Summary
Эндокринные срыве соединения (EDC) представляют значительную опасность для водной среды. Муниципальные очистные сооружения являются основными причинами эстрогенного активности поверхностных вод. Методология представлена в данной работе позволяет провести оценку эффективности и пригодности процессов очистки сточных вод в отношении удаления EDC.
Introduction
Опасения по поводу негативных последствий эндокринных нарушений соединений на диких животных в области репродуктивного здоровья привело к Европейскому Союзу разместить два эстрогенные вещества (эстрадиола и этинилэстрадиола) на "смотреть" список в соответствии с Рамочной директивой по воде (ВРД). EDC охватывают различные химические классы, в том числе природных и синтетических стероидных эстрогенов, лекарственных препаратов, пестицидов и промышленных химических веществ и компонентов потребительских товаров с известными отрицательными последствиями для дикой природы. Некоторые из этих соединений могут оказать воздействие на здоровье человека 1.
Исследования показали , что сточные воды из очистных сооружений являются эстрогенных рыбу 2 и , как следствие многие принимающие воды также эстрогенный для рыб 3. Это было впервые продемонстрировано с помощью национальных обследований в Соединенном Королевстве , которые показали увеличение концентрации вителлогенина (женский специфический предшественник желток белка 4) в крови дикого самца рыбы и высокого давлвалентность интерсекса (развивающиеся яйца и / или женских половых протоков в семенниках самцов рыбы) в обычно gonochoristic видов рыб 5,6.
Обычная очистка сточных вод обычно представляет собой процесс, состоящий из трех стадий предварительного скрининга с последующей первичной и вторичной обработки, которая удаляет как растворенного и взвешенного органического вещества. Эффективность удаления отдельных EDC зависит от физико-химических свойств веществ и от эффективности процесса лечения применяется. Для многих удаления EDC посредством адсорбции и биологической деградации может быть значительным, но неполным. Доочистка, такие как фильтрация песка, может быть эффективным при увеличении удаление EDC 7 , тогда как доочистку с использованием передовых окисления (например озона) или активированный уголь может быть эффективным для достижения почти полного удаления 7.
Оценка любой новой технологии для очистки сточных вод девичествеDS, чтобы определить эффективность предлагаемого процесса в удалении EDC. Батарея тестов, в том числе целевого химического анализа наряду тестирования экотоксикологии, используя в естественных условиях и в пробирке биопроб, предоставляет исчерпывающие данные для этой цели. Хотя очень полезно для целей регулирования, целевой химический анализ может предоставить только данные о соединениях (и специфических метаболитов) мониторинг. Биотесты дополнительно позволит "обнаружения" побочных эффектов метаболитов и обработки генерируемых трансформации сточных вод побочных продуктов , которые иначе были бы неопознанного 8,9. В данной статье описывается использование батареи химических и экотоксичности лабораторных анализов для оценки эффективности ряда развитых и развивающихся процессов очистки сточных вод в удалении эстрогенной потенцию нефти и очищенных сточных вод и получения воды.
Protocol
Заявление по этике: Протоколы оценки эндокринных нарушений активности химических веществ / смесей в рыбе были одобрены Brunel University Лондона защиты животных и этические нормы Орган по обзору (AWERB) и Министерство внутренних дел Великобритании под животных (научные процедуры) Закон 1986.
1. Вода для сбора проб, сохранение и извлечение
- Образец сбор и сохранение
- Перед использованием очистите бутылки с подходящей поверхностью активного моющего средства. После очистки промыть бутылки с водой, процедить и сухой.
- Собирают образцы в стеклянные бутылки объемом 2 л емкости, содержащей консервант, состоящую из 0,5 г бромида меди (II) нитрата и 6 мл 3,6 М раствора соляной кислоты. Образцы Хранить при температуре ниже 10 ° C. Извлечь и проанализировать, как можно скорее после сбора и сохранения.
- Извлечение пробы и очистки (для стероидного анализа эстрогена) 10
- Твердофазная экстракция (SPE)
- До начала добычи, чтобы уменьшить взвешенные твердые частицы, образцы для фильтрации воды с использованием 1 мкм фильтр с размером пор бумаги.
- После того, как фильтруется, образцы иглы с внутренним стандартом путем добавления 100 мкл дейтерированного пики внутреннего стандарта исходного раствора , содержащего 2,4,16,16-d 4 -estrone: 2,4,16,16-d 4 -17β-эстрадиол (Е2) : и 2,4,16,16-d 4 -17α-этинилэстрадиола (EE2) (все по 40 мкг / л в метаноле) до 1000 мл стоке (или 100 мл втекающий) , что приводит к внутреннему шипа 2 нг / л для сточных вод стоков пробы и 20 нг / л для проб сточных вод впадающих.
- Приложить одноразовые вкладыши клапанов, стирола дивинилбензола SPE картриджи и резервуары для картриджа к SPE устройства. Включите вакуумный насос, чтобы проверить оборудование надлежащим образом запечатаны.
- Пипетка 5 мл этилацетата в каждом резервуаре, чтобы состояние картриджей. Включите вакуумный насос (до уровня ниже 10 дюймы ртутного столба, чтобы скорость потока менее 10 мл в минуту)и тянуть через жидкость. Не позволяйте SPE картриджи высыхают. Повторите процесс с 5 мл метанола с последующим 5 мл воды.
- Залить каждого резервуара картриджа с водой и соединить 1/8 "тефлоновые трубки между резервуарами-картридж и образец стекла бутылок. Включите вакууме при скорости потока менее чем 10 мл в минуту и позволить весь образец проходить через картридж. колба отходов по мере необходимости пустой.
- Тщательно высушить SPE картриджи под вакуумом (или с помощью не используя воздух или азот) , пока содержимое картриджа меняют цвет (например, от темно - коричневого до светло - коричневого).
- Положить чистые сухие флаконы для сбора стекла 10 мл в стойку и место внутри коллектора экстракции. Убедитесь, что каждый вкладыш выше флакона. Пипетка 8 мл дихлорметана в каждом образце резервуара, включите вакуумный насос (скорости потока менее 10 мл в минуту) и оттягивание жидкости через во флаконы для сбора.
- Удалить 10 мл флаконах из коллектора SPEи использовать концентраторы, чтобы уменьшить объем до 1 мл. Передача каждого образца в ампулу автоматического пробоотборника и дополнительно концентрируют до 100 мкл с использованием азота продувка оборудования.
- До начала добычи, чтобы уменьшить взвешенные твердые частицы, образцы для фильтрации воды с использованием 1 мкм фильтр с размером пор бумаги.
- Гель-проникающей хроматографии (ГПХ) очистки
- Вводят 95 мкл элюированного образца экстракта в ГПХ оборудованном ВЭЖХ с использованием условий , описанных в таблице 1. Концентрат ГПХ экстракта до 200 мкл с использованием концентратора и азота продувка аппарата , а затем составляют до 2,0 мл гексана.
- SPE очистки
- Приложить одноразовые вкладыши клапанов, аминопропил картриджи и резервуары для картриджей коллектора SPE. Положить чистые сухие флаконы для сбора стекла 10 мл в стойку и место внутри коллектора экстракции. Пипетка 2 мл гексана в каждом резервуаре, чтобы состояние картриджей. Дайте жидкости проходить через картриджи.
- Пипетировать образец экстракта GPC в резервуар и снова позволить жидкостипроходят через картридж. Соберите образец элюат в пробирке и удалить из коллектора. Не выбрасывайте элюата.
- Положите новую чистую сухую пробирку 10 мл сбора в стойку и место внутри экстракционной коллектора. Для промывки картриджа, добавляют 2 мл этилацетата в гексане (30% об / об) в резервуар и оттягивание жидкости через картридж. Повторите еще 2 мл этилацетата в гексане, отбрасывая все стирок.
- Поместите оригинал 10 мл флакон для сбора (этап 1.2.3.2) обратно в стойку внутри коллектора экстракции. Пипетка 2 мл этилацетата в ацетоне (50% об / об) в резервуар, включите вакуумный насос (ниже 2 дюймы ртутного столба, чтобы скорость потока менее 2 мл в минуту) и оттягивание жидкости через во флакон , Повторите процесс с еще 2 мл этилацетата.
- Извлеките пробирку и использовать концентраторы, чтобы уменьшить объем экстракта до 1 мл. Переноса образца в меньший стеклянный флакон и использовать азот продувка оборудование, чтобы испарить тон доставать начинающегося сухости.
- Добавляют 100 мкл метанола и хорошо перемешать. Перенесите экстракт автоматическим пробоотборник флакон (0,3 мл вставкой) и колпачок флакона. Анализ образцов с помощью LCMS / MS (см раздел 2).
