Summary
תרכובות לשבש האנדוקרינית (EDC) להוות סיכון ממשי של הסביבה המימית. מתקני טיהור שפכים עירוניים הם תורמים עיקריים העצמה אסטרוגניים של מים עיליים. המתודולוגיה הניתן במאמר זה מאפשר הערכה של היעילות וההתאמה של תהליכי טיפול בשפכים ביחס להסרת EDC.
Introduction
חששות לגבי תופעות לוואי של תרכובות משיבוש האנדוקרינית על בריאות חיות הבר הרבייה הוביל את האיחוד האירופי להציב שני חומרים אסטרוגניים (אסטרדיול אתיניל-אסטרדיול) על "לרשימת מעקב" במסגרת הנחיית Framework מים (WFD). EDC להקיף מגוון רחב של שיעורים כימיים, כוללים אסטרוגנים סטרואידים טבעיים וסינטטיים, תרופות, חומרי הדברה, כימיקלים תעשייתיים ורכב מוצרים צריכים עם תופעות לוואי ידועות על חיות בר. חלק תרכובות אלה עשויים להשפיע על בריאות האדם פוטנציאל 1.
המחקרים הראו כי קולחי WWTP הם אסטרוגניים לדוג 2 וכתוצאה מכך רבי מי קבלה הם גם אסטרוגניים לדגים 3. זה הוצג לראשונה באמצעות סקרים לאומיים בבריטניה שהראה ריכוזי vitellogenin מוגברים (חלבון חלמון נקבה לנקבה מבשר 4) בדם של דגי ים זכר מראש גבוהערכיויות של אינטרסקס (פיתוח ביצים ו / או צינוריות רבייה נשיות ב testis של דג זכר) במיני דגים gonochoristic בדרך כלל 5,6.
לטיפול בשפכים מקובל הוא בדרך כלל תהליך בן שלושה שלב מורכב סינון ראשוני ואחריו טיפול יסודי ותיכון אשר מסיר הן נמוגות מושעות חומר אורגני. היעילות של הסרת פרט EDC תלויה מאפייני physicochemical של חומרים על האפקטיביות של תהליך הטיפול מיושם. למען סר רבים EDC באמצעות ספיחה והשפלה ביולוגית עשויים להיות משמעותי, אך לא שלם. טיפול שליישונים, כגון סינון חול, יכול להיות יעילה להגדלת הסרת EDC 7 ואילו טיפול מתקדם באמצעות חמצון מתקדם (עבור אוזון למשל) או פחם פעיל יכול להיות יעיל ולהשיג ליד הסרה מלאה 7.
ההערכה של כל טכנולוגיה חדשה לבית טיפול בשפכיםds כדי לקבוע את היעילות של התהליך המוצע להסרת EDC. סוללת בדיקות, כולל ניתוח כימי ממוקדות לצד בדיקות ecotoxicology, באמצעות in vivo ו bioassays במבחנה, מספק מידע מקיף למטרה זו. אמנם מאוד שימושי למטרות רגולטוריות, אנליזה כימית ממוקדת יכולה לספק רק נתונים על התרכובות (מטבוליטים ספציפיים) פיקוח. Bioassays בנוסף לאפשר "גילוי" של תופעות לוואי של מטבוליטים וטרנספורמציה שפכים שנוצר טיפול תוצרי לוואי שאחרת מבלי שיבחינו 8,9. מאמר זה מתאר את השימוש בסוללה של מבחנים כימיים ecotoxicity מעבדה כדי להעריך את היעילות של מספר תהליכים לטיפול בשפכים מתקדמים ומתפתחים הסרת האונות האסטרוגנית של גולמי הביוב מטוהר וקבלת מים.
Protocol
הצהרה אתיקה: הפרוטוקולים להערכת האנדוקרינית לשבש פעילות של כימיקלים / תערובות בדגים אושרו על ידי צער בעלי חיים וגוף סקירה האתיקה של אוניברסיטת לונדון ברונל (AWERB) ועל ידי משרד הפנים בבריטניה תחת בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986.
1. איסוף דגימת מים, שימור הפקת
- איסוף ושימור לדוגמא
- לפני השימוש, לנקות את הבקבוקים עם חומר ניקוי פעיל משטח מתאים. לאחר הניקוי, יש לשטוף את הבקבוקים עם מים, ניקוז ויבש.
- לאסוף דגימות בבקבוקי זכוכית של קיבולת 2-L המכילים חומר משמר המורכב של 0.5 גרם של נחושת (II) ניטראט 6 מ"ל של 3.6 פתרון חומצה הידרוכלורית M. חנות דגימות מתחת ל -10 מעלות צלזיוס. חלץ ולנתח בהקדם האוסף והשימור הבאים אפשריים.
- מיצוי לדוגמא וניקוי (לניתוח אסטרוגן סטרואידים) 10
- מיצוי שלב מוצק (SPE)
- לפני החילוץ, כדי להפחית מוצקים מרחפים, דגימות מים מסננות באמצעות נייר סינון גודל 1 מיקרומטר הנקבובית.
- לאחר סינון, דגימות ספייק עם תקן פנימי על ידי הוספת 100 μl של spiking פתרון המניות תקן פנימי deuterated המכיל 2,4,16,16-ד 4 -estrone: 2,4,16,16-ד 4 -17β-אסטרדיול (E2) : ו -4 -17α-אתיניל-אסטרדיול (EE2) (בבת 40 מיקרוגרם / ליטר מתנול) 1,000 מ"ל קולחים (או 100 מ"ל influent) וכתוצאה מכך ספייק פנימי של 2 ng / L לביוב 2,4,16,16-ד דגימות שפכים, ו 20 ng / L עבור דגימות influent הביוב.
- צרף ספינות שסתום חד פעמיות, מחסניות SPE בנזן סטירן divinyl, ומאגרי מחסנית למנגנון SPE. הפעל משאבת ואקום כדי לבדוק את הציוד אטום כראוי.
- פיפטה 5 מ"ל של אתיל אצטט לתוך כל המאגר, להתנות את מחסניות. הפעילו את משאבת ואקום (אל מתחת ל 10 inHg לאפשר קצב זרימה של פחות מ -10 מ"ל לדקה)ולמשוך דרך הנוזל. אל תתנו מחסניות SPE להתייבש. יש לחזור על התהליך עם 5 מ"ל של מתנול ואחריו 5 מ"ל מים.
- הוספת כספים בכל מאגר מחסנית עם מים ולהתחבר 1/8 "צינורות PTFE בין מאגרי המחסנית ובקבוקי מדגם זכוכית. הפעל את הוואקום בקצב זרימה של פחות מ -10 מיליליטר לדקה ולאפשר המדגם כולו לעבור את המחסנית. רוקן את הבקבוק פסולת לפי הצורך.
- ביסודיות לייבש את מחסניות SPE תחת ואקום (או באמצעות אוויר או חנקן) עד שהנוזלים מחסנית לשנות צבע (למשל, מחום כהה חום בהיר).
- שם נקי בקבוקוני איסוף זכוכית יבשים 10 מיליליטר לתוך מתלה ומקום בתוך סעפת החילוץ. בדוק שכל אניה היא מעל בקבוקון. פיפטה 8 מיליליטר של dichloromethane לתוך כל מאגר מדגם, מתג על משאבת הוואקום (קצב זרימה של פחות מ -10 מיליליטר לדקה) ולמשוך את הנוזל דרך לתוך הצלוחיות האוספות.
- הסר 10 מ"ל בקבוקונים מן סעפת SPEולהשתמש concentrator לצמצם את היקף עד 1 מ"ל. העברת כל מדגם לתוך בקבוקון אוטומטי סמפלר ובהמשך להתרכז 100 μl באמצעות חנקן מכה למטה הציוד.
- לפני החילוץ, כדי להפחית מוצקים מרחפים, דגימות מים מסננות באמצעות נייר סינון גודל 1 מיקרומטר הנקבובית.
- Gel חלחול כרומטוגרפיה (GPC) לנקות
- להזריק 95 μl של תמצית מדגם eluted לתוך HPLC מצוידים GPC באמצעות בתנאים המתוארים בטבלה 1. לרכז את GPC לחלץ עד 200 μl באמצעות concentrator וחנקן מכה למטה מנגנון ולאחר מכן לבצע עד 2.0 מ"ל עם הקסאן.
- SPE לנקות
- צרף ספינות שסתום חד פעמיות, מחסניות aminopropyl, ומאגרי מחסנית סעפת SPE. שם נקי בקבוקוני איסוף זכוכית יבשים 10 מיליליטר לתוך מתלה ומקום בתוך סעפת החילוץ. פיפטה 2 מיליליטר של הקסאן לתוך כל מאגר, להתנות את המחסניות. תאפשר לנוזל לעבור את המחסניות.
- פיפטה תמצית מדגם GPC אל תוך המאגר ושוב תאפשר לנוזללעבור את המחסנית. אסוף המדגם eluate בבקבוקון ומסירי הסעפת. אל תמחק eluate.
- שים בקבוקון אוסף יבש 10 מ"ל חדש ונקי לתוך מתלה ומניחים בתוך סעפת החילוץ. כדי לשטוף את המחסנית, להוסיף 2 מ"ל של אתיל אצטט בהקסן (30% v / v) למאגר ולמשוך את הנוזל דרך המחסנית. חזור עם אצטט 2 מיליליטר של אתיל נוסף הקסאן, שלכת כל הכביסות.
- מניח את צנצנת 10 מיליליטר אוסף המקורי (שלב 1.2.3.2) בחזרה מתל בתוך סעפת החילוץ. פיפטה 2 מ"ל של אתיל אצטט אצטון (50% v / v) אל תוך המאגר, מתג על משאבת ואקום (מתחת ל 2 inHg לאפשר קצב זרימה של פחות מ -2 מ"ל לדקה) ולמשוך את הנוזל דרך לתוך בקבוקון . חוזרים על הפעולה עם 2 מ"ל אחר של אתיל אצטט.
- הסר את הבקבוקון מדגם ולהשתמש concentrator לצמצם את היקף לחלץ 1 מ"ל. מעבירים את המדגם לתוך בקבוקון זכוכית קטן ולהשתמש חנקן לפוצץ ציוד, להתאדות tהוא לחלץ ליובש מתחלה.
- הוספת 100 μl של מתנול ומערבבים היטב. מעבירים את התמצית אוטומטי סמפלר בקבוקון (עם 0.3 מ"ל להוסיף) מכסה את הבקבוקון. ניתוח הדגימות באמצעות LCMS / MS (ראה סעיף 2).
