9.1 x 10 6 פיברובלסטים עובריים בעכבר mitotically מומת (iMEF) ב 45 מ"ל של מדיום iMEF דגירה של 37 ° C חממה לילה.
    3. לאחר דגירה לילה, להסיר את המדיום iMEF הישן ולשטוף פעם עם 25 מ"ל של D-PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. לשאוב את D-PBS לשטוף ולהוסיף 90 מ"ל של מדיום hPSC מחומם מראש, בתוספת 4 ng / ml של bFGF. דגירת 37 מעלות צלזיוס החממה בדיוק 24 שעות.
    5. לאחר 24 שעות של דגירה, בסביבה נקייה מחיידקים להסיר את המדיום hPSC מהבקבוק iMEF לעקר דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. Aliquot לתוך 50 צינורות מ"ל ולהקפיא חרוטים ב -20 ° C עד צורך. iMEF CM ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב -20 ° C.
    6. הוסף עוד 90 מ"ל של מדיום מראש התחמם hPSC השלימו עם 4 ng / ml של bFGF אל הבקבוק iMEF. דגירת 37 מעלות צלזיוס החממה בדיוק 24 שעות. חזור על הקצירה של CM עד 7 ימים.
    7. בעת השימוש, מראש ולחמם את iMEF-CM ל -37 מעלות צלזיוס, להשלים עם 4 ng / ml של bFGF.
  7. E8 בינוני
    1. להפשיר תוספת 10 מ"ל E8 ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הסר 10 מ"ל של המדיום הבסיס E8 ו בסביבה נקייה מחיידקים להוסיף את התוכן של המוסף E8 מופשר למדיום הבזליים הנותרים. מערבבים היטב לעקר דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. אחסן את הבינוני המלא ב 4 ° C עד 2 שבועות.
    3. בעת השימוש, מראש ולחמם את aliquot של המדיום כדי לשמש לטמפרטורת החדר. זה לא מומלץ טרום חם E8 בינוני עד 37 ° C.
  8. Cell אזrting הצפה
    1. הכן חיץ מיון טרי ממש לפני מיון התא על ידי הוספת פתרון EDTA (1 הריכוז הסופי מ"מ), חיץ HEPES (25 מ"מ הריכוז הסופי) פתרון פניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / הריכוז הסופי מ"ל) שור סרום אלבומין (1% ריכוז סופי) לתוך פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (סידן ומגנזיום חינם).
    2. לעקר למאגר דרך פילטר 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
  9. מיון תאי שחזור בינוני
    1. שינוי 50 מיליליטר של פיברובלסטים בינוניים על ידי הוספת פניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / ריכוז סופי מיליליטר) ורוק מונע Y-27632 (10 מיקרומטר ריכוז סופי). טרום חם בינוני עד 37 ° C לפני זריעת התאים הממוינים.

