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Simulación de un laboratorio de hierro (II) ricos sistema de afloramiento Precámbrico marina para explorar el crecimiento de bacterias fotosintéticas

Published: July 24, 2016 doi: 10.3791/54251
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Geosciences, University of Tuebingen, 2Department of Geological and Atmospheric Sciences, Iowa State University

Summary

Hemos simulado un sistema de afloramiento marino ferruginosa Precámbrico en una columna de flujo continuo vertical, a escala de laboratorio. El objetivo era comprender cómo los perfiles geoquímicos de O 2 y Fe (II) evolucionar a medida que las cianobacterias producen O2. Los resultados muestran el establecimiento de una chemocline debido a la oxidación Fe (II) por fotosintéticamente producido O 2.

Abstract

Un concepto convencional para la deposición de algunas formaciones de hierro bandeado Precámbricos (BIF) parte de la premisa de que el hierro ferroso [Fe (II)] afloramiento de fuentes hidrotermales en el océano Precámbrico se oxida por el oxígeno molecular [O 2] producido por las cianobacterias. Los BIFs más antiguos, depositados antes de la Gran Oxidación (GOE) en alrededor de 2,4 billón años (Gy) hace, podrían haberse formado por la oxidación directa de Fe (II) mediante anoxigénicas photoferrotrophs en condiciones anóxicas. Como método para probar los patrones geoquímicas y mineralógicas que se desarrollan en diferentes escenarios biológicos, hemos diseñado una columna de flujo continuo vertical de 40 cm de largo para simular un anóxica Fe (II) ricos representante de un antiguo océano sistema de afloramiento marino a escala de laboratorio . El cilindro se llena con una matriz de perlas de vidrio poroso para estabilizar los gradientes geoquímicos, y muestras líquidas para la cuantificación de hierro podría ser tomado a lo largo de la columna de agua. El oxígeno disuelto sedetectado de forma no invasiva a través de optodes desde el exterior. Los resultados de los experimentos bióticos que participan los flujos de corrientes ascendentes de Fe (II) de la parte inferior, un gradiente de luz distinta de la parte superior, y cianobacterias presentes en la columna de agua, muestran una clara evidencia de la formación de Fe (III) precipitados minerales y el desarrollo de un chemocline entre Fe (II) y O 2. Esta columna nos permite probar las hipótesis para la formación de los BIFs mediante el cultivo de cianobacterias (y en el futuro photoferrotrophs) en condiciones simuladas marinos precámbricos. Por otra parte la hipótesis de que nuestra columna concepto permite la simulación de diversos ambientes químicos y físicos - incluyendo los sedimentos marinos o lacustres superficiales.

Introduction

El Precámbrico (4.6 a 0,541 Gy atrás) ambiente experimentó un aumento gradual de la fotosíntesis produce oxígeno (O2), quizás marcada por cambios bruscos en la denominada "Gran Oxidación" (GOE) aproximadamente a 2,4 Gy atrás, y de nuevo en el Neoproterozoico (1 a 0,541 Gy atrás) como O 2 atmosférico se acercó a los niveles modernos 1. Las cianobacterias son los restos evolutivos de los primeros organismos capaces de fotosíntesis oxigénica 2. Geoquímicas y la evidencia de modelado estudios apoyan el papel de los ambientes costeros poco profundos en albergar comunidades activas de cianobacterias o organismos capaces de fotosíntesis oxigénica o fototrofas oxigénica, generando oasis de oxígeno locales en la superficie del océano por debajo de un ambiente anóxico predominantemente 3-5.

