Introduction
Durante el embarazo humano, las células citotrofoblastos placentarios, que son células madre mononucleadas, rápidamente proliferan y se diferencian en cualquiera de las células citotrofoblastos vellosos o extravillous. citrofoblastos extravelloso invaden y remodelar las arterias espirales de la pared uterina. Citotrofoblastos vellosos, por el contrario, siguen proliferar, diferenciarse y se fusionan para formar sincitiotrofoblasto multinucleadas (el sincitio) 1. El mantenimiento de la homeostasis del trofoblasto velloso es esencial para el bienestar del feto y el embarazo saludable. De hecho, los trofoblastos vellosidades permiten el intercambio materno-fetal de oxígeno y nutrientes, y producen hormonas esenciales para el embarazo. Por otra parte, el sincitiotrofoblasto es el único tipo de células en contacto directo con la circulación de la sangre materna y proporciona una barrera física e inmunológica esencial. Por lo tanto, el sincitiotrofoblasto debe someterse a la apoptosis y sustitución para el mantenimiento de la homeostasis y para evIdentificación del placentaria patologías 2-5.
La técnica desarrollada por Kliman et al., 6 en 1986 para aislar citrofoblastos vellosidades primarias de placentas humanas provocó una revolución en la investigación de la placenta al permitir el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la diferenciación del trofoblasto velloso. Esta técnica clásica, sobre la base de las digestiones enzimáticas secuenciales con tripsina y DNasa, seguido de aislamiento en los medios de densidad de centrifugación (partículas de sílice coloidal recubierto por polivinilpirrolidona, o Percoll) es ahora reconocido como el estándar de oro para el aislamiento de células del citotrofoblasto velloso. La técnica se puede optimizar mediante inmunopurificación magnético, un procedimiento que separa citotrofoblastos vellosos de las células no trofoblásticas en base a la expresión diferencial de antígenos específicos en la superficie de estas células. Elegimos el antígeno leucocitario humano ABC (HLA-ABC) debido a la ausencia de su expresión en la célula trofoblástica membrane 7,8.
La placenta es un órgano que sufre variaciones importantes en los niveles de oxígeno durante el embarazo. En el primer trimestre, la relación de la oxigenación es fisiológicamente muy baja (2% de O2), pero aumenta a niveles leves de oxigenación (8% O 2) en el segundo y tercer trimestre. Tuuli et al. 9 describe que la reproducción in vitro del medio ambiente en el interior del trofoblasto vellosidades placentarias es un desafío y las variaciones en los niveles de oxigenación pueden incluso conducir a cambios fenotípicos. Es, por lo tanto, sugiere adoptar 8% de oxígeno como normoxia para imitar la tensión de oxígeno que se encuentra en vellosidades placentarias durante el tercer trimestre de gestación 8,9. Chen et al. 10 ampliamente estudiado diversas variables relacionadas con la tensión de oxígeno en cultivos de células del trofoblasto y demostró la importancia de la determinación de los niveles de oxígeno en un ambiente pericellular. Los niveles de oxígeno en el vellosidades tienden a aumentardebido a la vasculogénesis. El flujo de sangre en las vellosidades placentarias aumenta constantemente y el nivel de peróxido de hidrógeno (una abundancia de especies reactivas del oxígeno) es una señal importante que controla la vasculogénesis 11,12. En las complicaciones del embarazo, la falta de vasculogénesis genera hipoxia, y lo más importante, las variaciones intermitentes de oxigenación (hipoxia llamados / reoxigenación). Estas condiciones llevan a un aumento anormal en el estrés oxidativo, lo que compromete la placenta y del 13,14 viabilidad fetal. Las alteraciones que se someten las células del trofoblasto in vivo durante los episodios de hipoxia / reoxigenación se pueden imitar in vitro de la siguiente manera: citrofoblastos vellosidades se mantienen en condiciones de normoxia (8% O 2) hasta que se diferencian en sincitiotrofoblasto. A continuación, se someten a condiciones de hipoxia (0,5% de O 2) para 4 horas, seguido de un 18 hr adicional de normoxia (reoxigenación). El uso de este enfoque hipoxia / reoxigenación, trofoblastos exHiBit desregulado estado redox y el aumento de los niveles de apoptosis intrínseca 8, como se ha observado en ciertas complicaciones del embarazo. Por lo tanto, este es un útil modelo in vitro para evaluar nuevos enfoques preventivos y terapéuticos para combatir las complicaciones del embarazo asociados con la placenta hipoxia / reoxigenación.