2. סנדאי מתווך תכנות מחדש של פיברובלסטים אדם

  1. 24 שעות לפני התמרה עם וירוסים סנדאי, לזרוע את הפיברובלסטים בצפיפות של 2 × 10 5 גאמות לכל טוב לתוך הבארות הרצויות של צלחת TC 6 באר.
  2. בצע התמרה ביום 0 כדלקמן.
    1. טרום חם 2 מיליליטר של פיברובלסטים בינוניים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. סור קבוצה אחת של צינורות וירוס סנדאי מ -80 אחסון ° C ו להפשיר צינור אחד אחד בכל פעם על ידי הטבילה הראשונה התחתון של הצינור בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 - 10 שניות, ולאחר מכן להסיר את הצינור מן המים לרחוץ ולאפשר לו להפשיר בטמפרטורת החדר. לאחר מופשר, בקצרה צנטריפוגות צינור ולמקם אותו מיד על הקרח.
    2. משתמשים בוירוסים דורות שני סנדאי מסחרי על ידי הוספת הכמויות המתאימות (לפי COA) עבור כל אחד הצינורות על מנת להשיג את הריבוי הבא של זיהום (משרד פנים) עד 1 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים מחומם מראש לכל טוב להיות transduced כמו בצע : KOS = 5 x 10 6 CIU, HC-Myc = 5 x 10 6 CIU, hKlf4 = 3 x 10 6 CIU.
    3. לערבב ביסודיות הפתרון ויראלי ידי pipetting את התערובת בעדינות מעלה ומטה. משליםte לשלב הבא תוך 5 דקות.
    4. לשאוב פיברובלסטים בינוני מהבאר של פיברובלסטים, לתכנת מחדש, ולהוסיף 1 מ"ל של הפתרון ויראלי היטב כל אחד. מניח את התאים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור דגירת הלילה.
  3. לאחר דגירת הלילה, לשאוב את המדיום התמר ולסלק את המדיום הישן כראוי (פתרון אקונומיקה 10% למשך 30 דקות). חלף עם 2 מיליליטר של טרום חמם פיברובלסטים בינוניים וממשיכים תרבות תאי transduced.
  4. תרבות התאים למשך 6 ימים נוספים, החלפת המדיום הישן עם פיברובלסטים בינוניים טריים בכל יום אחר.
    הערה: אל מעבר התאים לתכנות מחדש עד 7 ימים שלאחר התמרה.
  5. כלי היכונו דור iPSC: יום 6
    1. עבור דור iPSC תלוי מזין, להוסיף 1.5 מיליליטר של תמיסת הג'לטין 0.1% היטב בכל צלחת 6-גם בתרבית רקמה (TC) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. הסר את הג'לטין 0.1% כךlution אחרי שעה 1 של דגירה. הוסף 3 x 10 5 פיברובלסטים עובריים בעכבר mitotically מומת (iMEF) ב 2 מ"ל של מדיום iMEF לכל היטב דגירה של 37 מעלות צלזיוס חממה לילה.
    3. עבור דור מזין עצמאי iPSC, להוסיף 1.5 מיליליטר של מטריקס קרום במרתף המדולל (דילול 1: 100) היטב בכל צלחת 6-גם בתרבית רקמה (TC) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  6. שבעה ימים לאחר התמרה, לקצור את פיברובלסטים transduced מחדש צלחת אותם על תרבות המנות שהוכנו מראש עבור דור מושבת iPSC.
    1. לשאוב את מדיום התרבות הנורמלי מן פיברובלסטים, לשטוף את התאים פעם עם 2 מיליליטר של D-PBS.
    2. לשאוב את D-PBS לשטוף ולהוסיף 0.5 מ"ל של טריפסין מחומם מראש 0.05% / EDTA. דגירת התאים למשך 3 - 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. כאשר התאים יש מעוגל למעלה, להוסיף 2 מ"ל של טרום חימם פיברובלסטים בינוני לבאר כל להפסיק trypsinization. לסלק את התאים מן היטב על ידי pipetting בעדינות tהוא בינוני על פני השטח של המנה. אסוף את השעית תא צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חרוטים.
    4. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 2 דקות. לשאוב supernatant, מחדש להשעות את התאים 2 מיליליטר טרי, בינוניים פיברובלסטים מחוממים מראש.
    5. ספירת התאים בשיטה הרצויה (hemocytometer או נגד תא אוטומטי) וזרע את כלי התרבות המוכנים מראש עם 5 x 10 4 תאים תנאים מזינים תלוי 1 x 10 5 תאי תנאים מזינים-עצמאי, לכל טוב של 6 "טוב צלחת לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך הלילה.
    6. בעקבות הדגירה לילה, לשנות את ממדיום למדיום hPSC, בינוני E8 או מדיה ממוזג iMEF, בהתאם ליישום. החלף את המדיום הישן עם מדיום חדש כל יום לאחר מכן.

3. תכנות מחדש סנדאי של תאי גזע BGO1v hOct4-GFP כתב עובריים (hESC) הנגזר פיברובלסטים משנית