La deposición de formaciones de hierro bandeado (BIF) del agua de mar a través de los puntos del Precámbrico al hierro (II) (Fe (II)) como una importante c geoquímicaonstituent de agua de mar, al menos localmente, durante su deposición. Algunos de los más grandes BIFs son depósitos de aguas profundas, formando fuera de la plataforma continental y el talud. La cantidad de Fe depositado es incompatible desde un punto de vista del balance de masa con (es decir, a la intemperie) fuente predominantemente continental. Por lo tanto, gran parte de la Fe debe haber sido suministrada desde la alteración hidrotermal del fondo marino o máfica ultramáfica corteza 6. Las estimaciones de la tasa de Fe depositados por fuera de los ambientes costeros son consistentes con Fe (II) que se suministra a la superficie del océano a través de la surgencia 7. Con el fin de Fe a ser transportado en las corrientes de surgencia, debe haber estado presente en la forma reducida, móvil - como Fe (II). El estado de oxidación medio de Fe conservado en BIF es 2,4 8 y por lo general se cree que BIF preservar Fe deposita en forma de Fe (III), que se forma cuando la surgencia Fe (II) se oxidó, posiblemente por el oxígeno. Por lo tanto, la exploración de los posibles mecanismos de oxidación de Fe (II) a lo largo de la pendiente environmeNTS es importante entender cómo se formó el BIF. Por otra parte, refinado caracterización geoquímica de sedimentos marinos ha identificado que las condiciones ferruginosas, donde se encontraba presente en una columna de agua anóxica Fe (II), fueron una característica persistente de los océanos en todo el Precámbrico, y no siempre se han limitado a sólo el tiempo y el lugar donde BIF fueron depositados 9. Por lo tanto, durante al menos dos mil millones de años de historia de la Tierra, las interfaces entre redox Fe (II) y O 2 en los océanos poco profundos eran probablemente un lugar común.

Numerosos estudios utilizan sitios modernos que son análogos químicos y / o biológicos de diferentes características del océano Precámbrico. Un buen ejemplo son los lagos, donde ferruginosas Fe (II) es estable y está presente en las aguas superficiales iluminadas por el sol, mientras que la actividad fotosintética (incluyendo por las cianobacterias) fue detectado 10-13. Los resultados de estos estudios proporcionan información sobre las características geoquímicas y microbianas de un óxica a anóxicas / ferchemocline ruginous. Sin embargo, estos sitios son generalmente estratificados físicamente con poca mezcla vertical 14, en lugar de las interfaces químicas que se producen en un sistema de surgencia, y se cree que apoyar la producción más oxígeno en la era precámbrica 4.

Un análogo natural para explorar el desarrollo de un oasis marino de oxígeno por debajo de una atmósfera anóxica, y por un sistema de afloramiento rico en Fe (II) en la columna de agua de la superficie iluminada por el sol no está disponible en la Tierra moderna. Por lo tanto, se necesita un sistema de laboratorio que pueden simular una zona de surgencia ferruginosas y también apoyar el crecimiento de las cianobacterias y photoferrotrophs. La comprensión y la identificación de los procesos microbianos y su interacción con un medio acuoso que representa la surgencia de agua de mar Precámbrico promueven la comprensión y pueden complementar la información obtenida del registro de la roca con el fin de entender completamente los procesos biogeoquímicos distintivos en la antigua Tierra. Con ese fin, una columna a escala de laboratorio fue diseñado en el que se bombeó Fe (II) ricos en medio de agua de mar (pH neutro) en la parte inferior de la columna, y se bombea hacia fuera de la parte superior. La iluminación fue proporcionada en la parte superior para crear un 4 cm de ancho "zona fótica" que apoya el crecimiento de cianobacterias en la parte superior 3 cm. Los ambientes naturales son generalmente estratificada y estabilizado por los gradientes físico-químicas, como la salinidad o la temperatura. Con el fin de estabilizar la columna de agua sobre una escala de laboratorio, el cilindro columna fue empaquetada con una matriz de perlas de vidrio poroso que ayudó a mantener el establecimiento de patrones geoquímicos que se desarrollaron durante el experimento. Un flujo continuo de gas N 2 / CO 2 se aplicó para eliminar el espacio de cabeza de la columna con el fin de mantener una atmósfera anóxica reflectante de un océano antes de la GOE 15. Después se estableció un flujo constante de Fe (II), las cianobacterias se inocularon a través de la columna, y su growth fue supervisado por el recuento de células en muestras tomadas a través de los puertos de muestreo. El oxígeno se controló in situ mediante la colocación de láminas de optodos sensibles al oxígeno en la pared interior del cilindro de la columna y las mediciones se realizaron con una fibra óptica desde el exterior de la columna. especiación acuosa Fe se cuantificó mediante la eliminación de las muestras de los puertos de muestreo horizontal de profundidad de resolución temporal y se analizó con el método FerroZine. Los experimentos de control abióticos y resultados demuestran la prueba de concepto - que un análogo de escala de laboratorio de la columna de agua antiguo, mantenido en aislamiento de la atmósfera, es alcanzable. Las cianobacterias crecieron y produjeron oxígeno, y las reacciones entre Fe (II) y oxígeno eran resolubles. En este documento, se presenta la metodología para el diseño, preparación, montaje, ejecución y toma de muestras de tal columna, junto con los resultados de un plazo de 84 h de la columna mientras se inocularon con la cianobacteria marina Synechococcus sp. PCC 7002.