- מיצוי שלב מוצק (SPE)
| טור: | ג'ל PL, 50 א ', 300 x 7.5 מ"מ, 5 מיקרומטר |
| טור משמר: | ג'ל PL, 50 x 7.5 מ"מ, 5 מיקרומטר |
| שלב נייד: | dichloromethane |
| ספיקה: | 1 מ"ל לדקה |
| טמפרטורת עמודה: | 25 ° C |
| גלאי UV: | 210 ננומטר |
| נפח הזרקה: | 95 μl |
| מצב הזרקה: | לַעֲמוֹדARD |
| צייר מהירות: | 500 מ"ל לדקה |
| הוצא מהירות: | 500 מ"ל לדקה |
| צייר פריטים: | 3 מ"מ |
| שבר שנאסף: | חלק 3 מ"ל (7 - 10 דק ') ב 10 מ"ל בקבוקונים |
תנאי טבלה 1. פרמטרי Gel חלחול כרומטוגרפיה (GPC) לניקוי דגימות שפכי חילוץ. פרטים בטבלת עמודת GPC, בשלב נייד, טמפרטורה, עוצמת זריקה, ואורך גל גלאי.
- מיצוי לדוגמא (עבור מסך אסטרוגן שמרים)
- דגימות מסנן כמפורט בסעיף 1.2.1.1. צרף ספינות שסתום חד פעמיות, מחסניות SPE C18, ומאגרי מחסנית למנגנון SPE. הפעל את משאבת הוואקום כדי לבדוק את הציוד אטום כראוי.
- מתנול פיפטה 5 מ"ל לתוך כל המאגר, להתנות את C18 מחסניות. הפעל ואקום (לכ -5 inHg כדי לאפשר זרימה של כ -5 מ"ל לדקה) ולתת בטווח הנוזל דרך, ועצר כדי לתת דרך 1 דקות וחצי דרך. אל תתנו מחסניות תרגיל יבשות. יש לחזור על התהליך גם עם HPLC כיתה או מים מזוקקים פעמיים (DDH 2 O). שוב לא יתייבש.
- חלץ דגימות מים כמפורט בסעיף 1.2.1.4. המשך הוואקום למשך 30 דקות לפחות כדי לייבש את המחסניות ביסודיות.
- מניח צלוחיות אוספות 10 מיליליטר יבשות ונקיות לתוך מדף סעפת החילוץ. בדוק שכל אניה היא מעל בקבוקון. הוסף 5 מ"ל של מתנול לכל המאגר. הפעל את הריק (זרימה מקסימלית של 5 מ"ל / min) תאפשר לנוזל לעבור את המחסנית לתוך בקבוקון, ועצר כדי לתת דרך 2 דקות וחצי דרך.
- לפני הניתוח באמצעות מסך YES, להפחית את התמצית ליובש מתחלה באמצעות חנקן ולגבש מחדש עם 500-1,000 אתנול μl. חותם את המכסים של צלוחיות מדגם כדי למנוע אידוי ולשמור על 4 מעלות צלזיוס (ב ניצוץ ללאמְקָרֵר).
2. ניתוח כימי שימוש LCMS / MS
- מטב את תנאי ההפעלה של מערכת LCMS / MS באמצעות הוראות היצרן.
- לנתח פתרונות סטנדרטיים כיול, תמציות מדגם, ריק ואנליטית בקרת איכות (AQC) דגימות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ותנאי ספקטרומטריית מסה, ולפקח על מעברים יון כמפורט בטבלה 2. קבע את הריכוז של אסטרוגנים סטרואידים בקטע מדגם באמצעות פנימי תקני 10.
| LCMS | |||||
| כרומטוגרפיה נוזלית | |||||
| טור: | C18 (2), 150 x 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר. | ||||
| נפח הזרקה: | 20 μl | ||||
| זְרִימָה: | 0.5 מ"ל לדקה. | ||||
| Mשלב obile: | ממיס: מים המכילים אמוניה 0.1%. | ||||
| B מרכך: אצטוניטריל. | |||||
| תוכנית Gradient: | |||||
| זמן (דקות) | 0 | 10 | 18 | 24 | 28 |
| ת: יחס ממס B | 90:10:00 | 50:50:00 | 0.479167 | 0.479167 | 90:10:00 |
| ספקטרומטר מסה | |||||
| מָקוֹר: | Electrospray (יונים שליליים) | ||||
| גז מקור: | CUR: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi | ||||
| TEM: 600 ° C, CAD גז 5 ו IonSpray מתח -900 | |||||
| מעברי MRM: | |||||
| E1: | 269/145 & 269/143 | ||||
| E2: | 271/145 & 271/143 | ||||
| EE2: | 295/145 & 295/143 | ||||
| E1-D4: | 273/147 | ||||
| E2-D4: | 275/147 | ||||
| EE2-D4: | 299/145 | ||||
טבלה 2. פרטי פרמטרים ותנאי ניתוח LCMS / MS של אסטרוגנים סטרואידים בתמציות בשפכים. טבלה נותנת נפח הזרקת מדגם וספיקה, תנאי שלב ניידיםשיפוע nd.
3. פעילות אסטרוגנית שימוש במסך אסטרוגן שמרים Vitro (YES) Assay 8
- כן ולאחסן רכיבים בינוניים ובינוני מינימאליים לפי טבלה 3 (א) עד (ז).
| (א) בינוני מינימלי (pH 7.1): |
| הכן Fe 2 (SO 4) 3 הפתרון על ידי הוספת 40 מ"ג של Fe 2 (SO 4) 3 עד 50 מ"ל מים מזוקקים פעמיים (DDH 2 O) |
| הוסף 1 L DDH 2 O בכוס זכוכית 2 L |
| מוסיפים את הרכיבים הבאים אל מבחנה: |
| 13.61 גרם KH 2 PO 4 |
| 1.98 גר '(NH 4) 2 SO 4 |
| 4.2 גרם KOH |
| 0.2 גרם MgSO 4 |
| 1 מ"ל של Fe 2 (SO 4) |
| 50 מ"ג L-לאוצין |
| 50 מ"ג L-היסטידין |
| 50 מ"ג אדנין |
| 20 מ"ג L-arginine-HCl |
| 20 מ"ג L-מתיונין |
| 30 מ"ג L-tyrosine |
| 30 מ"ג L-isoleucine |
| 30 מ"ג L- ליזין-HCl |
| 25 מ"ג L-פנילאלנין |
| 100 מ"ג חומצה L-גלוטמית |
| 150 מ"ג L-ולין |
| 375 מ"ג L-סרין |
| שים את הכוס על בוחש מחומם עם פרעוש מגנטי ומערבבים עד שהוא נמס כל |
| בדוק את ה- pH הוא 7.1 ולהתאים במידת הצורך |
| באמצעות מזרק סטרילי 50 מ"ל לוותר 45 מ"ל aliquots לתוך בקבוקי זכוכית עם מכסים בראש הבורג מתכת |
| לעקר את הבינוני המינימאלי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב חיטוי |
| חנות בטמפרטורת החדר |
| (ב) D - (+) - גלוקוז: |
| כן פתרון 20% w / v ב DDH 2 O |
| לוותר 20 מ"ל aliquots כדי צלוחיות זכוכית עם מכסים בראש הבורג מתכת |
| לעקר את פתרון גלוקוז ב 121 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב חיטוי |
| חנות בטמפרטורת החדר |
| (ג) L-אספרטית חומצה: |
| הכן פתרון המניות של 4 מ"ג / מ"ל ב DDH 2 O |
| לוותר 20 מ"ל aliquots כדי צלוחיות זכוכית עם מכסים בראש הבורג מתכת |
| לעקר את פתרון חומצת L-אספרטית ב 121 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב חיטוי |
| חנות בטמפרטורת החדר |
| (ד) פתרון ויטמין: |
| כן פתרון ביוטין על ידי הוספת 2 מ"ג של ביוטין 100 מיליליטר של DDH 2 O |
| תשקול 8 תיאמין מ"ג, 8 מ"ג פירידוקסין, 8 מ"ג חומצה פנטותנית, 40 מ"ג אינוזיטול. מוסיפים את כל המרכיבים היבשים 20 מ"ל של פתרון ביוטין 180 מ"ל DDH 2 O |
| הפוך 10 מיליליטר aliquots סטרילי ידי סינון דרך פילטר הפנויה גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר לתוך בקבוקי זכוכית סטרילית, בתוך ארון זרימת אוויר למינרית |
| חנות ב 4 ° C |
| (ה) L-תראונין: |
| הכן 100 מ"ל של 24 מ"ג / מ"ל L-תראונין DDH 2 O |
| לוותר 10 מ"ל aliquots כדי צלוחיות זכוכית עם מכסים בראש הבורג מתכת |
| לעקר את פתרון L-תראונין ב 121 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב חיטוי |
| חנות בטמפרטורת החדר |
| הכן 25 מ"ל של פתרון סולפט 20 מ"מ נחושת (II) ב DDH 2 O |
| הפוך 5 מיליליטר aliquots סטרילי ידי סינון דרך מסנן גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר לתוך בקבוקי זכוכית סטרילית, בארון זרימה למינרית |
| חנות בטמפרטורת החדר |
| (ז) Chlorophenol אדום-β-D-galactopyranoside (CPRG): |
| הכן 25 מ"ל של פתרון 10 מ"ג / מ"ל של CPRG DDH 2 O |
| הפוך 5 מיליליטר aliquots סטרילי ידי סינון דרך מסנן גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר לתוך בקבוקי זכוכית סטרילית, בארון זרימה למינרית |
| חנות ב 4 ° C |
Assay אסטרוגן מסך לוח 3. שמרים; הכנה ואחסון של רכיבים בינוני ובינוני מינימלי.
- הכנת StoraGE של 10x תרבית שמרים מרוכז
- ביום 1, להכין מדיום הגידול (כמפורט 3.4.1) ויוצקים לתוך בקבוק חרוטי סטרילית. להוסיף 125 μl של 10x שמרים מרוכז מן הבקבוקון קריוגני מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. דגירת התקשורת המחוסנת ב 28 מעלות צלזיוס למשך כ 24 שעות על שייקר מסלולית.
