Summary
Protokollen præsenteres i denne undersøgelse beskriver fremgangsmåder til tidstro overvågning af omprogrammering progression via den kinetiske måling af positive og negative pluripotente stamceller cellemarkører ved anvendelse af flowcytometri analyse. Protokollen omfatter også imaging-vurdering af morfologi, og markør eller reporter udtryk under iPSC generation.
Introduction
Patient-afledte inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er lovende redskaber til celleterapi og narkotika screening. De giver et autologt kilde til celler til terapi. Derudover de omfatter en meget bred vifte af genetiske baggrunde, der muliggør en detaljeret in vitro analyse af genetiske sygdomme ud over, hvad nuværende embryonale stamceller (ESC) linjer ville tillade. Nylige fremskridt har ført til udviklingen af flere metoder til generering iPSCs, herunder omprogrammering med Sendai-virus, episomale plasmider eller mRNA'er 1,2. Især er forskellige omprogrammering metoder i forbindelse med varierende niveauer af effektivitet og sikkerhed, og vil sandsynligvis variere på andre måder, der påvirker deres egnethed til forskellige applikationer. Med tilgængeligheden af en række omprogrammering teknologier, er det blevet vigtigt at udvikle metoder til at vurdere omprogrammering proces. De fleste eksisterende metoder er afhængige af den kvalitative undersøgelse af morfologi eller farvningstamcelleantistoffer-specifikke farvestoffer og antistoffer. En nylig udviklet metode gør brug af lentivirale fluorescens reportere der er følsomme for PSC-specifikke miRNA eller differentierede cellespecifikke mRNA'er 3. Sådanne overvågningsmetoder lette udvælgelsen og optimering af omprogrammering teknikker til forskellige situationer. For eksempel har CDy1 blevet anvendt som en fluorescerende probe til tidlige iPSCs for at screene for omprogrammering modulatorer 4. Evnen til at observere og sammenligne forskellige omprogrammering eksperimenter er også kritisk til at få en bedre forståelse af selve processen. For eksempel er det nu kendt, at nogle somatiske celletyper er lettere at omprogrammere end andre 5, og at celler går gennem mellemliggende tilstande under omprogrammering 6-8. Desværre, mekanismerne bag omprogrammering proces er stadig ikke helt forstået og dermed de nøjagtige forskelle mellem omprogrammering metoder også mangler at blive defined. Således metoder til overvågning, vurdering og sammenligning af omprogrammering begivenheder fortsat være kritisk for stamcelle feltet.
De er beskrevet i denne protokol metoder muliggøre overvågning og vurdering af den omprogrammering proces, og viser, hvordan disse teknikker kan bruges til at sammenligne forskellige sæt omprogrammering reagenser. Den første fremgangsmåde involverer flowcytometri analyser anvendelse af kombinationer af antistoffer mod positiv og negativ pluripotente stamcelle (PSC) markører. Den anden fremgangsmåde par imaging i realtid og måling af total sammenflydning (den procentvise overfladeareal dækket af cellerne) og sammenløbet af markør signaler (den procentvise overfladeareal dækket af de fluorescerende signaler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.Solution og Medium Forberedelse
- Basalmembranmatrix (oprenset fra Engelbreth-Holm-Swarm Tumor)
- tø langsomt basalmembranmatrix (5 ml) på is ved 4 ° C natten over.
- Fortynd stamopløsning 1: 1 med 5 ml iskold, steril DMEM / F-12-medium i en steril, forkølet 15 ml konisk rør. Dispensere alikvoter i nedkølede, 1,5 ml sterile mikro centrifugerør og straks opbevares ved -20 ° C.
- Før brug, optø frosne 1: 1 basalmembranmatrix alikvot natten over ved 4 ° C. På tidspunktet for anvendelse, yderligere løsne 1: 1 alikvot yderligere 50 gange med iskold, steril DMEM / F-12-medium til en endelig fortynding på 1: 100.
- Tilsættes en passende mængde af 1: 100 fortyndet basalmembranmatrix løsning til den relevante vævskultur (TC) fartøjer og inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Typisk bruge 3 ml af den fortyndede basalmembranmatrix opløsning til at overtrække en TC skål of 20 cm2 overfladeareal, belægge alle andre typer af TC retter / plader ved et forhold på 0,15 ml fortyndet matrix pr cm2 overfladeareal. Aspirere den resterende opløsning før tilsætning af nogen dyrkningsmedium og celler.
- fibroblast Medium
- Tø en 100 ml flaske ES Qualified kalvefosterserum (ES-FBS) ved 4 ° C natten over.
- Tilsæt 50 ml af den optøede ES-FBS og 5 ml MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning (1x) til 445 ml DMEM-medium. Steriliser de kombinerede komponenter gennem et 0,22 um filter og opbevar ved 4 ° C i op til 4 uger.