  1. דרive פיברובלסטים אדם משני מקו hESC כתב BG01v hOct4-GFP לפי הנוהל שתואר לעיל 9.
  2. יומיים לפני התמרה, צלחת BGO1v / HOG נגזר פיברובלסטים לשתי בארות של צלחת 6-היטב ב -2 x 10 5 תאים לכל טוב, באמצעות פיברובלסטים בינוני.
    1. ביום של התמרה, טרום חם 2 מ"ל של פיברובלסטים בינוני עד 37 ° C.
    2. הסר קבוצה אחת של צינורות סנדאי מהאחסון -80 ° C. הסר הצלוחיות מן הכיס להפשיר צינור אחד אחד בכל פעם על ידי טבילה בתחתית הראשונה של הצינור בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 - 10 שניות, ולאחר מכן, לאפשר את הצינורות כדי להפשיר בטמפרטורת חדר. לאחר מופשר, בקצרה צנטריפוגות צינור ולמקם אותו מיד על הקרח.
    3. מוסיף את הכרכים המצוינים של כל אחד מהשלושה צינורות סנדאי (ראה CoA עבור הנפח המתאים) 2 מיליליטר של פיברובלסטים בינוניים, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס וביסודיות לערבב פתרון ויראלי ידי pipetting למעלה ולמטה. השלם את STE הבאp בתוך 5 דקות.
      הערה: לצורך ניסוי זה, משרד פנים של 5: 5: 6 נוצלו.
    4. לשאוב פיברובלסטים בינוני מבארות פיברובלסטים להיות transduced. הוסף 1 מ"ל של ההשעיה ויראלי לכל אחד שתי בארות להיות transduced. מניח את התאים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור דגירת הלילה.
    5. לאחר דגירת הלילה, להסיר את מדיום התמרה ועושה את זה כמו שצריך (פתרון אקונומיקה 10% למשך 30 דקות). החלף כל טוב עם 2 מ"ל של מדיום פיברובלסטים מחומם מראש ולהמשיך התרבות תאים transduced.
  3. תרבות התאים למשך 6 ימים נוספים, לשנות את המדיום הישן עם פיברובלסטים בינוניים טריים בכל יום אחר.
    1. שבעה ימים שלאחר התמרו, לקצור את פיברובלסטים transduced מחדש צלחת אותם על תרבות המנות שהוכנו מראש עבור דור מושבת iPSC.
    2. לשאוב את מדיום התרבות הנורמלי מן פיברובלסטים, לשטוף את התאים פעם עם 2 מיליליטר של D-PBS.
    3. לשאוב את העקוריםBS לשטוף ולהוסיף 0.5 מ"ל של טריפסין מחומם מראש 0.05% / EDTA. דגירת התאים למשך 3 - 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. כאשר התאים יש מעוגל למעלה, להוסיף 2 מ"ל של טרום חימם פיברובלסטים בינוני לבאר כל להפסיק trypsinization. לסלק את התאים מן היטב על ידי pipetting המדיום בעדינות על פני השטח של המנה. אסוף את השעית תא צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חרוטים.
    5. צנטריפוגה התאים ב 200 x גרם במשך 2 דקות. לשאוב supernatant, מחדש להשעות את התאים כמות מתאימה של בינוני פיברובלסטים טרי, מחומם מראש.
    6. ספירת התאים בשיטה הרצויה (hemocytometer או נגד תא אוטומטי).
    7. זרעי תאי transduced בצפיפות של 1 x 10 5 תאים לכל טוב של מטריצת קרום במרתף מצופה צלחת 6 היטב דגירה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך הלילה.
  4. בעקבות דגירת הלילה, לשנות את המדיום כדי iMEF בינוני אוויר, בתוספת 10 ng / ml של FGF ב. החלף את המדיום הישן עם היומיום iMEF CM טרי לאחר מכן.
  5. שלושה שבועות לפרסם התמרה, מכאני לנתח ולהעביר המושבות הרצויות עבור שיבוטים או להשתמש לניתוח.