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Protocol

1. Preparación de cultivo Medio

Nota: La información sobre el equipo necesario, los productos químicos y materiales para la preparación del medio de cultivo se muestra en la Tabla 1 itálicos códigos alfanuméricos entre paréntesis se refieren a los equipos detallados en la Tabla 2 y se muestra en la Figura 1..

  1. Preparar 5 litros de Marina fototrofo (MP) medio (denominado en lo sucesivo como "medio") siguiendo el protocolo de Wu et al. 16. Ajustar el pH a 6,8 usando HCl anóxica y estéril de 1 o 0,5 M NaCO3. Como fuente para el Fe (II), añadir 3,5 ml de una M anóxica 1 y estéril FeCl 2 solución al lograr una Fe final (II) de concentración de 500 mM después de filtrar la solución del medio en el paso siguiente.
  2. Almacenar la solución del medio a 5 ° C durante 48 horas con el fin de precipitar el carbonato y fosfato Fe (II) minerales. Fe (II) de suma y Fe resultados precipitación mineral en un pH el cambio, por lo tanto, volver a ajustar el pH de nuevo a 6,8. Filtrar el medio en una anóxica (100% N 2) de la guantera a través de una unidad de 0,22 micras filtro. Dispensar el medio filtrado en un frasco estéril de 5 l de vidrio (E.'1) dentro de una caja de guantes, y la tapa con un tapón de goma de butilo estéril.
  3. Enjuague el espacio de cabeza de la botella de medio con N 2 / CO 2 (v / v, 90/10) mediante la inserción de una aguja desechable conectado a la línea de gas en el tapón, y una segunda aguja que actúa como un orificio de ventilación. Asegúrese de cambiar el volumen del espacio de cabeza 10 veces. Por ejemplo, con un flujo de gas constante de 10 ml / seg, enjuagar el volumen del espacio de cabeza de 50 ml durante al menos 50 seg (comparar Hungate y Macy 17).
  4. Cubra la botella medio (E), que ahora está listo para usar con papel de aluminio y se almacena a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad para evitar la foto-oxidación de Fe (II). Permitir 3 días en preparación de medios.

2. Preparación de la Cultura

"> Nota:.. La cultura de Synechococcus sp PCC 7002 que se utiliza en el experimento de la columna se describe como marinos unicelulares género cianobacterias photoheterotrophic 18 Se fue proporcionada por el Dr. M. Eisenhut (Instituto de Bioquímica Vegetal, Universidad de Düsseldorf, Alemania) . Para el estudio actual del cultivo madre se hizo crecer en un medio anóxico MP sin Fe adicional (II).

  1. Preparar 100 ml de medio MP siguiendo el protocolo de Wu et al. 16 pero el cloruro férrico sustituto con 1 ml de citrato de amonio / L férrico a 6 mg / ml.
  2. En condiciones anóxicas (guantera, N2 100%), dispensar el medio en uno 120 ml botella de suero estéril, tapa con un tapón de goma de butilo estéril y engarzado con una cápsula de aluminio. Cambiar el espacio de cabeza de N 2 / CO 2 (v / v, 90/10) (comparar Hungate y Macy 17) e inocular con 5% del cultivo madre. Posteriormente almacenar el cultivo en una incubadora de luz a 25 ° C y 600 Lux a partir de una TunGsten bombilla.
  3. Desde Synechococcus sp. PCC 7002 es fotosensible, después de la transferencia, cubre la botella de suero con una toalla de papel fino para las primeras 24 horas de luz dentro de la incubadora. Deje que el cultivo crezca durante 6-8 días. La actividad fotosintética dará lugar a la oxidación de Fe no será estática para la escala de tiempo de crecimiento celular (II) y Fe (II), por lo tanto, transferir el cultivo después de 7 días para mantener Fe (II) en el medio y las células adaptadas a Fe (II).
  4. Monitor de la densidad celular mediante la toma de muestras para mediciones de la densidad óptica (DO): La densidad celular (células / ml) del cultivo se puede determinar a través de la absorbancia de la muestra de suspensión celular en una foto-espectrómetro para una longitud de onda de 750 nm 19. Una relación lineal entre OD 750 y el recuento de células microscópicas directas de una cultura en la fase de registro determinará la densidad absoluta de celda 20.
  5. Tan pronto como una densidad celular de 10 8 células / ml se alcanza,envolver la botella de suero con papel de aluminio con el fin de detener la producción de oxígeno por fotosíntesis.
  6. Retire el O 2 en la suspensión de células mediante el uso de un filtro de jeringa estéril de 0,22 micras unida a una larga (100 mm) aguja desechable insertado en el medio líquido. Enjuague el espacio de cabeza y la burbuja de la cultura con N2 / CO2 durante 5 min (comparar Hungate y Macy 17). Mantenga la muestra en la oscuridad hasta que la inoculación en la columna.

3. Preparación de artículos y piezas individuales para el montaje experimental

Nota: La información sobre el equipo necesario para la puesta en marcha experimental, cantidades y características se enumeran en la Tabla 2.   Las partes de los artículos que serán utilizados para el montaje experimental se preparan con antelación y están etiquetados individualmente con una sola letra mayúscula (AG), que se enumeran en la Tabla 2 y se muestran como primeros planos en la Figura 1 también. itálicas códigos alfanuméricos entre paréntesis en el protocolo se refieren a los equipos detallados en la Tabla 2 y se muestran en la Figura 1.

  1. Con el fin de preparar a los puertos de muestreo (D) para la columna, cerrar los puertos con tapones de caucho butílico de ajuste hermético (A.3). Inserte una aguja de acero inoxidable (D. ') en el tapón de goma de butilo. Asegúrese de que la punta de la aguja está en el centro de la columna.
    1. Conectar la aguja a un tubo de goma (D.2) y sellar la conexión con un tubo termorretráctil (D.3). Una el otro extremo del tubo para un pequeño conector Luer tubo de bloqueo ( 'D.5), sellar la conexión con un tubo termorretráctil (D.3) y cubrir el conector de tubo con una tapa de plástico apropiado (D.6) .
      Nota: Dependiendo del número deseado de orificios de muestreo es necesario para proporcionar un puerto principal con varios puertos de muestreo - therefovolver a insertar las agujas de acero inoxidable (D.1) en un ángulo oblicuo en el tapón de goma de butilo.
  2. Con el fin de conectar las botellas medianas y de descarga de la columna, modificar tapones de caucho butilo siguientes los siguientes pasos:
    1. Inserte dos capilares de acero inoxidable (E.3, E.4) en el tapón de goma de butilo (E.2). Conectar los tubos de goma apropiados (E.6) a estos capilares y sellar la conexión con los tubos de termocontracción (E.5).
    2. Añadir un conector de tubo (E.7) al otro extremo del tubo del capilar más largo (E.3) y también solucionar este conector con un tubo termorretráctil (E.5).
    3. Conectar una aguja de acero inoxidable (E.11) al extremo libre del otro tubo conectado al capilar más corta (E.4), sellar las conexiones con termorretráctil tubos (E.5), e inserte el otro extremo de la aguja de acero inoxidable en un tapón de goma de butilo más pequeño (E.10). Inserte dos capilares de acero inoxidable (G.3) en un tapón de goma de butilo grande (G.2) y adjuntar los tubos apropiados de goma (G.4); G.5. Conectar el extremo libre del tubo de goma corto (G.4) a un capilar de descarga botella medio (w2). Equipar el extremo libre del tubo más largo (G.5) con un conector de tubo pequeño (G.6). Repita estos pasos con el fin de preparar otro tapón de goma de butilo para una segunda botella de descarga.
  3. Preparar el tapón para el panel de distribución de fluido (F) mediante la inserción de dos agujas de acero inoxidable (F.3) en un tapón de goma de butilo (F.2) con el fin de producir dos líneas de medios de suministro para la columna. Adjuntar un tubo de goma (F.4) a cada una de las agujas y conecte un capilar botella medio (c1) a uno de los tubos de goma, respectivamente.
  4. A fin de preparar las glándulas de la línea de suministro de medio (B), conecte un mediocapilar de alimentación (c2) a un conector de tubo pequeño (B.3) con un tubo de goma (B.4). Repita este paso para la otra glándula de suministro del medio.
    1. Utilice el capilar de descarga más largo medio (W1) en lugar de preparar las glándulas de la línea de descarga medio y siga los pasos anteriores (compárese (B) en la figura 1).
      Nota: Es muy útil para etiquetar entrada y de salida con diferentes colores de cinta para ayudar en el montaje adecuado.
  5. Montar las piezas para el panel de intercambio de gases del espacio de cabeza (C) mediante la inserción de bloqueo Luer dos largas agujas de acero inoxidable (C.2) en un tubo de goma (C.1) y asegúrese de que las puntas de las agujas alcanzan 4 cm por fuera del otro extremo de la tubería. Llenar el tubo con pegamento Polímeros (C.8) y deje que el montaje en seco durante al menos 6 horas.
    1. Sin apretar llenar dos jeringas de vidrio cierre Luer (C.3) con algodón (C.4).
    2. Por separado, preparar dos frotación de butiloBER topes (C.5), uno con una aguja de acero inoxidable insertado (C.6) y el otro con una aguja de acero inoxidable (C.7). No conecte a las jeringas de vidrio, sin embargo.
  6. Preparar una jeringa de vidrio (E.8) lleno de algodón (E.9) para su uso posterior en línea con el paquete de botella y medio gas (GP).
  7. Se monta el equipo para un paquete de gas 10 L (GP) mediante la conexión de un tubo de goma (GP.1) en la válvula de gas de la manada. Insertar un conector de tubo (gp.2) en el extremo libre del tubo de goma. Repita este procedimiento para un segundo paquete de gas de 10 l.

4. Esterilización de la columna y el Equipo

Nota: Dependiendo de las propiedades de los materiales, el equipo se esteriliza por uno de los tres métodos siguientes:

  1. Esterilizar el equipo de vidrio mediante secado al horno (180 ° C durante 4,25 horas):
    1. Esterilizar el equipo necesario para hacer media (véase sección 1.2) por separado y con antelación. Por lo tanto, preparar 2 x 5 botellas de vidrio L y cubrir la abertura y el cuello de botella con papel de aluminio. Paquete de 4 x 5 ml y 5 x 2 ml pipetas de vidrio en un recipiente resistente al calor y horno-esterilizar todo el equipo.
    2. Esterilizar el equipo para la columna establecido en una segunda etapa. Envolver las jeringas de vidrio (C.3; E.8; F.1 - preparado en la sección 3) con papel de aluminio y asegurarse de que los correspondientes tapones de caucho de butilo se eliminan.
    3. Colocar las perlas de vidrio (A.2) en un vaso de vidrio y cubrir la parte superior con papel de aluminio. También cubrir la placa de vidrio transparente (A.4), 4 x conectores de tubos grandes (B.2) y el conector de 3 vías (G.7) ​​con papel de aluminio y horno a esterilizar todo.
  2. Esterilizar en autoclave plásticos y líquidos en autoclave (120 ° C, 10 bar, 20 min):
    1. En el primer paso, steRilize el matraz Widdel con el medio, la solución -buffer NaHCO3 y 2 tapones de goma de butilo para la botella de vidrio de 5 l.
      Nota: tapones de goma de butilo se preparan primero por ebullición en agua ultrapura 3 veces y después en autoclave en un vaso de precipitados de vidrio con un poco de agua, cubierto con papel de aluminio. Los tapones húmedas son más fáciles de insertar en las botellas de vidrio.
    2. En una segunda etapa de esterilizar el equipo para la columna de montaje experimental. Con el fin de preparar la columna para la esterilización en el autoclave, envuelva la abertura superior, las rejillas de suministro de medios de comunicación, las salidas de descarga medios de comunicación, y la cámara de aire de ventilación con papel de aluminio antes de esterilizar.
    3. Cubrir los orificios de muestreo (D.'5) con los tapones de plástico apropiados (D.'6) y asegúrese de retirar las abrazaderas (D.4) antes de esterilizar.
    4. Envolver los tapones de goma de butilo y los capilares correspondientes para las botellas medianas y vaciado (E.2; 2 x G.2 - i preparadan la sección 3), los tapones más pequeños para las jeringas de vidrio (2 x C.5; E.'10 '; F.'2 - preparada en el apartado 3) y los capilares conectados a las glándulas de suministro y descarga medianas (s2; w1 - preparado en la sección 3.4) en papel de aluminio y esterilizar todo el equipo en el autoclave.
    5. Después de la esterilización, se seca la columna y equipo esterilizado en un horno a 60 ° C durante otras 4 horas.
  3. Dado que el tubo de la bomba (pt) no es esterilizable en autoclave, esterilizar en una solución de etanol (EtOH) (80% de EtOH, 20% de agua). Llenar un vaso de precipitados adecuado con EtOH-solución y colocar el tubo de la bomba en el mismo, asegurando que el tubo está completamente lleno de EtOH-solución. Tomar después de 3 horas y se envuelven directamente en papel de aluminio pre-esterilizada (horno-esterilizado) y dejar secar a temperatura ambiente durante 2 horas.

5. Montaje de la columna y el Equipo

  1. Colocar la columna (A) sobre una superficie plana y estabilizar con un soporte de laboratorio y abrazaderas. Asegúrese de trabajar en condiciones estériles (por ejemplo, dentro de 40 cm de un mechero Bunsen o bajo una campana de flujo laminar). Retire con cuidado el papel de aluminio de apertura superior y rellenar las perlas de vidrio esterilizados (A.2).
    1. Preparar el vidrio de reloj (A.4) con el fin de cerrar herméticamente la columna mediante la aplicación de la cola Polímeros (A.5) a la superficie interior en la zona donde va a estar en contacto con la columna. Pulse ligeramente el vidrio de reloj en su lugar en la parte superior de la columna con el fin de pegar las dos partes estrechamente juntos. Deje por lo menos 6 horas para la instalación se seque.
      Nota: Es posible colocar un alambre maleable estéril, bien entre el borde de la columna y el vidrio de reloj, con el fin de eliminar fácilmente el vidrio de reloj después del experimento.
  2. Mientras se trabaja en condiciones estériles unir las piezas siguientes a la columna:
    1. Conectar los tubos de goma (B.1) y los correspondientes conectores de tubo (B.2) a las rejillas de suministro y de descarga medianas (compárese con (B) en la figura 1).
    2. Conectar los conectores de tubos de las glándulas (B.3) para el suministro de los medios de comunicación y la descarga (preparado en el apartado 3.4) a los conectores correspondientes en la columna (compárese con (B) en la figura 1).
    3. Coloque el panel de intercambio de gases del espacio de cabeza (compárese con (C) en la Figura 1 - preparada en el apartado 3.5) a la cámara de aire de ventilación en la columna y conectar las jeringas de vidrio (C.3) a las correspondientes agujas de acero inoxidable (C.2) y de inserción los tapones de caucho butílico apropiadas (C.6; C.7 - preparados en la sección 3.5.2) en las jeringas de vidrio forrado de algodón (C.3).
  3. Inserte los tapones de goma de butilo para las botellas de disparo (2 x G.20; - preparado en el apartado 3.2) en dos frascos de vidrio 3 L estériles (G.1), y conecte los conectores de tubos de las botellas (G.6) al conector de 3 vías (G.7).
  4. Conectar el extremo libre del capilar glándula de descarga medio (w1) en el extremo libre de un capilar botella de descarga (w2) con tubo de bomba (pt). Repita este procedimiento para el segundo capilar glándula de descarga media y la segunda botella de descarga.
  5. Conectar el extremo libre de un capilar botella medio (s1) al extremo libre del capilar glándula de suministro del medio (S2) con el tubo de la bomba (pt). Repita este procedimiento para el segundo capilar botella medio y el segundo capilar glándula de suministro del medio.
  6. Montar el panel de distribución de fluido mediante la inserción del tapón con los capilares correspondientes (F.2 - preparada en el apartado 3.3) en la jeringa de vidrio del mediopanel de distribución (F.1).
  7. Conectar el panel de distribución de medio al conector del tapón de goma de butilo para la botella medio (E.7 - comparar F en la figura 1).
  8. Conecte la línea 2 de gas N / CO2 al panel de intercambio de gases del espacio de cabeza a la Luer Lock aguja de acero inoxidable (ver posición (LLF) en la Figura 1), y lavar la instalación de la columna y el sistema capilar con N2 / CO2 a baja presión (<10 mbar). Mantener una salida de gas en los extremos abiertos de los capilares botella medio (E.3), el 3-way conector (G. 7), y los puertos de muestreo (D.5). Por lo tanto, asegúrese de tener las tapas de los puertos de muestreo (D.6) ligeramente abiertas, para mantener las condiciones estériles a través de una sobrepresión de gas que fluye hacia fuera.
    1. Enjuague la instalación completa durante al menos 20 min.
      Nota: Además, es posible cerrar la outgassiaguja ng (C.6) del panel de intercambio de gases del espacio de cabeza con un tubo de goma apropiado y una abrazadera con el fin de aumentar la eficiencia de lavado de la instalación completa.
  9. Mientras tanto, llenar una bolsa de gas 10 L (gp) con N 2 / CO 2 (v / v, 90/10), después de 10 rondas de llenado y de purga (usando una bomba de vacío) todo el volumen para asegurar la bolsa es completamente anóxica . Asegúrese de cerrar la válvula del envase de gas después del llenado final. Repita este procedimiento con un segundo paquete de gas, pero cerrar la válvula después de la desaireación (es decir, dejar en blanco).
    Nota: El paquete lleno de gas N 2 / CO 2 estará conectado a la botella de medio con el fin de compensar el volumen de espacio de cabeza en aumento debido a la pérdida de medio mediante bombeo. El N2 / CO2 enrojeció, pero el paquete de gasolina vacío, después se conectará a las botellas de disparo con el fin de permitir que el gas se escape el espacio de cabeza debido al aumento de volumen de descarga de líquido.
  10. inserción tél butilo tapón de goma (E.10 - preparado en el apartado 3.2.3) con la jeringa de vidrio estéril llena de algodón (E.8 - preparada en el apartado 3.6).
  11. Coloque la botella medio llena y cerrada (E - preparado en el apartado 1) en el banco de laboratorio junto al tapón para la botella medio (E.2), y preparar para conectar el tapón a la botella de medio utilizando el siguiente procedimiento:
    1. Cierre el flujo de gas N 2 / CO 2 en el capilar (E.3) cerrando el tubo de goma correspondiente (E.5) con una abrazadera de manguera.
    2. Ligeramente levantar el tapón de goma de butilo de la botella de medio y lavar el espacio de cabeza con N 2 / CO 2 (50 mbar) en la horca a, algodón jeringa -filled esterilizado con una inclinación, la aguja larga de metal (1 mm x 140 mm) en el cuello de botella de la botella medio (comparar Hungate y Macy 17).
      3. (E.2) en la botella de medio (E).
    3. Cambie la aguja de metal largo de la jeringa (utilizado anteriormente para el lavado del espacio de cabeza) a una aguja desechable (0,9 mm x 45 mm; ampliamente disponible) e inyectar en el tapón con el fin de lavar el espacio de cabeza de la botella de medio con N 2 / CO 2.
    4. Asegúrese de tener un ligero flujo de salida de gas en el extremo abierto de la jeringa de gas (E.8 - montado en la sección 5.10) conectado al tapón de la botella de medio. Enjuague el espacio de cabeza de la botella de medio (E) y la jeringa de vidrio (E.8) durante al menos 4 min.
  12. Mientras tanto, apretar los tapones de plástico (D.6) de los puertos de muestreo (D.'5) y cerrar el correspondiente tubo de goma (D.2) con una pinza (D.4).
    Nota: Si es necesario, abra elaguja desgasificación (C.6) del panel de intercambio de gases del espacio de cabeza de nuevo con el fin de mantener una salida de gas en el extremo abierto de la aguja.
  13. Coloque la bolsa de gas de 10 litros, llena de N2 / CO2 (preparado en la sección 5.9), en la mesa de laboratorio. Asegúrese de que el conector de tubo está en una posición próxima al extremo abierto de la jeringa de vidrio (E.8) conectado a la botella de medio.
  14. Después de inundar el espacio de cabeza de la botella medio (E) por lo menos durante 4 min, cierre la línea de gas N 2 / CO 2 de la jeringa de lavado y rápidamente tirar de la aguja de inyección hacia fuera del tapón (E.2). Ser liberado La sobrepresión restante de gas en el espacio de cabeza de la botella medio será a través de la jeringa de vidrio (E.8).
    1. Abrir rápidamente la válvula del paquete de gas y presione ligeramente en la bolsa para mantener una salida de N 2 / CO 2 con el fin de limpiar el tubo y el conector del paquete de gas.
    2. Tan pronto como la sobrepresión se libera de la botella de medio, conectar rápidamente el conector del paquete de gas (gp.3) al conector correspondiente de la jeringa de vidrio (E.8).
  15. Conectar una bolsa de vacío de 10 litros de gas (GP) que anteriormente se enrojeció 10 veces con N2 / CO2 (preparado en la sección 5.9) al puerto libre del conector de 3 vías (G.7) ​​conectado a las botellas de disparo. Asegúrese de mantener la válvula del envase de gas cerrado.
  16. Reducir la presión de la línea de N 2 / CO 2 gas (<0,1 mbar) en el panel de intercambio de gases del espacio de cabeza (C en la Figura 1; posición LLF) para mantener un flujo de salida de gas de la aguja de salida de gases (C.6).
  17. Insertar el tubo de la bomba (PT) en la bomba (P) y retire la abrazadera de la manguera desde el tubo de goma correspondiente (E.6) de la botella medio (E).
    1. Abra la válvula del envase de gas (GP)conectado a las botellas de descarga (g) para que el aire que se libera en el paquete de gas, mientras que las botellas de descarga se llenan con medio de flujo de salida.
  18. Arranca la bomba y controlar el panel de distribución de fluido (véase (F)) llenar con el medio. Asegúrese de eliminar el gas que queda en el panel ya que se llena sosteniéndolo en una posición invertida. se libera gas a través de los capilares que están conectados a la bomba.
  19. Monitor de la columna ya que se llena con medio, y ajustar la bomba a una velocidad de bombeo adecuada de 0,45 L / día, que se puede convertir a un flujo vertical de Fe 10 mM (II) / m 2 / d, con el fin de simular el flujo químico de interés.
  20. Instalar la fuente de luz (L) 2 cm por encima del extremo superior de la columna y cubrir los 10 cm superior alrededor de la columna con una cinta oscuro y / o papel de aluminio con el fin de evitar que la luz se irradia hacia fuera de la parte superior de la columna y la iluminación de la parte inferior de la columna. Cubrir la totalidadla instalación de una cubierta textil oscuro con el fin de evitar que la iluminación de la columna de fuentes de luz externas.