- ביום 2, להפוך שני בקבוקים של מדיום הגידול (~ 50 מ"ל) ויוצקים לתוך צלוחיות חרוטי סטרילי נפרד. הוסף 1 מ"ל של שמרים מתורבתים 24 שעות לתוך בקבוק אחד של התקשורת צמיחה. דגירת התקשורת המחוסנת ב 28 מעלות צלזיוס למשך כ 24 שעות על שייקר מסלולית.
- ביום 3, לשפוך כל תרבות 24 שעות לתוך צינור 50 מ"ל צנטריפוגות סטרילי. צנטריפוגה 50 מ"ל צינורות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 2,000 x ז. יוצקים את supernatant, מחדש להשעות כל גלולה ב 5 מ"ל של מדיום מינימלי עם גליצרול 15%. הפוך 0.5 מ"ל aliquots של 10x התרבות שמרים מרוכז 1.2 מ"ל cryovials ולאחסן סטרילי ב -20 ° C לכל היותר 4 חודשים.
- Prepaמנה ואחסון של מניות כימיות עקומים סטנדרטי
- יש לשטוף את כל כלי הזכוכית ומדיות פעמים עם אתנול אבסולוטי ולהשאיר לייבוש לפני השימוש כדי להסיר כל עקבות של מזהם.
- לשקול E2 ישירות לתוך בקבוקון זכוכית בארון במשקל אבקה ולהתאים ריכוז לפי נפח באתנול המוחלט. לדלל את ריכוז של 2x10 -7 M (54.48 מיקרוגרם / ליטר). מכסה ולאחסן חותם על 4 מעלות צלזיוס (בתוך מקרר ניצוץ-חינם).
- מפיק assay
- ביום 0, להכין מדיום הגידול. כדי בבקבוק 45 מ"ל של מדיום מינימלי להוסיף 5 מ"ל פתרון גלוקוז, 1.25 מ"ל תמיסת חומצה L-אספרטית, 0.5 מ"ל פתרון ויטמין, 0.4 מ"ל פתרון L-תראונין, ו 125 נחושת μl (II) פתרון סולפט. יוצקים מדיום הגידול לתוך בקבוק חרוטי סטרילית.
- להוסיף 125 μl של 10x מניות מרוכזות (מופשר מאחסון -20 ° C) אל בקבוק דגירת התקשורת המחוסנת ב 28 מעלות צלזיוס למשך כ 24 שעות על שייקר מסלולית.
- ביום 1, תווית 'צלחת דילול' 96-גם סטרילי ולעשות דילולים סדרתי (100 כרכים μl אתנול) של עקומת סטנדרט E2 ו- בדיקה כימית (ים) / תמצית השפכים (ים) (למשל, EE2).
- לייבל 96-גם סטרילי שטוח אופטית 'צלחת assay (ים)' microtiter התחתונה. על כל צלחת כולל חסר (פלוס / מינוס ממס) וכן עקומת סטנדרט E2, בנוסף שורות של בדיקה כימית (ים) / תמצית שפכים (ים).
- פיפטה 10 μl של כל ריכוז (E2, כימי או תמצית) לתוך הבאר המתאימה צלחת assay. פיפטה 10 μl של אתנול לבאר כל 'ריק ממס' של צלחת assay. השאירו צלחת assay עם המכסה להתאדות עד יובש.
- הפוך בקבוק של מדיום הגידול (~ 50 מ"ל) ולהוסיף 0.5 מ"ל של chlorophenol אדום-β-D-galactopyranoside (CPRG) פתרון לבקבוק. לקבוע את צפיפות התאים שמרים בתרבות 24 שעות על ידי מדידת עכירות של התרבות ב 620 ננומטר קורא צלחת. לחסן אבינוני ssay עם 4x10 7 תאים שמרים מ -24 התרבות hr.
- יוצקים בינוני assay מחוסן לתוך שוקת סטרילי. בעזרת פיפטה רב ערוצי להוסיף 200 μl של מדיום assay מחוסן היטב בכל צלחת 96-היטב assay.
- שים את המכסה על הצלחת assay 96-היטב וסוגרים את הקצוות עם הקלטת. לנער את צלחת assay (ים) במרץ למשך 2 דקות על שייקר צלחת כייל לדגור על 32 מעלות צלזיוס בתוך ארון חימום אוויר טבעי.
- ביום 2, לנער את צלחת assay (ים) נמרצות על שייקר צלחת כייל למשך 2 דקות. חזור אל 32 ° C חממה.
- ביום 4, לנער את צלחת assay (ים) במרץ למשך 2 דקות על שייקר צלחת כייל. השאר את הצלחת (ים) לעמוד במשך כ שעה 1 אז לקרוא את צלחת assay (ים) בבית ספיג של 540 ננומטר (ספיגה אופטימלית CPRG ~ 575 ננומטר) 620 ננומטר (עבור עכירות) באמצעות קורא צלחת. השאירו צלחת (ים) בטמפרטורת החדר ולקרוא מאוחר יותר במידת הצורך.
- ביום 0, להכין מדיום הגידול. כדי בבקבוק 45 מ"ל של מדיום מינימלי להוסיף 5 מ"ל פתרון גלוקוז, 1.25 מ"ל תמיסת חומצה L-אספרטית, 0.5 מ"ל פתרון ויטמין, 0.4 מ"ל פתרון L-תראונין, ו 125 נחושת μl (II) פתרון סולפט. יוצקים מדיום הגידול לתוך בקבוק חרוטי סטרילית.
- חישובי פעילות אסטרוגנית <ol>
- קריאות assay נכונות עבור עכירות באמצעות המשוואה הבאה: ערך מתוקן = מדגם או סטנדרטי (E2) ספיג ב 540 ננומטר - [מדגם או סטנדרטי (E2) ספיג ב 620 ננומטר - ספיגה ריק ב 620 ננומטר]. עקומת מגרש E2 רגילה עם חסר מתאים (כדי לבדוק זיהום) 8.
- השתמש מדגם תיקן (תמצית או כימי) לחשב 'ושווי אסטרדיול'. השתמש בערכים העקומים משוואת רגרסיה סטנדרטית זממו E2 (פולינום 3-פרמטר או ליניארי תלוי בכושר) לשרבב המדגם / לחלץ ערכים ספיגים לערכים מקבילים E2. השתמש גורם ריכוז (כלומר, מים נשאבים ונפח של אתנול לחלץ הוא מחדש תלויה) לחשב פעילות אסטרוגנית במדגם מראש חילוץ.
4. מעבדת הערכה מבוססת של פעילות אסטרוגנית שימוש ב אינדוקצית Vivo Vitellogenin ב דגיגי פאטהד זכר
- השתמש דגיגי פאטהד זכר (Pimephalespromelas)> 4 חודשים, מציגות מאפיינים מיניים משניים (כלומר, ההתפתחות גבשושית נישואים וכן fatpad הגבה) מעידה על נחישות מין גברית.
- כדי למנוע פעילות השרצה, נפרדת בוגרת זכרי שלושה שבועות (± 3 ימים) לפני התחלת המבחן. גדר לפחות באקווריומים זכוכית שני 45 L עם טעינת מקסימלית של 3 גר '/ ל. כדי להבטיח מספר הולם של דגים בריאים עבור הבדיקה, השתמש מינימום של 100 גברים.
- שמור על דג הזכר בתנאים סביבתיים זהים יהיה מנוסה במבחן (כלומר, טמפרטורת מים של 25 ± 1 ° C ו- 16: אור 8 שעות: photoperiod הכהה). לשמור על קצב זרימת המים דילול לכל טנק כדי להבטיח זמן החלפת 95% לפחות כל 6 עד 8 שעות, כלומר, 330 מ"ל / דקה עבור טנק 45 L.
- מנגנון בדיקה ותכנון ניסויים
- השתמשו במיכלי זכוכית גדול כדי להכיל טעינה של עד 3 גרם של דגים לליטר וואטאה. במשך 8 זכרים בוגרים (נומינלי 4.5 גרם כל אחד), להשתמש בטנק L 10-20.
- השתמש שני טנקים לשכפל עבור כל טיפול ולגונן כל טנק מכל הפרעות ראייה מיותרות (כלומר, להשתמש במסכי כרטיס למינציה בין הטנקים). זהה כל טנק עם מספר הלימוד, ריכוז חשיפה ומספר זיהוי כלי.
- עבור מחקרים בשפכי שפכים
- ביום ההגעה, מיד להעביר השפכים לתוך מיכל אחסון ב -10 ± 1 ° C. התחל מינון שפכים בתוך שתי שעות קבלת השפכים.
- להאכיל את השפכים, באמצעות משאבת peristaltic, מטנק אחסון C 10 ° עד ספינת הסתגלות. מחממים את השפכים בתוך כלי הסתגלות עד 18 ± 2 ° C. לשאוב את השפכים המחוממים מספינת ההסתגלות לכלי המינון / ערבוב ואחר כך באקווריומים הבדיקה (המחזיק את הדג). מחממים את באקווריומים לטמפרטורה של 25 ± 1 ° C.
- עבור מחקרי מינון כימיים
- לשקול כימיקלים מבחן בארון במשקל אבקה. הכן מניות כימי מרוכז DDH 2 O רצוי ללא שימוש בממיסים.
הערה: אם ממסים נדרשים solubilize תרכובות בדיקה, השתמש שולט ממס בנוסף לשליטת מים לדילול. - להאכיל הכביד או מים לדילול משאבה מטנק כותרת בקרת טמפרטורה באמצעות מכשיר בקרת זרימה (ים) מינון / ערבוב כלי. משאבה מרוכז מנייה כימית (ים) באמצעות מערכת שאיבת peristaltic אל המינון / ערבוב כלי. לשלוט על קצב המשאבה (כימי המלאי) וקצב זרימת מים (מי דילול) כדי להשיג את ריכוז החשיפה הרצויה.
הערה: צינורות סיליקון השתמש להאכיל כימיים במים / מבחן לכל כלי בדיקה מן המינון / ערבוב כלי. השתמש קצב הזרימה כי די בכך כדי לספק תחליף כלי 75% ב hr 24 לפחות, כלומר, 20 מ"ל / דקה עבור טנק 20 L. לשמור על קצב הזרימה ב ± 10% מהערך הנקוב המצוין.
- לשקול כימיקלים מבחן בארון במשקל אבקה. הכן מניות כימי מרוכז DDH 2 O רצוי ללא שימוש בממיסים.