4. הדמיה של תא חי פיברובלסטים תכנות מחדש

  1. ניטור בזמן אמת
    1. 7 ימים שלאחר התמרה עם ערכת תכנות מחדש סנדאי, לזרוע את הכמות הרצויה של תאים על גבי צלחות 6-היטב עם מערכות בינוניות מטריקס הרצוי כפי שתואר לעיל. מניחים את מנות זרע בתוך תרמי, ממוקם בתוך חממה humidified נקבע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    2. הגדר את תוכנת ההדמיה כדי ללכוד תמונות גם של כל אחד מבין היטב פרט במרווח סט (כל 6 - HR 8) של תמונה רציפה הלכידה עבור 14 הימים הבאים על פי הפרוטוקול של היצרן.
      הערה: הגדרות תמונה בניגוד שלב נבחרו לתכנות מחדש נורמלי להעריך התקדמות המושבה. במקרהשל BG01v / HOG נגזר תכנות מחדש פיברובלסטים, עדיף ללכוד תמונות בניגוד שלב ובערוץ פלואורסצנטי ירוק כמו הפעלה מחדש של הכתב Oct4-GFP אנדוגני ניתן לעקוב לאורך כל תהליך תכנות מחדש.
    3. שינוי המדיום יומי, זה יכול להיות בינוני hPSC, בינוני E8, או iMEF-CM, תלוי בניסוי, כפי שתואר לעיל מ יום 8 כדי 21 שלאחר התמר. הבארות ניתן לבצע עיבוד נוסף עבור היווצרות המושבה באמצעות immunofluorescence עקיפה.
    4. בסוף הניסוי ביום 19 עד 21, להסיר את מדיום התרבות מכל טוב להיות נחקר עם נוגדנים פיברובלסטים גזע סמני תא של בחירה.
    5. לשטוף היטב כל פעם עם 2 מ"ל של מדיום מראש חימם DMEM / F-12.
    6. הכן aliquots של כל זוגות נוגדן ראשוני חיובי / שלילי 1 מ"ל של מדיום DMEM / F-12 כדלקמן: SSEA4 אנטי עכבר (1: 200) ו CD44 אנטי עכברוש (1:50), אנטי עכבר TRA-1- 60 (1: 200) ו CD44 אנטי עכברוש (1:50), אלקליין פוספטאז Live כתם (1:50) ו CD44 אנטי עכברוש (1:50). הוסף 1 פתרונות הנוגדן ראשונים מיליליטר לכל מקביל היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
    7. לשאוב את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף פעמיים עם מדיום מראש חימם DMEM / F-12.
    8. הכן פתרונות נוגדנים משני (1 מיליליטר לכל היטב) באמצעות עזים אנטי עכבר אלקסה פלואוריד 488 משני מצומדות (1: 500) על קרינה ירוקה-עכברוש עז אנטי Alexa פלואוריד 594 משני מצומדות (1: 500) על קרינה אדומה DMEM / בינוני F-12. הוסף היטב כל לאחר השטיפה של הדבר. דגירת הנוגדנים משני למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: בשל אלקליין phosphatase Live של הכתם (APLS) אות חולפת, הדגירה העיקרית אנטי CD44 צריכה להתבצע תחילה על ידי עצם ואת APLS יש להוסיף בעת הדגירה עם נוגדנים משני
    9. לאחר דגירה נוגדנים משני, לשאוב את הפתרון ולשטוף פעמיים עם DMEM / בינוני F-12. הוסף DMEM מראש חימם טרי / F-12בינוני זה טוב לפני לכידת תמונה סופית.
    10. הגדר את התוכנה תרמי לרכוש תמונות גם של כל אחד מבין היטב באמצעות כל שלושת הפרמטרים סריקה: בניגוד שלב, פלואורסצנטי ירוק אדום פלואורסצנטי. יצירת תמונות בהגדלה שונה וליצור זמן לשגות סרטים עם התוכנה לניטור צמיחת ביטוי סמן. השתמש הפרוטוקול של היצרן.
    11. ניצול תוכנת ניתוח, להעריך מפגש של זמן מעל היטב בניגוד שלב וביחידות פלואורסצנטי ירוק עבור תכנות מחדש BG01v / HOG.
  2. ניטור שטח פני התא סמנים באמצעות ביניים Reprogramming
    1. מעקב אחר אירועי תכנות מחדש בנקודות זמן שונות על ידי חיטוט מנות תכנות מחדש בנקודות זמן שונות עם נוגדנים כנגד סמנים שליליים חיוביים / תאי גזע שונים על מנת לפקח על תהליך תכנות מחדש. תרבויות Probe כל 2 עד 3 ימים בהתאם לזמינות של משכפל. לחקור את דיס תכנות מחדשהס ב יום 19 עד 21 באמצעות האסטרטגיה המכתימה הכפולה לזהות מושבות iPSC לתכנות מחדש באופן מלא מושבות לתכנות מחדש באופן חלקי על בסיס דפוסי המכתים.
    2. בנקודת הזמן הרצויה, לשאוב את מדיום הצמיחה הנורמלי מכל טוב להיות נחקר עם נוגדני הסמנים של בחירה.
    3. לשטוף היטב כל פעם עם 2 מ"ל של מדיום מראש חימם DMEM / F-12.
    4. הכן aliquots של כל זוגות נוגדן ראשוני חיובי / שלילי 1 מ"ל של מדיום DMEM / F-12 כדלקמן: SSEA4 מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1: 200), TRA-1-60 מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1: 50), הכתם חי אלקליין (1: 500), CD24 מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1:50), B2M מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1:50), EpCAM מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1:50) העכבר, CD73 (1: 100) אשר נחקר עם נוגדנים משני אנטי עכבר מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1: 500), ו CD44 חולדה (1:50) אשר נחקר עםנוגדנים משני אנטי עכברוש מצומדות כדי fluorophore הניאון האדום (1: 500). הוסף 1 פתרונות הנוגדן ראשונים מיליליטר לכל מקביל היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
    5. לשאוב את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף פעמיים עם מדיום מראש חימם DMEM / F12.
    6. עבור נוגדני unconjugated, להמשיך בשיטת 2-צעד בהכנת פתרונות נוגדנים משני המתאימים דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. ודא נוגדנים משני הם למארחים הראשיים ולא לחצות להגיב. בצע שלבים לשטוף נוספים כפי שתואר לעיל.
    7. אחרי הכל שוטף המתאים, להוסיף מראש חימם טרי DMEM / F-12 בינוני זה טוב לפני לכידת התמונה הסופית.
    8. ללכוד את התמונות פלורסנט תחת המסנן המתאים בהגדלת 100X באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולנתח את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח זמינה.