Células de la placenta producen melatonina, que tiene varias funciones importantes, tales como la capacidad de evitar el estrés oxidativo y la disfunción placentaria 15. A continuación, presentamos los modelos de aproximación y de células experimentales utilizados para demostrar el efecto protector de la melatonina en las células trofoblásticas de la placenta a nivel molecular, celular y funcional 8.
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Protocol
Placentas fueron obtenidos inmediatamente después de los partos vaginales espontáneos de embarazos sin complicaciones en el CHUM St-Luc del Hospital, Montreal, QC, Canadá, con el consentimiento del paciente informado y la aprobación de los comités éticos (CHUM-St-Luc hospital y INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Quebec, Canadá).
1. Aislamiento y purificación de células citotrofoblastos velloso
- Soluciones y medios
- Preparar los medios de transporte, completándolo Dulbecco modificada de Eagle mediano de alta glucosa (DMEM-HG) con 1% de antibiótico vol / vol (10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) y se almacena a 4 ° C.
- Preparar medios de cultivo primario, completándolo DMEM-HG con 10% vol / vol de suero bovino fetal (FBS), 25 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES), 1% de antibiótico vol / vol (10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) y se almacena a 4 ° C. medios calientes a 37 ° C antesutilizar.
- Preparar 4 l de solución salina (cloruro de sodio en peso / vol 0,9%).
- Prepárese modificado solución salina equilibrada de Hank (HBSS) mediante la adición de HEPES 25 mM a 1x HBSS (pH 7,4).
- Preparar frescas, cuatro botellas de solución de digestión con HBSS modificado (preparado en 1.1.4), sulfato de magnesio (MgSO4), cloruro de calcio (CaCl 2), tripsina, desoxirribonucleasa IV (DNasa IV), y 1% de antibiótico vol / vol ( 10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) como se muestra en la Tabla 1.
- Preparar gradiente de densidad media centrifugación
- Preparar la solución de los medios de comunicación centrifugación de densidad complementando los medios de densidad de centrifugación con 10% vol / vol HBSS 10x.
- Preparar 14 tubos de ensayo con una solución de medios de comunicación centrifugación de densidad y HBSS modificado, como se describe en la Tabla 2.
- Mezcle cada solución densidad (paso 1.1.6.2) vigorosamente antes de añadir su contenido al gradiente. Suavementeañadir las soluciones de densidad a un tubo de centrífuga de vidrio de 50 ml con una bomba peristáltica (1 ml / min), comenzando con la concentración más alta (70%). Evitar gotitas mediante el drenaje de las soluciones contra la pared del tubo para mantener la separación adecuada de cada capa del gradiente.
- En ausencia de una bomba peristáltica, aplicar las capas muy suavemente con pipetas Pasteur.
- Preparar tampón final funcionamiento completando el tampón de ejecución (véase la Tabla de Materiales) con 2% de antibiótico vol / vol / antimicótico (10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina). Almacenar a 4 ° C.
- aislamiento citotrofoblasto velloso
Nota: El uso quirúrgico estéril equipos, material de vidrio, pipetas, matraces, etc.- En el día del aislamiento citotrofoblasto velloso, en un baño de agua C 37 °, calentar las soluciones digestiones (de la etapa 1.1.5) y 70 ml de FBS. Nota: El uso de 50 ml de FBS para interrumpir las digestiones y larestante 20 ml para la etapa de congelación (1.2.22) que se puede colocar en hielo una vez descongelado.
- Después del parto, llevar la placenta al laboratorio en medio de transporte enfriado con hielo (de la etapa 1.1.1) lo más rápidamente posible (menos de 1 hora).
- Descartar el medio de transporte y la sangre de la placenta en el cubo de basura líquida. Pesar la placenta y se sumergen en una solución salina fría.
- Medir y analizar las siguientes características: longitud del cordón umbilical; la localización del cordón umbilical; longitud de la placenta, ancho, forma (ovalada, discoide); color de las membranas; patologías de la estructura de los cotiledones. Nota: Los datos se presentan en la sección de resultados.
- Cortar el cordón umbilical junto a su inserción placentaria (es decir, en su base con un 1 cm círculo de radio adicional alrededor del cordón). Sumergir en 300 ml de solución de fijación de tejido histológico (formalina al 10%) para el análisis histológico posterior.
- Cortar toda la placenta en cubos de 5 x 5 x 5 cm. Lavar a fondo (4 veces x ~ 1 min) en el sol de solución salinaution (0,9%) para eliminar células de la sangre hasta que la solución salina es clara. Desechar el enjuague líquido.
- En un vidrio de reloj, retire membranas de la placenta y tejidos de carne picada para eliminar los vasos sanguíneos y calcificaciones. Mantenga los vasos sanguíneos firmemente con unas pinzas y extraer tejidos, utilizando la parte posterior de tijeras Metzenbaum.
