Summary
内分泌撹乱化合物（EDC）は、水生環境に対して実質的なリスクをもたらします。都市廃水処理プラントは地表水のエストロゲン効力に対する主要な貢献者です。このホワイトペーパーで提供方法論は、EDCの除去に関して、廃水処理プロセスの有効性と適合性の評価が可能になります。
Introduction
野生生物の生殖に関する健康上の化合物を内分泌かく乱の影響に関する懸念は、水枠組み指令（WFD）の下の「ウォッチリスト」の2つのエストロゲン様物質（エストラジオール及びエチニルエストラジオール）を配置するために、欧州連合（EU）をリードしてきました。 EDCは、天然および合成ステロイドエストロゲン、医薬品、農薬、および工業用化学物質や野生生物に関する既知の悪影響を消費者製品の成分を含む化学クラス、さまざまなを包含する。これらの化合物のいくつかは、潜在的に人間の健康1に影響を与える可能性があります 。
研究は、WWTPからの流出物は、2を魚にエストロゲンであることが示されている、結果として多くの水域は、魚類3にエストロゲンでもあります。これは最初の野生のオスの魚の血と高前で増加ビテロゲニン濃度（女性特有の卵黄タンパク質前駆体4）を示したイギリスの国民の調査を通して実証されました通常gonochoristic魚種5,6における半陰陽の価数（オス魚の精巣に卵および/ または女性の生殖管の開発）。
従来の下水処理は、一般的に溶解し、有機物を中断削除し、プライマリとセカンダリの両方の処理を行った予備スクリーニングからなる3段階のプロセスです。個々のEDCの除去の有効性は、物質の物理化学的特性にして適用処理プロセスの有効性に依存します。吸着および生物学的分解を介して、多くのEDCの除去には有意であるが不完全である可能性があります。三次処理、砂ろ過として、（例えば、オゾンなど）の高度な酸化を使用して高度処理のに対し、EDCの除去7を増加させるのに有効であることができ、または活性炭を完全に除去7の近くに達成するのに有効であることができます。
廃水処理旧姓のための新しい技術の評価EDCの除去で提案されたプロセスの有効性を決定するために、DS。対象となる化学物質の生態毒性試験と一緒に分析、in vivoおよびin vitroのバイオアッセイで使用することを含むテストのバッテリーは、この目的のために総合的なデータを提供します。規制目的のために非常に有用であるが、標的化学分析は、監視対象の化合物（及び特定の代謝産物）に関するデータを提供することができます。バイオアッセイは、さらに、それ以外の場合は8,9を未検出であろう副産物代謝産物および治療 で生成された廃水変換の副作用の「検出」を可能にします。本論文では、原油と下水処理水のエストロゲン効力を除去し、水を受信する際に高度な新興廃水処理プロセスの数の有効性を評価するための化学的および生態毒性の実験室アッセイのバッテリーの使用を記載しています。
Protocol
倫理の声明：魚中の化学物質/混合物の内分泌かく乱作用を評価するためのプロトコルは、法律1986ブルネル大学、ロンドンの動物福祉によっておよび倫理審査機関（AWERB）と動物の下で英国内務省（科学的手順）によって承認されています。
1.水のサンプル収集、保存と抽出
- サンプルの収集と保存
- 使用前に、適切な界面活性洗浄剤でボトルをきれいに。洗浄後、水、排水、乾燥してボトルをすすぎます。
- 硝酸銅（II）0.5gを注入し、6ml 3.6 M塩酸溶液からなる保存剤を含有する2リットルの容量のガラス瓶にサンプルを収集します。 10°C以下の店舗サンプル。抽出し、収集と保存、次できるだけ早く分析します。
- （ステロイドエストロゲン分析用）サンプルの抽出とクリーンアップ10
- 固相抽出（SPE）
- 抽出前に、1μmの孔径のろ紙を用いて浮遊物質、濾過水サンプルを低減します。
- 2,4,16,16-d 4が-17βエストラジオール（E2）：一度濾過し、2,4,16,16-dの4 -エストロンを含む重水素化内部標準原液をスパイク100μlを加えることにより、内部標準とサンプルをスパイク：下水のための2 ngの/ Lの内部スパイクをもたらし、2,4,16,16-dの4-17αエチニルエストラジオール（EE2）（すべてのメタノール中の40μg/ Lがで）千ミリリットルの流出物（または100ミリリットル流入）へ流出液サンプル、汚水流入サンプルの20 ngの/ Lの。
- SPE装置に使い捨てのバルブライナー、スチレンジビニルベンゼンSPEカートリッジ、およびカートリッジリザーバーを取り付けます。機器をテストするための真空ポンプ上のスイッチが適切に密閉されています。
- ピペット各リザーバに酢酸エチル5mlを、カートリッジを調整します。 （毎分10ml未満の流量を可能にするために10 inHg下に）真空ポンプのスイッチを入れますそして、液体を介して引き出します。 SPEカートリッジを乾燥させないでください。 5mlの水に続いてメタノール5mlと繰り返しプロセス。
- 水で各カートリッジリザーバを補充し、カートリッジの貯水池やガラス製サンプル瓶の間に1/8 "PTFEチューブを接続します。毎分未満10ミリリットルの流量で真空に切り替え、試料全体がカートリッジを通過することを可能にします。必要に応じて、廃棄物のフラスコを空にします。
- 徹底的に（ 例えば、暗褐色から淡褐色に）色を変更する真空下でのカートリッジの内容まで（空気または窒素を使用するか）SPEカートリッジを乾燥させます。
- 抽出マニホールドの内部でラックと場所に清潔で乾燥した10mlのガラスコレクションバイアルを置きます。各ライナーがバイアルの上にあることを確認してください。ピペット8真空ポンプ（毎分未満10ミリリットルの流量）の各サンプル容器にジクロロメタン、スイッチのミリリットルとはを通じて収集バイアルに液体を引っ張ります。
- SPEマニホールドから10ミリリットルバイアルを削除しますそして1ミリリットルにボリュームを減らすために、コンセントレータを使用しています。オートサンプラーバイアルに各サンプルを転送し、さらに窒素ブローダウン装置を使用して100μlに集中します。
- 抽出前に、1μmの孔径のろ紙を用いて浮遊物質、濾過水サンプルを低減します。
- ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）清掃
- 表1に記載の条件を用いたGPC備えたHPLCに溶出試料抽出物の95μLを注入する。GPCは、コンセントレータと窒素装置をブローダウンした後、ヘキサンで2.0ミリリットルを構成するを使用して200μlにダウンして抽出し濃縮します。
- SPEクリーンアップ
- SPEマニホールドに使い捨てバルブライナー、アミノプロピルカートリッジ、およびカートリッジリザーバーを取り付けます。抽出マニホールドの内部でラックと場所に清潔で乾燥した10mlのガラスコレクションバイアルを置きます。ピペット各リザーバにヘキサン2mlを、カートリッジを調整します。液体がカートリッジを通過することを許可します。
- リザーバにGPC試料抽出物をピペットし、再び液体に許可カートリッジを通過します。バイアル中のサンプルの溶出液を収集し、マニホールドから取り外します。溶出液は捨てないでください。
- ラックに新しい乾いた清潔な10ミリリットル収集バイアルを入れ、抽出マニホールドの内側に配置します。カートリッジを洗浄容器にヘキサン（30％v / v）の中の酢酸エチル2 mLを加え、カートリッジから液体を引きます。すべての洗浄液を廃棄し、ヘキサン中の酢酸エチルの更なる2mlで繰り返します。
- 逆抽出マニホールド内部のラックに元の10ミリリットル収集バイアル（ステップ1.2.3.2）を配置します。ピペットアセトン中の酢酸エチル2mlの（50％v / v）のリザーバに、真空ポンプのスイッチを、バイアル中を通る液体を引く（2 inHg毎分2ml未満の流量を可能にするために、次へ） 。酢酸エチルの別の2mlで処理を繰り返します。
- サンプルバイアルを取り外し、1ミリリットルに抽出量を削減するためにコンセントレータを使用しています。トン蒸発させるために、機器をダウンブロー小さいガラスバイアルに試料を移し、窒素を使用彼は初期の乾燥に抽出します。
- メタノール100μLを加え、よく混ぜます。 （0.3ミリリットルインサート付き）オートサンプラーバイアルに抽出液を移し、バイアルをキャップ。 LCMS / MSを使用してサンプルを分析する（セクション2を参照）。
- 固相抽出（SPE）
| カラム： | PLゲル、50 A、300×7.5ミリメートル、5ミクロン |
| ガードカラム： | PLゲル、50×7.5ミリメートル、5ミクロン |
| 移動相： | ジクロロメタン |
| 流量： | 毎分1ミリリットル |
| カラム温度： | 25°C |
| UV検出器： | 210 nmの |
| 注入量： | 95μlの |
| 注入モード： | スタンドアード |
| スピードを描きます： | 毎分500ミリリットル |
| スピードを取り出します： | 毎分500ミリリットル |
| 位置を描画： | 3ミリメートル |
| 画分を集めました。 | 3ミリリットル画分（7から10分）10ミリリットルバイアル中 |
表1の条件と抽出された廃水試料のゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）のクリーンアップのためのパラメータ表は、GPCカラム、移動相、温度、注入量、および検出器の波長を詳しく説明します。
- （酵母エストロゲン画面用）サンプル抽出
- セクション1.2.1.1で詳述されるようにフィルタサンプル。 SPE装置に使い捨てのバルブライナー、C18 SPEカートリッジ、およびカートリッジリザーバーを取り付けます。機器をテストするための真空ポンプのスイッチを入れるには、適切に密閉されています。