מדידת 5. של קינטיקס תכנות מחדש באמצעות זרימת Cytometry

  1. מדידה קינטי כמותי של תכנות מחדש באמצעות נוגדנים פני התא
    1. לפני תכנות מחדש, להגדיר את המספר המתאים של ניסויי תכנות מחדש עבור כל נקודת זמן. למדידת קינטיקה של תכנות מחדש של תכנות מחדש 7 ימים הראשונים, transductions הפרט מבוצע עבור כל נקודת זמן רצויה. לקבלת מועדים לפי שעון לאחר יום 7, זרע נקודות זמן מספיק עצמאי מזין להמשיך למדוד את אירועי תכנות מחדש. באר אחד של צלחת 6-גם תניב כמויות מספיקות של תאים לביצוע ניתוח תזרים cytometry.
    2. מדוד בכל נקודות זמן תכנות מחדש הרצויות מתוך בארות בודדות, כפי מדובר assay נקודת סיום. לשאוב את פיברובלסטים בינוני מן הרצוי היטב. שטפי פעם עם D-PBS.
    3. לשאוב את לשטוף D-PBS. הוסף 1 מ"ל של תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA אל הבאר כדי להיבדק. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    4. לאחר הדגירה, dissociאכלו את התאים לתוך תאים בודדים ידי שטיפה ההשעיה תא 1 מ"ל נגד פני השטח של הבאר ולהעביר את ההשעיה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. השתמש 3 מ"ל של D-PBS לשטוף את כל התאים הנותרים מהבאר ולהוסיף אותם אל חרוטי 15 מ"ל. השתמש 10 מיליליטר של D-PBS הנוספת כדי לדלל את תמיסת תא נוסף בצינור החרוטים.
    5. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 2 דקות. לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה לתוך 1 מ"ל של מדיום DMEM / F-12. בצעו ספירת תאים לפי הצורך כדי ליצור ההשעיה תא סטנדרטי כי הוא פחות מ 1 x 10 6 תאים / מ"ל.
    6. כן aliquot כל נוגדנים חיוביים / שליליים ישירות מצומדות בחירה 1 מיליליטר של מדיום DMEM / F-12 עבור פחות 1 x 10 מיליליטר 6 תאים / באמצעות השילובים הבאים: SSEA4 מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1: 200) עם CD44 מצומדות כדי PE-Cy5, או CD44 מצומדות כדי fluorophore ניאון ירוק SSEA4 מצומדות כדי fluorophore fluorescing אדום לכת. לִדגוֹרהנוגדנים עם ההשעיה תא במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. לשאוב את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף פעמיים עם מדיום מראש חימם DMEM / F-12.
    8. לשאוב לשטוף הסופי מחדש להשעות את התא גלולה ב 1 מ"ל של D-PBS. Pipet את התוכן של כל השעיה צינורות FACS הפרט.
    9. באמצעות הפקדים השליליים המתאימים (שולט בלא כתם אלוטיפ), לאשר את הפיזור קדימה וצד נכון הפרופיל ומתחים על cytometer. הגדר את המתחים עבור fluorophores המתאים על פי פרמטרים כתמים יחיד ראשוניים, כך fluorophores הירוק מופעלים על ידי הליזר הכחול האותות רכשו בערוץ BL1, בעוד fluorophore fluorescing האדום רחוק fluorophore PE-Cy5 מופעלים על ידי הליזר האדום אותות רכשו בערוץ RL1. רוכש את האוכלוסייה הכפולה מוכתם עבור כל נקודת זמן.
    10. לנתח את קבצי FCS עבור כל נקודת זמן באמצעות תוכנת ניתוח המתאים ולהשתמש לעורך ערהנתוני nge לקיים את משמרת ביטוי אוכלוסייה לאורך זמן.
    11. בצע את שלבי 5.1.1 כדי 5.1.6, אם מיון תא הוא רצוי בנקודות זמן שונות. השתמש שילובים fluorophore המתאים בהתאם לתצורת לייזר של סדרן התא כדי לשמש.
    12. בעקבות לשטוף הסופי, מחדש להשעות את התא גלולה ב 1 מ"ל של חיץ מיון התא. הגדרת סדרן תא פיזור קדימה וצד הנכון ההגדרות באמצעות פקד בלא כתם. השתמש בפקדים צבעוניים אחת להגדיר את ההגדרות המתאימות עבור כל fluorophore.
    13. השתמש מדגם קטן של השעית התא הכפולה מוכתם; לבחור את 2 האוכלוסיות להיות מסודרות ולהקצות את המטען המתאים כדי להבטיח אוסף התקין של התאים הממוינים.
    14. הוסף 200 μl של מדיום התאוששות תא לתוך הצינורות האוספים כדי להבטיח כי השעית התא המסודרת מרופדת ומוגנת בעת מיון. קציר את מספר הרצון של תאי ולהעביר על מנות iMEF חדשות המכילות טריly מוכן בינוני התאוששות.
    15. שינוי המדיום הבא הדגרתי לילה עם מדיום ההתאוששות. התרבויות חייבות להיות מוזן מכן ובאופן שגרתי passaged באמצעות מדיום hPSC המכיל פניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / ריכוז סופי מיליליטר).