- Coloque la placenta picada en un embudo Büchner. Enjuague con aproximadamente 100 ml de tampón de solución salina. Continuar picado hasta el 30 - Se obtiene 35 g de tejido picado (el uso de plástico con un peso del barco y la escala). Si es necesario, picar el resto de la placenta para obtener hasta tres adicionales 30 - 35 g preparados. Durante este tiempo, poner los tejidos picada en un recipiente pesado sobre hielo.
Nota: Este paso se llevará alrededor de 45 minutos a 1 hora.
- Coloque la placenta picada en un embudo Büchner. Enjuague con aproximadamente 100 ml de tampón de solución salina. Continuar picado hasta el 30 - Se obtiene 35 g de tejido picado (el uso de plástico con un peso del barco y la escala). Si es necesario, picar el resto de la placenta para obtener hasta tres adicionales 30 - 35 g preparados. Durante este tiempo, poner los tejidos picada en un recipiente pesado sobre hielo.
- Añadir el 30 - 35 g de tejido de la placenta picada a un matraz de tripsinización. Transferencia de 150 ml de la digestión preparado solución 1 (Tabla 1) al matraz trypsinizing y mezclar bien.
- Colocar el matraz en trypsinizingun baño de agua con agitación durante 30 min a una velocidad de no más de 50 ciclos / min y mezclar manualmente el matraz de tripsinización cada 5 min para la digestión homogénea.
- Al final de la primera digestión, quitar el matraz de tripsinización del baño de agua y la incline (45 °) durante 1 min para sedimentar el tejido de la placenta. Con una pipeta estéril de 10 ml, retirar y desechar aproximadamente 80 ml de sobrenadante. Evitar aspirar el tejido.
- Transferir 100 ml de solución de digestión 2 (Tabla 1) al matraz trypsinizing; mezclar bien y repita el paso 1.2.9.
- Al final de la segunda digestión, quitar el matraz de tripsinización del baño de agua y inclinarlo 45 ° durante 1 min. Con una pipeta estéril de 10 ml, 80 ml eliminar el sobrenadante y transferir con cuidado a un tubo de centrífuga con un filtro de células (malla 100 micras). Transferir el sobrenadante se filtró a un vaso de precipitados que contiene 2 ml de FBS cada vez que el tubo de centrífuga está lleno.
- Realizar la tercera digestión como se describe para lasegunda digestión (1.2.11 y 1.2.12), utilizando 75 ml de solución de digestión 3. En paralelo, realice los pasos a 1.2.15 1.2.16.1 para la digestión 2.
- Realizar la cuarta digestión exactamente como la tercera digestión utilizando la solución de digestión 4 (75 ml), pero recoger una cantidad máxima de sobrenadante. Realice los pasos a 1.2.15 1.2.16.1 en paralelo para la digestión 3, y finalmente para la digestión 4.
- Alícuota el sobrenadante (de digestiones 2, 3 y 4) en 13,5 ml partes, cada parte en un tubo de centrífuga de 15 ml. Con un 22.8 cm de largo pipeta Pasteur de vidrio, muy suave y lentamente colocar 1,5 ml de FBS en la parte inferior de cada tubo con el fin de crear una capa separada. No mezcle FBS y el sobrenadante. Centrifugar los tubos sin freno durante 20 minutos a 1.250 xg a temperatura ambiente.
Nota: Después de la centrifugación, 4 capas son visibles en el tubo, como se muestra en la Figura 1 La separación de las células tripsina y trofoblásticas evita la digestión celular excesiva.. - Con una bomba de vacío, ASPIRcomieron y descartar el sobrenadante (solución de digestión) y las capas de FBS, incluyendo la película blanquecina entre las dos capas. Resuspender el sedimento (los trofoblastos y capas de células de sangre rojas) con 1 ml de medio de cultivo celular caliente (paso 1.1.2; sin FBS y no HEPES).
- Recoger las células resuspendidas de todos los tubos y combinarlos en 1 tubo. Deje que el tubo de reposar a temperatura ambiente hasta que el fin de todas las digestiones. Nota: Después de todas las digestiones, el rendimiento normal es de 3 tubos de células resuspendidas (uno por la digestión).
- Completar el volumen a 15 ml con medio de cultivo celular caliente. Centrifugar a 1250 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante con una bomba de vacío. Evitar aspirar el pellet.
- resuspender suavemente el sedimento obtenido a partir de los 3 tubos con 1 ml de medio de cultivo celular caliente. En común su contenido en 1 tubo. Para obtener 8 ml, completar el volumen con medio de cultivo celular caliente.