- iMEF Medium
- Tø en 100 ml flaske ES-FBS ved 4 ° C natten over.
- Der tilsættes 50 ml af den optøede FBS 5 ml MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning (1x) og 500 pi 2-mercaptoethanol til 445 ml DMEM-medium.
- Steriliser de kombinerede komponenter gennem et 0,22 um filter og opbevar migdium ved 4 ° C i op til 4 uger.
- Basisk fibroblastvækstfaktor opløsning (b-FGF)
- Tilsæt 10 pi serum Erstatning til 990 pi D-PBS og blandes grundigt ved pipettering op og ned.
- Tilsæt 1 ml af 1% (v / v) serum Replacement løsning på et hætteglas af 10 ug lyofiliseret b-FGF. Blandes grundigt ved forsigtigt at pipettere op og ned.
- Alikvot den 10 ug / ml b-FGF-opløsning i 200 pi alikvoter i mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C indtil brug i op til 4 uger.
- Menneskelig Pluripotente Stem Cell (hPSC) Medium
- Tø en 100 ml flaske Serum Erstatning ved 4 ° C natten over.
- Tilsættes 100 ml af den optøede Serum Replacement 5 ml MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning (1x) og 500 pi 2-mercaptoethanol til 395 ml DMEM / F-12 medium.
- Steriliser de kombinerede komponenter gennem et 0,22 um filter og opbevar mediet ved4 ° C i op til 4 uger.
- På tidspunktet for brug, pre-opvarme hPSC medium til 37 ° C og supplere med 4 ng / ml bFGF.
- iMEF Konditioneret medium (CM)
- Tilsættes 18 ml 0,1% gelatine til en T-175 dyrkningskolbe og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Fjern 0,1% gelatineopløsning efter en times inkubation. Tilføj 9.1 x 10 6 mitotisk-inaktiverede muse embryonale fibroblaster (iMEF) i 45 ml iMEF medium og inkuberes i 37 ° C inkubator natten over.
- Efter inkubation natten over, fjerne den gamle iMEF medium og vask en gang med 25 ml D-PBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer off D-PBS vaske og tilsættes 90 ml forvarmet hPSC medium suppleret med 4 ng / ml bFGF. Der inkuberes i 37 ° C inkubator i præcis 24 timer.
- Efter 24 timers inkubation aseptisk fjerne hPSC medium fra iMEF kolbe og sterilisere gennem et 0,22 um filter. Portion i 50 ml koniske rør og nedfryses til -20 ° C indtil brug. iMEF CM kan opbevares i op til 6 måneder ved -20 ° C.
- Tilføje yderligere 90 ml foropvarmet hPSC medium suppleret med 4 ng / ml bFGF til iMEF kolbe. Der inkuberes i 37 ° C inkubator i præcis 24 timer. Gentag høst af CM i op til 7 dage.
- På tidspunktet for brug, pre-opvarme iMEF-CM til 37 ° C og supplere med 4 ng / ml bFGF.
- E8 Medium
- Tø en 10 ml E8 supplement ved 4 ° C natten over.
- Fjern 10 ml af E8 basalt medium og tilsættes aseptisk indholdet af den optøede E8 supplement til den resterende basalt medium. Bland grundigt og sterilisere gennem et 0,22 um filter. Opbevar komplet medium ved 4 ° C i op til 2 uger.
- På tidspunktet for brug, pre-opvarme alikvot af mediet, der skal anvendes til stuetemperatur. Det anbefales ikke at pre-varm E8 Medium til 37 ° C.
- celle Sårting Buffer
- Forbered frisk sortering buffer lige før cellesortering ved tilsætning EDTA-opløsning (1 mM slutkoncentration), HEPES-buffer (25 mM slutkoncentration) Penicillin / Streptomycin-opløsning (100 enheder / ml endelig koncentration) og bovint serumalbumin (1% slutkoncentration) i Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (calcium og magnesium free).
- Sterilisere bufferen gennem et 0,22 um filter før bruger.
- Cell Sortering Recovery Medium
- Ændre 50 ml fibroblast Medium ved tilsætning Penicillin / Streptomycin (100 enheder / ml endelig koncentration) og Rock Inhibitor Y-27632 (10 uM slutkoncentration). Pre-varme dette medium til 37 ° C før podning af sorterede celler.
2. Sendai medieret Omprogrammering af humane fibroblaster
- 24 timer før transduktion med Sendai-vira, frø fibroblasterne ved en densitet på 2 x 10 5 calen per brønd i de ønskede brønde i en 6-brønds TC plade.
- Udfør transduktionen på dag 0 som følger.