- להאכיל את הדגים פעם ביום עם ארטמיה למבוגרים קפוא מופשר טרי (הארטמיה) 2.5 (± 0.1) גרם לכל טנק לכל הזנה. גם להאכיל את הדגים פעם ביום עם כמות קטנה (שני קמצוץ אצבע) של מזון דגי פתית טרופי. השאר מינימום של 3 שעות בין כל עדכון.
- שמור תיעוד האכלה מדי יום כדי לעקוב האכלה בתגובה / התנהגות (טובה, בינונית או עניה, לעומת הבקרות). סיפון הטנקים לפחות פעמיים בשבוע (רצוי יומי) כדי להסיר כל מזון וצואה שלא נאכל. נקה את הצדדים ואת תחתית של כלי הבדיקה לפחות פעם בשבוע.
- קח דגימת מים שבועיתים מכל טנק כדי לאשר פעילות אסטרוגנית (באמצעות מסך שמרים) ואת ההרכב הכימי (באמצעות בכימיה אנליטית). ראה סעיפים 1-3 לפרטים של דגימת מים, מיצוי וניתוח.
הערה: כל ניסוי, השתמשו מלא מים לדילול (שליטה שלילית), בקרה חיובית (E2 או EE2) בתוספת לפחות שלושה דילולים של שפכים (100, 50 ו -25%) או בדיקה כימית לפקח מנת תגובה. אם נבדקים טכנולוגיות חדישות, להשתמש תרכובת / קולחים עם או ללא טיפול (למשל, EE2 ללא טיפול, EE2 עם TAML / מי חמצן (H 2 O 2) טיפול 12; איור 1).
- השתמשו במיכלי זכוכית גדול כדי להכיל טעינה של עד 3 גרם של דגים לליטר וואטאה. במשך 8 זכרים בוגרים (נומינלי 4.5 גרם כל אחד), להשתמש בטנק L 10-20.
תרשים איור 1. המייצגים עיצוב ניסיוני של in vivo פאטהד דגיג המבדק vitellogenin לקבוע הסרת ecotoxicity של אתיניל-אסטרדיול 17α באמצעות טיפול במים TAML / חמצן. Experimental להגדיר מורכב באקווריומים זכוכית שמונה 11 L כל הפד עם זרימה רציפה של מים. פתרונות מי מניות כימיות אישית (מסונן דה-כלור) מועברים לתאי הערבוב. ריכוזים נומינליים (ללא תגובה) של כלי ערבוב 2 ng / L EE2, 80 ננומטר TAML ו 0.16 מיקרוגרם / LH 2 O 2. פתרונות מניות כימיות (EE2, H 2 O 2 ו TAML) ערוך במינון בנפרד, כך שהתגובות החל משנת הלימודים באי כלי הערבוב. דגים (8 דגיגים פאטהד זכר לכל טנק) נחשפים לתערובת (ים) לאחר זמן מגע התגובה של כ 45 דקות. דגימות מי לקוחי טנקי החשיפה שבועית. דגימות פלזמה לקוחים דגיגים פאטהד למדוד את vitellogenin סמן ביולוגי אסטרוגניים (VTG) מקבוצה הבסיס, בתחילת המחקר, וכל הדגים האחרים לאחר 21 ימים של חשיפה. הטיפולים הספציפיים הם: '-C'; בקרה שלילית (מי דילול בלבד), '+'; בקרה חיובית של EE2,'+ ה'; EE2 בתוספת H 2 O 2, '+ T'; EE2 בתוספת H 2 O 2 בתוספת TAML. נתון זה יש הבדל בין מילס et al. 2015 12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- נוהל בדיקה
- תקופת הסתגלות
- מדוד משקל רטוב (ז) של כל דג זכר לבגרות מינית, ולהקצות באקראי לכל טנק (8 זכרים לכל טנק).
- יש לשמור את הדגים מוקצים מאותו יצווה ולתחזק אותם באותם תנאי הבדיקה. השתמשו בדגים אלה כדי להחליף כל אנשים המראים סימנים של נזק פיזי או חוסר מצב בזמן האיקלום 7 ימים. ודא בסוף האיקלום כל במכל טיפולים יש 8 זכרים אשר הסתגלו באופן מלא את תנאי הבדיקה.
- קח דגימות פלזמה "בסיס" מתוך 8 זכרים נוספים מאותו baטצ של דג זכר. פעל על פי שיטת דגימת דם בסעיף 4.4 ואת שיטת ניתוח Vitellogenin (VTG) ב 4.5.
- לאחר תקופת ההסתגלות, לספק מניות מינון בשפכים או כימיות אל טנקי החשיפה במשך 21 ימים כמתוארים 4.2.2 או 4.2.3. תמותת צג, התנהגות ומראה הפיזי של הדגים בכל לשכפל טנק יומי לפני המהדורה הראשונה של היום. שיא כל התנהגות או תקריות חריגות.
הערה: ודא תנאים סביבתיים ושיעורי האכלה לשמור על בריאות הדגים (סעיפים 4.2.4 ו 4.2.5).
- תקופת הסתגלות
- דגימת דגים לאחר תקופת החשיפה של 21 יום
- 12 שעות לפני הדגימה, להפסיק להאכיל את הדגים.
- צינורות מיקרו צנטריפוגות לייבל לאיסוף דגימות דם, להוסיף ~ 5 μl של Aprotinin (מעכב פרוטאז) ומניחים אותם על הקרח.
- בצע פתרון 500 מ"ג / ליטר של MS222 (הרדמה) על ידי המסת 500 מ"ג של MS222 לכל 1 ליטר של מים עם כלור-דה (הסתגל בעבר25 ± 1 ° C). לנטרל את MS222 ל- pH 7.4 ± 0.4 באמצעות 1 M NaOH.
- הזז כל הדגים מהמיכל לתוך MS222 שנאגרו. שמור על הפתרון עד הפסקת כל תנועת operculum (בדרך כלל 5 ± 1 דקות).
- מדוד ורשום את אורך מזלג (מ"מ) תחת הרדמה סופנית. השתמש אזמל חד פעמי לקטוע את הזנב, ולהשתמש צינור hemocrit heparinized כדי לאסוף את הדם מעורק הזנב (איור 2). בזהירות לוותר על הדם לתוך צינור microcentrifuge מראש שהכותרת ולשמור על קרח.
- להרוג את הדגים מיד לאחר להוציא דם. אשר למוות על ידי הפסקה מוחלטת של הזרימה ו / או ההרס של המוח. מדוד ורשום משקל דגים הכוללת (קרוב 0.01 גרם), לנתח רקמות כנדרשות.
- צנטריפוגה הדם (7,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C) בתוך 2 שעות של האוסף. מעבירים את supernatant פלזמה בעזרת פיפטה לתוך האמבטיה microcentrifuge 0.4 מ"ל חדש שכותרתוes ולאחסן על הקרח. להקפיא את צינורות המכילים פלזמה על קרח יבש בתוך 30 דקות של צנטריפוגה ולאחסן ב -80 ° C לפני ניתוח לריכוזי פלסמה VTG.
איור 2. תמונות המתארות דגיג פאטהד זכר (Pimephales promelas), אוסף פלזמה ומיקום של אשך. בסוף החשיפה של 21 יום כל דג צריך להיהרג כדי לאסוף דגימות דם. ברגע תחת אורך דגי הרדמת מסוף זה (אורך מזלג, מ"מ) יש למדוד, ומייד אחריה איסוף דם מעורק זנב התמונה-A:. קו מקווקו אדום מציין מיקום עבור קטיעת זנב (אזמל חד פעמי יש להשתמש כדי לקטוע את הזנב ). תמונה ב 'מראה צינור hemocrit heparinized לאיסוף דם. כל דג אמור להיות נהרג מייד לאחר דגימת הדם שלו נלקחה, במקרה זה על כל הראשנותק מהגוף (צילום-C). לאחר הדגים כבר נהרגו חלל הגוף ניתן לפתוח עד לחשוף את האיברים הפנימיים. תמונה-C מציג את המיקום של האשכים (בלוטת מין) ביחס בשלפוחית השחייה (SB) בדגי cyprinid, למשל, דגיג פאטהד, מקק, קרפיון, וכו ' אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- למדוד ריכוזי VTG פלזמה עם ערכת assay immunosorbent enzyme-linked VTG הומולוגי (ELISA) תוכננה במיוחד עבור דגיגים פאטהד.
- כן סטנדרטי VTG או מאגר כפי שמתואר הפרוטוקול של היצרן. לדלל מדגם פלזמה 1:50, 1: 5,000, ו 1: 500,000 ו assay אותם בשני עותקים להשיג קריאות בטווח עקומת סטנדרט VTG לפי הוראות היצרן. פעל לפי ההנחיות של היצרן כדי לחשב ריכוזי vitellogenin.
5. הערכות בתחום טכנולוגיות לטיהור שפכים מתקדמות / רומן להמתיק פעילות אסטרוגנית שימוש in vivo Vitellogenin ואינדוקצית אינטרסקס ב רואץ (rutilus Rutilus)
- לכידה של מקק בר חייה במורד זרם של שפכי מפעל טיפול שפכים
הערה: השתמש מקק (Rutilus rutilus) או דגים מלוחים או מתוקים שופעים אחרים מינים, שהם gonochoristic וידוע להיות רגיש הפרעה אנדוקרינית אסטרוגניים.- לתפוס דגים באמצעות electrofishing, רשת, השמנה או שיטות דיג מוכרות אחרות בהתאם למצב 13. הובלת דגים במיכלים סודה בחזרה למעבדה דגימה.
- הכן צינורות microcentrifuge כמפורט 4.4.2. כן בופר MS222 כמתואר 4.4.3. להרדים דגים כמפורט 4.4.4.
- מדוד באורך דגים במשקל בהרדמה סופנית.
- איסוף דם מהעורק הזנב באמצעות dispoמזרק heparinized צובל. הרוג כל הדגים מיד לאחר איסוף דגימת דם. בזהירות לוותר על הדם לתוך צינורות microcentrifuge מראש שכותרתו ולשמור על הקרח. הכן פלזמה כמתואר בשלב 4.4.7 ולמדוד VTG ידי ELISA (4.5).
- בעזרת מלקחיים להסיר 2-3 קשקשי דגים מכל דגים ומכניסים מעטפות נייר קטנות שכותרתו בנפרד. מעטפות חנות בטמפרטורת החדר בתנאים יבשים לקביעת וניתוח צמיחה גיל דג מאוחר יותר.