- Твердофазная экстракция (SPE)
| Колонка: | PL гель, 50 А, 300 х 7,5 мм, 5 мкм |
| Guard Колонка: | PL гель, 50 х 7,5 мм, 5 мкм |
| Мобильная фаза: | дихлорметан |
| Скорость потока: | 1 мл в минуту |
| Температура колонки: | 25 ° C |
| УФ - детектор: | 210 нм |
| Объем впрыска: | 95 мкл |
| Режим впрыска: | стендARD |
| Ничья скорость: | 500 мл в минуту |
| Выброс скорость: | 500 мл в минуту |
| Draw позиций: | 3 мм |
| Фракция собрали: | 3 мл фракции (7 - 10 мин) в 10 мл флаконах |
Таблица 1. Условия и параметры для гель - проникающей хроматографии (ГПХ) очистки извлеченных проб сточных вод. Таблица детали колонки ГПХ, подвижной фазы, температуру, объем впрыска и длины волны детектора.
- экстракции образца (для дрожжей Эстроген экран)
- Образцы фильтров, как описано в разделе 1.2.1.1. Приложить одноразовые вкладыши клапанов, С18 SPE картриджи и резервуары для картриджа к SPE устройства. Включите вакуумный насос, чтобы проверить оборудование надлежащим образом герметизированы.
- Пипетка 5 мл метанола в каждый резервуар, кондиционировать C18 картриджей. Включите вакууме (около 5 INhg, чтобы позволить потоку приблизительно 5 мл в минуту) и дайте жидкости пробегают, делая паузу в течение 1 мин на полпути через. Не позволяйте картриджи всухую. Повторите процесс либо с помощью ВЭЖХ или дважды дистиллированной водой (DDH 2 O). Опять же не иссякнет.
- Извлечение пробы воды, как описано в разделе 1.2.1.4. Продолжить вакуум в течение не менее 30 минут, чтобы полностью высохнуть картриджи.
- Поместите чистую сухую флаконы для сбора 10 мл в стойку в коллекторе экстракции. Убедитесь, что каждый вкладыш выше флакона. Добавить 5 мл метанола в каждом резервуаре. Включите вакуумный (максимальный поток 5 мл / мин) и позволяет жидкости проходить через картридж в пузырек, делая паузу в течение 2 мин на полпути через.
- Перед проведением анализа с использованием экрана Да, уменьшить экстракт начинающегося сухости с использованием азота и воссоздавать с 500-1000 мкл этанола. Печать крышках образцов флаконов, чтобы избежать испарения и хранить при температуре 4 ° С (в неискрящиехолодильник).
2. Анализ химических веществ Использование LCMS / MS
- Оптимизация условий эксплуатации системы ЖХ / MS, используя инструкции производителя.
- Анализ калибровочных стандартных растворов, экстрактов образцов, пустой и аналитического контроля качества (AQC) образцов с помощью жидкостной хроматографии и масс условия спектрометрии, а также контролировать ионные переходы , как указано в таблице 2. Определить концентрацию стероидных эстрогенов в экстракте образца с использованием внутренних стандарты 10.
| ЖХ | |||||
| жидкостной хроматографии | |||||
| Колонка: | С18 (2), 150 х 4,6 мм, 5 мкм. | ||||
| Объем впрыска: | 20 мкл | ||||
| Поток: | 0,5 мл в минуту. | ||||
| MOBILE фаза: | Растворитель А: вода, содержащая 0,1% аммиака. | ||||
| Растворитель В: ацетонитрил. | |||||
| Градиент программа: | |||||
| Время (мин) | 0 | 10 | 18 | 24 | 28 |
| A: соотношение B растворителя | 90:10:00 | 50:50:00 | 0.479167 | 0.479167 | 90:10:00 |
| Масс-спектрометрии | |||||
| Источник: | Электрораспылительная (отрицательный ион) | ||||
| Газ и источник: | CUR: 20 фунтов на квадратный дюйм, GS1: 70 фунтов на квадратный дюйм, GS2: 30 фунтов на квадратный дюйм | ||||
| ТЭМ: 600 ° C, CAD газа 5 и IonSpray напряжение -900 | |||||
| MRM переходов: | |||||
| Е1: | 269/145 и 269/143 | ||||
| Е2: | 271/145 и 271/143 | ||||
| ЕЕ2: | 295/145 и 295/143 | ||||
| E1-D4: | 273/147 | ||||
| E2-D4: | 275/147 | ||||
| ЕЕ2-D4: | 299/145 | ||||
Таблица 2. Детали параметры и условия для ЖХ / МС анализа стероидных эстрогенов в экстрактах сточных вод. Таблица дает образец объемом впрыска и расхода, условия подвижной фазы вй градиент.
3. эстрогенной активности Использование In Vitro Дрожжи Эстроген экран (ДА) Анализ 8
- Подготовить и хранить минимальные средние и средние компоненты в соответствии с таблицей 3 (а) (г).
| (а) Минимальное Среднее (рН 7,1): |
| Приготовьте Fe 2 (SO 4) 3 раствора добавлением 40 мг Fe 2 (SO 4) 3 до 50 мл дважды дистиллированной водой (DDH 2 O) |
| Добавить 1 л DDH 2 O в стеклянный стакан , 2 л |
| Добавьте следующие компоненты в стакан: |
| 13,61 г KH 2 PO 4 |
| 1,98 г (NH 4) 2 SO 4 |
| 4,2 г KOH |
| 0,2 г MgSO 4 |
| 1 мл Fe 2 (SO 4) |
| 50 мг L-лейцин |
| 50 мг L-гистидин |
| 50 мг аденин |
| 20 мг L-аргинин-HCl |
| 20 мг L-метионин |
| 30 мг L-тирозин |
| 30 мг L-изолейцин |
| 30 мг L-лизин-HCl, |
| 25 мг L-фенилаланина |
| 100 мг L-глутаминовой кислоты, |
| 150 мг L-валин |
| 375 мг L-серин |
| Поместите стакан на нагретую мешалкой с магнитным блохи и перемешивать до тех пор, пока не будет все растворили |
| Убедитесь, что значение рН 7,1 и при необходимости отрегулировать |
| Использование 50 мл стерильный шприц обойтись 45 мл аликвоты в стеклянные бутылки с металлическими винтами, верхняя крышка |
| Стерилизация минимальной среде при 121 ° С в течение 10 мин в автоклаве |
| Хранить при комнатной температуре |
| (б) D - (+) - глюкоза: |
| Приготовьте 20% вес / об раствора в DDH 2 O |
| Разлить по 20 мл аликвоты в стеклянных флаконах с металлическими винтовыми крышками верхних |
| Стерилизацию раствора глюкозы при 121 ° С в течение 10 мин в автоклаве |
| Хранить при комнатной температуре |
| (в) L-аспарагиновой кислоты: |
| Сделайте раствор с концентрацией 4 мг / мл в DDH 2 O |
| Разлить по 20 мл аликвоты в стеклянных флаконах с металлическими винтовыми крышками верхних |
| Стерилизуют раствор L-аспарагиновой кислоты при 121 ° С в течение 10 мин в автоклаве |
| Хранить при комнатной температуре |
| (d) Витамин Решение: |
| Готовят раствор биотин добавлением 2 мг биотина к 100 мл DDH 2 O |
| Взвесить 8 мг тиамина, 8 мг пиридоксина, 8 мг пантотеновой кислоты, 40 мг инозитол. Добавить все сухие компоненты и 20 мл раствора биотина до 180 мл DDH 2 O |
| Сделайте 10 мл аликвоты стерильной фильтрацией через 0,2 мкм с размером пор одноразовый фильтр в стерильные стеклянные бутылки с, в шкафу с ламинарным потоком воздуха |
| Хранить при температуре 4 ° С |
| (е) L-Треонин: |
| Приготовьте 100 мл 24 мг / мл L-треонина в DDH 2 O |
| Разлить 10 мл аликвоты в стеклянных флаконах с металлическими винтовыми крышками верхних |
| Стерилизацию раствора L-треонина при 121 ° С в течение 10 мин в автоклаве |
| Хранить при комнатной температуре |
| Подготовьте 25 мл (II) сульфат раствор 20 мМ меди в DDH 2 O |
| Приготовьте 5 мл стерильной аликвоты с помощью фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм в стерильные стеклянные флаконы, в шкафу с ламинарным потоком |
| Хранить при комнатной температуре |
| (г) Хлорфенол красно-β-D-галактопиранозида (CPRG): |
| Приготовьте 25 мл 10 мг / мл раствора CPRG в DDH 2 O |
| Приготовьте 5 мл стерильной аликвоты с помощью фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм в стерильные стеклянные флаконы, в шкафу с ламинарным потоком |
| Хранить при температуре 4 ° С |
Таблица 3. Дрожжи анализ Эстроген экрана; подготовка и хранение минимальных средних и средних компонентов.
- Подготовка и StoraGE 10х концентрированной культуры дрожжей
- На 1-й день, подготовить среду для роста (как описано в пункте 3.4.1) и вылить в стерильную коническую колбу. Добавить 125 мкл 10-кратного концентрированного дрожжей из криогенной флаконе хранили при -20 ° C. Выдержите привит носитель при температуре 28 ° С в течение приблизительно 24 ч на орбитальном шейкере.
- На 2-й день, сделайте две бутылки среды роста (~ 50 мл) и вылить в отдельные стерильные конические колбы. Добавьте 1 мл 24-часового культивированных дрожжей в каждую колбу питательной среды. Выдержите привит носитель при температуре 28 ° С в течение приблизительно 24 ч на орбитальном шейкере.