- 各リザーバにピペット5mLのメタノール、Cを調整します18のカートリッジ。 （毎分約5ミリリットルの流れを可能にするために約5 inHgに）真空をオンにしてから液体実行させ、1〜分間の半分の方法を一時停止。カートリッジは、乾燥させないでください。 HPLCグレードまたは再蒸留水（のddH 2 O）のいずれかでの繰り返し処理。再びドライ実行しないでください。
- セクション1.2.1.4で説明したように水のサンプルを抽出します。徹底的にカートリッジを乾燥させるために、少なくとも30分間真空を続けます。
- 抽出マニホールド内のラックにきれいな乾いた10ミリリットルのコレクションバイアルを置きます。各ライナーがバイアルの上にあることを確認してください。各リザーバにメタノール5mlを追加します。真空（5ミリリットル/分の最大流量）をオンにして、液体がバイアルにカートリッジを通過できるように、2〜分間の半分の方法を一時停止。
- YESの画面を使用して分析する前に、窒素を使用して初期乾燥するまで抽出物を低減し、500-1,000μlのエタノールを用いて再構成します。蒸発を避けるために、サンプルバイアルの蓋を密封し（4℃で維持スパーク・フリー冷蔵庫）。
LCMS / MSを使用した2化学分析
- 製造元の指示を用いてLCMS / MSシステムの動作条件を最適化します。
- 液体クロマトグラフィーおよび質量分析条件を用いてキャリブレーション標準液、サンプルを抽出し、空白と分析品質管理（AQC）のサンプルを分析し、 表2に詳述されるようにイオン遷移を監視します。内部使用して、サンプル抽出物中のステロイドエストロゲンの濃度を決定します規格10。
| LCMS | |||||
| 液体クロマトグラフィー | |||||
| カラム： | C18（2）、150×4.6 mmの5ミクロン。 | ||||
| 注入量： | 20μlの | ||||
| フロー： | 毎分0.5ミリリットル。 | ||||
| Mobileフェーズ： | 溶媒A：0.1％アンモニアを含む水。 | ||||
| 溶媒B：アセトニトリル。 | |||||
| 勾配プログラム： | |||||
| 時間（分） | 0 | 10 | 18 | 24 | 28 |
| A：B溶剤比 | 90:10:00 | 50:50:00 | 0.479167 | 0.479167 | 90:10:00 |
| 質量分析 | |||||
| ソース： | エレクトロ（マイナスイオン） | ||||
| ガスソース： | CUR：20 psiで、GS1：70 psiで、GS2：30のpsi | ||||
| TEM：600°C、CADガス5とイオンスプレー電圧-900 | |||||
| MRMトランジション： | |||||
| E1： | 145分の269＆143分の269 | ||||
| E2： | 145分の271＆143分の271 | ||||
| EE2： | 145分の295＆143分の295 | ||||
| E1-D4： | 147分の273 | ||||
| E2-D4： | 147分の275 | ||||
| EE2-D4： | 145分の299 | ||||
廃水抽出物中のステロイドエストロゲンのLCMS / MS分析のために表2の詳細なパラメータ及び条件表は、サンプル注入量を与え、流速、移動相条件AND勾配。
インビトロ酵母エストロゲン画面で使用3.エストロゲン活性（YES）アッセイ8
- 準備し、（a）〜（g）の表3の通り最小培地および培地成分を格納します。
| （a）最小培地（pHは7.1）： |
| Fe 2を40mgを添加することによっての Fe 2（SO 4）3溶液（SO 4）二回蒸留水（のddH 2 O）の3〜50ミリリットルを準備 |
| 2Lのガラスビーカーに1LののddH 2 Oを加えます |
| ビーカーに以下のコンポーネントを追加します。 |
| 13.61グラムのKH 2 PO 4 |
| 1.98グラム（NH 4）2 SO 4 |
| 4.2グラムのKOH |
| 0.2グラムのMgSO 4 |
| Fe 2（SO 4）1mlの |
| 50ミリグラムのL-ロイシン |
| 50mgのL-ヒスチジン |
| 50 mgのアデニン |
| 20mgのL-アルギニン塩酸 |
| 20mgのL-メチオニン |
| 30mgのL-チロシン |
| 30mgのL-イソロイシン |
| 30mgのL-リジン塩酸 |
| 25ミリグラムのL-フェニルアラニン |
| 100mgのL-グルタミン酸 |
| 150ミリグラムのL-バリン |
| 375ミリグラムのL-セリン |
| 磁気フリーで加熱撹拌機にビーカーを入れて、それがすべて溶解するまで撹拌します |
| pHが7.1であることを確認し、必要に応じて調整 |
| 50ミリリットルの無菌注射器は、金属ねじのトップ蓋付きガラス瓶に45ミリリットルのアリコートを分配使い方 |
| オートクレーブ中で10分間、121℃で最小培地を滅菌します |
| 室温で保存 |
| （b）のD - （+） -グルコース： |
| ddH 2 O中の20％のw / v溶液を調製 |
| 金属ネジの上部の蓋付きガラスバイアルにに20ミリリットルのアリコートを分注します |
| オートクレーブ中で10分間121℃でグルコース溶液を滅菌 |
| 室温で保存 |
| （C）L-アスパラギン酸： |
| ddH 2 O中に4mg / mlのストック溶液を作ります |
| 金属ネジの上部の蓋付きガラスバイアルにに20ミリリットルのアリコートを分注します |
| オートクレーブ中で10分間121℃でL-アスパラギン酸溶液を滅菌 |
| 室温で保存 |
| （d）のビタミンソリューション： |
| ddH 2 O 100mlにビオチン2ミリグラムを添加することによってビオチン溶液を調製 |
| 8 mgのチアミン、8mgのピリドキシン、8 mgのパントテン酸、40mgのイノシトールを量り分けます。すべての乾燥成分を追加し、180ミリリットルのビオチン溶液の20ミリリットルのddH 2 O |
| 層流キャビネット内で、滅菌ガラスボトルに0.2μmの細孔サイズの使い捨てフィルターを通して濾過することにより、10ミリリットルの滅菌アリコートを作ります |
| 4°Cで保存 |
| （E）L-トレオニン。 |
| ddH 2 Oに24 mg / mlでのL-スレオニンの100ミリリットルを準備 |
| 金属ネジの上部の蓋付きガラスバイアルにに10ミリリットルのアリコートを分注します |
| オートクレーブ中で10分間121℃でL-スレオニン溶液を滅菌 |
| 室温で保存 |
| ddH 2 O中20mM硫酸銅（II）溶液25mlを準備 |
| クリーンベンチ内で、滅菌ガラスボトルに0.2μmの孔径のフィルターを通して濾過することにより5ミリリットル滅菌アリコートを作ります |
| 室温で保存 |
| （g）のクロロフェノールレッド-β-D-ガラク（CPRG）： |
| ddH 2 OにCPRGを10mg / mlの溶液25mlを調製 |
| クリーンベンチ内で、滅菌ガラスボトルに0.2μmの孔径のフィルターを通して濾過することにより5ミリリットル滅菌アリコートを作ります |
| 4°Cで保存 |
表3 酵母エストロゲンスクリーンアッセイ;最小培地および培地成分の調製及び保管。
- 準備とストラ10倍に濃縮酵母培養のGE
- 1日目に、増殖培地を準備する（3.4.1に詳述）と、滅菌三角フラスコに注ぎます。 -20℃で保存した極低温バイアルから10倍に濃縮酵母の125μLを加えます。オービタルシェーカー上で約24時間、28℃で接種したメディアをインキュベートします。
- 2日目に、成長培地（〜50ミリリットル）の2つのボトルを作成し、個別の無菌コニカルフラスコに注ぎます。増殖培地の各フラスコに24時間培養した酵母の1ミリリットルを追加します。オービタルシェーカー上で約24時間、28℃で接種したメディアをインキュベートします。
- 3日目に、滅菌した50mlの遠心管に各24時間の文化を注ぎます。遠心2,000 X gで10分間4℃で50mlチューブに。上清を捨て、そして15％グリセロールを含む最少培地5ml中に各ペレットを再懸濁します。 4ヶ月の最大のために-20℃で1.2 mlの滅菌クリオバイアルや店舗で10倍濃縮された酵母培養液0.5mlのアリコートを行います。
- Prepa標準曲線のための化学株式の比率とストレージ
- 無水エタノールで二回、すべてのガラス製品やヘラをすすぎ、汚染物質の痕跡を除去するために、使用前に乾燥させるために残します。
- 粉末計量キャビネット内のガラスバイアルに直接E2を計量し、無水エタノール中の体積濃度を調整します。 2×10 -7 M（54.48μgの/ L）の濃度に希釈します。シール蓋とストア4℃で（スパーク・フリー冷蔵庫の中）。
- アッセイプロデューサー
- 0日目に、増殖培地を準備します。最少培地45mlのボトル5 mlのグルコース溶液1.25 mLのL-アスパラギン酸溶液を0.5mlのビタミン溶液0.4 mlのL-スレオニン溶液、および125μlの硫酸銅（II）溶液を加えます。滅菌三角フラスコに成長培地を注ぎます。
- フラスコに（-20℃の保存から解凍）10倍濃縮ストックの125μlを添加して、オービタルシェーカー上で約24時間、28℃で接種したメディアをインキュベートします。
- 1日目に、滅菌96ウェルの「希釈プレート」を標識し、E2標準曲線と試験化学物質（複数可）/廃液の抽出物（複数可）（ 例えば 、EE2）の連続希釈液（エタノール中の100μlのボリューム）を作ります。