- Pre-varme 2 ml fibroblast medium i et 37 ° C vandbad. Fjern et sæt af Sendai-virus rør fra -80 ° C opbevaring og tø hvert rør en ad gangen ved først at nedsænke bunden af røret i et 37 ° C vandbad i 5 - 10 sek, og derefter fjerne røret fra vandet bad og lad den tø op ved stuetemperatur. Når optøet, kortvarigt centrifugeres røret og placere det straks på is.
- Kommercielt anden generation Sendai-vira ved at tilføje passende mængder (som pr COA) for hver af rørene med henblik på at opnå følgende infektionsmultiplicitet (MOI) på 1 ml forvarmet fibroblast Medium per brønd til transduceres som følge : KOS = 5 x 10 6 CIU, hc-Myc = 5 x 10 6 CIU, hKlf4 = 3 x 10 6 CIU.
- Blandes grundigt viral opløsning ved pipettering af blandingen forsigtigt op og ned. komplete det næste skridt inden for 5 min.
- Aspirer Fibroblast Medium fra brønden af fibroblasterne skal omprogrammeres, og der tilsættes 1 ml af den virale opløsning til hver brønd. Placer cellerne i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator og inkuberes natten over.
- Efter inkubation natten over, aspireres fra transduktion medium og bortskaffe det gamle medie ordentligt (10% blegemiddel løsning til 30 min). Udskift med 2 ml forvarmet fibroblast Medium og fortsætte med at kultur de transducerede celler.
- Kultur cellerne for 6 flere dage, erstatter det gamle medium med frisk fibroblast Medium hver anden dag.
Bemærk: Må ikke passage de omprogrammerede celler indtil 7 dage efter transduktion. - Dag 6: forberede retter til iPSC Generation
- For feeder-afhængige iPSC generation, tilsættes 1,5 ml 0,1% gelatine-opløsning til hver brønd i en 6-brønds vævskulturplade (TC) skål og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Fjern 0,1% gelatine sålution efter 1 time inkubation. Tilsæt 3 x 10 5 mitotisk-inaktiverede muse embryonale fibroblaster (iMEF) i 2 ml iMEF medium per brønd og inkuberes i 37 ° C inkubator natten over.
- For feeder-uafhængig iPSC generation, tilsættes 1,5 ml fortyndet basalmembran matrix (1: 100 fortynding) til hver brønd i en 6-brønds vævskulturplade (TC) skål og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Syv dage efter transduktion, høste de transducerede fibroblaster og re-plade dem på de pre-made kultur retter til iPSC koloni generation.
- Aspirer off den normale dyrkningsmedium fra fibroblasterne, og vask cellerne en gang med 2 ml D-PBS.
- Aspirer off D-PBS vaske og tilsættes 0,5 ml forvarmet 0,05% trypsin / EDTA. Inkubér cellerne i 3 - 5 minutter ved 37 ° C.
- Når cellerne har rundet op, tilsættes 2 ml forvarmet fibroblast Medium i hver brønd for at stoppe trypsinisering. Løsne cellerne fra brønden ved forsigtigt at pipettere than medium hen over overfladen af skålen. Opsaml cellesuspension i en 15 ml konisk centrifugerør.
- Centrifugeres cellerne ved 200 x g i 2 min. Aspirere supernatanten, og re-suspendere cellerne i 2 ml frisk, forvarmet fibroblast Medium.
- Tæl cellerne ved hjælp af den ønskede metode (hæmocytometer eller automatisk celletæller) og frø fra før forberedte petriskåle med 5 x 10 4 celler til feeder-afhængige forhold og 1 x 10 5 celler til feeder-uafhængige forhold, pr brønd i en 6 Tja skål og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2-inkubator natten over.
- Efter inkubation natten over, ændre medium til hPSC medium, E8 medium eller iMEF aircondition medier, afhængigt af programmet. Udskift den gamle medium med frisk medium hverdag derefter.
3. Sendai omprogrammering af BGO1v hOct4-GFP Reporter humane embryonale stamceller (embryonale) Afledt Sekundære fibroblaster
- derive sekundære humane fibroblaster fra BG01v hOct4-GFP reporter hESC linje i henhold til fremgangsmåden beskrevet tidligere 9.
- To dage før transduktion, plade BGO1v / HOG afledte fibroblaster i to brønde i en 6-brønds plade ved 2 x 10 5 celler per brønd under anvendelse fibroblast Medium.
- På dagen for transduktion, præ-varme 2 ml fibroblast Mellem til 37 ° C.
- Tag et sæt Sendai rør fra -80 ° C opbevaring. Fjern hætteglassene fra posen og tø hvert rør en ad gangen ved først at nedsænke bunden af røret i et 37 ° C vandbad i 5 - 10 sek, hvorefter, tillade rørene at tø op ved stuetemperatur. Når optøet, kortvarigt centrifugeres røret og placere det straks på is.