- На 3-й день, влить каждый 24-часовой культуры в стерильную 50-мл центрифужную пробирку. Центрифугируйте 50 мл пробирки при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 2000 х г. Слейте надосадочную и повторно приостанавливать каждый осадок в 5 мл минимальной среды с 15% глицерина. Сделать 0,5 мл аликвот 10х концентрированной культуры дрожжей в 1,2 мл стерильной криопробирки и хранить при температуре -20 ° С в течение не более 4-х месяцев.
- Подготовительномрацион и хранение химических запасов для стандартных кривых
- Промыть все изделия из стекла и шпатели дважды с абсолютным этанолом и оставить высохнуть перед использованием, чтобы удалить любые следы загрязняет.
- Взвесить Е2 непосредственно в стеклянный флакон в шкафу для взвешивания порошка и регулировать концентрацию по объему в абсолютном этаноле. Разбавляют до концентрации 2х10 -7 М (54,48 мкг / л). Уплотнение крышки и хранят при температуре 4 ° С (в безыскровый холодильнике).
- Анализ производителя
- В день 0 готовят среду для роста. К 45 мл бутылки минимальной среде добавляют 5 мл раствора глюкозы, раствор 1,25 мл L-аспарагиновой кислоты, 0,5 мл раствор витаминов, 0,4 мл раствора L-треонин, и 125 мкл меди (II), раствор сульфата. Налейте ростовую среду в стерильную коническую колбу.
- Добавить 125 мкл 10-кратного концентрированного запаса (размороженной от хранения -20 ° C) в колбу и инкубировать инокулированных носитель при температуре 28 ° С в течение приблизительно 24 ч на орбитальном шейкере.
- На 1 -й день, маркировать стерильный 96-луночный 'разбавление пластину и сделать серийных разведений (100 мкл объемы в этаноле) Е2 стандартной кривой и исследуемого вещества (S) / отходящем экстракта (ов) (например, ЕЕ2).
- Этикетка стерильный 96-луночный оптически плоское дно Микротитровальный 'планшету (s)'. На каждой пластине включают пробелы (плюс / минус растворителя) и стандартную кривую Е2, в дополнение к строкам исследуемого вещества (ов) / вытекающего экстракта (ов).
- Пипетка 10 мкл каждой концентрации (Е2, химические или экстракт) в соответствующую лунку планшета для анализа. Внесите 10 мкл этанола в каждую "растворителя" пустой лунки планшета для анализа. Оставьте планшет для анализа с крышкой прочь, чтобы выпарить досуха.
- Сделать бутылку ростовой среды (~ 50 мл) и добавляют 0,5 мл раствора хлорфеноле красно-β-D-галактопиранозида (CPRG) за бутылку. Определить плотность дрожжевых клеток в 24-часовой культуры путем измерения мутности культуры при 620 нм в планшет-ридере. Прививать Assay среда с 4x10 7 клеток дрожжей из 24 ч культуры.
- Налейте прививку среды для анализа в стерильный корыто. Используя пипетку многоканальную по 200 мкл засеянных среды для анализа в каждую лунку 96-луночного планшета для анализа.
- Положите крышку на планшете для анализа 96-луночного и запечатать края с лентой. Встряхнуть планшет для анализа (ы) энергично в течение 2 мин на титр шейкере и инкубировать при 32 ° С в естественной вентиляцией сушильном шкафу.
- На 2-й день, встряхните планшет для анализа (ы) энергично на титр шейкере в течение 2 мин. Возврат к 32 ° С инкубатор.
- На 4-й день, встряхните планшет для анализа (ы) энергично в течение 2 мин на титр шейкере. Оставьте пластину (ы), чтобы стоять в течение приблизительно 1 часа, а затем прочитать аналитический планшет (ы) при поглощении 540 нм (оптимальное оптической плотности CPRG ~ 575 нм) и 620 нм (для мутности) с использованием планшет-ридера. Оставьте пластину (ы) при комнатной температуре и читать позже, если это необходимо.
- В день 0 готовят среду для роста. К 45 мл бутылки минимальной среде добавляют 5 мл раствора глюкозы, раствор 1,25 мл L-аспарагиновой кислоты, 0,5 мл раствор витаминов, 0,4 мл раствора L-треонин, и 125 мкл меди (II), раствор сульфата. Налейте ростовую среду в стерильную коническую колбу.
- Расчеты эстрогенной активности <ол>
- Правильные показания анализа на мутность, используя следующее уравнение: устранен значение = образец или стандарт (Е2) оптическую плотность при длине волны 540 нм - [образец или стандарт (Е2) оптическую плотность при длине волны 620 нм - оптическая плотность заготовки при 620 нм]. Участок E2 стандартной кривой с соответствующими пробелами (для проверки на предмет загрязнения) 8.
- Используйте исправленный образец (экстракт или химический) для расчета 'эстрадиола эквивалентов. Используйте проложенным значения стандартной кривой E2 и уравнение регрессии (3-параметр полиномиальное или линейный в зависимости от размера), чтобы интерполировать образец / извлечения значений оптической плотности для эквивалентных значений Е2. Использование коэффициента концентрации (то есть, извлеченной воды и объем этанола экстракт ресуспендировали в) для расчета эстрогенной активности в предварительно извлеченный образце.
4. Оценка лаборатории на базе эстрогенных Использование В Vivo вителлогенина индукции в Мале толстоголовому пескарей
- Используйте мужские толстоголового гольяна (Pimephalesпенью)> 4 месяца, которые показывают вторичные половые признаки (например, развитие брачных бугорков и спинные fatpad) свидетельствует о мужской сексуальной определения.
- Для предотвращения нерест активности, отдельные пожилые мужчины три недели (± 3 дня) до начала испытания. Установка по меньшей мере, два 45 л стеклянный аквариумы с максимальной загрузкой 3 г / л. Для обеспечения достаточного количества здоровых рыб для теста, использовать минимум 100 мужчин.
- Хранить Самец в одинаковых условиях окружающей среды , как будет иметь опыт в тесте (то есть, температура воды 25 ± 1 ° С и 16 а: 8 ч свет: темнота фотопериод). Поддержание скорости потока воды для разбавления в каждой емкости , чтобы обеспечить 95% времени замены , по меньшей мере , каждые 6 до 8 ч, т.е. 330 мл / мин в течение 45 л бак.
- Испытательное оборудование и опытно-конструкторских
- Используйте большие стеклянные резервуары для размещения загрузки до 3 г рыбы на литр очистэ. Для 8 взрослых самцов (номинально 4,5 г каждая), используют 10-20 л бак.
- Используйте две дублирующие емкости для каждой обработки и оградить каждый танк от любых ненужных визуальных помех (например, используйте слоистые экраны карты между танками). Определите каждый танк с номером исследования, концентрации экспозиции и идентификационный номер судна.
- Для исследования сточных вод сточных вод
- По прибытию, немедленно передать сточные воды в резервуар для хранения при 10 ± 1 ° С. Начало дозирования стоков в течение двух часов с момента получения выходящего потока.
- Поток выходящего потока, с помощью перистальтического насоса, от 10 & deg; С резервуара к акклиматизации судна. Нагреть сточные воды в акклиматизации сосуде до 18 ± 2 ° С. Насос нагретого выходящего потока из акклиматизации сосуда до дозирование / емкости для смешивания, а затем к испытательному аквариумах (который держит рыбу). Тепло аквариумы до температуры 25 ± 1 ° С.
- Для химических исследований дозирования
- Взвесьте испытаний химических веществ в шкафу порошка весом. Приготовьте концентрированные химические запасы в DDH 2 O предпочтительно без использования растворителей.
Примечание: Если растворители требуются для солюбилизации тестируемых соединений, используют средства управления растворитель, в дополнение к контролю разбавления водой. - бачком или разбавление водяной насос из контролируемой температурой бачком через устройство (а) управления потоком дозирования / емкость для смешивания. Насос концентрированные химические запаса (ов) с использованием перистальтического насосной системы для дозирования / смешивания сосудов. Управление скорость насоса (на складе химических) и скорости потока воды (разбавление водой) для достижения желаемой концентрации воздействия.
Примечание: Используйте силиконовые трубки, чтобы питательная вода / химически испытание для каждого испытательного сосуда из дозирования / емкость для смешивания. Используйте скорость потока, достаточную для обеспечения замены сосуда на 75% , по меньшей мере 24 ч, т.е. 20 мл / мин в течение 20 л бак. Поддержание скорости потока на ± 10% от указанного номинального значения.
- Взвесьте испытаний химических веществ в шкафу порошка весом. Приготовьте концентрированные химические запасы в DDH 2 O предпочтительно без использования растворителей.
- Поток рыбы два раза в день со свежей размороженной замороженное взрослых артемии (Artemia) 2,5 (± 0,1) г на танке на корм. Также кормить рыб один раз в день с небольшим количеством (два пальца щепоткой) тропических рыб чешуйчатый пищи. Оставьте как минимум 3 часа между каждым кормлением.