- חלל הגוף להרחיב עם אזמל כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. להוציא את הבטן כדי לחשוף את בשלפוחית השחייה עם בלוטת מין ממוקם משני הצדים (איור 2). מוציאים בזהירות את בלוטות המין זיווג עם מלקחיים בסדר חוטם ומקום לתוך בקבוקון זכוכית. מכסים את בלוטות המין עם מקבע של Bouin לפי יחס של 1:10 רקמות: מקבע.
- השאר את רקמת Bouin של עבור 6-24 שעות בהתאם לגודל של הרקמות (מקבעים חודר 1 מ"מ לכל שעה). לאחר קבוע, לשפוך את המקבע של Bouind להחליף עם 70% ספירט תעשייתי (IMS). אחסן את הרקמה הקבועה בטמפרטורת חדר עד רקמות מעובדי histopathology (סעיף 5.3).
- Field בהתבסס הערכת פעילות אסטרוגנית באמצעות in vivo vitellogenin, אינטרסקס אינדוקציה מקק
- עיצוב הניסיון ולהקים
הערה: הגדרת טנקי מפעל פיילוט מבעוד מועד התחלת עבודת vivo. התחל הטנקים זורמים 3-4 שבועות לפני כל תוספת של דגים למערכת. צג ספיקות מים, איכות מים ותנאים (pH, טמפרטורה, חמצן מומס, וכו ') באופן קבוע על מנת להפוך את הפרמטרים בטוחים יכול להישמר.- לבנות טנקים גדולים (למשל, 300-1,000 L) באתר במפעל הטייס, אשר יכול לקבל 'שליטה' מי ברז דה-כלור, מי קולחין סטנדרטי (ים) והתקדם מי קולחין (ים) במקביל. צרף משאבת אוויר / aerators אל הטנקים. ספיקות מי סט להשיג נ טנק 6 לפחותחילופי olume ליום.
הערה: הפוך טנקים בטוחים הם מבודדים היטב מוצלים כדי למנוע תנודות טמפרטורה יומיות מוגזמות. טנקי עיצוב לאפשר תצפית של הדגים, לשינויים התנהגותיים (חוסר ההאכלה, וכו '), סימנים של תחלואה ותמותה.
- לבנות טנקים גדולים (למשל, 300-1,000 L) באתר במפעל הטייס, אשר יכול לקבל 'שליטה' מי ברז דה-כלור, מי קולחין סטנדרטי (ים) והתקדם מי קולחין (ים) במקביל. צרף משאבת אוויר / aerators אל הטנקים. ספיקות מי סט להשיג נ טנק 6 לפחותחילופי olume ליום.
- הפעל את החשיפה על ידי צף השקיות של מקק (מחוות הדגים) ב הטנקים בהתאמה עבור שעה 1. מוסיף מי טנק אל השקיות בהדרגה עד טמפרטורת מים והגבלות הן סביבה. שחרר את הדגים לתוך הטנקים שלהם.
- Feed מקק מבוגר מדי יום על מוצרי דגים pelleted (גודל 0.5-0.8). Feed מקק לנוער יומי על pelleted קטן (בגדלים גלולה 100-300) כרצונך שאינם אסטרוגניים להאכיל 14, הותאם על בסיס של מזון שלא נאכל. שמור תגובת האכלה מתעדת ימי האכלת שיא / התנהגות (טוב, בינוני או עני, לעומת הבקרות).
- קח דגימות מים שבועיות מכל טנק כדי לאשר פעילות אסטרוגנית, הרכב כימי. Seסעיפים ה 1-3 לפרטים של שיטות דיגום ואנליזה מים.
- עיצוב הניסיון ולהקים
- Histopathology של דגים בלוטות המין 15
- מוציאים בזהירות את בלוטות המין גזור וקבוע (כמתואר בשלבים 5.1.6 ו 5.1.7) ממיכל עם פינצטה ומניחים על קרש חיתוך.
- השתמש בלהב microtome לחתוך כל בלוטת מין ל 3 חלקים (קדמי, באמצע ואת אחורי) ומכל חלק לחתוך חתך עבה 3-5 מ"מ. בזהירות במקום כל שש חתיכות לתוך קלטת ביופסיה פלסטיק שכותרתו, ומקום לתוך מעבד רקמות באמצעות תזמונים בטבלה 4.
- רקמות שעווה להטביע וסעיף על microtome סיבובית (3-5 מיקרומטר). העברת חלקי שקופיות זכוכית מצופית ביו-דבק שכותרתו ומגלשות ומניחים על צלחת מחוממת (נקבעה על 45 מעלות צלזיוס) להתייבש במשך 24 שעות.
- כתם השקופיות, באופן ידני או באמצעות Stainer אוטומטי, באמצעות התזמונים כמפורטים בטבלה 5. מניח ירידה של סוכן גובר על הרקמה הצבעונית, ואניאיי כוס coverslip על סוכן הרכבה להגן על הרקמה.
- ראשית, לבחון כל שקופית בהגדלה נמוכה (20X, מטרת 2X כלומר, עם גדלת 10x קווי עין) כדי לקבוע מין ומספר הנקודות של קבצים מצורפים חלל הגוף 15. הערה בתופעות חריגות עבור כל דגים.
- בהגדלה גבוהה יותר (100X או 400X), לבחון את הרקמה להעריך בשלבים gametogenesis, הפרעות ואת הנוכחות של ביציות ברקמת האשכים. רשום את חומרת אינטרסקס באמצעות המערכת לדירוג הבאה בטווח שבין 0 (רקמת זכר רגילה) עד 7 (100% רקמת השחלה) 6 (ראה לוח 6).
מספר שלב יַחַס מַטָרָה זמן (שעות) 1 70% IMS התייבשות 3 2 90% IMS התייבשות 2.5 3 95% IMS התייבשות 1.5 4 100% IMS התייבשות 1.5 5 100% IMS התייבשות 1.5 6 100% IMS התייבשות 1.5 7 100% IMS התייבשות 1.5 8 הסולק היסטולוגיה קָרְחַת יַעַר 1.5 9 הסולק היסטולוגיה קָרְחַת יַעַר 1.5 10 הסולק היסטולוגיה קָרְחַת יַעַר 1.5 11 דוֹנַג חדירת שעווה 1.25 12 דוֹנַג חדירת שעווה 1.25 סה"כ 20 שעות משטר עיבוד לוח 4. לשעווה הפריית רקמות עבור histopathology. רקמות אמורה להתבצע ב מעבד רקמות אוטומטיות. רקמות צריכות להיות שקועות הפתרונים המפורטים עבור פרק הזמן הקצוב.
כתם לא. כֶּתֶם מַטָרָה זמן (דקות) 1 הסולק היסטולוגיה מתמוסס שעווה 15 2 הִידרָצִיָה 2 3 90% IMS הִידרָצִיָה 2 4 70% IMS הִידרָצִיָה 2 5 מי ברז (ריצה) לִשְׁטוֹף 2 6 HAEMOTOXYLIN גרעין תא כתם כחול 10 7 מי ברז (ריצה) הסרת עודפים 10 8 acidified IMS dechlorination 20 שניות 9 מי ברז (ריצה) לִשְׁטוֹף 20 שניות 10 Lico 3 מלח 20 שניות 11 מי ברז (ריצה) לִשְׁטוֹף 20 שניות 12 1% Eosin (מימי) כתמים ורודים הציטופלסמה 20 שניות 13 מי ברז (ריצה) הסרת עודפים 5 14 70% IMS התייבשות 2 15 90% IMS התייבשות 2 16 100% IMS התייבשות 5 17 הסולק היסטולוגיה הסר IMS, סוכן מחייב 5 פתרונות לוח 5. ושעות טבילה עבור Haematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים של רקמות אשכים דגים. שקופיות צריכות להיות ממוקמות באמבטיה כל עבור allocated זמן ברצף. מכתים של רקמות H & E נדרש לקבוע השפעה על התפתחות או ארגונית של שפכי שפכים אסטרוגניים על בלוטות מין דגים.
ציון תיאור סעיף 0 אשך זכר רגיל 1 מולטיפוקלית ovotestis עם 1-5 ביציות (בדרך כלל בנפרד) מפוזרים בין רקמת האשכים 2 ovotestis מולטיפוקלית, 6-20 ביציות לעתים קרובות בקבוצות קטנות מפוזרות בין רקמת האשכים 3 ovotestis מולטיפוקלית, 21-50 ביציות באשכולות 4 > 50 <100 ביציות. סעיף בדרך כלל מולטיפוקליות ויש לו מראה של פסיפס של הבדיקהרקמת icular ואת השחלות. 5 > 100 ביציות, בדרך כלל מולטיפוקליות אבל יכול גם להיות מוקד עם אזורים לזיהוי בבירור של רקמת השחלה ועל אשכים מופרדות מרקמת האשך. 6 > 50 אחוזים של רקמת אשכים על סעיף שחלות מופרדות בבירור מרקמת האשך על ידי תאי אפיתל ורקמות phagocytic. 7 סנט 100 תוצאות של רקמת אשכים על סעיף שחלות. לוח 6: שיטת הניקוד כדי להעריך את חומרת מצבו אינטרסקס ב מקק. היסטולוגית שקופיות שהוכנו של רקמת האשכים יש לבחון תחת מיקרוסקופ אור, ב 20X, 100X והגדלה 400X, להעריך בתופעות חריגות ואת הנוכחות של ביציות ברקמת האשכים. טבלה זו שונה מן ג'ובלינג <em> et al. 2006 6.