- Tilføj de angivne volumener af hver af de tre Sendai rør (se CoA til det passende volumen) til 2 ml fibroblast Medium, forvarmet til 37 ° C og blandes grundigt viral opløsning ved pipettering op og ned. Gennemfør næste step inden for 5 min.
Bemærk: I dette eksperiment blev en MOI på 5: 5: 6 blev anvendt. - Aspirer Fibroblast Medium fra brøndene i fibroblaster, der skal transduceres. Der tilsættes 1 ml af den virale suspension til hver af to brønde, der skal transduceres. Placer cellerne i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator og inkuberes natten over.
- Efter inkubation natten over, fjern transduktion mellemstore og bortskaffe det korrekt (10% blegemiddel løsning til 30 min). Erstat hver brønd med 2 ml forvarmet fibroblast Medium og fortsætte med at kultur de transducerede celler.
- Kultur cellerne for 6 flere dage, ændre det gamle medium med frisk fibroblast Medium hver anden dag.
- Syv dage efter transduktion, høste de transducerede fibroblaster og re-plade dem på de pre-made kultur retter til iPSC koloni generation.
- Aspirer off den normale dyrkningsmedium fra fibroblasterne, og vask cellerne en gang med 2 ml D-PBS.
- Aspirer off DPBS vaske og tilsættes 0,5 ml forvarmet 0,05% trypsin / EDTA. Inkubér cellerne i 3 - 5 minutter ved 37 ° C.
- Når cellerne har rundet op, tilsættes 2 ml forvarmet fibroblast Medium i hver brønd for at stoppe trypsinisering. Løsne cellerne fra brønden ved forsigtigt at pipettere mediet hen over overfladen af skålen. Opsaml cellesuspension i en 15 ml konisk centrifugerør.
- Centrifugeres cellerne ved 200 x g i 2 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i en passende mængde af frisk, forvarmet fibroblast Medium.
- Tæl celler under anvendelse af den ønskede metode (hæmocytometer eller automatisk celletæller).
- Seed de transducerede celler ved en densitet på 1 x 10 5 celler pr brønd af en basalmembran matrix -belagt 6-brønds plade og inkuber i et 37 ° C, 5% CO2-inkubator natten over.
- Efter inkubation natten over, ændre medium til iMEF medium, suppleret med 10 ng / ml b-FGF. Udskift den gamle medium med frisk iMEF CM hverdagen derefter.
- Tre uger efter transduktion, mekanisk dissekere og overføre de ønskede kolonier for klonal udvidelse eller bruge til analyse.
4. Levende Cell Imaging af fibroblast Omprogrammering
- Real-time overvågning
- 7 dage efter transduktion med Sendai omprogrammering kit, frø den ønskede mængde af celler på 6-brønds skåle med det ønskede medium og matrixsystemer som tidligere beskrevet. Placer podede retter inde billeddanneren, beliggende i en fugtig inkubator indstillet til 37 ° C, og 5% CO2.
- Indstil billedbehandlingssoftware til at fange hele såvel billeder af hver enkelt brønd ved et indstillet interval (hver 6 - 8 timer) kontinuerlig billedoptagelse for de næste 14 dage ifølge fabrikantens protokol.
Bemærk: Fase kontrast billedindstillinger udvælges til normal omprogrammering for at evaluere koloni progression. I tilfældeaf BG01v / HOG afledt fibroblast omprogrammering, er det bedst at tage billeder i fase kontrast og i det grønt fluorescerende kanal som re-aktivering af det endogene OCT4-GFP reporter kan spores gennem hele omprogrammering processen. - Skift mediet dagligt, kan det være hPSC medium, E8 medium eller iMEF-CM, afhængig af eksperimentet, som tidligere beskrevet fra dag 8 til dag 21 efter transduktion. Brøndene kan yderligere analyseres for kolonidannelse hjælp indirekte immunofluorescens.
- Ved afslutningen af forsøget på dag 19 til 21, fjerne dyrkningsmediet fra hver brønd til probes med antistoffer til fibroblast og stamcellemarkører af valg.
- Vask hver brønd en gang med 2 ml forvarmet DMEM / F-12 medium.
- Der forberedes delprøver på hver positiv / negative primære antistof-par i 1 ml DMEM / F-12-medium som følger: anti-muse SSEA4 (1: 200) og anti-rotte-CD44 (1:50), anti-muse TRA-1- 60 (1: 200) og anti-rotte-CD44 (1:50), og alkalisk phosphatase Live Stain (1:50) og anti-rotte-CD44 (1:50). Tilsæt 1 ml primære antistof-løsninger til hver tilsvarende brønd. Der inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter.
- Aspirer off det primære antistofopløsning og vask to gange med forvarmet DMEM / F-12 medium.