- Держите ежедневные записи для кормления, чтобы следить за реакцией кормления / поведение (хорошее, умеренное или плохое, по сравнению с контрольной группой). Сифон танки по крайней мере два раза в неделю (желательно ежедневно), чтобы удалить остатки корма и экскременты. Очистите стороны и днища испытательных судов не реже одного раза в неделю.
- Возьмите пробу воды еженедельноs из каждого резервуара для подтверждения эстрогенной активности (через экран дрожжами) и химический состав (с помощью аналитической химии). См разделы 1-3 для деталей взятия проб воды, извлечения и анализа.
Примечание: Для каждого эксперимента используют контроль разбавляющей воды (отрицательный контроль), положительный контроль (E2 или EE2) плюс по меньшей мере три разведений вытекающего потока (100, 50 и 25%) или химически испытание для мониторинга реакции от дозы. Если испытываются новые технологии, используют соединение / сточные воды с лечением или без него (например, eE2 без лечения, ЕЕ2 с TAML / перекиси водорода (H 2 O 2) лечение 12; Рисунок 1).
- Используйте большие стеклянные резервуары для размещения загрузки до 3 г рыбы на литр очистэ. Для 8 взрослых самцов (номинально 4,5 г каждая), используют 10-20 л бак.
Рисунок 1. Диаграмма , представляющая экспериментальную конструкцию в естественных условиях Гольян вителлогенина биопробы , чтобы определить удаление экотоксичности 17 & этинилэстрадиола с использованием обработки воды TAML / пероксида. Ехрerimental создана состоит из восьми 11 л стеклянных аквариумах каждый кормили с непрерывным потоком воды. Индивидуальные химические растворы и стоковые воды (фильтрованное де-хлорированной) доставляются в смесительные камеры. Номинальные концентрации (без реакции) в смесительных сосудах являются 2 нг / л ЕЕ2, 80 нМ TAML и 0,16 мкг / LH 2 O 2. Химические исходные растворы (ЕЕ2, H 2 O 2 и TAML) получают и дозируют отдельно , так что реакции начинаются в смесительных сосудах. Рыба (8 самцов толстоголовые пескарей в танк) подвергаются смеси (ами) По истечении времени реакции контакта примерно 45 минут. Пробы воды берутся из резервуаров экспозиции еженедельно. Образцы плазмы взяты из толстоголового пескарями для измерения эстрогенной биомаркеров вителлогенина (VTG) от базовой линии группы, в начале исследования, а также все другие рыбы после 21 дней воздействия. Конкретные процедуры: '-C'; Отрицательный контроль (разведение только вода), '+'; положительный контроль eE2,'+ Н'; ЕЕ2 плюс H 2 O 2, '+ T'; ЕЕ2 плюс H 2 O 2 плюс TAML. Эта цифра была изменена от Миллса и др. 2015 12. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Тестовая процедура
- периода акклиматизации
- Мера мокрый вес (г) каждого половозрелого самца рыбы, а также выделить в случайном порядке для каждого танка (8 мужчин в бак).
- Хранить незанятого рыбу из той же партии, и поддерживать их в тех же самых условиях испытаний. Используйте эти рыбы для замены любых лиц, которые показывают признаки физического повреждения или отсутствия состояния в период акклиматизации 7 дней. Обеспечить в конце периода акклиматизации каждый танк лечение 8 мужчин, которые полностью акклиматизировались к условиям испытаний.
- Возьмем «базовые» образцы плазмы из дополнительных 8 самцов из того же баTCH мужской рыбы. Следуйте метод отбора проб крови в разделе 4.4 и метод вителлогенина (VTG) анализа в 4.5.
- После периода акклиматизации, доставки сточных вод или химических запасов дозирования к танкам воздействия в течение 21 дней, как описано в разделе 4.2.2 или 4.2.3. Монитор смертности, поведение и внешний вид рыбы в каждом реплицировать бак ежедневно до начала первой подачи дня. Запись любого ненормального поведения или инцидентов.
Примечание: Убедитесь, что условия окружающей среды и кормления темпы поддержания здоровья рыбы (разделы 4.2.4 и 4.2.5).
- периода акклиматизации
- Рыба Пробы после 21-дневного периода воздействия
- 12 ч до отбора проб, прекратить кормление рыб.
- Этикетка микро-центрифужные пробирки для сбора образцов крови, добавляют ~ 5 мкл апротинина (ингибитор протеазы) и поместить их на лед.
- Сделать 500 мг / л раствора MS222 (обезболивающий) путем растворения 500 мг MS222 на 1 л де-хлорированной воды (ранее акклиматизировалисьдо 25 ± 1 ° С). Нейтрализовать MS222 до рН 7,4 ± 0,4 с использованием 1 М NaOH.
- Переместить каждую рыбу из резервуара в буферном MS222. Хранить в растворе до прекращения всякого движения крышечкой (как правило, 5 ± 1 мин).
- Измерьте и запишите длину вилки (мм) под клеммной анестетика. Используйте одноразовый скальпель , чтобы ампутировать хвост, и использовать гепарином hemocrit трубку , чтобы собрать кровь из хвостовой артерии (рис 2). Тщательно дозировать кровь в предварительно меченных трубки микроцентрифужных и держать на льду.
- Убейте рыбу сразу же после нанесения крови. Подтверждение смерти путем постоянного прекращения циркуляции и / или разрушению мозга. Измерьте и запишите общий вес рыбы (до ближайшего 0,01 г) и рассекают ткани по мере необходимости.
- Центрифуга крови (7000 мкг в течение 5 мин при 4 & deg; С) в течение 2 часов сбора. Передача супернатант плазмы с помощью пипетки в новую меченым 0,4 мл микроцентрифужных ванныэс и хранить на льду. Замораживание пробирки, содержащие плазму на сухом льду в течение 30 мин центрифугирования и хранят при -80 ° С перед анализом концентрации в плазме VTG.
Рисунок 2. Фотографии , изображающие мужчин Гольян (Pimephales пенью), сбор плазмы и расположение семенников. В конце экспозиции 21-дневного все рыбы должны быть убиты , чтобы собрать образцы крови. После того, как в рамках этого терминала анестетика длины рыбы (длина вил, мм) должна быть измерена, быстро , с последующим сбором крови из хвостовой артерии Photo-A:. Красная пунктирная линия указывает на расположение хвоста ампутации (одноразовый скальпель следует использовать ампутировать хвост ). Фото-B показывает гепарином hemocrit трубки , используемой для сбора крови. Каждая рыба должна быть затем убит сразу после того, как его образец крови был взят, в этом случае вся головабыла отделена от тела (Фото-C). После того, как рыба была убита полость тела может быть открыта, чтобы выявить внутренние органы. Фото-C показано расположение семенников (гонад) по отношению к плавательного пузыря (SB) в карповых рыб, например, толстоголовому гольян, плотва, сазан и т.д. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Измерение концентрации в плазме VTG с гомологичной иммуноферментного анализа (ИФА) комплект VTG, разработанный специально для толстоголового пескарей.
- Подготовить стандарты и буферы VTG, как указано в протоколе изготовителя. Разреженной плазмы образец 1:50, 1: 5000 и 1: 500000 и пробирного их в двух экземплярах для получения показаний в пределах диапазона стандартной кривой VTG в соответствии с инструкциями изготовителя. Следуйте рекомендациям изготовителя для расчета концентрации вителлогенина.
5. Полевые оценки перспективных / Novel водоочистных технологий для Смягчение эстрогенной активности Использование В Vivo вителлогенина и интерсексуальной индукции в Роач (КиШиз гиШиз)
- Захват диких плотвы, живущих вниз по течению от водоотводах очистных сооружений сточных вод
Примечание: Используйте плотва (КиШиз гиШиз) или другие обильные пресноводные или солоноватой видов рыб, которые являются gonochoristic и , как известно, чувствительны к эстрогенным эндокринных нарушений.- Ловить рыбу с помощью электрорыболовства, плетение, захват или другие признанные методы промысла в зависимости от ситуации 13. Транспортировка рыбы в вентилируемых резервуарах обратно в лабораторию для отбора проб.
- Подготовьте микроцентрифужных трубки, как описано в разделе 4.4.2. Приготовьте буферном MS222, как описано в разделе 4.4.3. Обезболить рыбы, как описано в 4.4.4.
- Измерьте длину рыбы и вес под наркозом терминала.
- Собрать кровь из хвостовой артерии с использованием DISPOсоболь гепарином шприц. Убейте каждую рыбу сразу же после взятия пробы крови. Тщательно дозировать кровь в предварительно помеченных микропробирок и держать на льду. Подготовьте плазму, как описано в шаге 4.4.7 и измеряют VTG с помощью ELISA (4.5).
- С помощью щипцов удалить 2-3 рыбью чешую из каждой рыбы и место в индивидуальном порядке меченные небольшие бумажные конверты. Храните конверты при комнатной температуре в сухих условиях для определения возраста рыб позже и анализа роста.