- ラベル滅菌96ウェルの光学平底マイクロタイター」アッセイプレート（複数可）」。すべてのプレート上で試験化学物質（複数可）/廃液の抽出物（複数可）の行に加え、空白（プラス/マイナス溶媒）およびE2標準曲線が含まれます。
- ピペットアッセイプレートの適切なウェルに各濃度の10μlの（E2、化学的または抽出物）。ピペットアッセイプレートの各「溶媒ブランク」ウェルにエタノール10μlの。乾燥するまで蒸発させるために蓋をオフにしてアッセイプレートを残します。
- 成長培地（〜50ミリリットル）のボトルを作成し、ボトルあたりクロロフェノールの0.5ミリリットル赤-β-D-ガラク（CPRG）ソリューションを追加します。プレートリーダーで620 nmにおける文化の濁度を測定することにより、24時間培養中の酵母細胞の密度を決定します。 Aを接種します24時間の培養物から4×10 7酵母細胞とssay培地。
- 無菌トラフに接種アッセイ培地を注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルアッセイプレートの各ウェルに接種し、アッセイ培地200μlを加えます。
- 96ウェルアッセイプレートに蓋を入れ、テープで縁をシール。タイタープレートシェーカー上で2分間激しくアッセイプレート（複数可）をシェイクし、自然換気暖房キャビネット内で32℃でインキュベートします。
- 2日目に、2分間、タイタープレートシェーカー上精力的にアッセイプレート（複数可）を振ります。 32℃のインキュベーターに戻ります。
- 4日目に、タイタープレートシェーカー上で2分間激しくアッセイプレート（複数可）を振ります。プレートリーダーを用いて（濁度）を540nm（CPRG〜575 nmのための最適な吸光度）の吸光度と620 nmでアッセイプレート（複数可）を読んで、その後約1時間放置し、プレート（複数可）のままにしておきます。室温でプレート（複数可）し、必要に応じて、後で読みのままにしておきます。
- 0日目に、増殖培地を準備します。最少培地45mlのボトル5 mlのグルコース溶液1.25 mLのL-アスパラギン酸溶液を0.5mlのビタミン溶液0.4 mlのL-スレオニン溶液、および125μlの硫酸銅（II）溶液を加えます。滅菌三角フラスコに成長培地を注ぎます。
- エストロゲン活性の計算<オール>
- - [サンプルまたは標準（E2）620 nmの吸光度 - 620 nmでのブランク吸光度]補正値=サンプルまたは540 nmでの標準（E2）の吸光度：下記の式を用いて濁度の正しいアッセイの測定値。 （コンタミネーションをチェックする）適切なブランクがプロットE2標準曲線8。
- 「エストラジオール同等物 'を算出するために補正されたサンプル（抽出物または化学的）を使用します。 /サンプルを補間E2同等の値に吸光度値を抽出するためにプロットされたE2標準曲線値と回帰式（3-パラメータ多項式または線形フィットに応じて）を使用します。使用濃度因子（ すなわち 、水抽出とエタノールの体積抽出物に再懸濁される）前抽出されたサンプルにエストロゲン活性を計算します。
男性ファットヘッドミノーにおけるインビボビテロジェニン誘導で使用してエストロゲン活性の4研究室ベースのアセスメント
- 男性のファットヘッドミノー（Pimephalesを使用しますpromelas）>第二次性徴を（表示する旧4ヶ月、 すなわち 、婚姻結節の開発と男性の性的決意を示す背fatpad）。
- 産卵活動を防止するために、事前のテストの開始に成熟した男性3週間（±3日）を分離。 3グラム/ Lの最大積載して、少なくとも2 45リットルのガラス水槽をセットアップします。テストのために健康な魚の十分な数を確保するために、100人の男性の最小値を使用します。
- テストで経験されるように、同一の環境条件の下で男性の魚を保つ（ すなわち 、25±1℃の水温および16：8時間の明：暗の光）。 すなわち 、少なくとも毎に6~8時間、95％の交換時期を確実にするために、各タンクに希釈水の流量を維持し、45 Lタンク330 ml /分。
- 試験装置および実験デザイン
- ワット1リットルあたりの魚の最大3グラムの荷重に対応するために、大きなガラスの水槽を使用してえー。 8成人男性（公称4.5グラムずつ）について、10-20 Lタンクを使用します。
- 各治療のために2つのレプリカのタンクを使用し、不要な視覚障害から各タンクを保護する（ すなわち、タンク間ラミネートカード画面を使用）。研究番号、暴露濃度と容器識別番号で各タンクを特定します。
- 流出廃水の研究のために
- 到着時に、直ちに10±1℃での貯蔵タンクに廃液を転送します。流出物の受領後2時間以内に流出物を投与開始します。
- 馴化容器に10℃の貯蔵タンクから蠕動ポンプを介して、流出物を供給。 18±2℃に順化容器内の廃液を加熱します。投薬/混合容器に順化容器から温排水をポンプしてから（魚を保持している）試験水槽へ。 25±1℃の温度に水槽を熱し。
- 化学投薬研究のため
- 粉末計量キャビネットに試験化学物質を秤量します。好ましくは溶媒を使用せずのddH 2 O中濃化学株式を準備します。
注意：溶剤は、試験化合物を可溶化するために必要とされる場合は、希釈水の制御に加えて、溶媒対照を使用しています。 - 混合容器/投与するために流量制御装置（複数可）を介して温度制御されたヘッダタンクからの希釈水を重力供給またはポンプ。ポンプは、混合容器/投薬に蠕動ポンプシステムを用いて化学株（複数可）を濃縮しました。所望の露光濃度を達成するために、水の流量（希釈水）（在庫薬品の）ポンプ速度を制御します。
注意：使用のシリコンチューブを混合容器/投薬から各試験容器に水/試験化学物質を供給すること。少なくとも24時間で75％容器の交換を提供するのに十分である流量20 Lタンク用すなわち、20ml /分を使用します。指定された公称値の±10％の流量を維持。
- 粉末計量キャビネットに試験化学物質を秤量します。好ましくは溶媒を使用せずのddH 2 O中濃化学株式を準備します。
- 魚2.5（±0.1）で新鮮に解凍凍結した大人のブラインシュリンプ（ アルテミア ）で一日二回フィードあたりのタンクあたりのグラムを養います。また、熱帯フレーク魚の餌の少量（2つの指のピンチ）で一日一回魚を食べます。各フィードの間の3時間の最小値のままにしておきます。
- （対照と比較して、良好な中等度または悪い、）摂食応答/動作を監視するために毎日送り記録しておいてください。任意の食べ残しや糞を除去するために、週2回以上（好ましくは毎日）タンクを吸い上げます。少なくとも週に一度あたりの試験容器の側面と底部を清掃してください。
- 毎週水サンプルを取ります（分析化学を介して）（酵母画面を介して）エストロゲン活性および化学組成を確認するために、各タンクからの。採水、抽出および分析の詳細については、セクション1-3を参照してください。
注：各実験について、用量応答をモニターするために希釈水コントロール（ネガティブコントロール）、陽性対照（E2またはEE2）を加えた流出物（100、50および25％）、少なくとも3つの希釈液または試験化学物質を使用します。新技術をテストしている場合は、治療の有無にかかわらず、化合物/流出物を使用する（処理なし例えば 、EE2、TAML /過酸化水素とEE2（H 2 O 2）治療12; 図1）。
- ワット1リットルあたりの魚の最大3グラムの荷重に対応するために、大きなガラスの水槽を使用してえー。 8成人男性（公称4.5グラムずつ）について、10-20 Lタンクを使用します。
TAML /過酸化水処理を用いて、17αエチニルエストラジオールの生態毒性の除去を決定するためのin vivoでのファットヘッドミノービテロジェニンバイオアッセイの実験デザインを表す図1.図。EXPセットアップerimentalは、それぞれが水の連続流を与えた8 11 Lのガラス水槽で構成されています。個々の化学原液と水（ろ過脱塩素化）を混合チャンバに配信されます。混合容器内（反応なし）公称濃度は2 ngの/ L EE2、80 nMのTAMLおよび0.16μgの/ LH 2 O 2です。化学原液（EE2、H 2 O 2とTAML）を調製し、反応が混合容器に開始するように別々に投与します。魚（タンクあたり8男性のファットヘッドミノー）は約45分の反応接触時間後の混合物（複数可）にさらされています。水のサンプルは、毎週暴露タンクから取られています。血漿サンプルは、試験開始時に、ベースライングループからのエストロゲンのバイオマーカーのビテロジェニン（VTG）を測定するために、ファットヘッドミノーから採取した、と暴露の21日後に他のすべての魚されています。特定の治療法は以下のとおりです。 '-C';ネガティブコントロール（希釈水のみ）、 '+'。 EE2のポジティブコントロール、'+ H'; EE2プラスH 2 O 2、 '+ T'; EE2プラスH 2 O 2プラスTAML。この図は、ミルズら。2015年12から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 試験手順
- 順応期間
- 各性的に成熟したオスの魚の湿重量（g）を測定し、各タンク（タンクあたり8人の男性）にランダムに割り当てます。
- 同じバッチから未割り当ての魚をキープし、同じ試験条件の下でそれらを維持します。物理的な損傷または7日間の馴化期間中の条件の欠如の兆候を示す任意の個人を置き換えるために、これらの魚を使用してください。各処理槽が完全にテスト条件に順応している8人の男性を持つ順応期間の終了時に確認してください。
- 同じBAからの追加8人の男性から「ベースライン」血漿サンプルを取りますオスの魚のTCH。セクション4.4と4.5でのビテロジェニン（VTG）分析法で採血方法に従ってください。
- 4.2.2または4.2.3で説明したように順応期間の後、21日間露光タンクに廃液または化学的投薬ストックを提供します。それぞれにモニタ死亡率、行動や魚の物理的な外観は、前の日の最初のフィードを毎日タンクを複製します。任意の異常行動やインシデントを記録します。
注：環境条件および供給速度は、（セクション4.2.4および4.2.5）魚の健康を維持することを確認します。
- 順応期間
- 21日間の曝露期間後の魚のサンプリング
- サンプリングの前に12時間は、魚の供給を停止します。
- 血液サンプルの採取のためのラベルのマイクロ遠心チューブは、アプロチニンの〜5μlの（プロテアーゼ阻害剤）を追加し、氷の上に置きます。
- 脱塩素水1L当たりMS222 500mgのを溶解することにより、MS222（麻酔薬）の500 mg / Lの溶液を作製（以前順化25±1℃に）。 1 M NaOHを用いてpHを7.4±0.4にMS222を中和します。
- バッファリングMS222にタンクから各魚を移動します。すべての蓋の動き（典型的には5±1分）の停止まで溶液中に保管してください。
- 測定と端末麻酔下フォーク長さ（mm）を記録。尻尾を切断すると、尾動脈（ 図2）から血液を収集するために、ヘパリン処理ヘマトクリット管を使用するように使い捨てメスを使用してください。慎重に前標識されたマイクロ遠心チューブに血液を分配し、氷上に保ちます。
- 採血直後に魚を殺します。循環および/または脳の破壊の永久停止により死亡を確認。測定し、総魚体重（最も近い0.01グラム）を記録し、必要に応じて組織を分析。
- 遠心分離機コレクションの2時間内の血液（4℃で5分間、7000×gで）。新しいラベルされた0.4ミリリットルのマイクロ浴槽にピペットを用いてプラズマ上清を移し氷の上でESとストア。血漿VTG濃度の分析の前に-80℃で遠心分離し、店舗の30分以内にドライアイスでプラズマを含むチューブをフリーズします。
男性のファットヘッドミノーを描いた図2.写真（Pimephalesのpromelas）、精巣の血漿採取と場所。21日間の曝露の終わりに、すべての魚は、血液サンプルを収集するために殺されるべきです。一度、この端末麻酔魚の長さ（フォーク長、ミリメートル）の下で迅速に尾動脈からの採血に続いて、測定されるべきであるフォト-A：赤い点線は尾切断（使い捨てメスの位置が尾を切断するために使用されるべきであることを示します）。 フォト-Bは、血液を収集するために使用されるヘパリン処理ヘマトクリット管を示しています。各魚は、その血液サンプルは、この場合、ヘッド全体を撮影した直後に殺されるべきボディ（ 写真-C）から切断されています。魚が殺された後、体腔内部器官を明らかにするために開放することができます。フォト-Cは、 例えば、ファットヘッドミノー、ゴキブリ、鯉など 、コイ科魚類の浮き袋（SB）に関連して精巣（生殖腺）の位置を示し、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- ファットヘッドミノーのために特別に設計された相同VTGの酵素免疫測定法（ELISA）キットを用いて、血漿VTG濃度を測定します。
- 製造業者のプロトコルに概説されているようVTG規格およびバッファを準備します。 5,000および1：血漿サンプル1:50 1を希釈500,000、製造者の指示に従ってVTG標準曲線の範囲内で測定値を得るために、二重にしてアッセイします。ビテロゲニン濃度を計算するために、メーカーのガイドラインに従ってください。
インビボでのビテロジェニンとローチにおけるインターセックス誘導（Rutilus rutilus） で使用したエストロゲン活性を軽減するために高度/小説下水処理技術の5分野のアセスメント
- 廃水処理プラントの排水口の下流に住む野生のローチのキャプチャ
注：gonochoristicとエストロゲン様内分泌かく乱作用に敏感であることが知られている使用ローチ（Rutilusのrutilus）または他の豊富な淡水または汽水魚種を、。- 状況13に応じて電気漁法、ネッティング、トラップまたは他の認識漁法を使用して魚を捕まえます。サンプリングのために研究室に戻って曝気タンク内の魚を運びます。
- 4.4.2で説明するようにマイクロ遠心チューブを準備します。 4.4.3で説明したようにバッファリングMS222を準備します。 4.4.4で詳述されるように魚を麻酔。
- ターミナル麻酔下での魚の長さと重量を測定します。
- ディスポを使用して、尾動脈から血液を採取クロテンヘパリン処理シリンジ。血液サンプル採取後、直ちに各魚を殺します。慎重に前標識されたマイクロ遠心チューブに血液を分配し、氷上に保ちます。ステップ4.4.7で説明したように、プラズマを準備してELISA（4.5）によりVTGを測定します。
- 鉗子は、各魚から2-3魚のスケールを除去し、個別に標識した小さな紙の封筒の中に置いて使用します。後で魚の年齢の決意と成長の分析のための乾燥した状態で室温で保存封筒。
- メスで開いた体腔内部器官を明らかにする。 （ 図2）のいずれかの側に位置して生殖腺に浮き袋を明らかにするために、腸を取り出します。慎重に細かい鼻ピンセットで対になった生殖腺を除去し、ガラスバイアルに配置します。固定液：1時10組織の割合でブアン固定液で生殖腺をカバーしています。
- 組織の大きさ（固定液は、時間あたり1ミリメートルで貫通する）に応じて6-24時間ブアンで組織を残します。固定したら、ブアン固定液のANを捨てます70％工業用変性アルコール（IMS）と交換してくださいdは。組織は、組織病理学（セクション5.3）のために処理されるまで、室温で固定した組織を保管してください。
- ゴキブリにおけるin vivoビテロジェニンと陰陽誘導を使用して、エストロゲン活性の分野基づく評価
- 実験計画と設定
注：in vivoでの作業開始のかなり前にタンクやパイロットプラントを設定します。システムへの魚の任意の添加前に3-4週間を流れるタンクを開始します。パラメータを維持することができることを確認するために定期的に水の流量、水質条件（pH、温度、溶存酸素など ）を監視します。- 「コントロール」の脱塩素水道水、標準処理された流出物（複数可）を受け取ることができると並行して流出物（複数可）を処理した先進パイロットプラント、でサイト上で大型タンク（ 例えば 、300-1,000 L）を構築します。タンクに空気ポンプ/エアレーターを取り付けます。少なくとも6タンクVを達成するために、水の流量を設定します一日あたりolume交換。
注：必ず戦車がよく絶縁され、過度の気温の変動を防止するために網掛けしていることを確認します。デザインタンクは、行動の変化（摂食の欠如、 など ）、病気や死亡の兆候魚の観察を可能にします。
- 「コントロール」の脱塩素水道水、標準処理された流出物（複数可）を受け取ることができると並行して流出物（複数可）を処理した先進パイロットプラント、でサイト上で大型タンク（ 例えば 、300-1,000 L）を構築します。タンクに空気ポンプ/エアレーターを取り付けます。少なくとも6タンクVを達成するために、水の流量を設定します一日あたりolume交換。
- 1時間各タンクに（養魚場から）ゴキブリの袋を浮遊して露光を開始します。徐々に水の温度になるまで袋に水槽の水を追加し、条件が周囲のです。そのタンクに魚をリリース。
- ペレット化した魚の餌（サイズ0.5から0.8）で毎日の大人のゴキブリをフィード。食べ残しの飼料に基づいて調整小さなペレット化（ペレットサイズ、100〜300）非エストロゲンフィード14自由摂取、で毎日少年ゴキブリを養います。毎日送り記録文書化摂食応答/行動をしてください（コントロールと比較して、中程度または悪い、良いです）。
- エストロゲン活性と化学組成を確認するために、各タンクから毎週水サンプルを取ります。セ水のサンプリングと分析方法の詳細については、電子セクション1-3。
- 実験計画と設定
- 魚の生殖腺15の病理組織学
- 慎重カッティングボード上のピンセットと場所で容器から（ステップ5.1.6および5.1.7に記載）を解剖し、固定された生殖腺を除去します。
- 3部（前部、中間および後方）に、各パート3〜5 mm厚の断面を切るから、各生殖腺をカットするミクロトーム刃を使用してください。慎重にラベルされたプラスチックバイオプシーカセットにすべての6つのピースを置き、 表4に記載されたタイミングを用いて組織プロセッサに配置します。
- ワックス埋め込む組織やロータリーミクロトーム（3-5ミクロン）のセクション。 （45℃に設定）、加熱プレート上で標識された生体接着コーティングされたガラススライドと場所のスライドに転送のセクションでは、24時間乾燥させます。
- 表5に詳述されたタイミングを使用して、手動または自動染色装置を使用して、スライドを染色する。染色された組織上の封入剤のドロップ、およびlを配置AY封入剤の上にガラスカバースリップは、組織を保護します。
- まず、体腔15に性別や添付ファイルのポイント数を決定するために、低倍率（10Xアイライン倍率に20X、 すなわち 2X目的、）で各スライドを調べます。各魚のための任意の異常に注意してください。
- 高倍率（100Xや400X）では、配偶子形成段階、異常および精巣組織中の卵母細胞の存在を評価するために、組織を調べます。 （ 表6参照）0（正常な男性組織）から7（100％卵巣組織）の範囲以下のグレーディングシステムを用いて、半陰陽の重症度6を記録します。
ステップ数 治療 目的 時間（時間） 1 70％IMS 脱水 3 2 90％IMS 脱水 2.5 3 95％IMS 脱水 1.5 4 100％IMS 脱水 1.5 5 100％IMS 脱水 1.5 6 100％IMS 脱水 1.5 7 100％IMS 脱水 1.5 8 組織学の洗浄剤 決済 1.5 9 組織学の洗浄剤 決済 1.5 10 組織学の洗浄剤 決済 1。5 11 ワックス ワックスの浸透 1.25 12 ワックス ワックスの浸透 1.25 20時間のTOTAL 組織病 理学のための組織を含浸ワックス表4.処理体制。組織は、自動組織プロセッサで処理されなければなりません。組織は、指定された期間のための詳細なソリューションに浸漬する必要があります。
無染色。 染色 目的 時間（分） 1 組織学のクリアエージェント ワックスを溶解します 15 2 水和 2 3 90％IMS 水和 2 4 70％IMS 水和 2 5 水道水（RUNNING） リンス 2 6 ヘマトキシリン 青いしみの細胞核 10 7 水道水（RUNNING） 過剰削除 10 8 酸性化IMS 脱塩素 20秒 9 水道水（RUNNING） リンス 20秒 10 LICO 3 塩 20秒 11 水道水（RUNNING） リンス 20秒 12 1％エオシン（水） 汚れ細胞質ピンク 20秒 13 水道水（RUNNING） 過剰削除 5 14 70％IMS 脱水 2 15 90％IMS 脱水 2 16 100％IMS 脱水 5 17 組織学のクリアエージェント IMS、結合剤を削除します 5 魚の生殖腺組織のヘマトキシリン及びエオシン（H＆E）染色表5.ソリューションおよび浸漬時間。スライドのallocのために、各浴に配置する必要がありますシーケンスの時間をated。組織のH＆E染色は、魚類生殖腺に対するエストロゲン排水廃液の発達や組織への影響を判断するために必要とされます。
スコア セクション説明 0 正常な雄の精巣 1 精巣組織に散在1-5卵母細胞（通常は単独）と多焦点卵精巣 2 多焦点卵精巣は、しばしば小さなクラスター中6-20卵母細胞は精巣組織に散在します 3 多焦点卵精巣、クラスタ内の21から50卵母細胞 4 > 50と<100卵母細胞。セクションは、通常は多焦点であり、テストのモザイクの外観を持っていますicularおよび卵巣組織。 5 > 100卵母細胞、通常、多焦点だけでなく、精巣組織から分離した卵巣や精巣組織の明確に識別ゾーンを有する焦点である可能性があります。 6 >セクションの生殖腺組織の50％が卵巣であると明確に上皮細胞と貪食組織によって精巣組織から分離されています。 7 セクションの生殖腺組織の100％が卵巣です。 表6.スコアリングシステムはゴキブリで半 陰陽の状態の重症度を評価すること。組織学的に生殖腺組織の準備スライドを光学顕微鏡下で検査しなければならない、20Xで、100Xおよび400X倍率は、異常および精巣組織中の卵母細胞の存在を評価します。このテーブルはJoblingから変更されています<em>のら。 2006年6。
Representative Results
廃水処理プロセスの改善の影響を理解したり、排出さ廃液の内分泌攪乱活動の除去の有効性に関して、既存のWWTPで三次処理などの機器を改造するために最も適切な技術を決定する試みだけでなく、キーの化学物質の測定を必要とします作品を入力するだけでなく、内分泌攪乱作用を有することができる分解生成物の分析を必要とするコンポーネント。国内の下水排水では、存在する最もエストロゲン様物質は、ステロイドホルモン、エストロン（E1）、17βエストラジオール（E2）と17αエチニルエストラジオール（EE2）5,8です。ステロイドエストロゲンは主に不活性なコンジュゲート16,17の混合物として身体から排泄されます。これらの結合型エストロゲンは、実質的に細菌の活動によって下水道に脱抱合され、さらに劣化がWWTPで発生します。脱抱合ステロイドは、AReは汚泥への吸着により、廃水流から除去または形成をもたらす二次処理中に生分解、まず変換副産物の、最終的に完全な無機化は、初期の活性成分の発生する可能性があります。流出ストリーム中のすべての個々の化合物の化学分析は、時間とコストがかかることは困難であろうと、試料中に存在する未知の活性成分をカバーしていないだろう。また、各成分のエストロゲン寄与の合計は、分析される化合物のサンプルの累積エストロゲン効力の指標を提供します。これは、変換プロセスが未知のエストロゲン様物質を生成したり、流入が工業起源であるリスクです。 in vivoおよびin vitro生態毒性のバイオアッセイで用いて化学分析を組み合わせることで、このような下水処理水の混合物中の未知のエストロゲン様成分の存在に対する解決策を提供します。このような酵母エストロゲンのScrなどのin vitroアッセイをEENは（YES）下水排水のエストロゲン活性を決定し、処理した試料8,18,19に活性成分を識別するために広く使用されてきました。しかし、in vivoでおよびin vitro試験での間の比較は、11の重要な内分泌かく乱効力の治療に対する新しいプロセスを総合的に評価することができ、化学的及び生態毒性試験のバッテリーを必要とします。
個々の処理プラントまたはプロセスは、廃水流からの活性化合物を除去するか否かの決意は、ほとんどの場合、LCMS（/ MS）またはGCMSを用いて行わ、サンプル抽出、濃縮及び分析の前に抽出物のクリーンアップに続く化学分析を用いて達成することができます（/ MS）法。化学分析から得られたデータは、個々の準拠を決定するために使用することができる無影響濃度（PNEC）20や環境基準を予測しなかっS（EQS）特定の個々の化合物の21、したがって、そのような方法は、規制コンプライアンスデータのために不可欠です。さらに、標的または非標的化学分析法は、全応答を提供する生物学的方法と比較して個々の化合物または異性体の同定および定量を可能にします。化学分析法は、したがって、個別の化合物の評価を満たすために、個々の処理プラントに基づいて、これらの排水処理の課題を解決するためになされることを可能にします。研究は、合成ホルモンの除去はEE2はあまり効果的である傾向があるが、従来の排水処理（ 例えば、活性汚泥プラント）は、天然のステロイドホルモンの除去に非常に有効であることができることを示しています。それらはPRED以下にEE2を除去するために、エンド・オブ・パイプ溶液として使用することができるようなオゾンのような技術を利用して高度な処理を使用してフィールド試験は、造粒活性炭（GAC）と膜は、高コストであるが、実証されていますicted効果レベルと検出限界以下に。 図3は、パイロットスケールの都市廃水処理プラントでGACを使用して、EE2の除去を示しています。パイプGAC処理の終了を使用して、地方自治体の廃水処理プラントでのパイロットスケールで行った研究はまた、 図4に見られるようにGAC以下エストロゲン効力の低下は、酵母エストロゲン画面（YES）を用いて測定を示します。
高度な三次治療後のエチニルエストラジオールの除去を示す、図3の例フィールドのデータ。（A）サンプルは、サンプルの保存のために説明した手順に従って、従来の（活性汚泥プラント）治療後のWWTPから収集されています。 （B）サンプルを、順相SPEを用いて妨害物質を除去するために、固相抽出、クリーンアップを使用して抽出されゲル浸透クロマトグラフィー。 （C）清浄な濃縮抽出物を低容量に濃縮し、MRMモードでの陰イオンエレクトロLCMS / MSを用いて分析します。結果は、同位体標識内部標準を使用して内部標準を用いて計算されます。図示の例では、EE2は0.1 ngの/ Lと環境に安全な濃度にGACとオゾン（O 3）を用いて除去されるの予測無影響レベル（PNEC）を超える濃度で流出物の最終ASPで存在している。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
サンプルのエストロゲン活性に関する黄色から赤色への色の変化を示す図4.酵母エストロゲン画面の写真（YES）アッセイプレート（A）。補正後の吸光度（540を示すYESアッセイプレートから作成されたプロットエストラジオール標準（B）のNM）は、活性汚泥処理流出物（ASP）と粒状活性炭（GAC）処理された廃水流出物のサンプル（C）は、各サンプルを二重に試験しました。 ASPとGACの流出物を抽出し、セクション1に概説SPE法を用いて濃縮した。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
オゾン処理は、従来、処理された下水処理場からステロイドエストロゲンおよびエストロゲン活性の除去にも効果的です。オゾンは、廃水試料中の有機汚染物質の広い範囲、溶解有機物質を酸化することができ、消毒特性を提供します。オゾン処理の有効性は、pH、有機物の量とオゾンの適用量として水の特性に依存します。不十分従来の治療によって除去されるエストロゲンは、することができます0.8および2 mgのO 3 / mgのDOCの用量で廃水から除去します。オゾンは、EDCの数の内訳に適用可能なオゾンを作る電子リッチな部位（不飽和炭素 - 炭素結合、芳香族アルコールを含む芳香族化合物）と反応する選択的酸化剤、です。しかし、個々の化合物の除去は、必ずしも元の化合物の完全な無機化にはつながりません。オゾン化の後、有機物質が副生成物、低分子量、例えば、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、ケト酸、及び臭素化合物などの化合物の極性のクラスの数を含む中間体または形質転換の酸化を生成する形質転換することができます。例としては、臭素酸塩、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒドおよびカルボン酸が挙げられます。 インビボでの使用およびインビトロのバイオアッセイでは、オゾンが部分的にのみ、いくつかの化学物質を酸化するが、得られた主要な変換産物が低いestrogを有することが示されましたENIC効力ひいてはエストロゲン活性の高い除去に適切な用量の結果でオゾンの応用。
廃水の追加の治療の主な利点の1つは、水を受け雄魚の女性化の減少です。低受精率3につながることができます悪影響。魚を用いたin vivo研究（ 例えば 、ゴキブリやファットヘッドミノー）（ 図5に見られるように、例えば ）オスの魚の精巣で排水ショー女性の生殖細胞や卵母細胞に曝露しました。インターセックスや男性のVTGが存在しないか、または大幅にそのようなGAC 7やオゾン22などの高度な治療後の魚が縮小されています。これらの研究は、しかし、これは、生成流出物の毒性に対処していない、オゾン処理の間に生成変態生成物はエストロゲン様ではないことを示しています。この問題は、例えば、他の研究でマグデブルクらの研究に対処されてきました。 26 - TAML活性剤は、廃水12,24有機micropollutantsの過酸化水素の酸化を触媒するために開発されています。 TAMLは効果的に純粋な実験室水にだけでなく、自治体の下水処理施設からの排水にし、12スパイク尿サンプル中EE2および他のステロイドエストロゲンを低下させ、H 2 O 2と活性化剤。 TAML / H 2 O 2処理がEE2除去含む高ステロイドエストロゲンの除去を提供し、実質的YESバイオアッセイ及び物質を用いてインビトロで測定したエストロゲン活性を低下させる実験室での研究を示していますLLY VTGバイオアッセイ（ 図1および図6）を用いて測定し 、in vivoでの魚の女性化が低下します。 
フィールドベースの評価における廃水にさらさ図正常な男性（A）および成人ローチから半陰陽（B、C）生殖腺の5顕微鏡写真（Rutilus rutilus）。顕微鏡写真-Aは、通常の男性の精巣の組織切片を示しています。顕微鏡写真-B及び-C、6ヶ月間活性汚泥プロセス廃水流出物にさらされた、半陰陽男性の魚の組織切片を示しています。矢印は、精巣組織内に存在する卵母細胞を示しています。スケールバーは、それぞれの顕微鏡写真では100μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
ベースラインと暴露した雄の魚（B）図6.平均EE2濃度と処理および未処理タンクの水（A）中のエストロゲン活性および血漿ビテロジェニン。A）EE2濃度（ngの/ L、ダークブルーバーは）LCMS / MSにより測定しました。男性のファットヘッドミノーでのin vitroの酵母エストロゲン画面（YES）。B）プラズマビテロジェニン（ngの/ mlの、水色のバー）濃度は、定量的酵素を介して測定された経由して、エストロゲン活性（EE2同等ngの/ L、暗緑色のバー）を測定しました免疫吸着検定法（ELISA）を - 結合。 <0.03 ngの/ L EE2（ すなわち、検出限界（LOD）未満）として報告EE2化学分析結果は、半分のLOD（ すなわち、を有するように処理しました。 2 O 2 + TAML、EE2 + H 2 O 2、及びEE2のみ。グラフAにおけるエラーバーは平均の標準誤差を表し、グラフBにおけるエラーバーは標準偏差を表します。グラフ-Bでバーの上の文字は、統計的な類似性を表します。この図は、ミルズらから変更されている。12 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
廃水処理プラントは、EDCと地表水汚染の主要経路です。 、従来の高度なまたは新興の処理プロセスの内分泌活性の除去の有効性の評価は、化学的および生物学的アッセイの様々なを使用する必要があります。非標的および標的分析を用いて化学分析は、個々の成分の除去の有効性に関する定性的または定量的なデータを提供し、したがって、評価が環境基準に対して行わまたは分析の化合物または化合物の混合物のための効果濃度を予測しないことを可能にします。
治療後の物質の不完全な鉱化作用に起因する変換生成物の生成と廃水中の未知の生物学的に活性な成分の存在だけでは、化学試験の有用性を制限します。 in vivoおよび分析化学者との併用のin vitroバイオアッセイでの組み合わせRYスクリーニングは、新興の排水処理プロセスによるEDCの除去の有効性を決定するための有用なツールボックスを提供します。伝統的な水質パラメータおよび他の毒性学的および微生物学的エンドポイントと一緒に行ったこれらのテストは、現在および新興の排水処理技術の重要な評価を可能にします。
ベースのエストロゲン画面（ 例えば 、YES）は、化学物質や廃水のエストロゲン効力を決定するためのin vitroアッセイだけではないという酵母を注意することが重要です。安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞に基づくアッセイの数は、例えば、ER-CALUX 27およびヒト乳癌細胞又は子宮頸部腫瘍細胞と28hERα-たHeLa-9903はそれぞれ、あまりにも開発されてきました。 YESが類似哺乳類細胞ベースのアッセイと比較され、再現性の同等の高いレベルを有することが見出された、真陽性および真陰性のエストロゲン識別率29、althoぐふ時々 27わずかに感受性が低いことが考えられています。酵母ベースのレポーターアッセイの1つの利点は、それほど厳しくバイオ制御対策や滅菌技術を必要とする哺乳動物細胞培養での豊富な経験のないラボでYESをより容易に（YES必要に応じて作業台の上に行うことができます）、採用することができるということです。ヒトの細胞に基づくアッセイはまた、YESで使用される標準的なインキュベーターとマイクロプレートリーダーに比べてCO 2インキュベーターとルミノメーターを必要とします。業種を強調-二つの酵母ベースのエストロゲンレポーターアッセイ（YES、 サッカロマイセス・セレビシエおよびA-YES、Arxulaのadeninivorans）は、現在、ISO 19040「水のエストロゲンポテンシャルの決意と排水水質」の検証のための研究室間のコースを受けていますこれらの技術への関心。
潜在的な汚染を含んで記載されている方法の多くの制限があります。フィールドや実験室環境からまたはヒトの汚染（ 例えば、可塑剤、界面活性剤、パーソナルケア製品）によって発信エストロゲン様物質とサンプリング、試料保存および分析中のサンプル。 YESアッセイ（または他の細胞ベースのレポーターアッセイ）における汚染のこのタイプは、バックグラウンドを上昇し、アッセイの使用に影響を与えます。ペットボトルに格納された水サンプルまたは溶媒が簡単に偽陽性を引き起こす可能性があります。 LCMS / MSとYESアッセイの両方が検出可能なレベルにエストロゲンを濃縮するためにSPEを必要とする偽陰性も懸念されています。マトリックスは、SPE吸着剤と溶出溶媒の選択は、抽出効率溶出化合物の種類に影響を与えることができます。高極性及び塩基性化合物は、難吸着剤によって保持されるように、このプロトコールに記載された条件を使用して抽出するためのC18 SPEカートリッジを使用して、負のバイアスを生成することができます。また、このプロトコルは、メタンから溶出YESの溶離液の再構成を必要としますオールは、揮発性化合物の損失をもたらす出資者の窒素を乾燥するまで蒸発によりエタノールへ。その結果、プロトコルは、試験した試料の過小評価エストロゲン活性を提供することができます。彼らは、抽出されていないか、またはそれらが蒸発により失われるため、未知または予期しない化合物は、見逃される可能性があるとして、YESアッセイを検討する際にこれらの制限は特に重要です。また、LCMS / MS技術は、標識された内部標準の使用は回復のために補正することができます。このアプローチはYESアッセイで使用することができません。
流出物のin vivo試験の重大な制限は、in vitroの方法に比べて評価のために必要とされる高コストと時間が含まれます。現在、エストロゲン活性を検出するために魚の胚試験の使用が制限されます。しかし、将来のアプリケーションを持っている可能性があり、魚の胚30を 、輝くエストロゲン応答遺伝子導入を生産するといくつかの成功がありました。このprotocで使用ファットヘッドミノー（オール）一般的な実験の種であり、男性の魚でVTGの誘導は、エストロゲン暴露と流出廃水のエストロゲン22または他のエストロゲン様化合物または混合物31の定量化可能な測定値の十分に立証されたバイオマーカーです。内分泌かく乱化学物質のためのOECDテストガイドラインは、VTGは、すべての3種におけるエストロゲン暴露の敏感なバイオマーカーであることで、大人のファットヘッドミノー、メダカとゼブラフィッシュ32,33を使用して検証されています。しかし、VTG誘導は直接ひどく陰陽ゴキブリ3に見られるように、生殖障害に相関し、したがって、排水曝露の生態影響しません。一方、ゴキブリは、それらの大きなサイズ、長い世代時間（2〜3年は、性的成熟に達するために）、生殖スタイルに生態毒性の研究のための古典的な「実験室の種」ではありません。グループ産卵（繁殖）が中以外（年に一度行われ、雌から雄性を識別するための難しさ産卵期）。しかし、この通常gonochoristic種は非常にうまくによるエストロゲン排水廃液の下流、オスの魚は彼らの内分泌学に（ 例えば 、女性特有の彼らの血中ビテロゲニンの存在）および組織病 理学（ovotestisの複数形の摂動を示した発見に、英国で研究されています-精巣および/ または雌の生殖管）5,6に卵を開発。したがって、これらのプロトコルの将来の応用として、ローチ（または類似種）は排水の質（および減少エストロゲン）に真の改善が進んで処理された排水を受ける河川に見られているかどうかを示すために有用な野生センチネル種である可能性があります。彼らはまた、パイロット規模プラント7の技術的改良の流出物を監視するために配管システムの端部に用いることができます。 生体内排水評価でで使用する種検討する場合に比べて、実験室の種を使用して、比較的迅速かつ制御されたテストの間にトレードオフが存在します長いフィールド基づいていますが、在来種を使用してテストし、より環境に関連します。しかし、in vivoでの評価において 、このようなコスト高であり、唯一の化学分析およびin vitroアッセイを使用して評価を次のテストの最終セットとして考慮されるべきです。
記載されたプロトコル内の重要なステップは、準備とサンプルやガラス製品の取り扱いを含むプラスチックやとサンプルの接触を制限するなどの環境汚染物質からのサンプルの汚染を避けるために（ すなわち、ボトルやサンプリング装置は、適切な界面活性洗浄剤で前処理する必要があります）偽陽性を生成することができる他の材料。水槽や魚露光システムを設計し、構築するとき、これは同様に重要です。理想的には水槽（住宅ストック及びエクスポージャーの間）は、最小限の汚染リスクが低い吸着32を有する材料から構築されるべきです。ステンレス鋼は、流出物または水保持タンクに使用することができます。ガラス構造のタンクを水槽に好適であるのに対し、（これはまた、魚の容易観察を提供するように）。低グレードのプラスチックパイプまたはチューブの使用は、32を避けるべきである、PVC 34とABS 'が適切に味付け」の場合に使用することができ、 すなわち、使用前に少なくとも12時間、希釈水を実行中の任意の汚染物を浸出するために放置しました。医療グレードのシリコンチューブはタンクに化学薬品や排水/希釈水の蠕動ポンプの送達のために、私たちの施設で正常に使用されています。だけでなく、水泳システムの構築と運営にエストロゲン汚染を考えると、魚の食生活を考えることも重要です。多くの可否魚食品は、魚のエストロゲンであることが見出されています。したがって、以前の研究のこれらのタイプでそれらを使用する（ベレスフォードら 14を参照してください、酵母エストロゲン画面で、 例えば ）活性のために任意の食品をテストすることが重要です。
トラブルシューティング品質保証サンプルは、複数の旅行、研究室を含む、溶媒ブランクは偽陽性と偽陰性の結果を排除するためにポジティブコントロールと実際のサンプルと一緒に分析している場合は簡略化されて記載された化学分析YESまたはアッセイプロトコールの。陽性（ 例えば 、EE2）と負（希釈水のみ）コントロールも常に（期待生物バイオマーカーまたはエンドポイント（ すなわち 、VTGまたは組織病 理学）の感度を確認し、任意の予想外の汚染を検出することができるようにインビボアッセイにおいて使用されるべきです例えば、実験のセットアップ、ダイエット、または希釈水）から。プロトコル内の任意の変更は、任意の調査を実施する前に検証する必要があります。
WWTP流出液を経由して環境に入るエストロゲン化合物の規制強化で、より効果的な排水処理技術を開発する必要があること心に描くです。この原稿賛辞で説明するテストのバッテリー生態毒性および化学的評価試験は、通常、廃水処理工場排水放電に適用されます。そのため、テストの総合的なバッテリーのこのタイプの将来のアプリケーションは、特定の規制エストロゲン様化学物質および全体的な生物学的活性の両方を除去するための最良の方法を考慮し、最も生態学的に安全な設計を実現するために、排水技術開発者、およびプラントオペレータを有効にする必要があります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wellwash Versa plate washer | Thermo Scientific | 5165010 | |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax 340PC | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | 37 °C incubation required for carp assay |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Icemaker | Scotsman | AF80 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| ELISA kits | Biosense Laboratories | V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp) |
|
| Microfuge tubes, 0.5 ml | Alpha labs | LW2372 | |
| Microfuge tubes, 1.5 ml | Alpha labs | LW2375 | |
| Sulphuric acid, 95-98% | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Histology | |||
| Tissue processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Wax dispenser | Thermo Scientific Raymond Lamb | E66HC | |
| Metal embedding mold | Leica Biosystems | Various | |
| Hot plate | Thermo Scientific Shandon | 3120063 | |
| Cold plate (EG1150 C) | Leica Biosystems | 14038838037 | |
| Heated forceps (EG F) | Leica Biosystems | 14038835824 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2235 | |
| Paraffin section floatation bath | Electrothermal | MH8517 | |
| Slide drying bench | Electrothermal | MH6616 | |
| Stainmate automated stainer | Thermo Scientific Shandon | E103/S10L | |
| Cassettes, Histosette II, biopsy | Simport | M493 | |
| Paraffin wax | Thermo Scientific Raymond Lamb | W1 | |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | |
| IMS (ethanol mix), IDA99 | Tennants | ID440 | |
| Polysine adhesion slides | Thermo Scientific Gerhard Menzel | J2800AMNZ | |
| Cover slips, 22x50 mm | VWR | 631-0137 | |
| Histomount | National Diagnostics | HS-103 | |
| Haematoxylin Harris GURR | VWR | 351945S | |
| Eosin, 1%, aqueous | Pyramid Inovation | S20007-E | |
| Fisherbrand slide boxes | Fisher Scientific | 11701486 | |
| Microtome blades, MB35 | Thermo Scientific Shandon | 3050835 | |
| Bouin’s solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Yeast screen | |||
| Flow cabinet | Labcaire Systems Ltd | SC12R | |
| Cooled incubator | LMS Cooled Incubator | 303 | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | |
| Shaker | Grant | PSU-10i | |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Plate shaker | Heidolph Titramax 100 | 544-11200-00 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| 12-channel pipette, electronic | Sartorius | 735441 | |
| 96-well flat-bottom microplates | MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt |
76-232-05 260860 82.1581.001 |
We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds |
| HPLC grade water | Rathburn | RH1020 | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Sigma-Aldrich | P-5655 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A-2939 | |
| Potassium hydroxide, pellets | Sigma-Aldrich | P-1767 | |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Iron(III) sulfate | Sigma-Aldrich | 307718 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L-8912 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H-6034 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A-2786 | |
| L-Argenine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | A-6969 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M-5308 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T-8566 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I-7403 | |
| L-Lysine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | L-8662 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P-5482 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G-8415 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V-0513 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | T-1270 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P-5669 | |
| D-Pantothenic acid, hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P-5155 | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I-5125 | |
| D-Biotin | Sigma-Aldrich | B-4639 | |
| D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers | Sigma-Aldrich | G-7021 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A-4534 | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T-8441 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 10884308001 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G-2025 | |
| 17 β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E-8875 | |
| Steroids | |||
| Acetone | Rathburn | ||
| Acetonitrile | Rathburn | ||
| Ammonia solution | Rathburn | ||
| Ethylacetate | Rathburn | ||
| Copper(II) nitrate | Sigma-Aldrich | ||
| Acetone | Rathburn | ||
| Dichloromethane | Rathburn | ||
| 2,4,16,16-d4-17β-estradiol | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-estrone | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol | CDN Isotopes | ||
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Estrone | Sigma-Aldrich | ||
| 17α-ethynyl oestradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Hexane | Rathburn | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | ||
| Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Fish study | |||
| orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 | Watson Marlow | 982.0063.000 | |
| straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 | Watson Marlow | 999.2008.000 | |
| pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m | Watson Marlow | 913.A008.016 | |
| 200 series multi-channel persitaltic pump | Watson Marlow | 205CA | |
| Silicone tubing x 15 m (dosing tanks) | VWR | SFM1-3250 | |
| silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow) | VWR | SFM1-5450 | |
| 2.5 L glass winchester pk 4 | Fisher Scienctific | BTF-505-050B | |
| magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10 | Fisher Scienctific | FB55595 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
| 17α-Ethynylestradiol | Sigma Aldrich | E4876-100MG | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| SPE | |||
| 1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4 | Sigma Aldrich | 57276 | |
| disposable liners for manifold | Sigma Aldrich | 57059 | |
| filtration tubes without frits 6 ml pk 30 | Sigma Aldrich | 57242 | |
| reservior adaptors pk 12 | Sigma Aldrich | 57020-U | |
| stainless steel weight for manifold pk 4 | Sigma Aldrich | 57278 | |
| male Luer plug for manifold pk 12 | Sigma Aldrich | 504351 | |
| SPE Vacuum Manifold | Sigma Aldrich | 57265 | |
| stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 | Waters | WAT054806 | |
| Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50 | Waters | WAT020515 | |
| Methanol HPLC grade 2.5 L | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| 7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399 | Fisher Scientific | TUL-520-031K | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump | Camlab | 1136915 |
References
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