- Muy capa suavemente la suspensión de células en un graduado de separaciónient con una pipeta Pasteur. Centrifugar sin freno durante 30 min a 507 xg a temperatura ambiente.
- Después de la centrifugación, identificar las diferentes capas de células en el gradiente con iluminación de fondo. Localizar las capas que contienen trofoblasto y contaminación de las células entre 40 - 50% de medio de centrifugación por densidad. Con una bomba de vacío, eliminar las capas superiores (> 50%).
- Recoger las células situadas en las capas de interés con una pipeta Pasteur y transferirlos a un tubo de centrífuga de 50 ml. Completar el volumen hasta 50 ml con medio de cultivo celular. Centrifugar durante 10 minutos a 1250 xg a temperatura ambiente.
- En condiciones estériles, descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado con 20 ml de FBS y contar el número de células utilizando un hemocitómetro. En el hielo, añadir 2,22 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) estéril y mezclar suavemente moviendo de un tirón. Alícuota de 1,5 ml de suspensión de células en viales criogénicos, congelar durante la noche a -80 ° C y transferir a un tanque de nitrógeno líquido.
<li> purificación Trofoblasto - Instalar el enjuague y tampones en ejecución y una nueva columna de filtro en el instrumento de purificación magnética de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realizar el "programa de limpieza" para limpiar los puertos 1 negativos, positivos 1 y 2 positivos, y luego introducir los tubos de 50 ml en cada puerto según las instrucciones del fabricante.
- Descongelar las células que fueron congelados en el paso 1.2.22 rápidamente en un baño de agua a 37 °. La transferencia de células a un tubo de 50 ml y suspender las células suavemente con 20 ml de solución tampón fría. Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 450 x g y 4 ° C.
- Descartar el sobrenadante. Repita el paso de lavado con tampón corriente fría. Recuento de células utilizando un hemocitómetro para determinar la viabilidad. Repetir la centrifugación (durante 5 min, 450 xga 4 ° C). Retirar con cuidado el sobrenadante. Añadir 1 ml de tampón corriente fría que contiene vol de anticuerpos anti-HLA-ABC ratón 1% vol /. Se incuba a 4 ° C durante 30 min, mixing suavemente cada 5 minutos.
- Añadir 6 ml de tampón corriente fría. Centrifugar durante 5 min a 450 xg y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y repetir este paso. Resuspender las células en 1 ml de tampón corriente fría que contiene vol de perlas magnéticas de anticuerpos acoplados secundario anti-ratón de 10% vol /. Se incuba a 4 ° C durante 15 min, mezclando suavemente cada 5 min.
- Añadir 6 ml de tampón corriente fría. Centrifugar durante 5 min a 450 xg y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 5 ml de tampón corriente fría.
- Se separan las células del trofoblasto de utilizar el instrumento de purificación magnética. Recoger las células en el puerto negativo y añadir 20 ml de tampón corriente fría.
Nota: Las células trofoblásticas no contienen el complejo HLA-ABC, y por lo tanto se separan de otros tipos de células y dirigidas hacia el puerto 1 negativo. - Centrifugar durante 5 min a 450 xg y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente las células en 20 ml de medio de cultivo primario caliente. Contar las células usinga hemocitómetro para determinar la viabilidad.
- Placa de las células a las siguientes densidades: 0.15 x 10 6 células / pocillo en placas de 96 pocillos, 1,6 x 10 6 células / pocillo en placas de 24 pocillos y 4,5 x 10 6 células / pocillo en placas de 6 pocillos. Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO2.
- Confirmar la pureza de las células trofoblásticas por citometría de flujo 16,17 y / o por inmunohisto 18.
Nota: Se determinó la pureza de las células inmunopurificados utilizando anticuerpos monoclonales conjugados con FITC contra citoqueratina-7 y vimentina 17-19. Este protocolo es bien detallado en Lanoix et al., 2008 7. - Después de al menos 4 horas, lavar las células dos veces con medio de cultivo caliente para eliminar las células no unidas y luego transferir las placas a la cámara de normoxia, que se compone de 8% de O 2 (véase la Figura 2 y en la sección 2).
2. En Vitro induction de normoxia e hipoxia / reoxigenación
- Operación de cámara de la incubadora (véase la Figura 2A para la puesta a punto).
- En una campana de flujo laminar, coloque una placa de Petri que contiene agua estéril en la parte inferior de la cámara de la incubadora para evitar la sequedad; a continuación, colocar las placas o frascos (paso 1.3.10) de cultivo de células previamente preparadas en los estantes superiores de la cámara.