- Открытая полость тела с помощью скальпеля, чтобы выявить внутренние органы. Вынимают кишку , чтобы выявить плавательного пузыря с гонад , расположенной по обе стороны (рисунок 2). Осторожно удалите парные гонады с мелкими носатый щипцов и поместите в стеклянную пробирку. Накройте гонады с фиксатором Буэна в соотношении 1:10 ткани: фиксаж.
- Оставьте ткань в Буэна в течение 6-24 ч в зависимости от размера ткани (Фиксирующий проникает через 1 мм в час). После того, как фиксированной, слейте фиксаторный А.Н. Буэнаd заменить 70% промышленных денатурата (IMS). Храните фиксированной ткани при комнатной температуре до тех пор, пока ткани обрабатываются для гистопатологии (раздел 5.3).
- Поле на основе оценки эстрогенной активности с использованием в естественных условиях вителлогенина и интерсексуальной индукции в плотвы
- Экспериментальный дизайн и настройка
Примечание: Установить танки и опытно - промышленной установки и до начала работы естественных условиях , начиная с. Начните танки, протекающие за 3-4 недели до какого-либо добавления рыбы к системе. Мониторинг расхода воды, качества и условий (рН, температура, содержание растворенного кислорода и т.д.) регулярно , чтобы убедиться параметры воды могут быть сохранены.- Построить большие резервуары (например, 300-1000 л) на месте на опытном заводе, который может получить контроль над '' де-хлорированной водопроводной воды, очищенных сточных вод стандарт (ы) и расширенный очищенные сточные воды (ы) параллельно. Присоединить воздушный насос / аэраторов к танкам. Установить расход воды для достижения по меньшей мере, 6 танк Volume обмены в день.
Примечание: Убедитесь, что танки хорошо изолированы и затененных, чтобы предотвратить чрезмерное ежедневные колебания температуры. Проектирование резервуаров , чтобы наблюдение за рыбами, для поведенческих изменений (отсутствие кормления и т.д.), признаков заболевания и смертности.
- Построить большие резервуары (например, 300-1000 л) на месте на опытном заводе, который может получить контроль над '' де-хлорированной водопроводной воды, очищенных сточных вод стандарт (ы) и расширенный очищенные сточные воды (ы) параллельно. Присоединить воздушный насос / аэраторов к танкам. Установить расход воды для достижения по меньшей мере, 6 танк Volume обмены в день.
- Начало экспозиции плавучими мешки плотва (от рыбного хозяйства) в соответствующих резервуарах в течение 1 часа. Добавьте резервуар для воды до мешков постепенно, пока температура воды и условий окружающей среды. Отпустите рыбу в их танки.
- Корма для взрослых плотва ежедневно на гранулированных корм для рыб (размер 0,5-0,8). Поток несовершеннолетних плотва ежедневно на небольшом осаждали (размеры гранул 100-300) без эстрогенной подачи 14 вволю, скорректированной на основе непотребленного корма. Держите ежедневные записи подачи ответа документальное кормление / поведение (хорошо, умеренный или плохой, по сравнению с контрольной группой).
- Возьмем еженедельно образцы воды из каждого резервуара для подтверждения эстрогенной активности и химический состав. Seе секции 1-3 для подробностей отбора и анализа проб воды методами.
- Экспериментальный дизайн и настройка
- Гистологическое рыбы гонады 15
- Осторожно снимите расчлененный и фиксированные гонады (описанные в пунктах 5.1.6 и 5.1.7) из контейнера с помощью пинцета и положите на разделочную доску.
- Используйте микротома лезвие, чтобы разрезать каждую гонады на 3 части (передняя, середины и задней) и от каждой части вырезать толстый поперечное сечение 3-5 мм. Осторожно поместите все шесть штук в маркированные кассету пластиковой биопсии, и поместить в процессор ткани с использованием тайминги , перечисленных в таблице 4.
- Восковые встраивать ткани и участок на ротационный микротом (3-5 мкм). Перенос разделов с меченым био-клей для стекла с покрытием слайдов и место слайдов на нагретую пластину (установленной на уровне 45 ° С), чтобы высохнуть в течение 24 часов.
- Пятно слайды, либо вручную , либо с помощью автоматизированной Стайнер, используя тайминги , подробно описанные в таблице 5. Поместите каплю монтажного агента на окрашенном ткани, а лау покровным стеклом над монтажными средство для защиты ткани.
- Во- первых, рассмотрим каждый слайд при низком увеличении (20х, то есть цель 2X, с 10 - кратным увеличением глаз линиями) , чтобы определить пол и количество точек вложений в полости тела 15. Обратите внимание на любые отклонения для каждой рыбы.
- При большем увеличении (100X или 400X), исследовать ткани для оценки стадии гаметогенеза, аномалии и наличие ооцитов в тестикулярной ткани. Запишите тяжесть интерсекса с использованием следующей системы классификации в диапазоне от 0 (нормальный мужской ткани) до 7 (100% ткани яичников) 6 (смотри таблицу 6).
Шаг номер лечение Цель Время (ч) 1 70% IMS дегидратация 3 2 90% IMS дегидратация 2.5 3 95% IMS дегидратация 1.5 4 100% IMS дегидратация 1.5 5 100% IMS дегидратация 1.5 6 100% IMS дегидратация 1.5 7 100% IMS дегидратация 1.5 8 Гистологии осветлитель клиринг 1.5 9 Гистологии осветлитель клиринг 1.5 10 Гистологии осветлитель клиринг 1.5 11 ВОСК Воск инфильтрации 1,25 12 ВОСК Воск инфильтрации 1,25 20 ч ИТОГО Таблица 4. Режим обработки для воска для пропитки тканей для гистопатологии. Ткани должны быть обработаны в автоматическом процессоре ткани. Тканей должен быть погружен в растворах подробно в течение периода времени, указанного.
Пятно нет. пятно Цель Время (мин) 1 Гистологии осветлитель Растворяет воск 15 2 гидратация 2 3 90% IMS гидратация 2 4 70% IMS гидратация 2 5 Водопроводная вода (RUNNING) Полоскание 2 6 HAEMOTOXYLIN Пятна ядер клеток синий 10 7 Водопроводная вода (RUNNING) Удалить избыток 10 8 подкисленных IMS Дехлорирование 20 сек 9 Водопроводная вода (RUNNING) Полоскание 20 сек 10 LiCO 3 Поваренная соль 20 сек 11 Водопроводная вода (RUNNING) Полоскание 20 сек 12 1% эозином (ВОДНЫЙ) Пятна цитоплазма розовый 20 сек 13 Водопроводная вода (RUNNING) Удалить избыток 5 14 70% IMS дегидратация 2 15 90% IMS дегидратация 2 16 100% IMS дегидратация 5 17 Гистологии осветлитель Удалить IMS, связывающий агент 5 Таблица 5. Решения и время погружения для гематоксилином и эозином (H & E) окрашиванием рыбы гонадной тканей. Слайды должны быть помещены в каждую ванну для Allocованные время в определенной последовательности. H & E окрашивание тканей требуется для определения развития или организационных последствий эстрогенного сточных водах на рыбных гонад.
Гол Раздел Описание 0 Нормальный мужской семенник 1 Мультифокальная ovotestis с 1-5 ооцитов (обычно однократно), рассеянных среди тестикулярной ткани 2 Мультифокальная ovotestis, 6-20 ооцитов часто в небольших кластеров разбросаны среди тестикулярной ткани 3 Мультифокальная ovotestis, 21-50 ооцитов в кластерах 4 > 50 и <100 ооцитов. Раздел обычно мультифокальной и имеет вид мозаики из тестаicular и овариальной ткани. 5 > 100 ооциты, как правило, мультифокальной, но также может быть очаговым с четко идентифицируемых зон яичников и тестикулярной ткани, отделенного от ткани яичка. 6 > 50 процентов гонадальной ткани на участке находится в яичнике и четко отделены от тестикулярной ткани эпителиальными клетками и фагоцитирующих тканей. 7 100 процентов гонадной ткани на участке является овариальный. Таблица 6. Система скоринга для оценки тяжести состояния интерсексуальной в плотвы. Гистологически подготовленные слайды гонадной ткани должны быть исследованы под световым микроскопом, на 20X, 100X и 400X увеличение, для оценки каких - либо отклонений и наличие ооцитов в тестикулярной ткани. Эта таблица изменяется от Джоблинга <EM> и др. 2006 6.