- Forbered sekundært antistof opløsninger (1 ml for hver brønd) under anvendelse af gede-anti-muse Alexa Fluor 488 konjugeret sekundært (1: 500) for grøn fluorescens og gede-anti-rotte Alexa Fluor 594 konjugeret sekundært (1: 500) til rød fluorescens i DMEM / F-12 medium. Tilsættes til hver brønd efter den sidste vask. Inkubér sekundære antistoffer i 30 minutter ved 37 ° C.
Bemærk: På grund af alkalisk phosphatase Levende Stain s (personelminer) forbigående signal, bør anti-CD44 primære inkubation blive uropført af sig selv, og personelminer skal tilføjes på tidspunktet for inkubation med de sekundære antistoffer - Efter det sekundære antistof inkubation aspireres fra opløsningen og vaskes to gange med DMEM / F-12 medium. Tilføj frisk forvarmet DMEM / F-12medium til hver brønd før den endelige billedoptagelse.
- Indstil imager software til at erhverve hele godt billeder af hver brønd ved hjælp af alle tre scanningsparametre: fase kontrast, grøn fluorescens og rød fluorescens. Opret billeder på forskellige forstørrelser og skabe time-lapse film med software til at overvåge vækst og markør udtryk. Brug producentens protokol.
- Udnytte den analyse software, evaluere sammenløbet af godt over tid i fase kontrast og i grønne fluorescerende enheder til BG01v / HOG omprogrammering.
- Overvågning Omprogrammering Mellemprodukter hjælp celleoverflademarkører
- Overvåg omprogrammering begivenheder på forskellige tidspunkter ved sondering af omprogrammering retter på forskellige tidspunkter med antistoffer mod forskellige stamcelle positive / negative markører for at overvåge den omprogrammering proces. Probe kulturer hver 2 til 3 dage afhængigt af tilgængeligheden af gentagelser. Sonde omprogrammering dishes på dag 19 til 21 ved hjælp af den dobbelte farvning strategi til at identificere fuldt omprogrammerede IPSC kolonier og delvist omprogrammerede kolonier baseret på farvning mønstre.
- Ved det ønskede tidspunkt, aspireres fra normalt vækstmedium fra hver brønd til probes med antistoffer for markører af valg.
- Vask hver brønd en gang med 2 ml forvarmet DMEM / F-12 medium.
- Der forberedes delprøver på hver positiv / negative primære antistof-par i 1 ml DMEM / F-12-medium som følger: SSEA4 konjugeret til det grønt fluorescerende fluorofor (1: 200), TRA-1-60 konjugeret til det grønt fluorescerende fluorofor (1: 50), Alkaline Levende Stain (1: 500), CD24 konjugeret til et grønt fluorescerende fluorofor (1:50), B2M konjugeret til et grønt fluorescerende fluorofor (1:50), EpCAM konjugeret til et grønt fluorescerende fluorofor (1:50) , muse CD73 (1: 100), som blev probet med anti-muse-sekundært antistof konjugeret til et grønt fluorescerende fluorofor (1: 500), og rotte-CD44 (1:50), som er probet medanti-rotte-sekundært antistof konjugeret til den røde fluorescerende fluorofor (1: 500). Tilsæt 1 ml primære antistof-løsninger til hver tilsvarende brønd. Der inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter.
- Aspirer off det primære antistofopløsning og vask to gange med forvarmet DMEM / F12-medium.
- For ukonjugerede antistoffer, fortsætte til anvendelse af en 2-trins fremgangsmåde ved fremstilling af de passende sekundært antistof løsninger og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C. Bekræfter, at sekundære antistoffer er til de primære værter og krydsreagerer ikke. Udføre yderligere vasketrin som beskrevet tidligere.
- Efter alle passende vaske tilføje frisk forvarmet DMEM / F-12 medium til hver brønd før den endelige billedoptagelse.
- Fang de fluorescerende billeder under passende filter på 100X forstørrelse ved hjælp af et fluorescerende mikroskop og analysere billeder ved hjælp af tilgængelige analyse software.
5. Måling af Omprogrammering Kinetics Brug Flow Cytometry
- Kvantitativ Kinetic Måling af Omprogrammering hjælp Cell Surface Antistoffer
- Forud for omprogrammering, oprette et passende antal omprogrammering eksperimenter for hvert tidspunkt. Til måling kinetik omprogrammering i de første 7 dage af omprogrammering der individuelle transduktioner udføres for hver ønsket tidspunkt. For tidspunkter efter Dag 7, frø tilstrækkelige feeder-uafhængig tidspunkter at fortsætte med at måle omprogrammering begivenheder. En enkelt brønd i en plade med 6 brønde vil give tilstrækkelige mængder af celler til udførelse flowcytometrianalyse.