6. ניתוח Endpoint

  1. Terminal אלקליין phosphatase (AP) מכתים
    1. השתמש מכתים AP chromogenic מסוף לתאם אירועים הקינטית מורפולוגיים הנצפית עם יעילות תכנות מחדש הסופי.
    2. בעקבות 21 ימים של תכנות מחדש, להסיר את המדיום תרבות מהבאר להיות מוכתם בכתם מסוף AP ולשטוף פעם עם 200 mM Tris-HCl (pH 8.0).
    3. הכן את הכמות המתאימה של פתרון מכתים כפי שיורה במדריך של היצרן ב 200 mM Tris-HCl.
    4. לשאוב לשטוף ולהוסיף 2 מ"ל של הפתרון מכתים מוכן היטב כל אחד. דגירה במשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר, הרחק האור הדואר.
    5. לשאוב את הפתרון מכתים ולשטוף פעם עם 200 מ"מ טריס HCl. הסר לשטוף ולהוסיף מים מזוקקים לפני להדמיה.
    6. ללכוד את אות colorimetric באמצעות מצלמה בשידורים רגילה. ספירת מושבות מוכתמות חיובי ביד. דמיינו את הכתם באמצעות ניתוח פלורסנט בערוץ טריט-C, כמו הכתם הוא גם פלורסנט בטבע ולבצע הדמיה כולו היטב ונותחו באמצעות תרמי היטב כולו. השתמש הפרוטוקול של היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניטור קינטיקס Reprogramming שימוש cytometry זרימה

CD44 הוא סמן פיברובלסטים בעוד SSEA4 הוא סמן PSC 6,10. כצפוי מדפוס הביטוי הזה, cytometry זרימה של ב"ג פיברובלסטים מראה SSEA4 - CD44 + האוכלוסייה המאפשרת יצירת שערים ברבע בשילוב עם מדגם בלא כתם. במהלך תכנות מחדש של פיברובלסטים DF1 עם וירוסים סנדאי, CD44 הוא איבד בהדרגה תוך SSEA4 מתבטא לאט. ביום 3 לאחר התמרה עם וירוסים סנדאי, יש אוכלוסיה גדולה של SSEA4 - CD44 + תאים אוכלוסייה קטנה של תאים SSEA4 + CD44 + שהופכת יותר ברורים ב יום 7 (איור 1). ביום 13, אוכלוסיית הפעמים חיוב מעברים לכיוון SSEA4 + CD44 - המדינה. לפי יום 17, אחוז גדול של ceLLS בתרבות כבר SSEA4 + CD44 -. מופעים כמובן הפעם כי cytometry זרימה עם CD44 ו SSEA4 ניתן להשתמש כדי לפקח על ההתקדמות וקצב של תכנות מחדש.

השוואה כמותית מאשרת כי פיברובלסטים ב"ג תכנות מחדש עם וירוסים תכנות מחדש סנדאי מייצר SSEA4 + CD44 - תאים בקצב שונה מאשר תכנות מחדש של ב"ג פיברובלסטים (איור 2 א). הנתונים מוכיחים כי השוואה מוקדמת של האחוז PSC הדמוי SSEA4 + CD44 - תאים עוקבת אחר ההתקדמות של תכנות מחדש. מעניין לציין, כי ב יום 8 של תכנות מחדש פיברובלסטים DF1, מיון בנפרד culturing אוכלוסיית תאים הנמצאים בתהליך של upregulating SSEA4 ו downregulating CD44 מייצר AP + מושבות 11 (תרשים 2B). לעומת זאת, SSEA4 המקורי - האוכלוסייה CD44 + מייצר בבוקרUch מספר קטן יותר של מושבות AP + ב יום 21 של תכנות מחדש, המהווה את היום הטיפוסי של ניתוח מושבה סופי. הדבר מצביע על כך שזה אפשרי לכמת ולהשוות אוכלוסייה במעבר כדי לחזות הבדלים קינטיקה תכנות מחדש עוד לפני SSEA4 + CD44 - האוכלוסייה נוצרה. נקודה חשובה שיש לשים לב כאן היא תכנות מחדש הוא תהליך משתנה תלוי במספר גורמים כגון הפעלת אוכלוסיית תאים סומטיים, יעילות תמרה, בינוני, וכו 'עם זאת התבנית וההתקדמות הכללית של סמני המשטח שתוארו לעיל עולה בקנה אחד בין ניסויי תכנות מחדש שונים החל פיברובלסטים. הניתוח של קינטיקה תכנות מחדש יכול להיעשות גם עם סמנים שונים, כגון סמנים PSC זיהו לאחרונה שלילי CD73 ו -6 B2M, כמו גם סמנים PSC הוקמה CD24 12,13 ו EpCAM 14,15. בדומה CD44, CD73 ו B2M באים לידי ביטוי בסעיףב"ג פיברובלסטים ental, אבל הם downregulated במהלך תכנות מחדש, הופכת לגילוי ב iPSCs לתכנות מחדש באופן מלא (איור 3 א). זרימה cytometry כמובן זמן באמצעות CD44 ו CD73 או CD44 ו B2M מראה כי CD44 ו CD73 הם downregulated בשיעור דומה, ואילו B2M הוא downregulated מהר יותר CD44 (איור 3 ב). בשני המקרים, השיעור של תכנות מחדש יכול להיות שנצפה על ידי מדידת ההצטברות של האוכלוסייה השלילית הכפולה. בניגוד סמני PSC השליליים הללו, CD24 ו EpCAM נעדר פיברובלסטים ובאים לידי ביטוי iPSCs (איור 3 א). בשנת זרימה cytometry כמובן זמן, CD24 - CD44 + ו- EpCAM - CD44 + פיברובלסטים בסופו של דבר ליצור אוכלוסיות השלילה הכפולה שצריך לעבור מאוחר יותר לתוך CD24 + CD44 - ו EpCAM + CD44 - תאים דמויי PSC, בהתאמה (איור 3). לפיכך, במהלך תכנות מחדש, הוא סמני PSC חיובייםבאים לידי ביטוי לאחר הוא downregulated CD44. בדומה למה נצפתה עם SSEA4 ו CD44, היווצרות והצטברות של אוכלוסיות תאים שונות מצביעות על התקדמות של תכנות מחדש.