Representative Results
Попытки понять влияние улучшений в процессе очистки сточных вод или определить наиболее подходящую технологию для модернизации оборудования в качестве доочистки на существующих СОСВ относительно эффективности удаления эндокринных нарушений активности сбрасываемых стоков, требует не только измерение ключевых химических компоненты, которые входят работы, но требует анализа продуктов распада, которые также могут иметь активность эндокринных нарушений. Во внутренних канализационных стоков, наиболее эстрогенные вещества , присутствующие являются стероидные гормоны, эстрон (E1), 17β-эстрадиол (Е2) и 17α-этинилэстрадиола (EE2) 5,8. Стероидные эстрогены в основном выводится из организма в виде смеси неактивных конъюгатов 16,17. Эти конъюгированные эстрогены, по существу, deconjugated в канализационной системе бактериальной активности и дальнейшая деградация происходит в очистных сооружениях. В deconjugated стероиды аре удаляется из потока сточных вод путем адсорбции на отстой или биодеградации в процессе вторичной обработки, приводящей к образованию, во-первых побочных продуктов трансформации и в конечном итоге полной минерализацией может происходить из исходного активного компонента. Химический анализ всех индивидуальных соединений в отходящем потоке будет сложно, отнимает много времени и дорого, и не будет охватывать неизвестные активные компоненты, присутствующие в образце. Кроме того, сумма эстрогенного вклада каждого компонента будет только обеспечивать индикацию кумулятивного эстрогенной активности пробы из анализируемых веществ. Это риск, где процессы трансформации порождают неизвестные эстрогенные вещества или где втекающий является промышленного происхождения. Сочетание химического анализа с в естественных условиях и в пробирке экотоксикология биопробы обеспечивает решение наличием неизвестных эстрогенных компонентов в смесях , таких как очищенных сточных вод. Анализов в условиях in vitro , таких как дрожжи Эстроген Scrееп (ДА) широко используются для определения эстрогенной активности канализационных стоков , а также помочь идентифицировать активные компоненты в обработанных образцах 8,18,19. Однако, сравнение между в естественных условиях и в пробирке тестирования могут быть значительными 11 и комплексная оценка новых процессов в отношении лечения эндокринных нарушений потенции требует батарею химических и экотоксикология испытаний.
Определение того, является ли индивидуальные очистные сооружения или процессы удаления активных соединений из потока сточных вод может быть достигнуто с помощью химического анализа, который следует экстракции пробы, концентрацию и очистку экстракта перед анализом, наиболее часто осуществляется с помощью LCMS (/ MS) или GCMS (/ MS) методы. Данные , полученные из химического анализа могут быть использованы для определения соответствия с отдельными не предсказывал ни одного эффекта концентрации (ПБК) 20 или Стандарт качества окружающей средыs (EQS) 21 конкретных индивидуальных соединений и поэтому такие методы являются жизненно важными для данных нормативных требований. Кроме того, целевые или методы нецелевой химического анализа позволяют идентифицировать и количественно оценивать отдельных соединений или изомеров по сравнению с биологическими методами, которые обеспечивают ответную реакцию. Поэтому методы химического анализа позволяют оценка отдельных соединений, которые будут сделаны, чтобы встретиться и для решения этих проблем очистки сточных вод на индивидуальной основе очистных сооружений. Исследования показали , что обычные обработки сточных вод (например, активный ил растений) могут быть весьма эффективными при удалении естественных стероидных гормонов , хотя удаление синтетического гормона ЕЕ2 имеет тенденцию быть менее эффективными. Полевые исследования с использованием доочистку с использованием методов, таких как озон, гранулированный активированный уголь (GAC) и мембраны показали, хотя и при высокой стоимости, что они могут быть использованы в качестве раствора с истекшим трубы для удаления eE2 ниже ПРЕДicted уровни эффекта и ниже пределов обнаружения. Рисунок 3 показывает удаление eE2 с использованием GAC на муниципальных очистных сооружений сточных вод пилотном. Исследования , проведенные в экспериментальном масштабе на муниципальных очистных сооружениях , использующих конец трубы лечения GAC также показывают снижение эстрогенной активности следуя GAC измеряется с использованием дрожжей эстроген экрана (YES) , как показано на рисунке 4.
Рисунок 3. Пример полевые данные , показывающие , удаление этинилэстрадиола следующих дополнительных доочистки. (A) Пробы отбираются из очистного сооружения следующих обычных (активированный растительного шлама) обработки в соответствии с процедурами , описанными для сохранения образца. (B) Образцы извлекаются с помощью твердофазной экстракции, Начищенное для удаления мешающих веществ с использованием нормальной фазы SPE игель-проникающей хроматографии. (С) Чистый концентрированный экстракт концентрируют до небольшого объема и анализировали с использованием отрицательных ионов электрораспылением LCMS / MS в режиме MRM. Результаты рассчитываются с использованием внутренней стандартизации, используя меченные изотопами внутренние стандарты. В примере , показанном, ЕЕ2 присутствует в конечном ASP стоке в концентрации выше прогнозируемого уровня воздействия (ПКНВ) : 0,1 нг / л , и удаляется с помощью GAC и озона (O 3) к экологически безопасной концентрации. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра увеличенной версии этой фигуры.
Рисунок 4. Фотография Дрожжи Эстроген экрана (ДА) планшет для анализа (A) , показывающий изменение цвета от желтого до красного, связанной с эстрогенной активности образцов. Графики , созданные из показа YES планшета для анализа корректируется абсорбцию (540нм) стандарта эстрадиола (В), процесс с использованием активированного ила сточных вод (ASP) , и Гранулированный активированный уголь (GAC) Обработанные пробы сточных вод по стокам (С). Каждый образец был испытан в двух экземплярах. ASP и GAC сточные воды были извлечены и концентрировали с использованием методов SPE , изложенных в разделе 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Озонирование также эффективны при удалении стероидные эстрогены и эстрогенной активностью от условно очищенных сточных вод очистных сооружений. Озон способен окислять широкий спектр органических загрязнителей и растворенного органического вещества в пробах сточных вод и обеспечивает дезинфицирующих свойств. Эффективность озонирования зависит от характеристик воды, таких как рН, количество органического вещества и прикладной дозы озона. Эстрогены, которые плохо удаляются с помощью обычного лечения может бытьудаляются из сточных вод с дозами от 0,8 до 2 мг O 3 / мг DOC. Озон является селективным окислителем, который вступает в реакцию с обогащенными электронами сайтов (ненасыщенными углерод-углеродных связей, ароматические соединения, включая ароматические спирты), что делает озон, применимый для пробоя ряда EDC. Тем не менее, устранение отдельных соединений не обязательно приводит к полной минерализации исходного соединения. Органические вещества следующие озонирования могут быть трансформированы генерирующие промежуточные продукты или окисления преобразования побочных продуктов, которые включают в себя ряд с низкой молекулярной массой, полярные классы соединений, таких как альдегиды, кетоны, карбоновые кислоты, кетокислоты и бромированных соединений. Примеры включают в себя, бромата, формальдегид, ацетальдегид и карбоновые кислоты. Использование в естественных условиях и в пробирке биопробы было показано , что , хотя озон лишь частично окисляет некоторые химические вещества, полученные в результате основные продукты трансформации имеют более низкую estrogЕНИК потенцию и, следовательно, применение озона при соответствующей дозы приводит к высокой удаления эстрогенной активности.
Одним из основных преимуществ дополнительной обработки сточных вод является сокращение феминизации мужского рыбы в получении воды; неблагоприятный эффект , который может привести к снижению рождаемости 3. VIVO исследования в разделе Использование рыбы (например, плотва или Гольян) подвергается воздействию сточных вод шоу женских половых клеток или ооцитов в семенниках самцов рыбы (например, как показано на рисунке 5). Интерсексуальной или мужской VTG отсутствует или значительно уменьшена в рыбе следующие передовые методы лечения , такие как GAC 7 или озона 22. Эти исследования показывают, что продукты преобразования, произведенные во время озонирования не эстрогенных, однако это не касается токсичности сточных вод производства. Эта проблема была решена в других исследованиях, например , исследование , проведенное Магдебурга и др. 12,24 - 26. TAML активаторы с H 2 O 2 эффективно деградировать eE2 и другие стероидные эстрогены в чистой воде лаборатории, а также в стоках городских очистных сооружений и в обогащенных образцах мочи 12. Лабораторные исследования, показывает TAML / H 2 O 2 обработка обеспечивает высокую стероидный удаление эстрогена , включая удаление ЕЕ2 и существенно снижает эстрогенной активности , измеренный в пробирке с использованием ДА биопробы и субстанциLLY уменьшает рыбы феминизации в естественных условиях , измеренной с помощью биопробы VTG (рисунок 1 и рисунок 6). 