- Mål alle ønskede omprogrammering tidspunkter fra individuelle brønde, da dette er et endepunkt-assay. Aspirer off fibroblast Medium fra det ønskede godt. Der vaskes én gang med D-PBS.
- Aspirer off D-PBS vask. Der tilsættes 1 ml 0,05% trypsin-EDTA-opløsning til brønden, der skal testes. Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Efter inkuberingen dissocispiste cellerne i enkelte celler ved at skylle 1 ml cellesuspension mod overfladen af brønden og overfør suspensionen til et 15 ml konisk rør. Brug 3 ml D-PBS for at vaske eventuelle resterende celler fra brønden og tilføje dem til 15 ml konisk. Brug 10 ml ekstra D-PBS til yderligere løsne celle opløsning i den koniske rør.
- Centrifugeres cellerne ved 200 x g i 2 min. Aspirere supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml DMEM / F-12 medium. Udfør en celletal efter behov for at skabe en standard celle suspension, der er mindre end 1 x 10 6 celler / ml.
- Forbered hver alikvot af positive / negative direkte-konjugerede antistoffer af valg i 1 ml DMEM / F-12 medium til mindre 1 x 10 6 celler / ml under anvendelse af følgende kombinationer: SSEA4 konjugeret til et grønt fluorescerende fluorofor (1: 200) med CD44 konjugeret til PE-Cy5, eller CD44 konjugeret til et grønt fluorescerende fluorofor og SSEA4 konjugeret til en vidt- rød fluorescerende fluorofor. inkuberantistofferne med cellesuspensionen i 45 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer primære antistofopløsning og vask to gange med forvarmet DMEM / F-12 medium.
- Aspirere den sidste vask og genopslæmmes cellepelleten i 1 ml D-PBS. Pipette indholdet af hver suspension i individuelle FACS rør.
- Brug af passende negative kontroller (ufarvede og isotypekontroller), bekræfter den korrekte fremad og sidespredning profil og spændinger på cytometret. Indstil spændingerne for de tilsvarende fluoroforer efter indledende enkelt plet parametre, således at de grønne fluoroforer aktiveres ved Blue Laser og signaler erhvervet i BL1 kanal, mens langt rødt fluorescerende fluorophor og PE-Cy5 fluoroforen aktiveres af rød laser og signaler erhvervet i RL1 kanalen. Erhverve den dobbelt farvede population for hvert tidspunkt.
- Analyser FCS-filer til hvert tidspunkt ved hjælp af den passende analyse software, og bruge editoren til arraNSÆ data til at observere befolkningen udtryk skift over tid.
- Følg trin 5.1.1 til 5.1.6, hvis der ønskes cellesortering på forskellige tidspunkter. Brug de relevante fluoroforen kombinationerne ifølge laseren konfigurationen af cellesorteringsapparat, der skal anvendes.
- Efter den sidste vask resuspender cellepelleten i 1 ml af cellesortering buffer. Opsætning cellen sorteringsanlæg til de rigtige fremadrettede og side scatter indstillinger ved hjælp af en ufarvet kontrol. Brug enkelt farvede knapper til at oprette de korrekte indstillinger for hver fluoroforen.
- Brug en lille prøve af den dobbelt-farvet celle suspension; vælge de 2 befolkninger skal sorteres og tildele den pågældende afgift for at sikre korrekt samling af de sorterede celler.
- Tilsæt 200 pi af celleindvinding medium til opsamlingsrør de at sikre, at den sorterede cellesuspension polstret og beskyttet på tidspunktet for sortering. Høst ønsket antal celler og overføre på nye iMEF retter, der indeholder friskly forberedt retableringsmedie.
- Skift medium efter inkubation natten over med retableringsmedie. Kulturerne skal tilføres efterfølgende og rutinemæssigt passeret ved anvendelse hPSC medium indeholdende penicillin / streptomycin (100 enheder / ml slutkoncentration).
6. Endpoint Analyse
- Terminal alkalisk phosphatase (AP) Farvning
- Brug terminal kromogen AP farvning at korrelere observerede kinetiske og morfologiske arrangementer med endelige omprogrammering effektivitet.
- Efter 21 dage omprogrammering, fjerne dyrkningsmediet fra brønden, der skal farves med terminal AP pletten og vask en gang med 200 mM Tris-HCI (pH 8,0).
- Forbered den passende mængde farveopløsning som anvist af producentens manual i 200 mM Tris-HCI.
- Aspirer vask og tilsættes 2 ml af det forberedte farvning opløsning til hver brønd. Inkuber i 20 til 30 minutter ved stuetemperatur og væk fra the lys.
- Aspirer farvningsopløsning og vask en gang med 200 mM Tris-HCI. Fjern vask og tilsæt destilleret vand før visualisering.