- Fuera de la campana, conecte la cámara (orificio de entrada) a la manguera de gas (Figura 2A: 5a, b y c) para llegar al tubo de gas (8% de O 2 o 0,5% de O 2) (Figura 2A: 7). Abra las dos orificios de entrada y salida de la cámara. En este momento, el regulador de gas (Figura 2: 4) debe permanecer cerrada.
- Abrir con cuidado la válvula reguladora de gas (Figura 2: 4). Flush para 4 min con un flujo de aire de 25 L / min para reemplazar completamente el aire dentro de la cámara.
- Después de inundar la cámara, cerrar el regulador de gas a continuación, la entrada y outlet puertos de la cámara.
- Desconectar la manguera de salida del medidor de flujo (Figura 2A: 5c) del puerto de entrada de la cámara y colocar la cámara en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C.
- Reemplazar el aire actualmente presente en los platos, frascos y disuelto en el medio de cultivo por llenado de la cámara con gas 1 hr después de la etapa 2.1.3.
- Repita los pasos 2.1.1 a 2.1.6 para las otras composiciones de gas (por ejemplo, 2% de O2 para el primer trimestre de cultivo trofoblasto 9).
- Para confirmar el porcentaje de oxígeno (Figura 2B-C)
- Para confirmar la concentración de oxígeno en el medio de cultivo celular (sin células) dentro de la cámara, utilice un electrodo de oxígeno conectada a un adaptador de oxígeno. Conectar la sonda de oxígeno a un voltímetro.
- Crear una curva de calibración en la misma solución (es decir, medio de cultivo celular) mediante la exposición de la solución a los gases con contenido de oxígeno conocido (por ejemplo, 0% y21% de oxígeno). Después se estabilizan las lecturas para cada concentración, introducir el electrodo en el medio en la cámara.
Nota: Tome todas las mediciones a la misma profundidad con el fin de evitar cualquier sesgo en la concentración de oxígeno 10.
- La inducción de la normoxia e hipoxia / reoxigenación en trofoblastos.
- Después de la adición de las células trofoblásticas primarias a los matraces de cultivo de células apropiadas, placas o placas de Petri, realizar tratamientos según sea necesario.
- En paralelo, dentro de la cámara, exponer las células a la mezcla de gas deseada para reproducir una condición específica cada 24 horas (Figura 3).
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Representative Results
El aislamiento y la inmunopurificación de las células del citotrofoblasto velloso de la placenta normal plazo obtenidos por parto vaginal produjo 1 x 10 8 células viables. La placenta pesa 350 g, fue de 19 cm de diámetro, 4 cm de altura con forma discoidal y las membranas transparentes. No se detectó cotiledón malformación. El cordón umbilical tenía localización paracentral y una longitud de 56 cm. La pureza se evaluó por citometría de flujo utilizando vimentina y citoqueratina 7-marcadores. Más de 98% de las células fueron negativos para vimentina y positivas para citoqueratina-7, lo que confirma la pureza de las células trofoblastos vellosos obtenidos de la inmunopurificación. Se añadieron células citotrofoblastos vellosos a placas de cultivo de 96 pocillos en condiciones de normoxia en presencia o ausencia de la melatonina 1 mM. La diferenciación bioquímica de citotrofoblastos vellosos se controló mediante la determinación de los niveles de gonadotropina coriónica β-humana (β-hCG) como la secrecióndescrito anteriormente 1,7,20,21. La diferenciación morfológica y la apoptosis se evaluó por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos anti-desmoplakina y citoqueratina 18 filamentos intermedios anti-caspasa-troceados 7,22. Se recogieron los medios de cultivo celular a partir del día 1 (principalmente citotrofoblastos vellosos) a día 4 (principalmente sincitiotrofoblastos), se centrifugó y los niveles de β-hCG se midieron en los sobrenadantes. Producción de β-hCG, que es exclusiva para el sincitiotrofoblasto, aumentó con el tiempo de cultivo (Figura 4). No sólo la hipoxia / reoxigenación, pero hiperoxia (> 20% O 2) también se activa la apoptosis 23. Por lo tanto, la adopción de una concentración de 8% de O2 era representativa de la cantidad de oxígeno al que estaría expuesto una célula trofoblasto velloso durante el tercer trimestre del embarazo 10. El pico de los niveles de beta-hCG observados a 72 hr confirmó la capacidad de los citotrofoblastos vellosos de diferenciar en estas condiciones.La melatonina no alteró la secreción de β-hCG bajo estas condiciones de estudio. La disminución de los niveles de beta-hCG a las 96 horas fue probablemente causada por la apoptosis de las células trofoblásticas, que aumenta después de períodos prolongados en cultivo primario 5,7,22,24,25 (Figura 4). DMSO (0,1% vol / vol) fue seleccionado debido a que no afectó los niveles