Рисунок 5. Микрофотографии нормального мужчины (А) и интерсекса (B, C) гонады от взрослых плотвы (Rutilus Rutilus) подвергаются сточные воды в поле на основе оценки. Микрофотография-A, изображает гистологический срез нормального мужского яичка. Микрофотография-B и -C, изображает гистологические срезы с интерсексуальной мужской рыбы, подвергавшимися процесс с использованием активированного ила сточных вод сточных вод в течение шести месяцев. Стрелки указывают на ооциты, присутствующие в ткани яичка. Шкала бар составляет 100 мкм в каждой микрофотографии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 6. Средняя концентрация ЕЕ2 и эстрогенная активность в обработанных и необработанных танковые воды (А) и в плазме вителлогенин в базовой линии и подвергаются Самец (В). А) концентрация ЕЕ2 (нг / л, темно - синие полосы) измеряли с помощью LCMS / MS , эстрогенная активность (ЕЕ2 эквивалент нг / л, темно - зеленые полосы) измеряли с помощью экстракорпорального Дрожжи эстрогеновых экран (ДА). б) Плазма вителлогенина (нг / мл, светло - голубой полосы) концентрации в мужских толстоголового пескарями измеряли с помощью количественного фермента -связанной твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). EE2 результаты химического анализа , как сообщалось <0,03 нг / л ЕЕ2 (т.е. ниже предела обнаружения (LOD)) рассматривались как имеющие половину LOD (то есть, 2 O 2 + TAML, ЕЕ2 + H 2 O 2, и ЕЕ2 только. Столбики ошибок в графе-A представляют собой стандартную ошибку среднего, баров ошибок в графике-B представляют стандартное отклонение. Буквы над решеткой в граф-B представляют собой статистическую сходство. Эта цифра была изменена с Миллс и др. 12 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Станции очистки сточных вод являются основным путем загрязнения поверхностных вод с EDC. Оценка эффективности удаления эндокринной активности обычных, продвинутых или возникающих процессов обработки требует использования различных химических и биологических анализов. Химический анализ с использованием нецелевой и целенаправленный анализ дает качественные или количественные данные об эффективности удаления отдельных компонентов и, следовательно, позволяет провести оценку быть сделаны в отношении стандартов качества окружающей среды или не предсказывал ни одного концентрации эффекта для соединений или смесей соединений анализируемых.
Поколение продуктов трансформации в результате неполного минерализации веществ после окончания лечения и наличием неизвестных биологически активных компонентов в сточных водах ограничивает применение только химических испытаний. Сочетание пробирке биопроб в естественных условиях и в в сочетании с аналитической химиичень скрининг предоставляет полезный набор инструментов для определения эффективности удаления EDC с помощью новых процессов очистки сточных вод. Эти испытания, проведенные при наряду с традиционными параметрами качества воды и других токсикологических и микробиологических конечных точек позволяют критическую оценку текущих и новых технологий очистки сточных вод.
Важно отметить , что дрожжи эстрогена экраны на основе (например, YES) не только в пробирке анализы для определения эстрогенной активностью химических веществ и сточных вод. Ряд стабильно трансфицированных анализов на основе клеток млекопитающих , были разработаны также, например, ЕР-CALUX 27 и hERα-HeLa-9903 28 с клетками рака молочной железы человека или цервикальной опухолевых клеток соответственно. ДА сравнивают с аналогичными на основе клеточных анализах млекопитающих и было установлено, имеют сравнимую высокий уровень воспроизводимости, истинно положительных и истинно отрицательных ставок 29 эстрогенные идентификации, Althoтьфу иногда считается чуть менее чувствительным 27. Одним из преимуществ дрожжей на основе репортерных анализов является то, что в лабораториях без существенного опыта с культурой клеток млекопитающих ДА может быть более легко принята, так как она требует менее строгих мер биологического контроля и технические приемы стерилизации (ДА могут быть выполнены на скамье, если это необходимо) , Анализы на основе клеток человеческого также требуют CO 2 инкубаторы и люминометров по сравнению со стандартными читателей инкубатора и микропланшетов , используемых в YES. На основе эстрогена репортер анализы Два дрожжей (ДА, Saccharomyces CEREVISIAE и A-ДА, Arxula adeninivorans) в настоящее время проходят межлабораторные трассы для проверки достоверности ISO 19040 "Качество воды - Определение эстрогенной потенциала воды и сточных вод" выделяя отрасли интерес к этим методам.
Есть целый ряд ограничений способов, описанных, которые включают в себя потенциальное загрязнениепроб во время отбора проб, хранения и анализа проб с эстрогенных веществ , происходящих из полевых условиях или в лаборатории или человеческим загрязнением (например, пластификаторы, поверхностно -активные вещества, продукты личной гигиены). Этот тип загрязнения в анализе ДА (или другие репортерные анализы, основанные клеток) возвысит фона и воздействовать на использование анализа. Пробы воды или растворители, хранящиеся в пластиковых бутылках может легко привести к ложным срабатываниям. Ложноотрицательные также вызывают озабоченность, как и ЖХ / МС и анализ ДА требуют SPE сконцентрироваться на эстрогены обнаружению уровней. Матрица, выбор SPE сорбент и растворителя для элюции может повлиять на эффективность экстракции и типы соединений, элюированных. Использование С18 SPE картриджи для экстракции с использованием условий, описанных в данном протоколе могут генерировать отрицательное смещение, так как сильно полярные и основные соединения, будут плохо удерживаются сорбентом. Кроме того, этот протокол требует воссоздание элюированного YES элюента из метанол в этанол с помощью выпаривани до сухого состо ни Funder азота, что приводит к потере летучих соединений. В результате протокол может обеспечить недооценил эстрогенной активности испытуемых образцов. Эти ограничения особенно важны при рассмотрении анализа ДА в качестве неизвестных или неожиданных соединений может быть упущена, потому что они не были извлечены или они теряются из-за испарения. Кроме того, метод ЖХ / МС использует меченных внутренних стандартов для коррекции восстановления; Такой подход не может быть использован при анализе YES.
Значительные ограничения тестирования в естественных условиях сточных вод включают в себя высокую стоимость и время , необходимое для оценки по сравнению с методами в лабораторных условиях . В настоящее время применение тестов эмбрионов рыб для выявления эстрогенной активности ограничено. Тем не менее, был достигнут некоторый успех с производством эстрогеном трансгенным светящегося эмбрионов рыб 30, которые могли бы иметь для будущих приложений. Толстоголовому пескари (использованные в этом protocол) являются типичным лабораторным видов и VTG индукции у самцов рыб является хорошо документированы био-маркер эстрогенного воздействия и количественному мера сточных вод стоков эстрогенности 22 или других эстрогенных соединений или смесей 31. Испытаний ОЭСР руководящие принципы , нарушающие эндокринную систему химических веществ были проверены с помощью взрослых Гольян, японские Оризии и данио 32,33, с VTG быть чувствительным биомаркером воздействия эстрогена во всех трех видов. Тем не менее, VTG индукция не напрямую коррелирует с репродуктивным нарушениями , и поэтому экологические последствия воздействия сточных вод, как видно в сильно интерсексуальной плотвы 3. С другой стороны, плотва не являются классическим «лабораторных видов» для исследования экотоксикологии из-за их большого размера, длительным временем генерации (2-3 лет, чтобы достичь половой зрелости), репродуктивный стиль; группа нерест (разведение) проводится один раз в год, а также трудности для выявления мужчин от женщин (кроме во времянерестовый сезон). Тем не менее, это обычно gonochoristic вид был очень хорошо изучен в Великобритании, в связи с открытием , что вниз по течению эстрогенных стоков сточных вод, Самец выставленного возмущения к их эндокринологии (например, наличие женского специфической вителлогенина в крови) и гистопатологии (ovotestes - развитие яйца в семенниках и / или женских половых протоков) 5,6. Таким образом, в качестве будущего применения этих протоколов, плотва (или аналогичные виды) может быть полезным диких видов дозорных, чтобы показать, если реальные улучшения к качеству сточных вод (и снижение эстрогенности) наблюдаются в реках, получающих передовые очищенные сточные воды. Они также могут быть использованы в конце трубопроводных систем для мониторинга технологически усовершенствованных стоков с полупромышленных установок 7. При рассмотрении вопроса, какие виды для использования в оценках в естественных условиях сточных вод существует компромисс между относительно быстрых и контролируемых испытаний с использованием лабораторных видов по сравнению сбольше поля на основе, но более экологически актуальной, тестирование с использованием местных видов. Тем не менее, такие оценки в естественных условиях являются высокая стоимость и должны рассматриваться только в качестве окончательного набора тестов следующих оценок с использованием химического анализа и лабораторных анализов.
Критические шаги в рамках протоколов , описанных включают подготовку и обработку проб и стеклянной посуды (т.е., бутылки и оборудование для отбора проб должны быть предварительно обработаны с помощью подходящего поверхностно - активного моющего средства) , чтобы избежать загрязнения образцов от загрязнителей окружающей среды , включая ограничение контакта образцов с пластиками и другие материалы, которые могут производить ложных срабатываний. Это одинаково важно при проектировании и строительстве аквариумы и рыбы систем воздействия. В идеале аквариумы (жилищные акции и во время экспозиции) должны быть построены из материалов с низкой адсорбции 32 с минимальным риском загрязнения. Из нержавеющей стали могут быть использованы для стоков или резервуаров для воды проведения.В то время как танки конструкции стекла являются предпочтительными для танков рыбы (как это также обеспечивает легкое наблюдение рыбы). Использование низкосортных пластиковых труб или труб следует избегать 32, 34 ПВХ и АБС может быть использован , если "правильно заправленный ', то есть, слева вымываться любые загрязнения проточной воды для разбавления в течение по крайней мере 12 часов перед использованием. Медицинский класс кремния трубки был успешно применен в нашем учреждении для перистальтического насоса доставки химических веществ и сточных вод / воды для разбавления в цистернах. А также с учетом эстрогенной загрязнения в строительстве и запуск системы по водным видам спорта, также важно думать о диете рыбы; многие приличие рыбные продукты были признаны эстрогенным для рыб. Поэтому важно , чтобы проверить любые продукты для деятельности (например, в Эстроген экране дрожжей, см Beresford и др. 14) до использования их в этих типах исследований.