Representative Results
ניסיונות להבין את ההשפעה של שיפורים לתהליכי טיפול בשפכים או כדי לקבוע את הטכנולוגיה המתאימה ביותר כדי retrofit ציוד כטיפול שליישונים בבית קיים WWTP ביחס היעילות של הסרת פעילות משיבוש האנדוקרינית קולחים משוחררים, דורש לא רק את המדידה של כימיקל מפתח רכיבים להיכנס לתוך העבודות אבל דורש הניתוח של תוצרי הפירוק אשר יכולה להיות גם פעילות משיבוש האנדוקרינית. בקולחי ביוב ביתיים, את אסטרוגניים ביותר לחומרים הנוכחיים הם הורמוני הסטרואידים, אסטרון (E1), 17β-אסטרדיול (E2) 17α-אתיניל-אסטרדיול (EE2) 5,8. אסטרוגנים סטרואידים מופרשים בעיקר מהגוף כתערובת של 16,17 conjugates הפעיל. אסטרוגנים מצומדות אלו deconjugated משמעותי במערכת הביוב על ידי פעילות חיידקים הידרדרות נוספת מתרחשת WWTP. סטרואידי deconjugated arדואר יוסר מהצ'אט בשפכים על ידי ספיחה על הבוצה או biodegraded במהלך הטיפול משני וכתוצאה מכך ההיווצרות, ראשי של תוצרי לוואי טרנספורמציה ובסופו של דבר מינרליזציה מלאה יכולה להתרחש המרכיב הפעיל הראשוני. הניתוח הכימי של כל התרכובות הבודדות בזרם השפכים יהיה קשה, זמן רב ויקר ולא יכסה רכיבים פעילים ידועים נוכחיים במדגם. יתר על כן, סכום התרומה האסטרוגנית של כל רכיב יהיה רק לספק אינדיקציה לגבי העצמה מצטבר האסטרוגנית של מדגם של התרכובות מנותחות. זהו סיכון שבו תהליכי טרנספורמציה ליצור חומרים אסטרוגניים ידועים או שבו influent הוא ממוצא תעשייתי. שילוב אנליזה כימית עם in vivo ו bioassays ecotoxicology במבחנה מספקת פתרון לנוכחות של רכיבים אסטרוגניים ידועים בתערובות כגון ביוב מטוהר. מבחנים במבחנה כגון שמרים אסטרוגן Screen (YES) נעשה שימוש נרחב כדי לקבוע את הפעילות האסטרוגנית של שפכים וביוב לעזור לזהות את הרכיבים הפעילים בדגימות מטופל 8,18,19. עם זאת, השוואות בין in vivo ו בדיקות במבחנה יכולות להיות משמעותיות 11 ו הערכה מקיפה של תהליכים חדשים לגבי טיפול של עצמה לשבש האנדוקרינית דורשת סוללה של בדיקות כימיות ecotoxicology.
קביעה אם צמחים או תהליכי טיפול פרטניים להסיר תרכובות פעילות מזרם השפכים יכולה להיות מושגת באמצעות אנליזה כימית העוקבת חילוץ מדגם, ריכוז וניקוי של התמצית לפני הניתוח, לרוב המובלים באמצעות LCMS (/ MS) או GCMS (/ MS) שיטות. הנתונים המתקבלים מניתוח כימי יכולים לשמש כדי לקבוע את מידת ציות פרט חזה אין ריכוזי אפקט (PNEC) 20 או תקן איכות הסביבהs (EQS) 21 של תרכובות אדם ספציפי ולכן שיטות כאלה הם חיוניים עבור נתונים ותאימות לתקנות. יתר על כן, ממוקד או שיטות אנליזה כימית הלא ממוקד לאפשר זיהוי quantitation של תרכובות פרט או איזומרים בהשוואה לשיטות ביולוגיות, המספקים מענה מוחלט. שיטות אנליזה כימית ולכן לאפשר ההערכה של תרכובות דיסקרטיות להתבצע להיפגש כדי לעמוד באתגרי טיפול בשפכים אלה על בסיס צמח טיפול אינדיבידואלי. מחקרים הראו כי טיפול בשפכים קונבנציונלי (למשל, צמחי בוצה משופעלת) יכול להיות יעיל מאוד בהסרת הורמוני סטרואידים טבעיים למרות הסרת ההורמון הסינטטי EE2 נוטה להיות פחות יעיל. מחקרי שדה באמצעות טיפול מתקדם תוך שימוש בטכניקות כגון אוזון, פחם פעיל מגורען (GAC) וממברנות הוכיחו, אם כי במחיר גבוה, כי הם יכולים לשמש פתרון מקצה הצנרת להסיר EE2 אל מתחת predicted רמות אפקט ו אל מתחת לתחום הגילוי. איור 3 מציגה את הסרת EE2 באמצעות GAC במפעל טיהור עירונית פיילוט בהיקף. מחקרים שנעשו על פיילוט בהיקף במפעלי טיהור עירוניים באמצעות סיום טיפול צינור GAC גם להראות הפחתת עצמת אסטרוגניים הבאה GAC נמדד באמצעות מסך אסטרוגן שמרים (YES) כפי שניתן לראות באיור 4.
איור 3. נתוני שדה הדוגמא מראים את הסרת אתיניל-אסטרדיול לאחר טיפול שליישונים מתקדם. (א) דוגמאות נאספות מן WWTP הבא (צמח בוצה משופעלת) קונבנציונלי טיפול בעקבות ההליכים המתוארים לשימור מדגם. (ב) דוגמאות מופקות באמצעות מיצוי שלב מוצק, למעלה ניקה כדי להסיר חומרים מפריעים באמצעות SPE שלב נורמליכרומטוגרפיה ג'ל חלחול. (ג) תמצית מרוכזת נקי מרוכזת לנפח נמוך ונותחו באמצעות LCMS / MS electrospray יונים שליליים במצב MRM. תוצאות מחושבות באמצעות סטנדרטיזציה פנימית באמצעות סטנדרטים פנימיים שכותרתו isotopically. בדוגמא המוצגת, EE2 שוהה שפכי ASP הסופיים בריכוז מעל לרמת השפעה לא חזה (PNEC) של 0.1 ng / L ו- מוסר באמצעות GAC ו אוזון (O 3) כדי ריכוז ידידותי לסביבה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תמונה של מסך אסטרוגן שמרים (YES) צלחת assay (א) מראה שינוי צבע מצהוב לאדום, הקשורים לפעילות האסטרוגנית של הדגימות. מגרשים שנוצרו והקרנת צלחת assay YES תיקן ספיגת (540ננומטר) של התקן אסטרדיול (B), השפכים תהליך בוצה משופעלת (ASP) ו גרגירי פחם פעיל (דגימות שפכים קולחים GAC) (C). כל דגימה נבדקה בשני עותקים. שפכי ASP ו- GAC חולצו ומרוכזים באמצעות שיטות SPE המפורטים בסעיף 1. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Ozonation הוא גם יעיל בהסרת אסטרוגנים סטרואידי פעילות אסטרוגנית מצמח טיפול בשפכים כמקובל מטופלים. אוזון הוא מסוגל לחמצן מגוון רחב של מזהמים אורגניים חומר אורגני מומס דגימות שפכים מספק תכונות חיטוי. האפקטיבי של Ozonation תלויה במאפייני מים כגון pH, כמות חומר אורגני והמנה היישומית של אוזון. אסטרוגנים כי יוסרו כהלכה על ידי טיפול קונבנציונלי יכול להיותיוסר שפכים עם מינונים בין DOC O 3 / מ"ג מ"ג 0.8 ו -2. אוזון הוא סוכן חמצון סלקטיבי, אשר מגיב עם אתרים עשירים אלקטרונים (קשרי פחמן-פחמן בלתי רווי, תרכובות ארומטיות כוללים אלכוהול ארומטיים), מה שהופך את אוזון ישים עבור התפלגות מספר EDC. עם זאת, החיסול של תרכובות פרט אינו בהכרח להוביל מינרליזציה המלאה של המתחם המקורי. חומרים אורגניים Ozonation הבאים עשויים להשתנות ביניים ייצור או חמצון טרנספורמציה תוצרי לוואי הכוללות מספר בעלי משקל מולקולרי נמוך, כיתות הקוטב של תרכובות כגון אלדהידים, קטונים, חומצות קרבוקסיליות, קטו חומצות, תרכובות ברום ו. דוגמאות כוללות, bromate, פורמלדהיד, אצטאלדהיד וחומצות קרבוקסיליות. שימוש in vivo ו bioassays במבחנה הוכח כי למרות האוזון באופן חלקי בלבד מתחמצנים כמה חומרים כימיים, המוצרים שינו במידה רבה וכתוצאה מכך יש estrog נמוךenic עצמה ומכאן היישום של אוזון לעבר תוצאות מינון מתאימות לשלילה גבוהה של פעילות אסטרוגנית.
אחד היתרונות העיקריים של טיפול נוסף של שפכים הוא הפחתת פמיניזציה של דג זכר בקבלת מים; השפעה שלילית שיכול להוביל פוריות 3 מופחת. במחקרי vivo באמצעות דגים (למשל, מקק או דגיג פאטהד) נחשף תאי נקבה ניבטו צג שפכים או ביציות ב testis של דג זכר (למשל, כפי שניתן לראות באיור 5). אינטרסקס או זכר VTG נעדר או מופחת באופן משמעותי בדגים בעקבות טיפול מתקדם כגון GAC 7 או אוזון 22. מחקרים אלה מראים כי מוצרים טרנספורמציה הנוצרים במהלך Ozonation אינם אסטרוגניים, אולם זה אינו עוסק רעיל של הקולחים מיוצרים. בעיה זו טופלה במחקרים אחרים, למשל מחקר שנערך על ידי מגדבורג et al.
איור 5. Photomicrographs של גבר נורמלי (א) ו אינטרסקס (B, C) בלוטות המין מן מקק מבוגר (rutilus Rutilus) נחשף wastewaters ב הערכה מבוססות בשטח.-A Photomicrograph, מתאר קטע היסטולוגית של testis זכרות נורמלי. Photomicrograph-B ו- -C, מתארים סעיפים היסטולוגית של דג זכר אינטרסקס, שהוא נחשף בשפכי שפכי תהליך הבוצה משופעלת במשך שישה חודשים. חצים מצביעים ביציות נוכחיות ברקמת האשכים. סרגל קנה מידה מייצג 100 מיקרומטר בכל photomicrograph. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
together.within-page = "1"> העלות הגבוהה של סיום טיפול צינור באמצעות אוזון, GAC או טכנולוגית קרום מחייבת הפיתוח של בעלות נמוכה אלטרנטיבית, שיטות קיימא עבור האנדוקרינית שיבוש כימי סרה (EDC). יתר על כן, שיטות ספיחה והפרדה פשוט להפריד EDC משלב אחד למשנהו ולא לחסלם באמצעות השפלה. Activators TAML פותחו כדי לזרז חמצון מי חמצן של micropollutants האורגני בשפכים 12,24 - 26. TAML מטהרים עם H 2 O 2 לבזות EE2 ביעילות אסטרוגנים סטרואידים אחרים במי מעבדה טהורים וכן בקולחי מצמחי טיפול בשפכים עירוניים בדגימות שתנו ממוסמרות 12. מחקרי מעבדה, תערוכות TAML / H 2 O 2 טיפול מספק הסרת אסטרוגן סטרואידים גבוהה כולל הסרת EE2 ו מפחית באופן משמעותי פעילות אסטרוגנית נמדדה במבחנה באמצעות מבדק YES ו substantially פוחתת פמיניזציה דגים in vivo, הנמדדים על פי המבדק VTG (איור 1 ואיור 6).