- Fang kolorimetrisk signal ved hjælp af et normalt billede kamera. Tæl antallet af positivt farvede kolonier i hånden. Visualisere pletten med fluorescerende analyse i trit-C kanal, som pletten er også fluorescerende art og udføre hele brønde billedbehandling og analyseret ved anvendelse af hel-brønd imager. Brug producentens protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overvågning omprogrammering Kinetics anvendelse af flowcytometri
CD44 er en fibroblast markør mens SSEA4 er en PSC markør 6,10. Som forventet ud fra dette ekspressionsmønster, flowcytometri af BJ fibroblaster viser en SSEA4 - CD44 + population, der letter oprettelsen af kvadrant porte i kombination med den ufarvede prøve. Under omprogrammering af DF1 fibroblaster med Sendai-vira, er CD44 gradvist tabt mens SSEA4 langsomt udtryk. På dag 3 efter transduktion med Sendai-vira, er der en stor population af SSEA4 - CD44 + celler og en lille population af SSEA4 + CD44 + -celler, der bliver mere tydelig på dag 7 (figur 1). På dag 13, dobbelt-positive population overgange mod SSEA4 + CD44 - tilstand. På dag 17, en stor procentdel af ceLLS i kultur allerede SSEA4 + CD44 -. This tidsforløbet viser, at flowcytometri med CD44 og SSEA4 kan anvendes til at overvåge progression og hastigheden af omprogrammering.
En kvantitativ sammenligning bekræfter, at omprogrammering BJ fibroblaster med Sendai omprogrammering virus genererer SSEA4 + CD44 - celler med en anden hastighed end omprogrammering af BJ fibroblaster (figur 2A). Dataene viser, at en tidlig sammenligning af den procentdel af PSC-lignende SSEA4 + CD44 - celler sporer udviklingen af omprogrammering. Interessant, på dag 8 i DF1 fibroblast omprogrammering, sortering og separat dyrkning af populationen af celler, der er i færd med at opjustere SSEA4 og nedregulering CD44 genererer AP + -kolonier 11 (figur 2B). I modsætning hertil oprindelige SSEA4 - CD44 + -populationen genererer amn sådan mindre antal AP + kolonier på dag 21 af omprogrammering, som er den typiske dag i sidste koloni analyse. Dette antyder, at det er muligt at kvantificere og sammenligne Overgang population for at forudsige forskelle i omprogrammering kinetik selv før SSEA4 + CD44 - dannes population. Et vigtigt punkt at bemærke her er, at omprogrammering er en variabel proces afhængig af flere faktorer, såsom start somatisk cellepopulation, transduktion effektivitet, medium, etc. Men det generelle mønster og progression af de ovenfor beskrevne overflademarkører er konsistent mellem forskellige omprogrammering eksperimenter og begyndende fibroblaster. Analysen af omprogrammering kinetik kan også gøres med forskellige markører, såsom de nyligt identificerede negative PSC markører CD73 og B2M 6, samt de etablerede PSC markører CD24 12,13 og EPCAM 14,15. Svarende til CD44, CD73 og B2M udtrykkes i parEntal BJ fibroblaster, men er nedreguleret i løbet af omprogrammering, bliver målbart i fuldt omprogrammerede iPSCs (figur 3A). En flowcytometri tidsforløb hjælp CD44 og CD73 eller CD44 og B2M viser, at CD44 og CD73 er nedreguleres med samme hastighed, hvorimod B2M nedreguleres hurtigere end CD44 (figur 3B). I begge tilfælde kan hastigheden for omprogrammering observeres ved at måle akkumulering af det dobbelt negativ befolkning. I modsætning til disse negative PSC markører, CD24 og EPCAM er fraværende i fibroblaster og udtrykkes i iPSCs (figur 3A). I en flowcytometri tidsforløb, CD24 - CD44 + og EPCAM - CD44 + fibroblaster i sidste ende danne dobbelt-negative populationer, der senere overgang til CD24 + CD44 - og EpCAM + CD44 - PSC-lignende celler, henholdsvis (figur 3B). Således under omprogrammering, både positive PSC markørerudtrykkes efter CD44 nedreguleres. Svarende til, hvad der blev observeret med SSEA4 og CD44, dannelsen og akkumuleringen af de forskellige cellepopulationer indikerer progression af omprogrammering.
Sporing Omprogrammering Brug Real-tid Imaging Analysis
Real-time imaging af omprogrammering kulturer efter reseeding viser den gradvise dannelse af kolonier (figur 4A), hvilket svarer til en logaritmisk stigning i konfluens under fasekontrast (figur 4B). Confluence under fasekontrast giver således en anden metrik til overvågning omprogrammering kvantitativt, men det omfatter både de kolonier, der er positive for PSC markører og den fortsatte spredning af unreprogrammed eller delvist omprogrammerede celler (figur 4A, sidste panel). Kvantificering af de områder, der er blevet farvet for pluripotens markørerTRA-1-60, SSEA4 og AP 6,10 på dag 21 indikerer, at iPSCs kun udgør mindre end halvdelen af den samlede sammenløbet (figur 4B). At måle fremskridtet af omprogrammering strengere, er det muligt at anvende en reporter linje for omprogrammering. Her blev sekundære fibroblaster genereret fra BG01v / HOG ESC linje, som er blevet manipuleret med en OCT4-GFP reporter 16. GFP udtrykkes som cellerne omprogrammeres og som kolonier dannet (figur 5A). Måling sammenflydning under fasekontrast og de grønne kanaler viser, at GFP sammenløbet stiger langsommere end den samlede sammenløbet, og GFP sammenløbet på dag 19 er mindre end halvdelen af den samlede sammenløbet (figur 5B), minder om TRA-1-60, SSEA4 og AP farvning på dag 21.
Figur 1. Monitoring Progress af Reprogramming anvendelse af flowcytometri. Flowcytometri Dot Pladser til DF1 fibroblaster omprogrammeres med Sendai virus under Feeder-fri betingelser. Cellerne blev høstet og farvet med SSEA4 og CD44 antistoffer ved forskellige intervaller fra Dag 3 (D3) til Dag 19 (D19) af omprogrammering proces. Kulturer på dag 9 (D9) og fremefter blev analyseret efter at cellerne blev podet på dag 7 (D7). Dot plots viser 8.000 slåbrokker. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 2. Evaluering omprogrammering Kinetics og effektivitet under Feeder-fri betingelser (A) Graf der viser ændringer i den procentdel af SSEA4 + CD44 - omprogrammeres celler efter transduktion DF1 fibroblasts og BJ fibroblaster med Sendai-vira. Celler blev analyseret ved flowcytometri på dag 3 til 19 post-transduktion, med kulturer på dag 9 og fremefter undergår tilsået på dag 7. (B) Pseudo-farve flowcytometri grunde til DF1 celler transduceret Sendai-vira og farvet med SSEA4 og CD44-antistoffer. SSEA4 -. CD44 + celler (sort cirkel) og SSEA4 + celler (rød cirkel) blev sorteret på dag 8 og lov til at vokse, indtil Dag 19 før farvning for alkalisk phosphatase (rød) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Observing Omprogrammering Kinetik af Feeder-fri kulturer ved hjælp af forskellige positive og negative PSC Markers. (AD) Levende farvningaf Day-18 DF1-afledte omprogrammering kulturer under anvendelse af antistoffer for de positive PSC markører CD24 og EPCAM og negative PSC markører CD44, CD73, og B2M. Toppanelerne fusionere de grønne og røde fluorescens kanaler, mens bundpanelerne også omfatte fase kontrast billede. Skalaen søjle repræsenterer 200 um. (E) Flowcytometri dot grunde til DF1-afledte omprogrammering kulturer høstet og farvet med de samme markører fra dag 9 til 17 (D9 til D17) post-transduktion. Før analyse blev kulturer genpodedes på dag 7. Dot plots viser 8.000 slåbrokker. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Sporing Omprogrammering Kinetics ved Måling Total Confluence. (A) Real-time imaging af BJ fibroblaster omprogrammeres med Sendai-vira under feeder-fri betingelser. Fase kontrast billeder af de samme kolonier blev taget på dag 7 til 19, så i dag 21 med ekstra farvning for CD44 og SSEA4, TRA-1-60 eller AP. Scale bar svarer til 400 um. (B) Kvantificering af total sammenløb (fasekontrast) som omprogrammering skrider fra tilsået på dag 7 til dag 21. Samlet sammenløb på dag 21 er i forhold til SSEA4, TRA-1-60 og AP signal sammenløb ( grøn kanal). klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Vurdering Omprogrammering Kinetics ved Måling OCT4-GFP Confluence. (A) Real-time billeddannelse af BG01v / Høg embryonale-afledte fibroblaster omprogrammeres medSendai-vira under fødefri betingelser. Fasekontrast, grøn fluorescens og fusionerede billeder af de samme kolonier blev dannet på dag 7 til 19. Scale bar svarer til 400 um. (B) Kvantificering af total sammenflydning (fasekontrast) og OCT4-GFP konfluens (grønne kanal) som omprogrammering skrider fra re-seeding ved dag 7 til dag 21. klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne [RHQ, JSTA, KS, og UL] er medarbejdere i Thermo Fisher Scientific, der producerer nogle af de reagenser og instrumenter, der anvendes i denne artikel.
Acknowledgments
Forfatterne takker Tchad MacArthur for nyttige diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1x) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
References
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834 (2010).
- Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419 (2014).
- Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
- Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728 (2014).
- Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
- Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
- Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
- Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
- Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).