Исправление проблемхимического анализа или да протоколов анализа, описанных упрощается, если образцы контроля качества, включая несколько поездок, лабораторных и растворителей заготовки анализируются наряду с положительным контролем и реальных образцов для устранения ложных положительных и ложно отрицательных результатов. Положительный (например, ЕЕ2) и отрицательным (только вода разведение) контроль должен также всегда быть использован в в естественных условиях анализов для подтверждения чувствительности ожидаемой биологической биомаркера или конечной точки (т.е. VTG или патоморфологическую), и допускать нежелательного скалывания быть обнаружены ( например, из экспериментальной установки, диеты, или разбавления воды). Любые изменения в протоколе должны быть проверены перед проведением любого исследования.
С более строгого регулирования эстрогенных соединений, попадающих в окружающую среду через СОСВ стоками это предусмотрено, что более эффективные технологии очистки сточных вод должны быть разработаны. Батарея тестов, описанных в этой рукописи комплиментэкотоксикологические и химические тесты оценки, обычно применяемые для очистки сточных вод сточных вод. Таким образом, будущее применение этого типа батареи целостного теста должны позволить разработчикам технологии очистки сточных вод, и операторы завода, реализовывать самые экологически безопасных конструкций с учетом наиболее эффективные методы для удаления обоих конкретных регулируемых эстрогенных химических веществ и общей биологической активности.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wellwash Versa plate washer | Thermo Scientific | 5165010 | |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax 340PC | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | 37 °C incubation required for carp assay |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Icemaker | Scotsman | AF80 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| ELISA kits | Biosense Laboratories | V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp) |
|
| Microfuge tubes, 0.5 ml | Alpha labs | LW2372 | |
| Microfuge tubes, 1.5 ml | Alpha labs | LW2375 | |
| Sulphuric acid, 95-98% | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Histology | |||
| Tissue processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Wax dispenser | Thermo Scientific Raymond Lamb | E66HC | |
| Metal embedding mold | Leica Biosystems | Various | |
| Hot plate | Thermo Scientific Shandon | 3120063 | |
| Cold plate (EG1150 C) | Leica Biosystems | 14038838037 | |
| Heated forceps (EG F) | Leica Biosystems | 14038835824 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2235 | |
| Paraffin section floatation bath | Electrothermal | MH8517 | |
| Slide drying bench | Electrothermal | MH6616 | |
| Stainmate automated stainer | Thermo Scientific Shandon | E103/S10L | |
| Cassettes, Histosette II, biopsy | Simport | M493 | |
| Paraffin wax | Thermo Scientific Raymond Lamb | W1 | |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | |
| IMS (ethanol mix), IDA99 | Tennants | ID440 | |
| Polysine adhesion slides | Thermo Scientific Gerhard Menzel | J2800AMNZ | |
| Cover slips, 22x50 mm | VWR | 631-0137 | |
| Histomount | National Diagnostics | HS-103 | |
| Haematoxylin Harris GURR | VWR | 351945S | |
| Eosin, 1%, aqueous | Pyramid Inovation | S20007-E | |
| Fisherbrand slide boxes | Fisher Scientific | 11701486 | |
| Microtome blades, MB35 | Thermo Scientific Shandon | 3050835 | |
| Bouin’s solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Yeast screen | |||
| Flow cabinet | Labcaire Systems Ltd | SC12R | |
| Cooled incubator | LMS Cooled Incubator | 303 | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | |
| Shaker | Grant | PSU-10i | |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Plate shaker | Heidolph Titramax 100 | 544-11200-00 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| 12-channel pipette, electronic | Sartorius | 735441 | |
| 96-well flat-bottom microplates | MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt |
76-232-05 260860 82.1581.001 |
We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds |
| HPLC grade water | Rathburn | RH1020 | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Sigma-Aldrich | P-5655 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A-2939 | |
| Potassium hydroxide, pellets | Sigma-Aldrich | P-1767 | |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Iron(III) sulfate | Sigma-Aldrich | 307718 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L-8912 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H-6034 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A-2786 | |
| L-Argenine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | A-6969 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M-5308 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T-8566 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I-7403 | |
| L-Lysine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | L-8662 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P-5482 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G-8415 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V-0513 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | T-1270 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P-5669 | |
| D-Pantothenic acid, hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P-5155 | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I-5125 | |
| D-Biotin | Sigma-Aldrich | B-4639 | |
| D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers | Sigma-Aldrich | G-7021 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A-4534 | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T-8441 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 10884308001 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G-2025 | |
| 17 β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E-8875 | |
| Steroids | |||
| Acetone | Rathburn | ||
| Acetonitrile | Rathburn | ||
| Ammonia solution | Rathburn | ||
| Ethylacetate | Rathburn | ||
| Copper(II) nitrate | Sigma-Aldrich | ||
| Acetone | Rathburn | ||
| Dichloromethane | Rathburn | ||
| 2,4,16,16-d4-17β-estradiol | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-estrone | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol | CDN Isotopes | ||
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Estrone | Sigma-Aldrich | ||
| 17α-ethynyl oestradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Hexane | Rathburn | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | ||
| Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Fish study | |||
| orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 | Watson Marlow | 982.0063.000 | |
| straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 | Watson Marlow | 999.2008.000 | |
| pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m | Watson Marlow | 913.A008.016 | |
| 200 series multi-channel persitaltic pump | Watson Marlow | 205CA | |
| Silicone tubing x 15 m (dosing tanks) | VWR | SFM1-3250 | |
| silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow) | VWR | SFM1-5450 | |
| 2.5 L glass winchester pk 4 | Fisher Scienctific | BTF-505-050B | |
| magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10 | Fisher Scienctific | FB55595 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
| 17α-Ethynylestradiol | Sigma Aldrich | E4876-100MG | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| SPE | |||
| 1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4 | Sigma Aldrich | 57276 | |
| disposable liners for manifold | Sigma Aldrich | 57059 | |
| filtration tubes without frits 6 ml pk 30 | Sigma Aldrich | 57242 | |
| reservior adaptors pk 12 | Sigma Aldrich | 57020-U | |
| stainless steel weight for manifold pk 4 | Sigma Aldrich | 57278 | |
| male Luer plug for manifold pk 12 | Sigma Aldrich | 504351 | |
| SPE Vacuum Manifold | Sigma Aldrich | 57265 | |
| stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 | Waters | WAT054806 | |
| Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50 | Waters | WAT020515 | |
| Methanol HPLC grade 2.5 L | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| 7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399 | Fisher Scientific | TUL-520-031K | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump | Camlab | 1136915 |
References
- Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T.
- Rodgers-Gray, T. P., et al. Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development. Environ. Sci. Technol. 35 (3), 462-470 (2001).
- Jobling, S., et al. Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biol. reprod. 66 (2), 272-281 (2002).
- Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish. J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166 (7), 418-426 (1996).
- Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. Widespread sexual disruption in wild fish. Environ. Sci. Technol. 32 (17), 2498-2506 (1998).
- Jobling, S., et al. Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations. Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).
- Baynes, A., et al. Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments. Environ. Sci. Technol. 46 (10), 5565-5573 (2012).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ. Toxicol. Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
- Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade. Chemosphere. 84 (10), 1512-1520 (2011).
- The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).
- Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol. Aquat. toxicol. 66 (2), 183-195 (2004).
- Mills, M. R., et al. Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment. Sci. Rep. 5, 10511 (2015).
- EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods. , British Standards Institute. London, UK. (2006).
- Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem. 30 (5), 1139-1145 (2011).
- Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. A histological description of intersexuality in the roach. J. Fish Biol. 58 (1), 160-176 (2001).
- Dascenzo, G., et al. Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities. Sci. Total Environ. 302 (1-3), 199-209 (2003).
- Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry. Int. J. Environ. Anal. Chem. 85 (1), 1-14 (2005).
- Metcalfe, C. D., et al. Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes). Environ. Toxicol. Chem. 20 (2), 297-308 (2001).
- Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity. Water Res. 45 (3), 1015-1024 (2011).
- Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol. Environ. Toxicol. Chem. 31 (6), 1396-1406 (2012).
- Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents. Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).
- Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish. Environ. Sci. Technol. 44 (11), 4348-4354 (2010).
- Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species. Chemosphere. 88 (8), 1008-1014 (2012).
- Collins, T. J. TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems. Acc. Chem. Res. 35 (9), 782-790 (2002).
- Collins, T. J. Designing Ligands for Oxidizing Complexes. Acc. Chem. Res. 27 (9), 279-285 (1994).
- Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts. Green Chem. 15 (9), 2339-2343 (2013).
- Murk, A. J., et al. Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environ. Toxicol. Chem. 21 (1), 16-23 (2002).
- Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Kolle, S. N., et al. In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays. Toxicol in Vitro. 24 (7), 2030-2040 (2010).
- Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos. BMC Biotechnology. 12, 32 (2012).
- Brian, J. V., et al. Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals. Environ Health Perspect. 113 (6), 721-728 (2005).
- Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
