Summary
Vi simulerade en Precambrian ferruginous marin upwelling system i en laboratorieskala vertikal genomströmnings kolonn. Målet var att förstå hur geokemiska profiler av O 2 och Fe (II) utvecklas som cyanobakterier producerar O2. Resultaten visar att upprätta en chemocline grund av Fe (II) oxidation av fotosyntetiskt producerat O2.
Abstract
En konventionell koncept för avsättning av vissa prekambriska bandad järnmalm (BIF) utgår från antagandet att ferrojärn [Fe (II)] uppvällning från hydrotermiska källor i den prekambriska havet oxiderades molekylärt syre [O2] produceras av cyanobakterier. De äldsta formationer av bandad järnmalm, överförs före den stora Oxidation Event (GOE) på ca 2,4 miljarder år (Gy) sedan, kan ha bildats genom direkt oxidation av Fe (II) genom anoxygenic photoferrotrophs under anoxiska förhållanden. Som en metod för att testa de geokemiska och mineralogiska mönster som utvecklar under olika biologiska scenarier utformade vi en 40 cm lång vertikal genomströmning kolonn för att simulera en anoxisk Fe (II) -rika marina upwelling system som är representativt för en gammal havet på en laboratorieskala . Cylindern var packad med en porös glaspärla matris för att stabilisera de geokemiska gradienter, och vätskeprover för järn kvantifiering kunde tas i hela vattenmassan. Upplöst syre vardetekteras icke-invasivt via optodes från utsidan. Resultat från biotiska experiment som involverade uppvällning flöden av Fe (II) från botten, en distinkt ljus gradient uppifrån, och cyanobakterier närvarande i vattnet, visar tydliga bevis för bildningen av Fe (III) mineral fällningar och utveckling av en chemocline mellan Fe (II) och O 2. Den här kolumnen ger oss möjlighet att testa hypoteser för bildandet av formationer av bandad järnmalm genom att odla cyanobakterier (och i framtiden photoferrotrophs) under simulerade marina prekambriska förhållanden. Dessutom hypotes vi att vår kolumn koncept möjliggör simulering av olika kemiska och fysiska miljöer - däribland grunda marina eller lakustrina sediment.
Introduction
Den Precambrian (4,6 till 0,541 Gy sedan) atmosfär upplevt en gradvis uppbyggnad av fotosyntetiskt producerat syre (O 2), kanske avbryts av stegvisa förändringar i den så kallade "Great Oxidation Event" (GOE) till cirka 2,4 Gy sedan, och igen i neoproterozoikum (1-0,541 Gy sedan) som atmosfärisk O2 närmade moderna nivå 1. Cyanobakterier är de evolutionära resterna av de första organismer som kan syrehaltig fotosyntes två. Geokemiska bevis och modelleringsstudier stödja den roll grunda kustmiljöer hyser aktiva samhällen av cyanobakterier eller organismer som kan syrehaltig fotosyntes eller syrehaltig fotoautotrof genererar lokala syre oaser i ytan havet nedanför en övervägande anoxisk atmosfär 3-5.
Avsättningen av bandad järnmalm (formationer av bandad järnmalm) från havsvatten igenom prekambriska punkter till järn (II) (Fe (II)) som en viktig geokemisk constituent av havsvatten, åtminstone lokalt, under deras deponering. Några av de största formationer av bandad järnmalm är djupt vatten insättningar, bildar av kontinentalsockeln och lutning. Mängden Fe deponeras är oförenligt från en massbalanssynpunkt med övervägande kontinentala (dvs vittring) källa. Därför är mycket av den Fe måste ha lämnats från hydrotermiska förändring av mafic eller ultramafic havsbotten skorpa 6. Uppskattningar av graden av Fe deponerade på utsidan av kustmiljöer är förenliga med Fe (II) tillförs ytan havet via uppvällning 7. För Fe att transporteras i uppvällning strömmar, måste ha varit närvarande i den reducerade, mobil formen - som Fe (II). Den genomsnittliga oxidationstillståndet för Fe bevarade i BIF är 2,4 8 och det är allmänt trott att BIF bevara Fe deponerats som Fe (III), som bildas när uppvällande Fe (II) oxiderades, eventuellt genom syre. Därför undersöker potentiella Fe (II) oxidation mekanismer längs sluttningen environmennts är viktigt att förstå hur BIF bildas. Dessutom har förfinat geokemisk karakterisering av marina sediment upptäckt att järnhaltig förhållanden, där Fe (II) var närvarande i en anoxisk vattenpelare, var en ihållande inslag i haven hela prekambrisk, och får inte ha begränsats till bara tid och plats där BIF deponerades 9. Därför, för åtminstone två miljarder år av jordens historia, redox gränssnitt mellan Fe (II) och O2 i de grunda haven sannolikt vanligt.
Ett flertal studier utnyttja moderna webbplatser som är kemiska och / eller biologiska analoger av olika funktioner i Precambrian havet. Ett bra exempel är järnhaltig sjöar där Fe (II) är stabil och förekommer i solbelysta ytvatten medan fotosyntetisk aktivitet (bland annat genom att cyanobakterier) upptäcktes 10-13. Resultaten av dessa studier ger inblick i de geokemiska och mikrobiella egenskaper hos en oxisk att anoxiska / ferruginous chemocline. Men dessa platser är i allmänhet fysiskt stratifierat med lite vertikal blandning 14, snarare än de kemiska gränssnitt som förekommer i ett upwelling system och tros stödja de mest syreproduktionen i Precambrian tid 4.
En naturlig analog till undersöka utvecklingen av en marin syre oas under en syrefri atmosfär och vid en Fe (II) -rik upwelling systemet i solbelyst yta vattenpelare är inte tillgänglig på den moderna Jorden. Därför behövs ett laboratoriesystem som kan simulera en ferruginous upwelling zon och även stödja tillväxten av cyanobakterier och photoferrotrophs. Förståelsen och identifiering av mikrobiella processer och deras samspel med en upwelling vattenbaserat medium som representerar Precambrian havsvatten främjar förståelse och kan komplettera den information de fått från berget rekord för att till fullo förstå den distinkta biogeokemiska processer gamla jorden. Mot detta syfte hade en laboratorieskala kolonn utformad i vilken Fe (II) -rika havsvatten medium (pH neutral) pumpades in i botten av kolonnen, och pumpas ut från toppen. Belysning tillhandahölls i toppen för att skapa en 4 cm bred "fotiska zon" som stödde tillväxten av cyanobakterier i topp 3 cm. Naturliga miljöer är generellt skiktad och stabiliseras genom fysikalisk-kemiska gradienter, som salthalt eller temperatur. För att stabilisera vattenmassan på en laboratorieskala, kolonnen cylinder packad med en porös glaspärla matris som hjälpte till att upprätthålla inrättandet av geokemiska mönster som utvecklats under experimentet. En kontinuerlig N 2 / CO 2 gasflödet applicerades för att spola det övre utrymmet av kolonnen för att bibehålla en anoxisk atmosfär reflekterande av en ocean före GOE 15. Efter en konstant flöde av Fe (II) bildades, var cyanobakterier inokulerades genom hela kolonnen, och deras growth övervakades av celltal på prov avlägsnas genom provtagningsportar. Syre övervakades in situ genom att placera syrekänsliga optode folier på den inre väggen av pelaren cylindern och mätningar gjordes med en optisk fiber från utanför kolonnen. Vattenbaserad Fe artbildning kvantifierades genom att avlägsna prover från djupupplöst horisontella provtagningsportar och analyseras med FerroZine metoden. De abiotiska kontrollexperiment och resultat visar proof-of-concept - att i laboratorieskala analog av den gamla vattenpelaren, hålls i isolering från atmosfären, kan uppnås. Cyanobakterier växte och producerade syre, och reaktionerna mellan Fe (II) och syre var upplösningen. Häri är metoden för konstruktion, beredning, montering, utförande, och provtagning av en sådan kolonn presenteras tillsammans med resultaten från en 84 h körning av kolonnen medan ympades med den marina cyanobakterien Synechococcus sp. PCC 7002.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av odlingsmediet
Obs: Information om den utrustning som behövs, kemikalier och tillbehör för framställning av odlingsmediet anges i tabell 1 Italic alfanumeriska koder inom parentes avser den utrustning som specificeras i tabell 2 och visas i figur 1..
- Förbered 5 L Marine fotoautotrof (MP) medium (hädanefter som "medium") efter protokollet av Wu et al. 16. Justera pH till 6,8 med hjälp av syrefritt och steril 1 M HCI eller 0,5 M NaCOs 3. Som källa för Fe (II), tillsätt 3,5 ml av en 1 M anoxiska och steril FeCl2-lösning för att uppnå en slutlig Fe (II) -koncentration av 500 ^ M efter filtrering mediet lösning i nästa steg.
- Lagra substratet lösningen vid 5 ° C under 48 h, för att fälla ut Fe (II) karbonat och fosfat mineraler. Fe (II) addition och Fe mineral nederbörd resulterar i en pH förändring, därför justera pH tillbaka till 6,8. Filtrera mediet i en anoxisk (100% N 2) handskfacket genom ett 0,22 | im filterenhet. Dispensera filtrerade mediet i en steril 5 L glasflaska (E.'1) inuti en handskbox, och locket med en steril propp av butylgummi.
- Spola topputrymmet av mediet flaskan med N2 / CO2 (vol / vol, 90/10) genom att sätta in en engångsnål som är ansluten till gasledningen in i proppen, och en andra nål som fungerar som en ventil. Se till att ändra huvudutrymmesvolymen 10 gånger. Till exempel, med en konstant gasflöde av 10 ml / sek, spola huvudutrymmesvolymen 50 ml under minst 50 sek (jämför Hungate & Macy 17).
- Täck mediet flaskan (E) som är nu klar att användas med aluminiumfolie och förvara vid rumstemperatur under mörka förhållanden för att förhindra fotooxidation av Fe (II). Låt 3 dagar för medel beredning.
2. Beredning av kultur
"> Obs!.. Kulturen i Synechococcus sp PCC 7002 som används i kolumnen experimentet beskrivs som encelliga marina photoheterotrophic cyanobakterier genus 18 Det tillhandahölls av Dr. M. Eisenhut (Institutet för växtbiokemi, University of Düsseldorf, Tyskland) . för den aktuella studien stamkulturen odlades på anoxisk MP medium utan ytterligare Fe (II).- Bered 100 ml MP-medium efter protokollet av et al. Wu 16 men ersätter järnklorid med 1 ml / L jämammoniumcitrat vid 6 mg / ml.
- Under syrefria förhållanden (handskfack, 100% N2), fördela mediet i en 120 ml steril serumflaska, mössa med en steril butylgummipropp och krusning med ett aluminiumlock. Ändra det övre utrymmet till N2 / CO2 (vol / vol, 90/10) (jämför Hungate & Macy 17) och inokulera med 5% av stamkulturen. Därefter lagra kulturen i en ljus inkubator vid 25 ° C och 600 Lux från en Tungsten glödlampa.
- Sedan Synechococcus sp. PCC 7002 är ljuskänsliga, efter överföring, täcka serumflaska med ett tunt pappershandduk för första 24 tim inuti ljus inkubator. Tillåta odlingen att växa under 6-8 dagar. Fotosyntetisk aktivitet kommer att resultera i oxidation av Fe (II) och Fe (II) kommer inte att vara statisk för tidsskalan av cellulär tillväxt, därför överföra odlingen efter 7 dagar för att upprätthålla Fe (II) i mediet och cellerna anpassas till Fe (II).
- Övervaka celldensiteten genom att ta prover för optisk densitet (OD) mätningar: Celldensiteten (celler / ml) av kulturen kan bestämmas via absorbansen hos provet cellsuspensionen i ett foto-spektrometer vid en våglängd av 750 nm 19. Ett linjärt förhållande mellan OD 750 och direkta mikroskopiska cellräkningar av en kultur i logfas avgör den absoluta celltätheten 20.
- Så snart som en celltäthet av 10 8 celler / ml uppnås,linda serumflaska med aluminiumfolie för att stoppa syreproduktionen från fotosyntesen.
- Ta bort O 2 i cellsuspensionen med hjälp av en 0,22 | im sterilt sprutfilter fäst till en lång (100 mm) engångsnål införd i det flytande mediet. Spola huvudutrymmet och bubbla kulturen med N2 / CO2 under 5 min (jämför Hungate & Macy 17). Hålla provet i mörker tills inokulering in i kolonnen.
3. Framställning av artiklar och enskilda delar för försöksuppställningen
Obs: Information om den utrustning som behövs för den experimentella set-up, kvantiteterna och specifikationer som anges i tabell 2. Delar av de objekt som kommer att användas för den experimentella set-up bereds i förväg och är individuellt märkta med en enda bokstav (AG), som anges i tabell 2 och visas närbilder i figur 1 liksom. Italic alfanumeriska koder inom parentes i protokollet hänvisar till den utrustning som specificeras i tabell 2 och visas i figur 1.
- För att förbereda provtagningsportar (D) för kolumnen, stänger portarna med åtsittande butylgummiproppar (A.3). Sätt en nål av rostfritt stål (D.) i butylgummipropp. Se till att nålspetsen är i mitten av kolonnen.
- Anslut nålen till en gummislang (D.2) och försegla samband med en värmekrympslang (D.3). Anslut den andra änden av röret till ett litet Luer lås rörförbindning ( 'D.5), försegla samband med ett värmekrympbart rör (D.3) och täcka röret uttag med ett lämpligt plastlock (D.6) .
Obs! Beroende på det önskade antalet provtagningsportar är det nödvändigt att tillhandahålla en huvudport med olika provtagningsportar - therefoåter sätta nålar av rostfritt stål (D.1) i en sned vinkel i butylgummipropp.
- Anslut nålen till en gummislang (D.2) och försegla samband med en värmekrympslang (D.3). Anslut den andra änden av röret till ett litet Luer lås rörförbindning ( 'D.5), försegla samband med ett värmekrympbart rör (D.3) och täcka röret uttag med ett lämpligt plastlock (D.6) .
- För att ansluta medel och utlopps flaskor till kolonnen, ändra butylgummipropp efter nästa steg:
- Sätt två kapillärer rostfritt stål (E.3, E.4) in i butylgummipropp (E.2). Anslut lämpliga gummirör (E.6) och dessa kapillärer och täta samband med värme krympa rör (E.5).
- Lägg till en rörkoppling (E.7) till den andra änden av röret av längre kapillär (E.3) och även fixa detta kontakt med en värmekrympslang (E.5).
- Anslut en nål av rostfritt stål (E.11) till den fria änden av det andra röret fäst vid kortare kapillär (E.4), täta anslutningarna med krymps rör (E.5), och den andra änden av rostfri nål i en mindre butylgummipropp (E.10). Sätt två kapillärer rostfritt stål (G.3) i en stor propp av butylgummi (G.2) och fäst lämpliga gummirör (G.4, G.5). Anslut den fria änden av det kortare gummislang (G.4) till ett medium urladdningsflaska kapillär (w2). Utrusta den fria änden av det längre röret (G.5) med ett litet rör kontakt (G.6). Upprepa stegen för att förbereda en annan butylgummi för en andra urladdning flaska.
- Förbereda propp för mediet panel utgåvan (F) genom att föra in två nålar av rostfritt stål (F.3) i en propp av butylgummi (F.2) i syfte att producera två medieföringsledningar för den kolumnen. Fäst ett gummirör (F.4) till var och en av nålarna och anslut en medel flaska kapillär (C1) till en av de gummirör, respektive.
- För att förbereda körtlar på medellång matarledningen (B), ansluta ett mediummatnings kapillär (C2) till ett litet rör kontakt (B.3) med en gummislang (B.4). Upprepa detta steg för ett annat medium körtel försörjningen.
- Använd längre medel kapillär urladdning (w1) istället för att förbereda körtlar för medellinjen ansvarsfrihet och följ de tidigare stegen (jämför (B) i figur 1).
Obs: Det är bra att märka inlopp och utlopp med olika färger av tejp för att underlätta korrekt montering.
- Använd längre medel kapillär urladdning (w1) istället för att förbereda körtlar för medellinjen ansvarsfrihet och följ de tidigare stegen (jämför (B) i figur 1).
- Montera delarna för huvudutrymmet gasutbyte panelen (C) genom att föra in två långa Luer lås nålar av rostfritt stål (C.2) till en gummislang (C.1) och se till att spetsarna på nålarna når 4 cm utanför den andra änden av slangen. Fyll röret med Polymers lim (C.8) och låt monterings torka i minst 6 timmar.
- Löst fylla två Luer lås glassprutor (C.3) med bomull (C.4).
- Separat förbereda två butyl gnuggaBER proppar (C.5), en med en nål av rostfritt stål införd (C.6) och den andra med en nål av rostfritt stål (C.7). Inte ansluta till glassprutor, ännu.
- Förbered en glasspruta (E.8) fylld med bomull (E.9) för senare användning i linje med mediet flaskan och gas pack (gp).
- Montera utrustningen för en 10 L-gas pack (gp) genom att ansluta en gummislang (gp.1) på ventilen av gasen pack. Infoga en rörkoppling (gp.2) till den fria änden av gummiröret. Upprepa denna procedur för en andra 10 L gas pack.
4. Sterilisering av kolonnen och utrustning
Obs! Beroende på materialegenskaper, är utrustningen steriliseras genom någon av följande tre metoder:
- Sterilisera utrustning tillverkad av glas genom torr ugn (180 ° C under 4,25 h):
- Sterilisera utrustning för tillverkning av medium (se
- Sterilisera utrustning för kolonnen som inrättats i ett andra steg. Linda glassprutor (C.3, E.8, F.1 - upprättad avsnitt 3) med aluminiumfolie och se till att motsvarande butylgummiproppar tas bort.
- Placera glaspärlor (A.2) i en glasbägare och täcka toppen med aluminiumfolie. Även omfatta den transparenta glasskivan (A.4), 4 x stora rörkopplingar (B.2) och 3-vägskopplingen (G.7) med aluminiumfolie och ugn-sterilisera allt.
- Sterilisera utrustning för tillverkning av medium (se
- Sterilisera autoklaver plaster och vätskor genom autoklav (120 ° C, 10 bar, 20 min):
- I det första steget, sterilize den Widdel kolven med mediet, NaHCOs 3 -buffer lösning och två butylgummipropp för 5 L glasflaska.
Obs: butylgummipropp bereds först genom kokning i ultrarent vatten 3 gånger och sedan autoklaveras i en glasbägare med lite vatten, täckt med aluminiumfolie. De våta proppar är lättare att infoga i glasflaskor. - I ett andra steg sterilisera utrustning för den experimentella kolumnen inrättas. För att förbereda kolumnen för sterilisering i autoklav, linda den övre öppningen, medieförsörjnings ventiler, ventilerna media urladdnings och gasutrymmet ventilera med aluminiumfolie före autoklavering.
- Täck provtagningsportar (D.'5) med lämpliga plastlock (D.'6) och se till att ta bort klämmorna (D.4) före autoklavering.
- Linda butylgummipropp och motsvarande kapillärerna på medellång och utlopps flaskor (E.2, 2 x G.2 - beredda in avsnitt 3), de mindre proppar för glassprutor (2 x C.5, E.'10 ", F.'2 - framställd i avsnitt 3) och kapillärerna anslutna till medelförsörjnings och urladdnings körtlar (S2; w1 - framställd i avsnitt 3.4) i aluminiumfolie och sterilisera all utrustning i autoklaven.
- Efter sterilisering, torka den steriliserade kolonnen och utrustning i en ugn vid 60 ° C under ytterligare 4 timmar.
- I det första steget, sterilize den Widdel kolven med mediet, NaHCOs 3 -buffer lösning och två butylgummipropp för 5 L glasflaska.
- Eftersom pumpen slang (pt) är inte autoklaveras, sterilisera dem i en etanol (EtOH) lösning (80% EtOH, 20% vatten). Fyll en lämplig bägare med EtOH-lösning och placera pumpslangen i det, att säkerställa att röret är helt fylld med EtOH-lösning. Ta ut efter 3 h och linda direkt in försteriliserad aluminiumfolie (ugn-steriliserad) och låt torka vid RT under 2 h.
5. Montering av kolonnen och utrustning
- Placera kolonnen (A) på en plan yta och stabilisera med en laboratoriestativ och klämmor. Se till att arbeta under sterila förhållanden (t ex inom 40 cm från en bunsenbrännare eller under ett laminärt flöde huva). Försiktigt bort aluminiumfolie från övre öppningen och fyll i de steriliserade glaspärlor (A.2).
- Förbereda urglaset (A.4) i syfte att tätt nära kolonnen genom att applicera Polymers lim (A.5) till den inre ytan i det område där det kommer att vara i kontakt med kolonnen. Tryck lätt urglaset på plats på toppen av kolonnen för att limma tätt ihop båda delarna. Låt minst sex timmar för installationen att torka.
Obs: Det är möjligt att placera en steril, fin smidig tråd mellan kolumnkanten och urglas, för att enkelt ta bort urglaset efter försöket.
- Förbereda urglaset (A.4) i syfte att tätt nära kolonnen genom att applicera Polymers lim (A.5) till den inre ytan i det område där det kommer att vara i kontakt med kolonnen. Tryck lätt urglaset på plats på toppen av kolonnen för att limma tätt ihop båda delarna. Låt minst sex timmar för installationen att torka.
- Under arbetet under sterila förhållanden bifoga följande delar till kolonnen:
- Anslut gummirör (B.1) och motsvarande rörkopplingar (B.2) till mediet leverans och utloppsöppningarna (jämför (B) i figur 1).
- Anslut rörkopplingarna av körtlar (B.3) för mediaförsörjning och utsläpp (framställd i avsnitt 3.4) till motsvarande kontakter på kolonnen (jämför (B) i figur 1).
- Fäst gasutrymmet gasutbyte panel (jämför (C) i figur 1 - framställd i avsnitt 3.5) till det fria utrymmet ventilera på kolonnen och anslut glassprutor (C.3) till motsvarande nålar av rostfritt stål (C.2) och insatsen lämpliga butylgummiproppar (C.6, C.7 - framställda i avsnitt 3.5.2) i bomullsfyllda glassprutor (C.3).
- Sätt i butylgummipropp för flaskorna urladdnings (2 x G.20, - framställd i avsnitt 3.2) i två sterila 3 L glasflaskor (G.1), och anslut röret kontakterna på flaskorna (G.6) till 3-vägskopplingen (G.7).
- Anslut den fria änden av mediet urladdningskörteln kapillär (w1) till den fria änden av en urladdningsflaska kapillär (w2) med pumpslangen (pt). Upprepa denna procedur för det andra mediet urladdnings körtel kapillär och andra utsläpp flaskan.
- Anslut den fria änden av en medel flaska kapillär (s1) till den fria änden av mediet tillförselkörteln kapillär (s2) med pumpslangen (pt). Upprepa denna procedur för det andra mediet flaskan kapillär och det andra mediet matnings körtel kapillär.
- Montera mediet elcentralen genom att sätta proppen med motsvarande kapillärer (F.2 - framställd i avsnitt 3.3) till glasspruta av medieteltavlor (F.1).
- Anslut mediet panelen distributionen till kontakten på butylgummi för mediet flaskan (E.7 - jämför F i figur 1).
- Anslut N 2 / CO 2 gasledningen till huvudutrymmet gasutbytet panelen till Luer lås nål av rostfritt stål (se position (LLF) i figur 1), och spola kolonnen installation och kapillärsystem med N2 / CO2 vid lågt tryck (<10 mbar). Upprätthålla ett utflöde av gas vid de öppna ändarna av mediet flaskan kapillär (E.3), 3-vägskopplingen (G. 7) och provtagningsportar (D.5). Se därför till att ha locken av provtagningsportar (D.6) glänt, för att upprätthålla sterila förhållanden genom ett övertryck av gas strömmar ut.
- Spola komplett installation under minst 20 min.
Obs: Dessutom är det möjligt att stänga outgassing nål (C.6) av huvudutrymmesgasen utbyte panel med en lämplig gummislang och en klämma för att öka effektiviteten i spolning av hela installationen.
- Spola komplett installation under minst 20 min.
- Under tiden, fylla en 10 L gaskudden (gp) med N2 / CO2 (vol / vol, 90/10), efter 10 omgångar av fyllning och avluftning (med användning av en vakuumpump) hela volymen för att säkerställa att påsen är helt anoxisk . Var noga med att stänga ventilen av gasen paketet efter den sista fyllningen. Upprepa denna procedur med en andra gas pack men stänga ventilen efter avluftning (dvs lämna det tomt).
Anmärkning: N 2 / CO 2 fylld gas pack kommer att anslutas till mediet flaskan för att kompensera den ökande huvudutrymmesvolym på grund av medelförlust genom pumpning. N2 / CO2 spolades, men tom gas pack, kommer senare att anslutas till flaskorna urladdnings så att gas att undkomma det fria utrymmet på grund av ökad volym flytande utsläpp. - insert than butylgummipropp (E.10 - framställd i avsnitt 3.2.3) i steril spruta glas fyllt med bomull (E.8 - upprättad avsnitt 3.6).
- Placera den fyllda och stängda medel flaska (E - framställd i avsnitt 1) på laboratoriebänken bredvid proppen på medellång flaska (E.2), och förbereda för att ansluta proppen till mediet flaskan med användning av följande förfarande:
- Stänga N 2 / CO 2 gasflödet in i kapillären (E.3) genom att stänga motsvarande gummislang (E.5) med en slangklämma.
- Lätt lyfta butylgummi utanför mediet flaskan och spola det övre utrymmet med N2 / CO2 (50 mbar) genom att hänga en steriliserad, bomull -filled spruta med en böjd, lång metall nål (1 mm x 140 mm) i flaskhalsen av mediet flaskan (jämför Hungate & Macy 17).
- Ändra lång metall sprutans nål (som tidigare använts för spolning av gasutrymmet) till en engångsnål (0,9 mm x 45 mm; allmänt tillgänglig) och injicera i proppen för att spola det övre utrymmet av mediet flaskan med N2 / CO 2.
- Se till att ha en liten utflöde av gas vid den öppna änden av sprutan gas (E.8 - monteras i avsnitt 5.10) är ansluten till proppen av mediet flaskan. Spola topputrymmet av mediet flaskan (E) och sprutan glas (E.8) under minst 4 min.
Obs: Om det behövs öppnarutgasning nål (C.6) av huvudutrymmesgasen utbyte panelen igen för att upprätthålla ett utflöde av gas vid den öppna änden av nålen.
- Snabbt öppna ventilen på gas pack och lätt tryck på påsen för att upprätthålla ett utflöde av N2 / CO2 för att spola röret och anslutningen av gasen paketet.
- Så snart övertrycket frigörs från mediet flaska, snabbt ansluta anslutningsdonet av gasen pack (gp.3) till motsvarande kontakten på glasspruta (E.8).
- Öppna ventilen av gasen pack (gp)ansluten till urladdnings flaskor (G) för att tillåta luft att släppas ut i gasen paketet medan flaskorna utlopps tanka utflöde medium.
6. Inokulering av bakterier i kolonnen
Obs! För en abiotisk kontrollexperiment detta steg hoppas över.
- Eftersom cellkulturen kommer att injiceras direkt in i kolonnen genom butylgummipropp av de viktigaste urvals hamnar längs sidan av pelaren, se till att ha förberett sex sprutor med nålar som är tillräckligt lång för att nå mitten av kolumnstommen.
- Sterilisera utsidan av butylgummiproppar av de sex huvudsakliga provtagningsportarna vid kolonnen (A.3) med en EtOH-lösning (80%).
- Har serumflaska med kulturen för ympning klar (framställd i avsnitt 2) och sterilisera butylgummipropp genom flammande flera droppar EtOH lösning. Spola sprutan med steril N2 / CO2 innan du tar en alikvot av kulturen. Ta en ml of den anoxiska cellen lösningen och injicera det i mitten av kolonnen genom de butylgummiproppar för de viktigaste provtagningsportar (A.3).
Obs! Beroende på bakterietillväxt, kan det vara nödvändigt att justera pumphastigheten (eller stoppa pumpning) under de första dagarna av lag-fasen för celltillväxt och utveckling för att förhindra att kulturerna från att tvättas bort.
7. provtagning
Obs: För att samla in prover över de kemiska gradienter som utvecklas inuti kolonnen, är det nödvändigt att starta provtagning från de bästa provtagningsportarna före de djupare hamnar, som volymförlust inträffar. Se till att upprätthålla sterila förhållanden (t.ex., genom att arbeta inom 40 cm från en bunsenbrännare eller under ett laminärt flöde huva).
- Samla de första exemplaren 24 timmar efter ympning. Spola sprutan som kommer att användas för provtagning med steril N2 / CO2, i syfte att undvika syre injektion i sampling portar (D). Se till att fylla sprutan med N2 / CO2 före provtagning.
- Snabbt ta bort plastlocket (D.6) och sätt spruta provtagning i röret kontakten (D.5). Upprätthålla ett litet gap mellan sprutan och rörkoppling. Frigöra gasen från sprutan och spola slangförbindningen med N2 / CO2.
- Stadigt ansluta sprutan till röret kontakten. Ta bort klämman (D.4) och börjar ta ett prov på ca 1 ml.
- Efter att dra provet och innan du tar bort sprutan, fäst klämman (D.4). Ta sedan bort sprutan provtagning och stänga ordentligt röret kontakten (D.5) med motsvarande plastlocket (D.6).
- Omedelbart upprepa steg 7,1-7,3 för provtagning från varje hamn.
- Samla in nästa uppsättning av prover varje 24 h.
Obs! För ytterligare prover vid olika tidssteg, är det nödvändigt att avlägsna en liten amount prov (t.ex. 0,2-0,4 ml) från början innan provet kan tas för att avlägsna kvarvarande media i provtagningsröret och uppnå representativa prover från inuti kolonnen.
8. Analysmetoder
- Syre kvantifiering:
Notera: Syrekoncentrationen i den genomflödesmediet och det övre utrymmet av kolonnen kvantifieras icke-invasivt och icke-destruktivt med användning av de optiska syresensorer och syrekänslig fluorescerande folie fläckar av 0,5 x 0,5 cm (så kallade optodes), limmas längs den inre glasvägg av kolonnen med hjälp av kisel lim (A.6). Det säkerställdes att syrekänsliga folieplåster är okänsliga för Fe arter för att uppnå tillförlitliga avläsningar.- Se till att kalibrera den mjukvara med lämpliga kalibreringsparametrar för optodes som används i kolonnen. De optiska syresensorer har en specifik KALion för mätning med hjälp av en motsvarande PC-styrd fiberoptisk syremätare.
- Starta mätningen och ta hand för att hålla polymeren optiska fibern i syremätare i en rät vinkel till syrekänslig folie som är limmad på insidan av transparenta glasvägg av kolonnen.
- Upprepa mätningen för varje enskild O 2 mätpunkt genom hela kolonnen.
- Fe (II) och totalt fe analys av vattenprover:
- Eftersom Fe (II) snabbt oxideras av syre i luft vid neutralt pH, stabilisera de flytande prover för vattenhaltig Fe (II) kvantifiering omedelbart i 1 M HCl-lösning. För en slutlig provvolym på 1 ml blanda 0,5 ml vätskeprov med 0,5 ml 2 M HCl.
- Kvantifiera total Fe efter inkubation en alikvot av 1 M HCl-stabiliserade provet med hydroxylamin-hydroklorid (10% vikt / volym, i 1 M HCl) under 30 min. Detta reagens reducerar alla Fe (III) till Fe (II), som sedan kan kvantifieras via FerroZine assay
- Utför en FerroZine analysen med en mikro-titer-plattläsare. Mät absorbansen vid en våglängd av 562 nm. Se till att det finns standarder inom området för detekterbara Fe (II) och de totala Fe koncentrationer.
Obs: Om Fe-koncentrationer i vätskeprovet överstiger standard kalibreringar, är det nödvändigt att späda det stabiliserade provet med 1 M HCl.- Beräkna koncentrationen av Fe (III) genom skillnaden mellan total Fe och Fe (II).
- Utför en FerroZine analysen med en mikro-titer-plattläsare. Mät absorbansen vid en våglängd av 562 nm. Se till att det finns standarder inom området för detekterbara Fe (II) och de totala Fe koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
kontrollexperiment
Abiotisk kontrollexperiment (10 dagar) visade genomgående låga syrehalter (O 2 <0,15 mg / L) med några betydande variationer i Fe (II) -profil hela upwelling vattenmassan. Bildandet av fällningar (förmodligen Fe (III) (oxyhydr-) oxider) i mediet reservoaren och liten minskning i den totala Fe (II) koncentration från 500 ^ M till 440 | iM över 10 dagar indikerar lite syre diffusion genom anslutningar gjorda av gummi (t.ex. E.6; gp.1 i figur 1) 22 för detta experiment, de lägsta syrehalter som var rimligen är möjligt var ≤0.15 mg / L och är i intervallet för en känslig syre kvantifiering och ovanför detektionsgräns. 0,03 mg / L. Syrevärden under 0,15 mg / L är för remainder av detta dokument kallad "anoxisk".
biotiska experiment
Synliga parametrar, celltillväxt och förändringar i vattenpelaren
Före ympning på dag 0 inga fällningar var synliga (figur 2 A). Detta indikerade att kolonnen var korrekt installation och att inget syre var närvarande (jämför figur 3 A) som kan leda till oxidation av Fe (II) och bildningen av Fe (III) utfälles. Som ett resultat, Fe (II) -koncentrationen var konstant under hela upwelling vattenmassan som det visas i profilen i figur 4A. Figur 2 A visar att ljus gradient narrowed till de övre 6 cm inomvattenpelare genom användning av glaspärlor matrisen den i kolumnen cylindern.
Den gröna färgen inom topp 2,0 cm av vattenmassan 84 h efter ympning indikerar tillväxten av cyanobakterier (fig 2 B). Det anmärkningsvärda ljust orange band på ett djup av -3 cm (markerat med pilen i figur 2 B) nedanför det gröna bandet är på grund av de Fe-fällningar som bildats under Fe (II) oxidation med molekylärt syre, som produceras av cyanobakterier. Liknande fällningar var också synlig på ytan av vattenpelaren. Ljusorange skum bildas vid vattenpelaren ytan 84 h efter inokulering (fig 2 B) vilket indikerar produktion av O 2 genom cyanobakterier. Fällningarna på ytan av vattenpelaren förmodligen bildas på grund av det syre som är utgasning vidyta. Kvarvarande Fe (II) så småningom oxideras vid ytan och bildade fällningar på glaspärla matrisen.
syre-gradient
Före ympning på dag 0, var den initiala O 2-koncentration i det flytande mediet bestämmas. Figur 3 A visar tydligt att koncentrationen för O 2 genom hela vattenmassan var konsekvent under koncentrationen närvarande i kontrollexperimentet. Pre-ympning O 2 -koncentration aldrig översteg värden av 0,13 mg / LO 2 (O 2 medelvärde = 0,099 ± 0,002 mg / L). Detta tyder på att kolonnen var syrefria före ympning.
Figur 3 B visar en ökning av O2-koncentrationen vid84 h efter inokulering med cyanobakterier. Detta, tillsammans med det synliga gröna biomassan (Figur 2 B) är förenliga med produktion fotosyntetiska och ackumuleringen av O2 i kolonnen. O 2 koncentrationen efter 84 timmar uppnådde en maximal koncentration på O 2 = 29,87 mg / L i en djup på -0,5 cm under vattnet yta. O 2 värdena i Figur 3 B visar att O 2 våningar var alltid över bakgrundskoncentrationen i de övre 8,5 cm i vattenmassan (O 2> 0,15 mg / L). Märkbart hög O 2 koncentrationer (> 0,50 mg / L) detekterades från -0,5 till -5,5 cm djup under vattnet yta. Lägre koncentrationer för O 2 ≤ 0,15 mg / L på djup under -10.5 cm, tillsammans med den lägsta uppmätta värdet för O 2 = 0,09 mg / L på ett djup av -20.5 cm tyder på att these områden var syrefria.
Fe (II) gradient
Figur 4 A visar att Fe (II) -koncentrationen på dag 0, före ympning med cyanobakterier, var konstant genom hela vattenmassan med en genomsnittlig koncentration av Fe (II) medelvärde = 282,6 ± 6,8 ^ M. Koncentrationen i mediet reservoaren på dag 0 var Fe (II) reservoar = 320,4 ± 11,6 ^ M.
84 h efter inokulering med cyanobakterier Fe (II) -koncentrationen minskat avsevärt i de övre 9 cm i vattenpelaren. Figur 4 B visar en distinkt Fe (II) gradient, där koncentrationer av Fe (II) minskar till den övre ytan av den vattenpelare. Dock Fe (II) var fortfarande detekterbar vid ytan av vattenpelaren. th e lägsta Fe (II) -koncentrationen detekterades var direkt under det flytande mediet ytan på ett djup på -0,9 cm. Fe (II) koncentrationer ökade med djup från Fe (II) = 9,9 ± 2,8 ^ M vid -0.9 cm till Fe (II) = 258,6 ± 3,1 pM på ett djup av -8.9 cm och bildar en brant positiv linjär Fe (II) gradient under djup ([Fe (II) d] = (d + 1,278) ∙ 0,031 -1; d: djup (cm) ; R 2 = 0,9694) begränsade till de övre 6,8 cm. Områden i vätskemediet under -9 cm djup förblir märkbart konstant och visar ingen signifikant minskning av deras koncentrationer för Fe (II) jämfört med deras ursprungliga värden för Fe (II) på dag 0 (T-test, p> 0,05).
Figur 1. Schematisk experiment inrättas. Alfanumeriska koder för poster avser delar som anges i tabell 2.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54251/54251fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Synliga förändringar i glaspärla matrisen hela kolonnen cylindern före och 84 timmar efter ympning med cyanobakterier. Rosa rutor är syresensorer. (A) Stäng upp av de övre 6 cm i kolonnen bildas innan inokulering. Det vätskefyllda kolonnen som visar ett synligt ljus-gradient. Glas pärlmatrisen smalnar det synliga ljuset gradienten till de övre 6 cm. (B) Närbild på den övre 6 cm 84 timmar efter ympning. Grönt indikerar synlig biomassa, tätare i toppen av kolonnen där ljusintensiteten är störst. Pilen pekar på en svagt synlig apelsin band, vilket resulterade från bildandet av Fe(III) utfälles på grund av Fe (II) oxidation med molekylärt O 2 produceras av cyanobakterier. Svagt synlig orange-färgat skum på toppen av vattenmassan ytan indikerar Fe (III) är också utfällning där. O 2 utgasning genom ytan orsakar skumning av Fe (III) utfälles. (C) Översikt över fyllda kolonnen cylinder. Synlig tillväxt av cyanobakterier är begränsad till de övre 4 cm på grund av begränsad ljus tillgänglighet med djup. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Syre profil inom vattenmassan före och 84 h efter inokulering med cyanobakterier. Zero cm för djupet på y-axeln anger vatten Column yta. Positiva värden för djup hänvisar till utrymmet ovanför vätskemediet nivå, medan negativa värden representerar djup i vattenpelaren. Notera den logaritmiska skalan för O 2-koncentrationer på x-axeln. Den vertikala streckade linjen anger tröskeln för anoxiska förhållanden (O 2 ≤ 0,15 mg / L). (A) Oxygen profile [0h] före ympning. Värden för O2 var ständigt under 0,13 mg / L i hela vattenmassan. (B) Oxygen profil 84 timmar efter ympning. O 2 var över 0,5 mg / L i de övre 5,5 cm av vattenmassan. O 2 Halterna var högre än bakgrundskoncentrationerna (≥ 0,15 mg / L, streckad linje) i områden ovanför -8,5 cm djup. Djupare områden var anoxisk med O 2 ≤ 0,15 mg / L. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 4. Fe (II) profil inom vattenmassan före och 84 timmar efter ympning med cyanobakterier Anm. Felstaplar representerar tekniska replikat härledas ur trippelmätningar av ett prov i FerroZine analysen. (A) Fe (II) profile [0h] innan inokulering. Värdena för Fe (II) var konstant genom hela vattenmassan med ett medelvärde för Fe (II) medelvärde = 282,6 ± 6,8 ^ M. Variationer i Fe (II) profil resultat från enstaka prov Fe (II) kvantifieringar. Fe (II) kvantifiering på prov tre exemplar skulle sannolikt leda till mindre variation. (B) Fe (II) profil 84 h efter ympning. Märkbart lägre Fe (II) koncentrationer i de övre 6,8 cm i vattenmassan. Fe (II) värden under -8,9 cm djup visar högre Fe(II) koncentrationer som inte väsentligt skiljer sig från initiala Fe (II) värden före ympning med cyanobakterier (T-test, p <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Utrustning | Kvantitet | Föremålsbeskrivning | information detaljer | ||
| Stämpla | Beställningsnr. | referens adress | |||
| 1 | Widdel kolv (5 L) | Ochs | 110015 | labor-ochs.de | |
| 2 | Glasflaskor (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com | |
| 3 | Glaspipetter (5 ml) | 51714 | labor-ochs.de | ||
| 1 | 0,22 | j, m Steritop filterenhet (0,22 fim polyetersulfon-membran) | millipore | X337.1 | carlroth.com | |
| 0,5 m 2 | Aluminiumfolie | - | |||
| förnödenheter | - | N 2 - handskfacket (100% N2) | - | ||
| - | N 2 / CO 2 - gas (90/10, v / v; 50 mbar) | - | |||
| 1 | Steril Luer Lock glasspruta, fylld med bomull | C681.1 | carlroth.com | ||
| 1 | Luer Lock rostfria nålar (150 mm, 1,0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | ||
| Kemikalier | 4,8 L | MQ-vatten | - | ||
| för 5 L-medium lösning | 100 g | NaCl | 433209 | sigmaaldrich.com | |
| 34 g | MgSO 4 | 208094 | sigmaaldrich.com | ||
| 7,5 g | CaCl2 | C4901 | sigmaaldrich.com | ||
| 1,25 g | NH4CI | A9434 | sigmaaldrich.com | ||
| 0,34 g | KH 2 PO 4 | P5655 | sigmaaldrich.com | ||
| 0,45 g | KBr | P3691 | sigmaaldrich.com | ||
| 3,3 g | KCl | P9541 | sigmaaldrich.com | ||
| 200 ml | Anoxiska Na 2 HCO3 -buffer lösning (22 mM) | - | |||
| 15 mg | Selen och volframat lösningen (för. Wu et al., 2014) | - | |||
| 5 ml | Na2S 2 O 3-lösning (1 M) | - | |||
| 2,5 ml | Marine fotoautotrof (MP) vitaminlösning (comp. Wu et al., 2014) | - | |||
| 5 ml | MP spårämne solution (för. Wu et al., 2014) | - | |||
| Referens | |||||
| Wu, W., Swanner, ED, Hao, LK, Zeitvogel, F., Obst, M., Pan, YX & Kappler, A. (2014). Karakterisering av fysiologin och cell-mineral interaktioner av den marina anoxygenic fototrofa Fe (II) oxideraren Rhodovulum iodosum - effekterna Precambrian Fe (II) oxidation. FEMS Microbiology Ecology, 88 (3), 503-515. | |||||
Tabell 1. Medium Förberedelser. Lista utrustning, förnödenheter och kemikalier för framställning av odlingsmedium.
| Antal. | Ref. | Föremålsbeskrivning | information detaljer | ||||
| för | 1 | (EN) | glascylinder | Y310.1 | carlroth.com | * Anpassade modifieras genom glastillverkningsanläggning | |
| 2 g | (A.1) | Glasull | 7377,2 | carlroth.com | |||
| 1,03 L | (A.2) | Glaspärlor (ø 0,55 till 0,7 mm) | 11079105 | biospec.com | |||
| 6 | (A.3) | Butylgummipropp (ø 1,2 cm) | 271024 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (A.4) | Petriskål, glas (ø 8,0 cm) | T939.1 | carlroth.com | |||
| 40 ml | (A.5) | polymerer lim | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |||
| 11 | (A.6) | Optisk syresensor folie (för syre analys, se nedan) | - på förfrågan - | presens.de | |||
| för | 4 | (B) | Medium körtlar | ||||
| 4 | (B.1) | Gummislang (35 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |||
| 4 | (B.2) | Luer Lock rörkopplingen (3,0 mm, Luer hane = LLM) | P343.1 | carlroth.com | |||
| 4 | (B.3) | Luer Lock rörkopplingen (3,0 mm, luer lås kvinnliga = LLF) | P335.1 | carlroth.com | |||
| 4 | (B.4) | Gummislang (25 mm, 0,72 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| för | 1 | (C) | Headspace Gas Exchange Panel | ||||
| 1 | (C.1) | Gummislang (50 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |||
| 2 | (C.2) | Luer Lock nål av rostfritt stål (150 mm, 1,0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | |||
| 2 | (C.3) | Luer Lock glasspruta (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |||
| 2 g | (C.4) | lös bomull | - | ||||
| 2 | (C.5) | Butylgummipropp (ø 1,75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (C.6) | Nål av rostfritt stål (40 mm, 1,0 mm ID) | Sterican | 4665120 | bbraun.de | ||
| 1 | (C.7) | Luer Lock nål av rostfritt stål (150 mm, 1,5 mm ID) | 201520 | labor-ochs.de | |||
| (LLF) | positioner: Luer Lock kvinnliga connector del på C.7 | ||||||
| 10 ml | (C.8) | polymerer lim | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |||
| för | 1 | (D) | provtagning Port | ||||
| 1 | (D.1) | Nål av rostfritt stål (120 mm, 0,7 mm ID) | Sterican | 4665643 | bbraun.de | ||
| 1 | (D.2) | Gummislang (40 mm, 0,74 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 2 | (D.3) | Krympslang (35 mm, 3 mm ID krympt) | 541458-62 | conrad.de | |||
| 1 | (D.4) | rörklämma | STHC-C-500-4 | tekproducts.com | |||
| 1 | (D.5) | Luer Lock rörkopplingen (1,0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (D.6) | Luer Lock plastlock (LLM) | CT69.1 | carlroth.com | |||
| för | 1 | (E) | medel flaska | ||||
| 1 | (E.1) | Glasflaska (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com | ||
| 1 | (E.2) | Butylgummipropp (för GL45) | 444704 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (E.3) | Rostfritt stål kapillär (300 mm, 0,74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 1 | (E.4) | Rostfritt stål kapillär (50 mm, 0,74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |||
| 4 | (E.5) | Krympslang (35 mm, 3 mm ID krympt) | 541458-62 | conrad.de | |||
| 2 | (E.6) | Gummislang (100 mm, 0,74 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 1 | (E.7) | Luer Lock rörkopplingen (1,0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (E.8) | Luer Lock glasspruta (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |||
| 1 g | (E.9) | lös bomull | - | ||||
| 1 | (E.10) | Butylgummipropp (ø 1,75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (E.11) | Nål av rostfritt stål (40 mm, 0,8 mm ID) | Sterican | 4657519 | bbraun.de | ||
| för | 1 | (F) | Medium eltavlor | ||||
| 1 | (F.1) | Luer Lock glasspruta (5 ml) | <td>C679.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (F.2) | Butylgummipropp (ø 1,75 mm) | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 2 | (F.3) | Nål av rostfritt stål (40 mm, 0,8 mm ID) | Sterican | 4657519 | bbraun.de | ||
| 2 | (F.4) | Gummislang (40 mm, 0,74 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| för | 2 | (G) | urladdnings flaskor | ||||
| 2 | (G.1) | Glasflaska (2 L) | Rotilabo | X716.1 | carlroth.com | ||
| 2 | (G.2) Butylgummipropp (för GL45) | 444704 | labor-ochs.de | ||||
| 4 | (G.3) | Rostfritt stål kapillär (50 mm, 0,74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 2 | (G.4) | Gummislang (30 mm x 0,74 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 2 | (G.5) | Gummislang (100 mm x 0,74 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 2 | (G.6) | Luer Lock rörkopplingen (1,0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (G.7) | Luer Lock 3-vägskopplingen (LLF, 2x LLM) | <td>6134 | cadenceinc.com | |||
| extra utrustning | |||||||
| 1 | (L) | Ljuskälla | Samsung | SI-P8V151DB1US | samsung.com | ||
| 1 | (P) | peristaltisk pump | Ismatec | EW-78.017-35 | coleparmer.com | ||
| 4 | (Pt) | Pumpning slang (0,89 mm ID) | EW-97.628-26 | coleparmer.com | |||
| 4 | (S1 / 2) | Rostfritt stål kapillär (200 mm, 0,74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 4 | (W3 / 4) | staiSåvida stål kapillär (400 mm, 0,74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |||
| 2 | (Gp) | Supel inert Foil (Tedlar - PFC) gas pack (10 L) | 30240-U | sigmaaldrich.com | |||
| med | 2 | (Gp.1) | Gummirör (30 mm, 6 mm ID) | 770300 | labor-ochs.de | ||
| 1 | (Gp.2) | Luer Lock rörkopplingen (3,0 mm, LLM) | P343.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (Gp.3) | Luer Lock rörkopplingen (3,0 mm, LLF) | P335.1 | carlroth.com | |||
| förnödenheter | 2 | - | N 2 / CO 2 - gasledningen (90/10, v / v; 50mbar) | - | |||
| 2 | - | Gastät spruta (20 ml) | C681.1 | carlroth.com | |||
| 1 | - | bunsenbrännare | - | ||||
| 1 | - | Fiberoptisk syremätare för syre kvantifiering | presens | TR-FB-10-01 | presens.de | ||
| 1 | - | Vakuumpump | - | ||||
| 1 | - | Silikon lim för syre optodes | presens | PS1 | presens.de | ||
| -: Poster som försetts med ett streck (-) är allmänt tillgängliga och inte somÄRSKILD objektet | |||||||
Tabell 2. Kolumn set-up. Mängder, alfanumeriska referensnummer och artikelbeskrivningar av utrustning för försöksuppställningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrobiella samhällen i prekambriska havet reglerades genom eller modifierade som ett resultat av deras verksamhet och de rådande geokemiska förhållanden. Vid tolkningen ursprunget till BIF, forskare sluta sig generellt närvaron eller aktiviteten av mikroorganismer baserat på sedimentologi eller geokemi av BIF, t.ex., Smith et al. 23 och Johnson et al. 24. Studiet av moderna organismer i moderna miljöer som har geokemiska analoger till gamla miljöer är också en värdefull metod, t ex Crowe et al. 11 och Koeksoy et al. 14. Ett tredje sätt är att utnyttja organismer i tekniska laboratoriesystem som simulerar processer som äger rum i den prekambriska havet, t.ex. Krepski et al. 25. Denna typ av tillvägagångssätt är användbart för att testa specifika hypoteser, och ta bort kemiska eller biologiska faktorer som kan förekomma i moderna system, men var inteen del av den prekambriska havet (t.ex., vattenlevande växter och djur). Vi presenterar därför ett proof-of-concept metod för en dynamisk, laboratorium upwelling system där aktiviteten av (cyano-) bakterier och deras inverkan på resulterande geokemiska profiler kan bedömas under kontrollerade laboratorieförhållanden. Vår kolonn kan användas för att testa hypoteser om organismer och processer som bidrar till nedfall av BIF, och biosignatures behålls i BIF.
Vi optimerat protokoll för kolumninställningar så att monteringen är förståeligt och lätt conductible. Men vissa steg i protokollet måste åtgärdas noggrant och helst genomföras med hjälp av en assisterande person. I synnerhet måste anslutningen av de medel flaskor till kolonnen cylindern som skall utföras snabbt för att undvika kontaminering av mediet lösning med syre. Användningen av icke-steril utrustning eller arbetar under sterila laboratorieförhållanden kommer att resultera in föroreningen av experimentet och otillförlitliga resultat. Därför är det absolut nödvändigt att sterilisera utrustning och bibehålla sterila förhållanden (som arbetar i ett laminärt flöde huva eller 40 cm bredvid en bunsenbrännare) medan du ställer upp experimentet och insamling av prover. Dessutom är vissa fysikalisk-kemiska parametrar i kolumnen materialet orsakade kemiska förändringar på lång tid set-up i kolumnen experiment. Delar som är gjorda av gummislangen verkar ha en diffusionskoefficient för syre som är tillräckligt hög för att signifikant påverka medelreservoaren flaskan och leda till oxidation av Fe (II) och mineral utfällning i mediumlösning. Den abiotiska förbrukningen av> 10% Fe (II) på grund av nederbörd under abiotiska experimentet över 10 dagar (jämför: Representativa resultat) behöver beaktas för framtida långtidsförsök. Ljuskällan som användes i den aktuella studien skapade en downwelling ljus gradient inom den övre 6 cmav kolonnen. Den ljusspektra täckte foto aktiva våglängder av klorofyll a och b i Synechococcus och tillät tillväxt och fotosyntetisk aktivitet. I själva verket är ljuskällan en av de viktigaste parametrarna avseende fototrofa organismer eftersom båda kan lätt kvalitet och kvantitet starkt påverka fototrofa bakterier 11,13. Variationer av våglängder och spektralområden, också med tanke på högre UV-strålning under prekambrisk, kan dessutom ge insikter i ljus beroende biogeokemiska reaktioner. Under ljus inkubation experiment, märkte vi att ljus genomfördes genom glasväggen i kolumnen, avger ljus genom provtagnings hamnar längst ned i kolumnen. För framtida experiment, bör glaset vid toppen av kolonnen ersättas med icke-ljusledande glas. Ljus lutning skall mätas i en mock set-up, eftersom det fanns inget enkelt och billigt sätt att mäta ljus lutning inomslutna kolonnsystem tillgängliga. Vi antar en betydande förändring över tiden i det maximala penetrationsdjupet av ljus beroende på absorption av ljus av celler och mineraler. Mätning av ljus lutning in situ under försöket kommer att vara av intresse för framtida experiment. Användningen av ljusspridande pärlor i glaspärlor matrisen och kvantifiering av spritt ljus från utsidan kan vara en möjlighet att kvantifiera den relativa ljus tillgänglighet i vissa djup över tiden. En ytterligare förbättring skulle inkludera ett omslag som inte behöver limmas, men kan enkelt fästas och tas bort med en fläns och omslutande klämma. En 4-punktsmediatillförsel och utloppsporten skulle resultera i en mer homogen flödesfält inuti kolonnen. Smalare positionering av de huvudsakliga provtagningsportar för vätskeprover skulle resultera i en högre upplösning på provtagning av de biologiska och geokemiska gradienter inom kolonnen.
Icke desto mindre, de första resultaten visard att den vertikala genomströmnings kolonn kan betraktas som en lämplig experimentell uppställning för att undersöka mikrobiella processer och geokemiska förändringar i ett upwelling system. Vi hävdar att denna kolumn fungerar som en prototyp för att bevisa den totala systemets funktionalitet. Vidare validera våra resultat allmänt hålls antaganden, modellresultat och slutsatser från sedimentära geokemi att en chemocline mellan syre och Fe (II) resultat om cyanobakterier förekommer i en Fe (II) -rik upwelling systemet 20. De anoxiska förhållanden före ympning återspeglar en Precambrian havet innan kolonisering av cyanobakterier eller organismer som kan syrehaltig fotosyntes. Med anledning av syret i ytvattnet, blir upwelling Fe (II) oxideras och faller ut som Fe (III) mineraler, såsom skedde under avsättning av BIF 26 .Det inrättandet av en chemocline och mineralbildning kan utvärderas för att extrapolera geokemiska processer i större skala miljös. Men för uppskalning de utvärderade resultaten naturliga (gamla) miljöer, ytterligare fysikaliska processer måste beaktas. Advektiv lateral transport, till exempel, kan störa etableringen av en chemocline, samma som vindinducerade turbulens i ytvattnet.
Utvinning av vätskeprover från vattnet för Fe (II), totalt Fe mätningar och icke-invasiv O2 kvantifiering kunde spåra utvecklingen av en reaktions front mellan dessa kemiska ämnen på ett enkelt, snabbt och tillförlitligt sätt . Den låga Fe (III) koncentration i prover tagna från kolonnen inrättades abiotiska kontrollexperiment visar tydligt att även om vissa oxidation inträffade i media flaskan kolonnen själv stängt hermetiskt till extern O2 tillströmning. Vidare indikerar dessa resultat att vår provtagningsprotokoll upprätthålls anoxiska prover för Fe (II) kvantifiering. Förändringar i pH registrerades inte under kolumn experiment och kan ha en dominerande effekt på Fe-artbildning. Emellertid var den aktuella genomflödessystem buffras av 22 mM NaHCOs 3 som är i jämvikt med den anoxiska N2 / CO2 atmosfär i huvudutrymmet och gör det möjligt att upprätthålla en omständig-neutralt pH under minst 84 h. Icke desto mindre kan in situ kvantifiering av pH vara en viktig parameter för att till fullo förstå geokemiska processer i potentiella långsiktiga experiment och extrapolering till (gamla) öppna havssystemen. Den glaspärla matris, som används för att stabilisera upprättandet geokemiska gradienter i kolumnen cylindern lett till en ackumulering av Fe-fällningar under ytan av vattenpelaren. Vår hypotes är att de ackumulerade fällningarna inte har en dominerande effekt på vår 84 timmar experiment. Däremot kan försämra biomassa inducerar redox processer på Fe-fällningar som resulterar i Fe cykling. Detta måste beaktas när det gäller potentiella lång körning (<84 h) experiment. I själva verket, lättinducerad Fe-redox cykling och ett frisläppande av Fe till ferrojärn poolen kunde observeras och kvantifieras i replikera lång sikt (21 dagar) experiment (Wu, W., Maisch, M., Kappler, A., Pan, Y. & Swanner, ED Fotokemisk Fe (III) minskning stabiliserad Fe (II) i Arkeiska syre oaser. geologi. (i prep.)).
Framtida kolumn experiment kommer att innehålla både olika mikroorganismer och variationer i odlingsmediet sammansättning. Detta möjliggör simulering av olika miljöförhållanden som är representativa för olika stadier under omvandlingen av Precambrian oceanen. Exempelvis skulle kiseldioxid tillsättas till mediet för att simulera de koncentrationer av 0,67 till 2,2 mM som fanns närvarande i prekambrisk havsvatten 27. Vidare kunde ändras koncentrationen av sulfat i mediet lösning för att bemöta variationer i sammansättningen av prekambriska havsvatten. Variationer av odlingsmediet kommer sannolikt att påverka physiology och verkan av mikroorganismer på geokemiska mönster i vattenmassan 19 att den aktuella kolumnen inställning ger oss möjlighet att undersöka på plats. I tillägg till detta, kommer förväntade experiment innebära mer komplexa mikrobiella samhällen såsom fototrofa Fe (II) -oxidizing bakterier (t.ex. Kappler et al.) 28, microaerophilic Fe (II) -oxidizing bakterier (t.ex. Krepski et al.) 29 och cyanobakterier. Kolumn experiment kommer att bidra till retas isär individuella bidrag av dessa mikrobiella processer för avsättning av bandad järnmalm. Men för tolkning och extrapolering till gamla (och moderna) miljöer måste härledas mycket noggrant. Den mikrobiella habitat som simuleras i den aktuella studien endast modeller de grundläggande funktionerna i en potentiell Precambrian upwelling hav vattenpelaren: vertikala Fe (II) flussmedel, en fotiska zonen lätt lutning, anoxisk atmosfär och cyanobakterier. i adsättning, villkoren i den konstgjorda upwelling systemet potentiellt gynnar tillväxten av cyanobakterier, på grund av konstant temperatur och 24 timmar ljusförhållanden som kan leda till högre O 2 produktionstakt, medan den upphöjda O 2 koncentrationer leder därefter till högre Fe (II) oxidation priser . Därför denna studie kan inte tolkas som ett experiment som passar alla hypoteser om BIF ursprung.
Ändå tillåter ställa in in situ undersökning av olika geokemiska processer och variationen och simulering av vissa randvillkor (lätt tillgänglighet, mediumkomposition, flux). Kvantifiering av enskilda parametrar och geokemiska interaktioner under laboratorie-kontrollerade betingelser kan ge insikter i forntida och moderna miljöer. Dessutom tillåter kolonnsystemet oss att testa hypoteser om hur de geokemiska förhållandena regleras mikrobiell aktivitet. Till exempel, har det varit en hypotesd att höga Fe (II) koncentrationer i Precambrian uppvällning system kan ha begränsad produktion foto syre på grund av toxiciteten hos Fe (II) i solbelyst, syre miljöer 20. Framtida undersökningar kommer dessutom innehålla kemiska flöden och volympriser som gör kvalitativa och kvantitativa stökiometriska beräkningar av reaktionskinetik i den konstgjorda vattenmassan. Enkel observationer kommer sedan kopplas för att utvärdera en modell för enskilda miljö simuleringar. Med kolonnen inrättas, kan vi nu att undersöka den direkta stress av (cyano-) bakterier till flöden av hög Fe (II) och ljus i en in-situ upwelling system som representerar marina Tidig Earth villkor 20. Kolonnen kan också användas för att testa hypoteser angående de geokemiska signaturer som produceras av mikrobiell aktivitet, t ex utvecklingen av Fe isotopkompositioner längs en uppvällningsområdet där Fe (II) oxideras (t.ex. Czaja etal.) 30. Dessutom kunde de glaspärlor som stabiliserar de kemiska gradienter inom spalten ersättas med sand eller sediment. Därför är det också möjligt att tillämpa den här kolumnen för simuleringar av geokemiska gradienter som kan utvecklas i marina organismer eller sötvattenssediment bebos av mikroorganismer (t.ex. Melton et al.) 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Mark Nordhoff medverkat i utformningen och genomförandet av slanganslutningar. Ellen Struve hjälpte till att välja ut och förvärva utrustning som används.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Widdel flask (5 L) | Ochs | 110015 | labor-ochs.de |
| Glass bottles (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com |
| Glass pipettes (5 ml) | 51714 | labor-ochs.de | |
| 0.22 µm Steritop filter unit (0.22 µm Polyethersulfone membrane) | Millipore | X337.1 | carlroth.com |
| Aluminum foil | |||
| Sterile Luer Lock glass syringe, filled with cotton | C681.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock stainless steel needles (150 mm, 1.0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | |
| NaCl | Sigma | 433209 | sigmaaldrich.com |
| MgSO4 | Sigma | 208094 | sigmaaldrich.com |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | sigmaaldrich.com |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | sigmaaldrich.com |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | sigmaaldrich.com |
| KBr | Sigma | P3691 | sigmaaldrich.com |
| KCl | Sigma | P9541 | sigmaaldrich.com |
| Glass cylinder | Y310.1 | carlroth.com | |
| Glass wool | 7377.2 | carlroth.com | |
| Glass beads (ø 0.55 - 0.7 mm) | 11079105 | biospec.com | |
| Butyl rubber stopper (ø 1.2 cm) | 271024 | labor-ochs.de | |
| Petri Dish, glass (ø 8.0 cm) | T939.1 | carlroth.com | |
| Polymers glue | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |
| Optical oxygen sensor foil (for oxygen analysis, see below) | – on request – | presens.de | |
| Rubber tubing (35 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, Luer lock male = LLM) | P343.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, Luer lock female = LLF) | P335.1 | carlroth.com | |
| Rubber tubing (25 mm, 0.72 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Rubber tubing (50 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock stainless steel needle (150 mm, 1.0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock glass syringe (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |
| Loose cotton | – | ||
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel needle (40 mm, 1.0 mm ID) | Sterican | 4665120 | bbraun.de |
| Luer Lock stainless steel needle (150 mm, 1.5 mm ID) | 201520 | labor-ochs.de | |
| position: Luer Lock female connector part at C.7 | |||
| Polymers glue | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |
| Stainless steel needle (120 mm, 0.7 mm ID) | Sterican | 4665643 | bbraun.de |
| Rubber tubing (40 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Heat shrink tubing (35 mm, 3 mm ID shrunk) | 541458 - 62 | conrad.de | |
| Tube clamp | STHC-C-500-4 | tekproducts.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock plastic cap (LLM) | CT69.1 | carlroth.com | |
| Glass bottle (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com |
| Butyl rubber stopper (for GL45) | 444704 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel capillary (300 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Stainless steel capillary (50 mm, 0.74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |
| Shrink tubing (35 mm, 3 mm ID shrunk) | 541458 - 62 | conrad.de | |
| Rubber tubing (100 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock glass syringe (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |
| Loose cotton | – | ||
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Stainless Steel needle (40 mm, 0.8 mm ID) | Sterican | 4657519 | bbraun.de |
| Luer lock glass syringe (5 ml) | C679.1 | carlroth.com | |
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 mm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Rubber tubing (40 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Glass bottle (2 L) | Rotilabo | X716.1 | carlroth.com |
| Butyl rubber stopper (for GL45) | 444704 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel capillary (50 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Rubber tubing (30 mm x 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Rubber tubing (100 mm x 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock 3-way connector (LLF, 2x LLM) | 6134 | cadenceinc.com | |
| Light source | Samsung | SI-P8V151DB1US | samsung.com |
| Peristalic pump | Ismatec | EW-78017-35 | coleparmer.com |
| Pumping tubing (0.89 mm ID) | EW-97628-26 | coleparmer.com | |
| Stainless steel capillary (200 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Stainless steel capillary (400 mm, 0.74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |
| Supel-Inert Foil (Tedlar - PFC) gas pack (10 L) | 30240-U | sigmaaldrich.com | |
| Rubber tube (30 mm, 6 mm ID) | 770300 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, LLM) | P343.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, LLF) | P335.1 | carlroth.com | |
| Gas-tight syringe (20 ml) | C681.1 | carlroth.com | |
| Bunsen burner | – | ||
| Fiber optic oxygen meter for oxygen quantification | Presens | TR-FB-10-01 | presens.de |
| Vacuum pump | – | ||
| Silicone glue for oxygen optodes | Presens | PS1 | presens.de |
References
- Lyons, T. W., Reinhard, C. T., Planavsky, N. J. The rise of oxygen in Earth's early ocean and atmosphere. Nature. 506 (7488), 307-315 (2014).
- Raymond, J., Blankenship, R. E.
- Kendall, B., Reinhard, C. T., Lyons, T., Kaufman, A. J., Poulton, S. W., Anbar, A. D. Pervasive oxygenation along late Archaean ocean margins. Nature Geosci. 3 (9), 647-652 (2010).
- Olson, S. L., Kump, L. R., Kasting, J. F. Quantifying the areal extent and dissolved oxygen concentrations of Archean oxygen oases. Chem. Geol. 362 (1), 35-43 (2013).
- Satkoski, A. M., Beukes, N. J., Li, W., Beard, B. L., Johnson, C. M. A redox-stratified ocean 3.2 billion years ago. Earth Planet. Sci. Lett. 430 (1), 43-53 (2015).
- Holland, H. D. Oceans - Possible Source of Iron in Iron-Formations. Econ. Geol. 68 (7), 1169-1172 (1973).
- Holland, H. D., Lazar, B., Mccaffrey, M.
- Klein, C., Beukes, N. J. Time distribution, stratigraphy, and sedimentologic setting, and geochemistry of Precambrian iron-formations. The Proterozoic Biosphere. Schopf, J. W., Klein, C. , Cambridge University Press. 139-146 (1992).
- Poulton, S. W., Canfield, D. E. Ferruginous Conditions: A Dominant Feature of the Ocean through Earth's History. Elements. 7 (2), 107-112 (2011).
- Busigny, V., et al. Iron isotopes in an Archean ocean analogue. Geochim. Cosmochim. Acta. 133, 443-462 (2014).
- Crowe, S. A., et al. Photoferrotrophs thrive in an Archean Ocean analogue. PNAS. 105 (41), 15938-15943 (2008).
- Jones, C., et al. Biogeochemistry of manganese in ferruginous Lake Matano, Indonesia. Biogeosciences. 8 (10), 2977-2991 (2011).
- Lliros, M., et al. Pelagic photoferrotrophy and iron cycling in a modern ferruginous basin. Sci. Rep. 5 (13803), (2015).
- Koeksoy, E., Halama, M., Konhauser, K. O., Kappler, A. Using modern ferruginous habitats to interpret Precambrian banded iron formation deposition. Int. J. Astrobiol. , 1-13 (2015).
- Canfield, D. E. A new model for Proterozoic ocean chemistry. Nature. 396 (6710), 450-453 (1998).
- Wu, W. F., et al. Characterization of the physiology and cell-mineral interactions of the marine anoxygenic phototrophic Fe(II) oxidizer Rhodovulum iodosum - implications for Precambrian Fe(II) oxidation. FEMS Microbiol. Ecol. 88 (3), 503-515 (2014).
- Hungate, R. E., Macy, J. The Roll-Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes. Bull. Ecol. Res. Comm. 17 (1), 123-126 (1973).
- Van Baalen, C. Studies on marine blue-green algae. Bot. mar. 4 (1-2), 129-139 (1962).
- Sakamoto, T., Bryant, D. A. Growth at low temperature causes nitrogen limitation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Arch. Microbiol. 169 (1), 10-19 (1998).
- Swanner, E. D., Mloszewska, A. M., Cirpka, O. A., Schoenberg, R., Konhauser, K. O., Kappler, A. Modulation of oxygen production in Archaean oceans by episodes of Fe(II) toxicity. Nature Geosci. 8 (2), 126-130 (2015).
- Stookey, L. L. Ferrozine - a New Spectrophotometric Reagent for Iron. Anal. Chem. 42 (7), 779-784 (1970).
- Fitch, M. W., Koros, W. J., Nolen, R. L., Carnes, J. R. Permeation of Several Gases through Elastomers, with Emphasis on the Deuterium Hydrogen Pair. J. Appl. Polym. Sci. 47 (6), 1033-1046 (1993).
- Smith, A. J. B., Beukes, N. J., Gutzmer, J. The Composition and Depositional Environments of Mesoarchean Iron Formations of the West Rand Group of the Witwatersrand Supergroup, South Africa. Econ. Geol. 108 (1), 111-134 (2013).
- Johnson, C. M., Beard, B. L., Klein, C., Beukes, N. J., Roden, E. E. Iron isotopes constrain biologic and abiologic processes in banded iron formation genesis. Geochim. Cosmochim. Acta. 72 (1), 151-169 (2008).
- Krepski, S. T., Emerson, D., Hredzak-Showalter, P. L., Luther, G. W., Chan, C. S. Morphology of biogenic iron oxides records microbial physiology and environmental conditions: toward interpreting iron microfossils. Geobiology. 11 (5), 457-471 (2013).
- Posth, N. R., Konhauser, K. O., Kappler, A. Microbiological processes in banded iron formation deposition. Sedimentology. 60 (7), 1733-1754 (2013).
- Maliva, R. G., Knoll, A. H., Simonson, B. M. Secular change in the Precambrian silica cycle: Insights from chert petrology. Geol. Soc. Am. Bull. 117 (7-8), 835-845 (2005).
- Kappler, A., Pasquero, C., Konhauser, K. O., Newman, D. K. Deposition of banded iron formations by anoxygenic phototrophic Fe(II)-oxidizing bacteria. Geology. 33 (11), 865-868 (2005).
- Krepski, S. T., Hanson, T. E., Chan, C. S. Isolation and characterization of a novel biomineral stalk-forming iron-oxidizing bacterium from a circumneutral groundwater seep. Environ. Microbiol. 14 (7), 1671-1680 (2012).
- Czaja, A. D., Johnson, C. M., Beard, B. L., Roden, E. E., Li, W. Q., Moorbath, S. Biological Fe oxidation controlled deposition of banded iron formation in the ca. 3770 Ma Isua Supracrustal Belt (West Greenland). Earth. Planet. Sci. Lett. 363 (1), 192-203 (2013).
- Melton, E. D., Schmidt, C., Kappler, A. Microbial iron(II) oxidation in littoral freshwater lake sediment: the potential for competition between phototrophic vs. nitrate-reducing iron(II)-oxidizers. Front. Microbiol. 3 (197), 1-12 (2012).