מעקב תכנות מחדש באמצעות ניתוח הדמיה בזמן אמת

הדמיה בזמן האמת של תכנות מחדש תרבויות לאחר הזריעה מחדש מופעי ההיווצרות ההדרגתית של מושבות (איור 4 א), אשר תואמת את גידול לוגריתמים ב מפגש תחת בניגוד שלב (האיור 4B). מפגש תחת בניגוד שלב ובכך מספק ערך אחר לניטור תכנות מחדש כמותית, אבל זה כולל את שתי הגרסאות, המושבות, כי הם חיוביים עבור סמנים PSC ואת המשך התפשטות של תאים unreprogrammed או חלקית לתכנות מחדש (איור 4 א, ​​הפאנל האחרון). כימות אזורים כי כבר מוכתם עבור סמנים pluripotencyTRA-1-60, SSEA4 ו AP 6,10 ב יום 21 עולה כי iPSCs מהווים רק פחות ממחצית מפגש הכולל (איור 4). כדי למדוד את ההתקדמות של תכנות מחדש באופן מחמיר, אפשר להשתמש בקו כתב לתכנות מחדש. הנה, פיברובלסטים משני נוצרו מקו BG01v / HOG ESC, אשר תוכנן עם כתב Oct4-GFP 16. GFP מבוטא התאים לתכנות מחדש וכפי מושבות נוצרות (איור 5 א). מפגש מדידה תחת בניגוד שלב ואת ערוצי ירוק מוכיח כי מפגש GFP מגביר לאט יותר מאשר המפגש הכולל, ואת מפגש GFP ב יום 19 הוא פחות ממחצית המפגש הכולל (איור 5), מזכיר TRA-1-60, מכתים SSEA4 ו AP ב יום 21.