איור 6. ריכוז EE2 ממוצע ופעילות אסטרוגניים מטופלים ומי טנק שלא טופלו (א) ו vitellogenin פלזמת בסיס ודגי זכר חשוף (B). א) ריכוז EE2 (ng / L, ברים כחולים כהים) נמדדו על ידי LCMS / MS , פעילות אסטרוגנית (L ng / שווה EE2, ברים ירוקים כהים) נמדדה באמצעות מסך אסטרוגן במבחנת שמרים (YES). B) vitellogenin פלזמה (ng / ml, ברים תכלת) ריכוז דגיגי פאטהד זכר נמדדו באמצעות אנזים כמוני -linked assay immunosorbent (ELISA). תוצאות אנליזה כימית EE2 כפי שדווח <0.03 ng / L EE2 (כלומר, נמוך יותר מאשר גבול הגילוי (לוד)) טופלו כבעל מחצית לוד (כלומר, 2 O 2 + TAML, EE2 + H 2 O 2, EE2 בלבד. ברי שגיאה ב-גרף מייצגי סטיית התקן של הממוצע, ברי שגיאה ב-B גרף מייצגי סטיית התקן. מכתבים מעל ופאב בבית-B גרף מייצגים דמיון סטטיסטי. נתון זה יש הבדל בין מילס et al. 12 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
מתקני טיהור שפכים הם התוואי העיקרי של זיהום מים עיליים עם EDC. הערכת היעילות של הסרת פעילות אנדוקרינית של תהליכי הטיפול הקונבנציונלי, מתקדמים או המתעוררים מחייב שימוש במגוון של מבחני כימי וביולוגי. ניתוח כימי באמצעות ניתוח הלא ממוקד וממוקד מספק מידע איכותי או כמוני על היעילות של הסרת רכיבים בודדים ולכן מאפשר הערכה להתבצע נגד תקני איכות הסביבה או חזה אין ריכוזי אפקט ליצירת התמציות או התערובות של תרכובות המנותחות.
הדור של מוצרי שינוי נובעים מינרליזציה שלם של חומרים לאחר טיפול ואת הנוכחות של רכיבים פעילים ביולוגי ידועים בשפכים מגביל את השימושיות של בדיקות כימיות לבד. שילוב של in vivo ו bioassays במבחנה בשילוב עם כימאי אנליטיהקרנה ר"י מספקת ארגז כלים שימושי כדי לקבוע את היעילות של הסרת EDC ידי תהליכי טיפול בשפכים מתעוררים. בדיקות אלו, כאשר שנערכו לצד פרמטרים של איכות מים מסורתיים נקודות קצה טוקסיקולוגית מיקרוביולוגית אחרות מאפשרות הערכה ביקורתית של טכנולוגיות טיפול בשפכים נוכחיות ועתידיות.
חשוב לציין כי מסכי אסטרוגן מבוסס שמרים (למשל, YES) אינם רק במבחנה מבחני לקבוע עוצמה האסטרוגנית של כימיקלים wastewaters. מספר מבחני מבוססי תאים יונקים transfected ביציבות פותחו מדי, למשל, ER-CALUX 27 ו hERα-הלה-9903 28 עם תאי סרטן שד אנושיים או תאים סרטניים בצוואר הרחם בהתאמה. ה'כן הושווה מבחני יונקים דומים מבוססי תאים ונמצא יש רמה גבוהה המקביל שחזור, שיעורי זיהוי אסטרוגניים שלילי חיובי אמת אמת 29, althoאיכס זה נחשב לפעמים להיות מעט פחות רגיש 27. אחד היתרונות של מבחני הכתב מבוסס שמרים היא כי במעבדות ללא ניסיון משמעותי עם תרבית תאים יונקים ה'כן ניתן לאמץ בקלות רבה יותר, כפי שהוא דורש אמצעים ביו-בקרה מחמירים פחות וטכניקות סטרילי (YES יכול להתבצע על גבי ספסל במידת הצורך) . בתא האנושי מבוסס המבחנים גם דורשים CO 2 חממות ו luminometers לעומת קוראי חממת microplate התקניים הנהוגים YES. שני שמרים המבוססים אסטרוגן כתב מבחנים (YES, שמר אפייה וא-כן, adeninivorans Arxula) כרגע עוברים שבילים בין-מעבדת תיקוף ISO 19,040 "איכות מים - קביעת הפוטנציאל אסטרוגניים של מים ושפכים" המדגיש את התעשיות עניין הטכניקות הללו.
ישנן מספר המגבלות של השיטות שתוארו הכולל זיהום הפוטנציאלישל דגימות במהלך דגימה, מדגם אחסון וניתוח עם חומרים אסטרוגניים שמקורם בסביבת השדה או מעבדה או על ידי זיהום אדם (למשל, plasticizers, פעיל שטח, מוצרי טיפוח אישי). סוג זה של זיהום ב assay YES (או מבחני כתב מבוססים תאים אחרים) יהיה להעלות את הרקע ואת להשפיע על השימוש של assay. דגימות מים או ממסים מאוחסנים בבקבוקי פלסטיק יכולות לגרום חיוביות שגויות בקלות. שלילי שווא הם גם דאגה היא LCMS / MS ואת assay YES דורשים SPE להתרכז אסטרוגנים לרמות לזיהוי. המטריצה, הבחירה של ממס sorbent ו elution SPE יכול להשפיע על יעילות מיצוי סוגי תרכובות eluted. באמצעות מחסניות SPE C18 עבור חילוץ באמצעות בתנאים המתוארים בפרוטוקול זה עלול ליצור דעה קדומה שלילית, כמו תרכובות קוטב והבסיסיות ביותר היו להישמר היטב על ידי הסופג. יתר על כן, פרוטוקול זה דורש כינון מחדש של eluent YES eluted מ methanol כדי אתנול באמצעות אידוי ליובש חנקן למממן וכתוצאה מכך אובדן של תרכובות נדיפות. כתוצאה מכך הפרוטוקול יכול לספק לזלזל פעילות האסטרוגנית של בדגימות שנבדקו. מגבלות אלה חשובות במיוחד כאשר בוחנים את assay YES באופן תרכובות ידועות או לא צפויות עלול לפספס, כי הם לא חולצו או שהם אבדו בשל התאדות. יתר על כן, טכניקת LCMS / MS עושה שימוש סטנדרטים פנימיים שכותרתו לתקן להתאוששות; גישה זו לא ניתן להשתמש עם assay YES.
מגבלות משמעותיות של בדיקות in vivo קולחים כוללות גבוהה עלות וזמן הנדרשים להערכה בהשוואה לשיטות במבחנה. כיום השימוש במבחני עובר דגים על מנת לאתר פעילות אסטרוגנית מוגבל. עם זאת, יש כבר כמה הצלחה עם ההפקה מהונדסת תגובת אסטרוגן זוהרת עוברי דגים 30, אשר יכולים לשמש ליישומים עתידיים. דגיגים פאטהד (ששימשו protoc זהol) הוא זן מעבדה משותף ואינדוקצית VTG בדגי זכר היא סמן ביולוגי מתועדת היטב של חשיפה אסטרוגנית מידה לכימות של estrogenicity שפכים הקולח 22 או תרכובות אסטרוגניים אחרות או תערובות 31. הנחיות בדיקת OECD לכימיקלים לשבש האנדוקרינית אומתו באמצעות דגיג פאטהד מבוגר, Medaka היפני ו דג זברה 32,33, עם היותו VTG סמן רגיש חשיפה אסטרוגן בכל שלושת המינים. עם זאת, אינדוקציה VTG אינו תואם ישירות פגיעה ברבייה ולכן ההשלכות האקולוגיות של חשיפה בשפכים, כפי שניתן לראות אינטרסקס קשות מקק 3. מצד השני, מקק אינם 'מיני מעבדה "קלסיים למחקר ecotoxicology בשל הגודל הגדול שלהם, זמן דור ארוך (2-3 שנים להגיע לבגרות מינית), בסגנון רבייה; השרצת קבוצה (רבייה) מתקיימת אחת לשנה, ועל הקושי לזהות זכרים ונקבות (למעט בזמןעונת ההשרצה). עם זאת, בדרך כלל זה מינים gonochoristic נחקרו היטב בבריטניה, בשל הגילוי כי זרם של שפכי שפכים אסטרוגניים, דג זכר הציג הפרעות כדי אנדוקרינולוגיה שלהם (למשל, נוכחות של vitellogenin נקבה הספציפית בדמן) ו histopathology (ovotestes - פיתוח ביצים ב testis ו / או צינוריות רבייה נשיות) 5,6. לכן, כיישום עתיד של הפרוטוקולים הללו, מקק (או מינים דומים) יכול להיות מיני זקיף ברים שימושיים כדי להראות אם שיפורים של ממש איכות שפכים (ו estrogenicity המופחת) נראים בנהרות קבלת קולחים מתקדמים. הם יכולים גם להיות מועסקים סוף הצנרת לפקח שפכים משופרים מבחינת טכנולוגי מצמחי פיילוט בהיקף 7. כאשר שוקלים אילו מינים להשתמש ב בהערכות שפכי vivo קיימת תחלופה בין שימוש במיני מעבדת בדיקה מהיר יחסית ומבוקר לעומתכבר בשדה מבוסס, אבל יותר לסביבה רלוונטית, בדיקות באמצעות מינים מקומיים. עם זאת, כגון בהערכות vivo הוא עלות גבוהה וצריכים להיחשב רק במערכה האחרונה של בדיקות בעקבות שומות באמצעות אנליזה כימית וב מבחני חוץ גופייה.