de β-hCG 26,27. El papel protector de la melatonina estaba fuertemente relacionada con sus propiedades antioxidantes. La hipoxia / reoxigenación después de 72 horas de cultivo inducido estrés oxidativo en las células del trofoblasto velloso. El efecto protector de la melatonina se evaluó con especies reactivas de oxígeno reactivo (ROS) Detección (Figura 5A). Después de 96 horas de cultivo, se incubaron las células trofoblásticas de 45 min con 10 M de 5- (y-6) carboxi 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (carboxi-H2DCFDA) para detectar la cantidad total de ROS produce 8. las células del trofoblasto velloso que fueron sometidos a hipoxia / reoxigenación teníanaumentado significativamente los niveles de ROS (54%) en comparación con los menores de normoxia. Este aumento fue revertido por el tratamiento con melatonina 1 mM. Por otra parte, en virtud de normoxia melatonina no modular los niveles de ROS (homeostasis), que era similar a las células del trofoblasto no tratados vellosidades (Figura 5). Figura 4 y muestran 5A que bajo la normoxia melatonina no alteró los niveles de estrés oxidativo o la secreción de β-hCG en las células trofoblásticas, que corrobora los estudios anteriores que no muestran la modulación de la homeostasis celular en condiciones normales de 28,29.
Figura 1:. Tubo de digestión Después de la centrifugación, se forman 4 capas. La capa superior se compone de solución de digestión; justo debajo de, el suero bovino fetal (FBS). Ambas capas deben ser desechados con una bomba de vacío. Las capas inferiores are integrado de la siguiente manera: una capa blanca que contiene fibroblastos, leucocitos, macrófagos y trofoblastos; y una capa inferior compuesta de células rojas de la sangre. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 2: Componentes de la Cámara La hipoxia y la medición / cálculo de la concentración de oxígeno disuelto (A) cámara de hipoxia y el conjunto de cilindro de gas: (1) de cilindro de gas; (2) El regulador de gas; (3) la abrazadera de manguera de gas; (4) la manguera de gas del cilindro; (5) Filtro de entrada; (6) La manguera de entrada; (7) Medidor de caudal; (8) Tubo de salida; (9) cámara de la incubadora Modular. (B) Cálculo de la concentración de oxígeno real en el medio de cultivo celular utilizando una curva estándar producida con concentraciones de oxígeno conocidos. (C y D)Los valores relativos obtenidos en las soluciones "0% O 2" y "21% de O 2", se representan gráficamente como una función lineal para determinar la concentración de oxígeno en el medio de cultivo celular "?% De O2". Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Generic diseño experimental de cultivo de células en Modular incubación Cámara normoxia (8% O 2; 5% de CO 2; 87% N 2) y la hipoxia / reoxigenación (H / R) (0,5% de O 2; 5% de CO 2; 94,5% de N2) son condiciones usadas para estudiar las condiciones patológicas en citotrofoblasto velloso (vCTB) y las células de sincitiotrofoblasto (STB). se cambia cada 24 horas, con o sin medio de la melatonina (1 mM)y la mezcla de gas se renueva. En H / R, las células se someten a la hipoxia STB (0,5% de O2) durante 4 horas y luego se vuelven a normoxia (8% de O2). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Efecto de la melatonina sobre la gonadotropina coriónica (β-hCG) Secreción beta-humana durante velloso Trofoblasto Diferenciación células citotrofoblastos vellosos fueron aislados y purificados de placentas plazo sanos humanos. Las células fueron tratadas durante 96 horas con la melatonina 1 mM o sulfóxido de dimetilo (DMSO 0,1%: control de vehículo) en condiciones de normoxia (8% de O 2; 5% de CO 2; 87% N 2). los niveles de β-hCG en medio de cultivo se midieron por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) después de 24, 48, 72 y 96 hr of cultivo primario. Los niveles se normalizaron al contenido de proteína del lisado de células enteras de cada pocillo correspondiente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Efecto anti-oxidante de la melatonina en Sincitiotrofoblasto expuesto a hipoxia / reoxigenación (A) El efecto de la melatonina (M; 1 mM) sobre las especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS) niveles en células de sincitiotrofoblasto bajo normoxia (N) o hipoxia / reoxigenación (HR), inducida después de 72 horas de cultivo, se evaluó por 5- (y 6) ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (carboxi-H2DCFDA) de fluorescencia-2-carboxi. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar de 3 placentas diferentes; *** P <0,001 (Lanoix, et al. 8). (B) Las vías celulares implicadas en la protección putativa de la melatonina contra la hipoxia / reoxigenación la apoptosis inducida. Células citotrofoblastos de las vellosidades primarias se cultivaron durante 72 horas bajo normoxia (8% de O 2) para permitir la diferenciación en sincitiotrofoblasto. Las células se expusieron a 1 mM de melatonina o control del vehículo y después se sometieron a la hipoxia (0,5% de O 2) durante 4 horas seguido de un período de reoxigenación 18 hr (8% O 2). La hipoxia / reoxigenación inducida por el estrés oxidativo activa redox sensible factores de transcripción tales como el factor nuclear kappa B (NF-kB) y factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1). NF-kappa B induce p53, lo que desencadena la vía de Bax / Bcl-2 de la apoptosis mitocondrial que implica la escisión y activación de las caspasas 9 y 3. Caspasa 3 activa asociada a Rho, en espiral que contiene de bobina de la proteína quinasa 1 (ROCK-1), el la escisión de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y la insuficiencia de la reparación del ADN. Prevenir la melatoninas la inducción de la apoptosis mitocondrial, actuando como un poderoso antioxidante para reducir el estrés oxidativo causado por la hipoxia / reoxigenación. Esta cifra ha sido modificado a partir de Lanoix et al., 2013 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| digestión 1 | digestión 2 | digestión 3 | La digestión 4 | |
| Modificado HBSS (ml) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNAsa (l) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0,1 mg /l) | ||||
| MgSO 4 (l) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 mM) | ||||
| CaCl 2 (l) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 mM) | ||||
| Tripsina (U) | 1,824,000 | 1,200,000 | 960.000 | 960.000 |
| P / S (ml) | 1 | 0 | 0 | 0 |
Tabla 1: Las cantidades de los ingredientes para la digestión solución de penicilina y estreptomicina (P / S);. sulfato de magnesio (MgSO 4); cloruro de calcio (CaCl <sub> 2); desoxirribonucleasa IV (DNasa IV).
Tabla 2: Volúmenes de densidad de la solución centrifugación Medios y Modificado HBSS necesarios para la preparación de la solución de gradiente.
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Discussion
En los mamíferos, el desarrollo fetal depende directamente de la función placentaria adecuada. Los orígenes del desarrollo de trastornos de la salud se basan en la hipótesis de que la causa de las enfermedades que se manifiestan más tarde en la vida se remonta al desarrollo temprano y que la placenta tiene una función mecánica en la programación fetal 30-32. La placenta es el mediador clave de crecimiento y desarrollo del feto: regula la transferencia de nutrientes, protege contra la exposición dañina, y tiene importantes funciones endocrinas. El desarrollo por parte Kliman et al. De una técnica reproducible para aislar citrofoblastos primarios viables es un hito en el estudio de las funciones placentarias normales y anormales 6. Muchos investigadores han adaptado esta técnica para reproducir las condiciones específicas in vitro de entender 18,20,33,34 fisiología placentaria. Según lo descrito por Petroff et al., Muchos pasos son importantes para garantizar un rendimiento purificado y robusta de cito aislado18 células trofoblásticas. Por ejemplo, los pasos de digestión han sido objeto de varias modificaciones desde el desarrollo de la técnica en 1988, tal como un aumento del número y longitud de las digestiones, así como a la composición y la cantidad de enzimas de digestión, lo que resulta en un mayor número de citotrofoblastos aisladas viables 18. Este protocolo actual tiene tres ventajas principales: de crioconservación, que permite la posibilidad de seguir el protocolo después de purificación inmunomagnética, lo que aumenta la pureza citotrofoblasto y el uso de pre-recubierto microplacas de mejorar la unión celular 7,34-36. La literatura existente contiene varios ejemplos de diversas modificaciones de la técnica de aislamiento de células citotrofoblastos, pero las características de los medios de comunicación centrifugación de densidad se ha mantenido prácticamente no modificado 37. La técnica presentada de aislamiento / inmunopurificación tiene varios pasos críticos. Por lo tanto, es importante para evaluar la purezade las células citotrofoblastos vellosos al final de cada inmunopurificación. Esto se puede hacer por citometría de flujo usando anticuerpos apropiados como marcadores: citoqueratina-7 (marcador trofoblástica), grupo de diferenciación 45 (CD45) y vimentina (células no trofoblásticas marcadores) 18,38,39. Otros aspectos críticos son la calidad de las placentas obtenidos, los FBS y gradiente de centrifugación de densidad media, así como la velocidad de centrifugación, que pueden influir en el rendimiento y calidad de las células 20,40.
Aunque ampliamente utilizado, la presente técnica tiene limitaciones inevitables. En primer lugar, la cantidad de células citotrofoblastos viables obtenidos después de inmunopurificación es relativamente baja y es el principal factor limitante en el número de posibles condiciones / tratamientos que se pueden probar. En segundo lugar, la vida útil de las células trofoblásticas primarias es corta y en la diferenciación in vitro en sincitiotrofoblasto es seguido de cerca por una reducción de viabili celular Ty y un aumento de la apoptosis. La corta duración de la viabilidad celular trofoblasto que no proliferan in vitro, limita la evaluación de los tratamientos a largo plazo, debido a la apoptosis se desencadena de forma irreversible después de 4 días de cultivo 7,41. En tercer lugar, la variabilidad interplacental es grande, por lo que se requiere un número relativamente grande de placentas para obtener resultados estadísticamente interpretables. Por otro lado, la cultura trofoblasto primaria tiene ventajas únicas, tales como la capacidad de las células para diferenciarse en sincitio, que permite el estudio de las condiciones y tratamientos en diferentes fenotipos de células de acuerdo con las diversas etapas de diferenciación. El método de oxigenación se presenta en este protocolo es altamente adaptable y su configuración se puede adaptar para otras situaciones, tales como el cultivo de células trofoblásticas primarias de primer trimestre del embarazo, los cuales deben estar expuestos a una tensión de oxígeno inferior a normoxia 9,42,43.
ntent "> Hay otros enfoques para estudiar la función de la placenta humana in vitro. Snap-congelación tejidos de la placenta permite la multi-ómicas los análisis, pero requiere un muestreo de varios sitios de la placenta, para evitar, por ejemplo, las variaciones metabólicas debido al gradiente de oxigenación, lo que disminuye desde el centro vellosidades a la periferia 44. sin embargo, la biología de células del trofoblasto en directo y el comportamiento no pueden ser estudiados utilizando este enfoque 45. explantes vellosos tienen la ventaja de mantener toda la estructura de las vellosidades con los tipos de células constituyentes y su comunicación, pero las respuestas a tratamientos no son específicos de células trofoblásticas 23. líneas celulares coriocarcinoma trofoblasto-como disponibles comercialmente, tales como BeWo, JEG-3 y JAR se pueden utilizar para estudiar las funciones de la placenta, como la fusión, la diferenciación, y el transporte transplacentaria. Sin embargo, estudios recientes muestran que la expresión de genes en primaria citrofoblastos y células tumorales BeWo están poco correlacionados 46-48. THus, cultivo de células de trofoblasto velloso primario, a pesar de sus limitaciones, poseen la ventaja única de imitar el ambiente in vivo de la placenta normal o anormal.Los estudios que utilizan las células del trofoblasto velloso en cultivo primario y explantes vellosos muestran que la hipoxia e hipoxia / reoxigenación disminuyen sistemáticamente la viabilidad celular trofoblasto, concomitante con el aumento de los niveles de estrés oxidativo, la inflamación, la apoptosis y la autofagia 43,49-52. Este modelo de cultivo celular hipoxia / reoxigenación, en concreto, nos ha permitido demostrar los antioxidantes y anti-apoptóticos efectos de la melatonina en las células del trofoblasto velloso. En las células del trofoblasto velloso primarios expuestos a hipoxia / reoxigenación, la melatonina previene la siguiente: la inducción de estrés oxidativo, disminución de la actividad antioxidante de enzimas, aumento de la actividad de las vías de señalización redox-sensibles, e inducción de apoptosis mitocondrial (Figura 5B) 8. el HYmodelo poxia / reoxigenación es una herramienta única para determinar el papel preventivo de la melatonina en el daño inducido por el estrés oxidativo y su papel protector posible en las complicaciones del embarazo como la preeclampsia, donde la síntesis de melatonina de la placenta se reduce 53. La melatonina es un potente antioxidante con una amplia gama de objetivos 54. Además, la seguridad de la melatonina como tratamiento ha sido en gran medida establecida. Los resultados beneficiosos con melatonina han sido reproducidas por varios investigadores y la melatonina se encuentra actualmente en ensayos clínicos como tratamiento preventivo o terapéutico potencial en los embarazos complicados por la preeclampsia o restricción del crecimiento intrauterino 55,56.
En conclusión, el aislamiento, purificación y cultivo primario de células de alta calidad citotrofoblasto, junto con la técnica de la hipoxia / reoxigenación permiten una amplia gama de enfoques experimentales prometedores para entender mejor las complicaciones del embarazo relacionados con oxidativoel estrés y mejorar la salud de la placenta.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
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