איור 1
איור 1. מוnitoring ההתקדמות של תכנות מחדש שימוש cytometry זרימה. מגרשים cytometry זרימה Dot עבור DF1 פיברובלסטים לתכנות מחדש עם סנדאי וירוסים תחת תנאי מזין חינם. התאים נקצרו מוכתם נוגדנים SSEA4 ו CD44 במרווחי זמן שונים בין 3 יום (D3) ליום 19 (D19) של תהליך תכנות מחדש. תרבויות ביום 9 (D9) ואילך נותחו לאחר התאים היו reseeded ב יום 7 (D7). מגרשי דוט להראות 8,000 singlets. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
. איור 2. הערכת Reprogramming קינטיקס ויעילות בתנאי מזין ללא (א) גרף המציג שינויים באחוז SSEA4 + CD44 - לתכנות מחדש תאים לאחר transducing לבלף DF1roblasts ו פיברובלסטים ב"ג עם וירוסים סנדאי. תאים נותחו על ידי cytometry זרימה ב יום 3 עד 19 שלאחר התמר, עם תרבויות ביום 9 ואילך עוברות זריעה מחדש ב יום 7. (ב) פסיאודו צבע cytometry זרימה מגרש עבור תאי DF1 transduced וירוסים סנדאי ומוכתמים עם נוגדני SSEA4 ו CD44. SSEA4 -. CD44 + תאים (עיגול שחור) SSEA4 + תאים (עיגול אדום) מוינו ב יום 8 ואיפשר לגדול עד יום 19 לפני מכתים עבור phosphatase אלקליין (אדום) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. קינטיקס Reprogramming התבוננות של תרבויות מזינות ללא באמצעות סמני PSC חיוביים ושליליים שונים. (AD) מכתים חישל תרבויות תכנות מחדש היום-18 DF1 הנגזרים באמצעות נוגדנים עבור סמני PSC החיוביים CD24 ו EpCAM וסמנים PSC השליליים CD44, CD73, ו B2M. הפנלים העליונים למזג את ערוצי פלואורסצנטי הירוקים ואדום בעוד לוחות התחתונים גם לכלול את התמונה לעומת השלב. סרגל הסולם מייצג 200 מיקרומטר. (E) cytometry זרימה מגרש נקודה עבור תרבויות תכנות מחדש הנגזרות DF1 שנקטפו ומוכתמת באמצעות אותו הסמנים מ יום 9 עד 17 (D9 כדי D17) שלאחר התמר. לפני הניתוח, תרבויות היו reseeded ב יום 7. מגרשי דוט להראות 8,000 singlets. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. מעקב Reprogramming קינטיקס ידי מדידת מפגש סה"כ. (א) בזמן אמת imaging של ב"ג פיברובלסטים לתכנות מחדש עם וירוסים סנדאי בתנאים מזינים חינם. בניגוד שלב תמונות של אותו מושבות צולמו יום אחד 7 עד 19, ואז יום 21 עם מכתים נוסף עבור CD44 ו SSEA4, TRA-1-60 או AP. סרגל קנה מידה מתאים ל 400 מיקרומטר. (ב) כימות של מפגש כולל (לעומת שלב) כמו תכנות מחדש עם התקדמות מן הזריעה מחדש ב יום 7 עד יום 21. מפגש סה"כ ב יום 21 מושווית SSEA4, TRA-1-60 ו מפגש אות AP ( מסלול ירוק). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. הערכת קינטיקס תכנות מחדש על ידי מדידת Oct4-GFP מפגש. (א) הדמיה בזמן אמת של פיברובלסטים BG01v / HOG hESC הנגזרות לתכנות מחדש עםסנדאי וירוסים בתנאים מזינים חינם. בניגוד שלב, פלואורסצנטי ירוק ומתמזג תמונות מאותו המושבות נוצרו ב יום 7 עד 19. סרגל קנה מידה מתאים ל 400 מיקרומטר. (ב) כימות של מפגש הכולל (בניגוד לפאזה) מפגש Oct4-GFP (מסלול ירוק) כמו תכנות מחדש מתקדם מ מחדש זריעה ב יום 7 עד יום 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים [RHQ, JSTA, KS, ו UL] הם עובדי תרמו פישר סיינטיפיק, אשר מייצרת חלק ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

Acknowledgments

המחברים מודים צ'אד מקארתור לדיונים מועילים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin Thermo Fisher Scientific 16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts Thermo Fisher Scientific A24903
Attachment Factor Protein (1x) Thermo Fisher Scientific S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565-018
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
Collagenase, Type IV, powder Thermo Fisher Scientific 17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red  Thermo Fisher Scientific 12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium  Thermo Fisher Scientific 14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413302
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260-037
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
InSolution Y-27632 EMD Millipore 688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal ATCC CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast Thermo Fisher Scientific N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells Thermo Fisher Scientific R7799-105
IncuCyte ZOOM Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) Thermo Fisher Scientific SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) Thermo Fisher Scientific A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70) Thermo Fisher Scientific 41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A) Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate Thermo Fisher Scientific A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) Thermo Fisher Scientific RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate Thermo Fisher Scientific MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) Thermo Fisher Scientific A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) Thermo Fisher Scientific A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2) Thermo Fisher Scientific 41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope  Carl Zeiss 491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software FLOJO, LLC N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser Thermo Fisher Scientific Use Attune NXT 
S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) BIO-RAD 1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap Corning 352235
Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap Corning 352097
Falcon T-75 Flask Corning 353136
Falcon T-175 Flask Corning 353112
Falcon 6-well dish Corning 353046
Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator Thermo Fisher Scientific 51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml AM12450
HulaMixer Sample Mixer 15920D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  2. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  3. Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834 (2010).
  4. Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
  5. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  6. Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419 (2014).
  7. Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
  8. Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728 (2014).
  9. Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
  10. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
  11. Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
  12. Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
  13. Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
  14. Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
  15. Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
  16. Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 113 תכנות מחדש תאי גזע מושרים הדמיה בזמן אמת cytometry זרימה סמני תא גזע פלוריפוטנטיים מדידה הקינטית
מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J.,… More

Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J., Sylakowski, K., Lakshmipathy, U. Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming. J. Vis. Exp. (113), e54190, doi:10.3791/54190 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter