Abstract
ירידה בזיכרון מפורש תלוי בהיפוקמפוס (זיכרון עובדות ואירועים) היא אחד הסימפטום הקליני המוקדם של מחלת אלצהיימר (AD). היא מבוססת היטב כי הפסד הסינפסה ניוון מוחיים שהתפתח הם המנבאים הטובים ביותר עבור ליקויי זיכרון של מחלת אלצהיימר. המחקרים האחרונים הדגישו את תפקיד הנוירו של oligomers המסיס-בטא עמילואיד (Aβo) שמתחיל להצטבר במוח האנושי כ 10 עד 15 שנה לפני התסמינים הקליניים לעין. דיווחים רבים מצביעים על כך מסיסה Aβo לתאם עם גירעונות זיכרון במודלים ובני אדם לספירה. ניווניות של מערכת העצבים הנגרמת Aβo שנצפו תרבויות פרוסות עצביות ומוח כבר יותר מאתגר להתרבות במודלים של בעלי חיים רבים. המודל של חליטות Aβo חזרו המוצג כאן להתגבר על בעיה זו ולאפשר פונה שני תחומים מהותיים בפיתוח טיפולי שינוי מחלה חדש: לזהות סמנים ביולוגיים כדי לאבחן מחלת אלצהיימר מוקדם, ולקבוע את Mecha המולקולריתמנגנונים בבסיס Aβo הנגרמים גירעונות זיכרון בתחילה לספירה. מאז המצרפי Aβo מסיס יחסית מהר לתוך סיבי Aβ מסיסים המתואמים גרוע עם המדינה הקלינית של חולים, מסיס Aβo ערוך טרי והזריק פעם ביום במשך שישה ימים לייצר מוות של תאים ניכר בהיפוקמפוס. השתמשנו צינורית במיוחד לעצב לאינפוזיות סימולטני של Aβo ו עירוי מתמשך של נוגדן Aβo (6E10) בהיפוקמפוס באמצעות משאבות האוסמוטי. זה חדשני בשיטת vivo כעת ניתן להשתמש במחקרים פרה כדי לאמת את היעילות של טיפולים לספירה חדשים שעשויה למנוע בתצהיר ואת הרעילות העצבית של Aβo בחולים טרום דמנציה.
Introduction
זה בתחילה הוצע ההצטברות של מיני Aβ מסיסים במוח הייתה מרכזית בהיווצרות לספירה. 1,2 עם זאת, פלאקים של עמילואיד גם מזוהים בחלק קוגניטיבית נורמלי קשישים. 3-7 כדי להתגבר על קורלציה החלשה קיימת בין תצהירי רובד ליקויים קוגניטיביים ב AD, הדיווחים האחרונים הראו הנוכחות של Aβo המסיס הרעיל בתחילת המחלה, בעלי המתאם הרבה יותר טוב עם המדינה הקלינית של המטופלים. 8-14 מאחר שתהליך oligomerization Aβ הוא דינמי מאוד, הוצע כי neurotoxicity הוא המושרה על ידי שונים Aβo במקום סוג של oligomer ספציפי אחד בלבד. 14-16 מאחר ומחקרים רבים הראו כי Aβo יכול ליזום תפקוד סינפסה לפני הסינפסה איבוד עצבי, מצביעים 17-24 תיאוריות עכשוויות שטיפול הקשורות Aβ עשוי להיות יעיל AD מוקדם ולא בשלבים מאוחרים יותר כפי שנבדקו עד כה בניסויים קליניים.
תכונת סימן היכר אחד בפתוגנזה AD היא המוות של התאים מסיביים ונפוץ שנצפה בשלבים המאוחרים של המחלה, ואת סינפסה המשמעותית איבוד עצבי שנצפה אזורים במוח מקומיים כאשר גירעונות זיכרון להפוך לגילוי ברמה הקלינית. מסלול perforant מקרין מן קליפת entorhinal (EC) כדי gyrus המשוננת (DG) הוא מוטרד באופן ניכר על ההתפרצות המוקדמת של מחלת אלצהיימר. 25,26 במהלך מדינת prodromal של ספירה, כאשר ליקוי קוגנטיבי מתון (MCI) הופך מוות של תאים משמעותיים לכאורה כמו גם אובדן הסינפטי מזוהה ב EC של DG. 25,26
למרות גוף גדול של ראיות אתר את הפעולה הרעילה של Aβo המסיס לספירה מוקדם, 8-14 Aβo הנגרם ניוון מוחיה שנצפה תרבות העצבית או תרבות פרוסת מוח organotypic כבר יותר מאתגר להתרבות במודלים של בעלי חיים. 27 רוב לספירה המהונדסת מודלים overexpressingיש β פלאקים של עמילואיד, hyperphosphorylation טאו, חסר הסינפטי גירעונות זיכרון. 27 עם זאת, המודלים האלה כבר הרבה פחות מוצלחים מוות של תאי דוגמנות נצפה בהיפוקמפוס של חולי אלצהיימר. כדי להתגבר על הבעיות הטכניות פיתחנו מודל המבוסס על חליטות תוך-מוחי של מסיס Aβo. דיווחנו קודם לכן כי חזרתי חליטות בהיפוקמפוס של מסיס Aβo לגרום איבוד עצבי הדרגתי hyperphosphorylation טאו, שני סימנים מובהקים פתולוגי קשור עם ירידה בזיכרון של מחלת אלצהיימר. 28 הנה, אנחנו מראים שיטה חדשה לבדוק טיפולי AD באמצעות צינורית במיוחד לעצב לאינפוזיות סימולטני של Aβo ו עירוי מתמשך של נוגדן Aβo (6E10) עם משאבות האוסמוטי.
משאבות אוסמוטי מספקים דרך ייחודית לבחון in vivo את היעילות של כל הנוגדנים (או תרכובות אחרות) נגד ניוון מוחיים הנגרמת Aβo ישירות באתר עירוי של Aβo. לכן, אלה משאבות represent כלי נוח להקים הוכחה של קונספט מוצק לגבי מנגנוני הפעולה של תרופות פוטנציאליות של מחלת אלצהיימר. מאז הדיווחים אחרונים מצביעים על ההשפעה הקריטית של מסיס Aβo בשלבים המוקדמים של מחלת אלצהיימר, טיפולים רבים מכוונים Aβo הם למעשה נבדקו על ידי מעבדות אוניברסיטאיות והפרמצבטיקה. במודל חית הרומן הזה מאפשר מחק את ההפסד הסינפטי עצבי שנצפה לספירה מוקדם, ומשאבות האוסמוטי משמשות להחדיר סוכני טיפול רציף באופן ספציפי את האינפוזיה Aβo. הכישלונות החוזרים של טיפולים לספירה נבחנה לאורך השנים האחרונות קל עד בינוני חולים כפי שתתבקש החוקרים להתחיל מחקרים בחולים טרום דמנציה לפני Aβo מתחילים לצבור בשפע וליצור נזק מוחי בלתי הפיך. בהקשר זה, בדיקת תרכובות חדשות המונעות בתצהיר וכתוצאה מכך ברעילות של Aβo שאולי יעניינו בחולים טרום קליניים.
Protocol
הצהרה אתיקה: פרוטוקול חיה עבור פרויקט זה קיבל את אישור ועדת טיפול בבעלי חיים של מונטריאול Hôpital du Sacré-Coeur de בהתאם להנחיות המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.
1. הכנת צנתר לפני ניתוח Stereotaxic
- חותכים צנתרים PE50 (6 ס"מ אורך) אשר ישמשו כדי להתחבר צינורית עם משאבות האוסמוטי (ראה איור 1 א). מלאו צנתרים PE50 עם מלאכותי הנוזל השדרתי (aCSF) ולאטום את שני הקצוות של צנתרים. שמור את הקטטר על 4 מעלות צלזיוס עד בשימוש.
2. קניית השרשה ידי Stereotaxy
- לבצע את הניתוח בתנאים סטריליים. לעקר את כל מכשירי הניתוח וחומרים ידי מעוקר. נקו את מנגנון stereotaxic ואת אזור העבודה ביסודיות, ולחטא עם פתרון אתנול 70%. תלבש מסכה כירורגית, מצנפת שיער וכפפות סטריליות.
- להרדים חולדות על ידי הזרקת intraperitoneally (IP) פתרון של קטמין ו xylazine (100 מ"ג / ק"ג ו -10 מ"ג / ק"ג, בהתאמה). אשר הרדמה על ידי סימון התנועה לאחר קמצוץ בוהן עדין.
- להזריק תרופה לא סטרואידיות נוגדות דלקת (Meloxicam; 1 מ"ג / ק"ג) תת עורי (SC) לחיה-מורדם לפחות 30 דקות לפני הניתוח.
- לגלח את הראש של החיה באמצעות קוצץ ולחטא את העור עם תמיסה של gluconate chlorhexidine 2% ואלכוהול איזופרופיל 2% שלוש פעמים. החל משחת עיני וטרינרים על עיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
- מניח את החיה על מסגרת stereotaxic עם ברי אוזניים. תקן צינורית אחד על הזרוע בעל מסגרת stereotaxic. להזריק (SC) סוכן הרדמה מקומית (bupivacaine (1.5 מ"ג / ק"ג) ו לידוקאין (1.5 מ"ג / ק"ג) על החלק העליון של הראש. הרדמה היא שומרת במהלך ההליך כולו על ידי הצבת חרטומו ומספק isoflurane 3%. שטח כל בתחום כירורגית צריך להיותעטוף את, אבל זה לא נעשה כאן כדי להדגים את הטכניקה יותר טוב.
- עושים חתך של 3 ס"מ על החלק העליון של הראש עם אזמל. התקן 4 מלחציים סביב החתך לעזוב את הגולגולת ברורה. באמצעות מספריים מסביב טיפ, ליצור כיס (2 x 2 ס"מ 2) מתחת לעור בין השכמות של החיה.
- לגרד את periosteum של הגולגולת עם להב. החל פד גזה על הגולגולת אם הדימום.
- ודא כי הגולגולת היא שטוחה היטב מיושר על מסגרת stereotaxic. כדי לוודא כי הגולגולת היא שטוחה, לבדוק את גובה קואורדינטות גבחת ובבית למבדה. קח את הקואורדינטות של גבחת אשר תשמש כנקודת ההתייחסות.
- החל מ גבחת, לחשב את הקואורדינטות של צינורית שני מדריך כי יושתלו בילטרלי בהיפוקמפוס (anteroposterior: - 0.42 ס"מ; mediolateral: ± 0.30 ס"מ; dorsoventral: - 0.28 ס"מ על פי אטלס המוח עכברוש Paxinos ווטסון) 29 . ציין אתהמיקום של צינורית בטוש.
- לקדוח חור (0.5 מ"מ) בגולגולת בנקודת ההשתלה היא הצינורית. המקדחה שני חורים אחרים כ 5 מ"מ מעל ומתחת נקודות אלה להכניס ברגים יהיה לגבש צינורית בעת החלת מלט שיניים.
- חותכים קצה אחד של הקטטר מילא בעבר עם aCSF עם אזמל, ולהכניס אותו בזרוע הזווית של צינורית. תקן הצינורית הראשונה במלט שיניים. יש להימנע מלמקם את דבק דנטלי סביב עמד על הצינורית השנייה.
- תן יבש מלט השיניים עבור 2 - 3 דקות, ולאחר מכן להסיר את היד בעל מן הצינורית הראשונה, ולתקן את הצינורית השנייה בה. חזור על שלבים 2.11 ו 2.12. שים צינורית דמה משני צינורית המדריך. ודא כי הדמה ו צינורית מדריך הוא מאותו האורך למניעת הסתננות רקמות חסימת הצינורית.
- הכנס את הקצה החופשי של שני צנתרים בכיס שנעשו בעבר בין השכמות של החיה. הסר את המהדק לתפור את העור עםתפר חוט 4-0.
ההערה: צינורית המדריך העליונה צריכה להיות נגיש לאינפוזיות Aβo הקרובה. - הסר את החיה מן המסגרת stereotaxic והכניס אותו לכלוב שלו. במהלך התאוששות לאחר ניתוח, למקם את הכלוב על שמיכת חימום מים עד שהחיה מתעוררת. הכלוב צריך להיות חלקי על הכרית כך החולדה יכולה להתרחק ממקור החום במקרה צורך. לפקח על בעלי החיים כל זמן עד שהוא חוזר להכרה מספיק כדי לשמור שכיבה sternal.
- חזור חולדות למתקן חיה להתאושש מהניתוח במשך 10 ימים תחת מעקב צמוד.
הערה: אל תחזור בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד התאושש לחלוטין. Meloxicam (1 מ"ג / ק"ג) ניתנת פעם ביום במשך יומיים לאחר ניתוח לטיפול בכאב.
3. התקנת משאבת אוסמוטי
- יום אחד לפני ההתקנה, למלא משאבות האוסמוטי עם נוגדן 6E10 (1 מ"ג / מ"ל; 100 μl) ו IgG1 מלאהנוגדנים (1 מ"ג / מ"ל; 100 μl) על פי הוראות היצרן בתנאי סטרילי. שמור משאבות במים מזוקקים סטריליים על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להפעיל משאבות.
- להרדים חולדות עם% isoflurane 3 להתקין משאבות האוסמוטי (0.5 μl / hr למשך 7 ימים). לגלח בין השכמות ולחטא את העור עם תמיסה של gluconate chlorhexidine 2% ואלכוהול איזופרופיל 2%. עושה חתך של 2 סנטימטר עם אזמל בין השכמות לאתר את צנתרי PE50 מחוברים צינורית המדריך.
- חותכים את הקצה של צנתרים PE50 המכיל צמנט שיניים עם אזמל. חבר את המשאבות האוסמוטי אל צנתרי PE50, ולהוסיף קצת דבק דנטלי בצומת משאבת קטטר כדי לאבטח את החיבור.
- לתפור את העור בחוזקה עם חוט תפר 4-0. מכניס את גב החיה בכלוב שלה על כרית חימום מים. שימו לב בעקבות החיה במהירות מתוך הרדמה isoflurane (כ -5 דקות).
הערה: הניתוח לוקח approximately 5 עד 10 דקות.
4. עירוי Aβo ב Awake בחופשיות חולדות Moving
- הכן את הפתרון Aβo (0.2 מיקרוגרם / μl) כפי שדווח בעבר. 28,30 אפשר Aβo כדי לצבור דינמי וספונטני עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר לפני עירוי.
- התקן שני 10 מזרקים μl על משאבת עירוי. מלא את המזרקים עם 5 μl של מים מזוקקים סטריליים. חותכים שתי צנתרים PE50 לכ -60 ס"מ אורך עם אזמל. מלאו הן צנתרים עם מים מזוקקים סטריליים באמצעות 1 מ"ל מזרקים ומחטים 21G.
- שמור על 1 מ"ל מזרקים בקצה אחד של הקטטר ולחבר את הקצה השני מזרקים המילטון. הסר את 1 מ"ל מזרקים ולבדוק שאין בועות אוויר בתוך צנתרים.
- הכנס צינורית פנימית בסוף צנתרי PE50. שימוש במים מזוקקים סטריליים, למלא את הצינורית הפנימית מחובר צנתרים PE50 עד to1 μl על מזרקים המילטון. תן בועת אוויר על ידי pulling בחזרה את הבוכנות עד 2 μl.
- מערבבים את הפתרון Aβo ידי pipetting מעלה ומטה באמצעות קצה של מינימום של דבקות. הימנע ויוצרים בועות במהלך ערבוב. מלאו הן צינורית פנימית עם 1.5 μl של פתרון Aβo ידי שהפיל את הבוכנות עד 3.5 μl.
- הפוך שורות בטוש לפני ואחרי בועת האוויר נעשה בשני צנתרים. זה משמש כנקודת סימון של עירוי מתמשך. לקבלת עירוי, להביא את הכלוב ליד משאבת אינפוזיה ולהסיר העטיפה שלו.
- מניחים את החולדה בתוך לְהִצְטָנֵף בחוזקה לגרד את הזרוע של לְהִצְטָנֵף סביב הצוואר שלו כדי לשתק את הראש של החולדה. הסר צינורית דמה מן הצינורית שתי מדריך. הכנס את הצינורית הפנימית שהוכנה קודם לכן ב צינורית המדריך. ודא שהמחסניות הוכנסו במלואן היטב קבוע לבסיס של צינורית מדריך.
- שחרר חולדה מן לְהִצְטָנֵף והכניס אותו לכלוב שלו כדי להגביל מתח הטענה. לעקוב מקרוב על מנת להבטיח כי צנתרים לא לסובב את דיראותה ואת העירוי נעשה כראוי.
- הפעל את משאבת העירוי. להזריק 1 μl של פתרון Aβo בשיעור של 0.1 μl / דקה (10 דק '). במהלך אינפוזיה, לבדוק כי מהלכי בוכנת מזרק מ -3.5 μl 2.5 μl, וכי בועת האוויר הוא צנתרי PE50 לנוע ברציפות.
- השאר את הצינורית הפנימית במקום לעוד 5 דקות לאחר עירוי כדי לאפשר דיפוזיה יעילה של פתרון Aβo. תביא את החולדה בחזרה לְהִצְטָנֵף להסיר צינורית פנימית צינורית מדריך כתרים כדי למנוע רפלוקס של הפתרון המוזרק. השתמש צינורית דמה לזה לעצור ממש לפני זרוע הזווית של הצינורית. מחזירים את החיה בכלוב שלה.
- חזור עירוי Aβo פעם ביום במשך 6 ימים רצופים. להרדימו על ידי עריפת ראש.
Representative Results
ההשפעה הנוירו של Aβo נחקרה בחולדות הארוכות אוונס ידי השתלת צינורית ב המנכ"ל של ההיפוקמפוס. מסיסים Aβo הוזרקו כל יום מעל שישה ימים רצופים. השתמשנו צינורית במיוחד לעצב לאינפוזיות סימולטני של Aβo ו עירוי מתמשך של נוגדן IgG1 6E10 או שליטה בהיפוקמפוס באמצעות משאבות האוסמוטי (איור 1 א). לחולדות אימונוהיסטוכימיה היו מורדמים, perfused transcardially עם 0.9% NaCl, והמוח שקוע בפתרון paraformaldehyde 4% במשך 48 שעות ו -15% תמיסת סוכרוז למשך 24 שעות. חלקי העטרה חינם צפו (40 מיקרומטר) טופלו 0.3% H 2 O 2 למשך 30 דקות, חסום סרום עיזים 1% במשך שעה 1, ו מודגרות הלילה ב 4 ° C עם נוגדן אנטי הפאן Aβ. סעיפים טופלו 70% חומצה פורמית במשך 3 דקות לפני מריחת הנוגדן. האיתור בוצע באמצעות מורכבי ABC ו 0.05% פתרון 3,3-diaminobenzidine. סעיפים היו רכובים על שקופיות זכוכית מצופית ג'לטין, האוויר יבש 2 hr, מיובשות (30, 70, 95, ו 100% אלכוהול), וטופחו דקות טולואן 5, ו coverslipped. עבור מכתים סגול cresyl, סעיפים הודגרו 10 דקות בתמיסה סגולה 0.5% cresyl, וטופחו 1 דקות בתמיסת חומצת 0.5% אצטית, ונטולות צבע (70, 95, ו 100% אלכוהול), שקועות דקות טולואן 5, ומכוסה coverslip זכוכית.
התוצאות המוצגות כאן להראות בתצהיר של Aβo ב DG בסביבתו של האינפוזיה, מוות של תאים הקשורים הצטברות זו. מצאנו כי רמת Aβo הוקטנה באופן משמעותי על ידי טיפול נוגדן 6E10 (איור 1B). ניוון מוחיה מסומן נצפה סמוך לאתר ההזרקה של Aβo, והיה נחלש ידי טיפול נוגדן 6E10 (איור 1B). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם Aβo הצטברות כי צפינו במסגרת DGבעקבות חליטות Aβo חזרו בעכברים. 28 ניקויים של בתצהיר עמילואיד ידי אימונותרפיה עם 6E10 נוגדנים המוצגים כאן עולים בקנה אחד עם דו"ח נוסף נעשה במודל של עכברים לספירה מהונדס. 31
באיור 1. תמונה של בעלי החיים עם קנייה בילטראליים במהלך עירוי Aβo פתרון של Aβo. (0.2 מיקרוגרם / μl; 1 μl) שהוזרקה במעבר חולדות ערות בחופשיות (פעם ביום למשך 6 ימים) באמצעות צנתרי PE50 מחוברים צינורית פנימית מוכנס לתוך צינורית מדריך. טיפול עם שליטה (CTL) IgG1 או 6E10 נוגדן היה חדור ישירות באתר של אינפוזיה Aβo באמצעות משאבות האוסמוטי ממוקם מתחת לעור בין השכמות של החיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של ההוא דמות.
הפסד איור 2. העצבית הנגרמת על ידי Aβo הפקדת מוחלש על ידי 6E10 טיפול נוגדן A, Aβo (0.2 מיקרוגרם / μl; 1 μl). שהוזרק פעם ביום במשך 6 ימים רצופים, ומטופל עם CTL (IgG1) או 6E10 נוגדן בבית באתר של אינפוזיה באמצעות משאבות האוסמוטי. B, הצטברות נציג של Aβo ב DG על קטע מיד ליד הכניסה צינורית, והכתים נציג עם סגול cresyl מראה אובדן התא. ברי סולם: 50 מיקרומטר (n = 4) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
ישנם שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול זה שדרש תשומת לב מיוחדת. כאשר השתלת הצינורית אל תשים דבק דנטלי כאשר הוא נוזלי מדי כדי למנוע חסימת החור של הצינורית השנייה. חשוב למקם דבק דנטלי בסוף ללא קטטר P50 המצורף המשאבה כדי למנוע גירוי תגובה דלקתית אפשרית. ביום של הניתוח stereotaxic, להשתמש צינורית דמה כי הם באותו אורך כמו צינורית מדריך כדי למנוע חסימת צינורית. עם זאת, לאחר התקנת משאבות להשתמש צינורית דמה קצרה לזה לעצור לפני זרוע הזווית של הצינורית כדי לאפשר חליטה נכונה של הפתרון מהמשאבה ההיפוקמפוס. לעקוב מקרוב חליטות Aβo ולוודא כי בועת האוויר נעשתה צנתרים נעה באופן רציף במהלך חליטות. תמיד לוודא כי צינורית ההזרקה מוכנסת כהלכה לתוך צינורית המדריך במהלך חליטות.
אם הבעיה היא המפגש במהלך עירוי Aβ, ודא כי הצינורית הפנימית אינה חסומה. אם זה מקרה, שטוף מים מזוקקים סטריליים באמצעות הצינורית הפנימית. אם צינורית המדריך חסומה, להפוך את הצינורית הפנימית לתוך צינורית המדריך. אחרת להעביר את הצינורית הפנימית למעלה ולמטה. מריבה של לְהִצְטָנֵף יכולה להיות מלחיצה עבור חולדות, במיוחד ביום הראשון. כדי להקטין את הלחץ של בעל החיים, אנו ממליצים לתמרן להרגיל חולדות אל לְהִצְטָנֵף לפני הניתוח stereotaxic.
יתרונות רבים ניתן לייחס הרומן הזה וגמישים בגישה vivo. אכן, אופי Aβo מוזרק ניתן לשלוט במדויק לפני עירוי, וסוג שונים של ההכנות Aβ (עבור סינתטי למשל לעומת פתרונות Aβ שמופק מהמוח) ניתן להזריק להעריך neurotoxicity שלהם in vivo. מודל זה יכול לשמש גם כדי לחקור מנגנונים שבאמצעותם מיני Aβ שונים (למשל, מונומרים מעוטים ו-משקל גבוה מולקולרי oligomers, protofibrils) יכול לגרום שפעות הנוירו in vivo, וכיצד טיפולים כמו אימונותרפיה עשויים לנטרל ההשפעה המזיקה שלהם במוח. מאז החליטות הן להופיע ערות, חיות בחופשיות-נעימות, אין תופעות של בלבול בין סוכני הרדמה ופתרון Aβo על מסלולי איתות, כפי שמוצגים במחקרים קודמים. 32,33 עירויים ב לנוע בחופשיות בעלי חיים גם עולות בקנה אחד עם בדיקות התנהגותיות כל זמן לפני ואחרי החליטות.
עירויים של Aβo והתקנת משאבה יכול להיעשות חיה בגילאים שונים כדי לקבוע את ההשפעות של Aβo וטיפולים במהלך ההזדקנות. מאז ניווניות של מערכת העצבים מתרחשת בסביבת האתר עירוי, הסינפסה איבוד עצבי יכול להיגרם באזורי מוח שונים מקומי. החליטה בטחונות של Aβo והבקרה (רכב או לטרוף Aβ) מאפשרות שליטה על כל שינוי בתוך החיה אותו. לעומת זאת, Aβo או שליטה solutions ניתן להזריק בשני צידי ימין ועל שמאל ההיפוקמפוס, למשל כאשר בודקים חי משימות התנהגותיות. עירוי של Aβo וטיפול ניתן לעשות בו זמנית או לחילופין משאבות ניתן להתקין לאחר עירוי Aβo להעריך אם הטיפול הוא יעיל לאחר בתצהיר Aβ. אותו הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש גם כשעושים חליטות intracerebroventricular של Aβo. השפעת Aβo על מסלולי איתות תאיים ניתן להעריך לפני ואחרי איבוד עצבי בתוך פרק זמן קצר למדי. המינון ומספר חליטות Aβ יכול גם להיות מותאם כדי להשיג פחות או יותר חמור פתוגניות Aβ.
אמנם מאוד תכליתי, טכניקה זו יש מספר מגבלות. קניית השתלה מייצרת הפרעה מכאנית של הרקמות neuroinflammation בימים הראשונים לאחר ניתוח. לכן, זה הכרחי לחכות לפחות שבוע לאחר הניתוח לפני תחילת Aβo infuשיאון, וכדי להוסיף בקרות נאותות (הזרקה של רכב או לטרוף פעיל Aβ) לקחת בחשבון את האירועים הללו. כמו כן, רק נפח קטן של Aβo יכול להיות חדור להגביל דיפוזיה של הפתרון.
המשאבות האוסמוטי מייצגות שיטת הצגה נוחה וייחודית עבור אימות פרה-קלינית של סוכנים שנועדו למנוע ניוון מוחיה הנגרמת Aβ. מאז אימונותרפיה עם נוגדן 6E10 הוכחה בעבר כדי להקטין הצטברות Aβ במוח, 31 השתמשנו נוגדני 6E10 כהוכחה-of-concept כדי לאמת גישת in vivo החדשה שלנו. The Used של משאבות האוסמוטי במודל זה אולי כעת ניתן להשתמש כדי לפתח טיפולים שינוי המחלה הרומן הזה יכול למנוע בתצהיר ואת הרעילות העצבית של Aβo בחולי אלצהיימר פרה-קליניים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) | Harvard Apparatus | 59-7316 | |
| PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
| Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bioniche | 1989529 | |
| Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) | Bimeda | 8XYL004C | |
| Meloxicam (5 mg/ml) | Norbrook | 215670I01 | |
| Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
| Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
| ophthalmic ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
| stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
| stereotaxic cannula holder arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Guide Cannula | Plastics one | 326OPG/spc | |
| Injection Cannula | Plastics one | C315I/spc | |
| Dummy Cannula | Plastics one | C315DC/spc | |
| Suture thread coated vicryl rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
| Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| 6E10 antibody (mouse IgG1 isotype) | BioLegend | 803003 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | AB18447 | |
| Alzet osmotic pumps model 1007D | Durect corporation | 290 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Amyloid-beta 1-42 | rPeptide | A-1163-1 | |
| Hamilton syringe (10 µl) | Fisher Scientique | 14815279 | |
| Infusion Syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Needle 21 G | Terumo | NN-2125R | |
| Snuggle | Lomir Biomedical | RTS04 |
References
- Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
- Selkoe, D. J. Toward a comprehensive theory for Alzheimer's disease. Hypothesis: Alzheimer's disease is caused by the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein. Ann. N.Y. Acad. Sci. 924, 17-25 (2000).
- Terry, R. D., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30, 572-580 (1991).
- Giannakopoulos, P., et al. Tangle and neuron numbers, but not amyloid load, predict cognitive status in Alzheimer's disease. Neurology. 60, 1495-1500 (2003).
- Price, J. L., Morris, J. C. Tangles and plaques in nondemented aging and "preclinical" Alzheimer's disease. Ann. Neurol. 45, 358-368 (1999).
- Reiman, E. M., et al. Fibrillar amyloid-beta burden in cognitively normal people at 3 levels of genetic risk for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6820-6825 (2009).
- Aizenstein, H. J., et al. Frequent amyloid deposition without significant cognitive impairment among the elderly. Arch. Neurol. 65, 1509-1517 (2008).
- Mc Donald, J. M., et al. The presence of sodium dodecyl sulphate-stable Abeta dimers is strongly associated with Alzheimer-type dementia. Brain. 133, 1328-1341 (2010).
- Tomic, J. L., Pensalfini, A., Head, E., Glabe, C. G. Soluble fibrillar oligomer levels are elevated in Alzheimer's disease brain and correlate with cognitive dysfunction. Neurobiol. Dis. 35, 352-358 (2009).
- Naslund, J., et al. Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline. JAMA. 283, 1571-1577 (2000).
- Hardy, J.
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 101-112 (2007).
- McLean, C. A., et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer's disease. Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999).
- Hepler, R. W., et al. Solution state characterization of amyloid beta-derived diffusible ligands. Biochemistry. 45, 15157-15167 (2006).
- Martins, I. C., et al. Lipids revert inert Abeta amyloid fibrils to neurotoxic protofibrils that affect learning in mice. EMBO J. 27, 224-233 (2008).
- Lesne, S., et al. A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature. 440, 352-357 (2006).
- Hung, L. W., et al. Amyloid-beta peptide (Abeta) neurotoxicity is modulated by the rate of peptide aggregation: Abeta dimers and trimers correlate with neurotoxicity. J. Neurosci. 28, 11950-11958 (2008).
- Ono, K., Condron, M. M., Teplow, D. B.
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448-6453 (1998).
- Shankar, G. M., et al. Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory. Nat. Med. 14, 837-842 (2008).
- Shankar, G. M., et al. Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway. J. Neurosci. 27, 2866-2875 (2007).
- Cleary, J. P., et al. Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat. Neurosci. 8, 79-84 (2005).
- Townsend, M., Shankar, G. M., Mehta, T., Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers. J. Physiol. 572, 477-492 (2006).
- Gomez-Isla, T., et al. Profound loss of layer II entorhinal cortex neurons occurs in very mild Alzheimer's disease. J. Neurosci. 16, 4491-4500 (1996).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5, 417-421 (1996).
- Brouillette, J. The Effects of Soluble Abeta Oligomers on Neurodegeneration in Alzheimer's Disease. Curr. Pharm. Des. 20, 2506-2519 (2014).
- Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-beta1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. J. Neurosci. 32, 7852-7861 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. New York. Fourth edition (1998).
- Broersen, K., et al. A standardized and biocompatible preparation of aggregate-free amyloid beta peptide for biophysical and biological studies of Alzheimer's disease. PEDS. 24, 743-750 (2011).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 4501-4506 (2009).
- Papon, M. A., Whittington, R. A., El-Khoury, N. B., Planel, E.
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