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול המתואר כוללים הכנה וטיפול בדגימות וכלי הזכוכית (כלומר, בקבוקים וציוד דגימה צריכים להיות מראש שטופלו משטח מתאים חומר ניקוי פעיל) כדי למנוע זיהום של דגימות מפני מזהמים סביבתיים לרבות הגבלת קשר של דגימות עם פלסטיק חומרים אחרים שיכולים לייצר תוצאות חיוביות שגויות. זה חשוב לא פחות בעת תכנון ובניית מערכות חשיפה באקווריומים ודגים. באופן אידיאלי באקווריומים (מניות הדיור במהלך חשיפות) צריך להיות בנוי מחומרים עם ספיחה נמוכה 32 עם סיכון זיהום מינימלי. נירוסטה ניתן להשתמש לקערות החזקה בשפכים או מים.בעוד טנקים של בניית זכוכית עדיפים על טנקי דגים (כמו זה גם מספק התבוננות קלה של הדג). השימוש בצינורות פלסטיק נמוך כיתה או צינורות יש להימנע 32, PVC 34 ו- ABS יכול לשמש אם מתובל כמו שצריך ", כלומר, משמאל לדלוף החוצה מזהמים כל במים זורמים דילול לפחות 12 שעות לפני השימוש. צינורות סיליקון כיתה רפואית הועסקו בהצלחה במתקן שלנו למסירת משאבת נפיחה של כימיקלים ומי שפכים / דילול לטנקים. וכן בהתחשב זיהום אסטרוגניים בבנייה והפעלה של מערכת Aquatics, חשוב גם לחשוב על דיאטה של דגים; מזונות תקינות דגים רבים כבר מצאו להיות אסטרוגניים לדגים. לכן חשוב לבדוק מזונות כלשהם עקב פעילות (למשל, במסך אסטרוגן שמרים, ראה ברספורד ואח '. 14) לפני השימוש בהם בסוגים אלה של מחקרים.
פתרון בעיותפרוטוקולי assay כימי ניתוח או YES תארו הוא פשוט אם דגימות לאבטחת איכות ובכלל זה נסיעות, מעבדה מרובות ואת חסר ממס מנותח לצד בקרות חיוביות דגימות אמיתיות לחסל תוצאות שליליות חיוביות שקר שקר. חיובי (למשל, EE2) ושלילי (רק מי דילול) שליטה צריכה גם תמיד לשמש מבחני vivo כדי לאשר רגישות של סמן ביולוגי או נקודות קצה ביולוגיים צפויים (דהיינו, VTG או histopathology), ולאפשר כל זיהום בלתי צפוי כדי להתגלות ( למשל, ממערכת ניסיוני עד, דיאטה, או מי דילול). כל שינוי בפרוטוקול צריך להיות מאומת לפני ביצוע כל מחקר.
עם רגולציה של תרכובות אסטרוגניים שתיכנסנה לסביבה באמצעות מי קולחי WWTP זה חוזה כי טכנולוגיות טיפול בשפכים יעילות יותר תהיינה צורך מפותח. סוללת הבדיקות המתוארות בכתב היד הזה להחמיאבדיקות הערכת ecotoxicological והכימיות שתוחלנה על פריקות שפכים למתקן טיפול בשפכים. לכן, יישום עתידי של סוג זה של סוללה הוליסטית של מבחן צריך לאפשר למפתחי טכנולוגית שפכים, ומפעילי צמח, כדי ליישם את העיצובים בטוחים האקולוגיים ביותר בהתחשב השיטות הטובות ביותר כדי להסיר את שני ספציפי מוסדר כימיקלים אסטרוגניים ופעילות ביולוגית הכוללת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wellwash Versa plate washer | Thermo Scientific | 5165010 | |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax 340PC | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | 37 °C incubation required for carp assay |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Icemaker | Scotsman | AF80 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| ELISA kits | Biosense Laboratories | V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp) |
|
| Microfuge tubes, 0.5 ml | Alpha labs | LW2372 | |
| Microfuge tubes, 1.5 ml | Alpha labs | LW2375 | |
| Sulphuric acid, 95-98% | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Histology | |||
| Tissue processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Wax dispenser | Thermo Scientific Raymond Lamb | E66HC | |
| Metal embedding mold | Leica Biosystems | Various | |
| Hot plate | Thermo Scientific Shandon | 3120063 | |
| Cold plate (EG1150 C) | Leica Biosystems | 14038838037 | |
| Heated forceps (EG F) | Leica Biosystems | 14038835824 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2235 | |
| Paraffin section floatation bath | Electrothermal | MH8517 | |
| Slide drying bench | Electrothermal | MH6616 | |
| Stainmate automated stainer | Thermo Scientific Shandon | E103/S10L | |
| Cassettes, Histosette II, biopsy | Simport | M493 | |
| Paraffin wax | Thermo Scientific Raymond Lamb | W1 | |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | |
| IMS (ethanol mix), IDA99 | Tennants | ID440 | |
| Polysine adhesion slides | Thermo Scientific Gerhard Menzel | J2800AMNZ | |
| Cover slips, 22x50 mm | VWR | 631-0137 | |
| Histomount | National Diagnostics | HS-103 | |
| Haematoxylin Harris GURR | VWR | 351945S | |
| Eosin, 1%, aqueous | Pyramid Inovation | S20007-E | |
| Fisherbrand slide boxes | Fisher Scientific | 11701486 | |
| Microtome blades, MB35 | Thermo Scientific Shandon | 3050835 | |
| Bouin’s solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Yeast screen | |||
| Flow cabinet | Labcaire Systems Ltd | SC12R | |
| Cooled incubator | LMS Cooled Incubator | 303 | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | |
| Shaker | Grant | PSU-10i | |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Plate shaker | Heidolph Titramax 100 | 544-11200-00 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| 12-channel pipette, electronic | Sartorius | 735441 | |
| 96-well flat-bottom microplates | MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt |
76-232-05 260860 82.1581.001 |
We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds |
| HPLC grade water | Rathburn | RH1020 | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Sigma-Aldrich | P-5655 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A-2939 | |
| Potassium hydroxide, pellets | Sigma-Aldrich | P-1767 | |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Iron(III) sulfate | Sigma-Aldrich | 307718 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L-8912 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H-6034 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A-2786 | |
| L-Argenine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | A-6969 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M-5308 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T-8566 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I-7403 | |
| L-Lysine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | L-8662 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P-5482 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G-8415 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V-0513 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | T-1270 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P-5669 | |
| D-Pantothenic acid, hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P-5155 | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I-5125 | |
| D-Biotin | Sigma-Aldrich | B-4639 | |
| D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers | Sigma-Aldrich | G-7021 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A-4534 | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T-8441 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 10884308001 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G-2025 | |
| 17 β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E-8875 | |
| Steroids | |||
| Acetone | Rathburn | ||
| Acetonitrile | Rathburn | ||
| Ammonia solution | Rathburn | ||
| Ethylacetate | Rathburn | ||
| Copper(II) nitrate | Sigma-Aldrich | ||
| Acetone | Rathburn | ||
| Dichloromethane | Rathburn | ||
| 2,4,16,16-d4-17β-estradiol | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-estrone | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol | CDN Isotopes | ||
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Estrone | Sigma-Aldrich | ||
| 17α-ethynyl oestradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Hexane | Rathburn | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | ||
| Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Fish study | |||
| orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 | Watson Marlow | 982.0063.000 | |
| straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 | Watson Marlow | 999.2008.000 | |
| pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m | Watson Marlow | 913.A008.016 | |
| 200 series multi-channel persitaltic pump | Watson Marlow | 205CA | |
| Silicone tubing x 15 m (dosing tanks) | VWR | SFM1-3250 | |
| silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow) | VWR | SFM1-5450 | |
| 2.5 L glass winchester pk 4 | Fisher Scienctific | BTF-505-050B | |
| magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10 | Fisher Scienctific | FB55595 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
| 17α-Ethynylestradiol | Sigma Aldrich | E4876-100MG | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| SPE | |||
| 1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4 | Sigma Aldrich | 57276 | |
| disposable liners for manifold | Sigma Aldrich | 57059 | |
| filtration tubes without frits 6 ml pk 30 | Sigma Aldrich | 57242 | |
| reservior adaptors pk 12 | Sigma Aldrich | 57020-U | |
| stainless steel weight for manifold pk 4 | Sigma Aldrich | 57278 | |
| male Luer plug for manifold pk 12 | Sigma Aldrich | 504351 | |
| SPE Vacuum Manifold | Sigma Aldrich | 57265 | |
| stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 | Waters | WAT054806 | |
| Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50 | Waters | WAT020515 | |
| Methanol HPLC grade 2.5 L | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| 7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399 | Fisher Scientific | TUL-520-031K | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump | Camlab | 1136915 |
References
- Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T.
- Rodgers-Gray, T. P., et al. Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development. Environ. Sci. Technol. 35 (3), 462-470 (2001).
- Jobling, S., et al. Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biol. reprod. 66 (2), 272-281 (2002).
- Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish. J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166 (7), 418-426 (1996).
- Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. Widespread sexual disruption in wild fish. Environ. Sci. Technol. 32 (17), 2498-2506 (1998).
- Jobling, S., et al. Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations. Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).
- Baynes, A., et al. Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments. Environ. Sci. Technol. 46 (10), 5565-5573 (2012).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ. Toxicol. Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
- Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade. Chemosphere. 84 (10), 1512-1520 (2011).
- The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).
- Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol. Aquat. toxicol. 66 (2), 183-195 (2004).
- Mills, M. R., et al. Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment. Sci. Rep. 5, 10511 (2015).
- EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods. , British Standards Institute. London, UK. (2006).
- Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem. 30 (5), 1139-1145 (2011).
- Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. A histological description of intersexuality in the roach. J. Fish Biol. 58 (1), 160-176 (2001).
- Dascenzo, G., et al. Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities. Sci. Total Environ. 302 (1-3), 199-209 (2003).
- Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry. Int. J. Environ. Anal. Chem. 85 (1), 1-14 (2005).
- Metcalfe, C. D., et al. Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes). Environ. Toxicol. Chem. 20 (2), 297-308 (2001).
- Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity. Water Res. 45 (3), 1015-1024 (2011).
- Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol. Environ. Toxicol. Chem. 31 (6), 1396-1406 (2012).
- Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents. Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).
- Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish. Environ. Sci. Technol. 44 (11), 4348-4354 (2010).
- Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species. Chemosphere. 88 (8), 1008-1014 (2012).
- Collins, T. J. TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems. Acc. Chem. Res. 35 (9), 782-790 (2002).
- Collins, T. J. Designing Ligands for Oxidizing Complexes. Acc. Chem. Res. 27 (9), 279-285 (1994).
- Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts. Green Chem. 15 (9), 2339-2343 (2013).
- Murk, A. J., et al. Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environ. Toxicol. Chem. 21 (1), 16-23 (2002).
- Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Kolle, S. N., et al. In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays. Toxicol in Vitro. 24 (7), 2030-2040 (2010).
- Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos. BMC Biotechnology. 12, 32 (2012).
- Brian, J. V., et al. Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals. Environ Health Perspect. 113 (6), 721-728 (2005).
- Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