6. La inoculación de las bacterias en la columna

Nota: Para un experimento de control abiótico se salta este paso.

  1. Dado que el cultivo celular se inyecta directamente en la columna a través de los tapones de goma de butilo de los principales puertos de muestreo a lo largo del lado de la columna, asegúrese de tener preparada seis jeringas con agujas que son lo suficientemente largo como para alcanzar el centro del cuerpo de la columna.
  2. Esterilizar el exterior de los tapones de caucho de butilo de los seis puertos principales de muestreo en la columna (A.3) con una solución de EtOH (80%).
  3. Tener la botella de suero con el cultivo para la inoculación listo (preparado en el apartado 2) y esterilizar el tapón de goma de butilo mediante flameado varias gotas de solución de EtOH. Enjuague la jeringa con estéril N2 / CO2 antes de tomar una alícuota del cultivo. Tomar 1 ml de of la solución de células anóxicas e inyectarla en el centro de la columna a través de los tapones de goma de butilo de los principales puertos de muestreo (A.3).
    Nota: Dependiendo del crecimiento bacteriano, puede ser necesario ajustar la velocidad de bombeo (o incluso dejar de bombeo) durante los primeros días de la fase de retraso para el crecimiento celular y el desarrollo para evitar que los cultivos de ser lavado.

7. Muestreo

Nota: Con el fin de recoger muestras a través de los gradientes químicos que se desarrollan dentro de la columna, es necesario para iniciar el muestreo de los puertos de muestreo superior antes de los puertos más profundas, como se produce la pérdida de volumen. Asegúrese de que para mantener las condiciones estériles (por ejemplo, trabajando dentro de 40 cm de un quemador Bunsen o bajo una campana de flujo laminar).

  1. Recoger las primeras muestras de 24 horas después de la inoculación. Enjuague la jeringa que se usará para el muestreo con N estéril 2 / CO 2, con el fin de evitar la inyección de oxígeno en el sapuertos mpling (D). Asegúrese de llenar la jeringa con N2 / CO2 antes del muestreo.
  2. Eliminar rápidamente la tapa de plástico (D.6) e inserte la jeringa de muestreo en el conector de tubo (D.5). Mantener un pequeño espacio entre la jeringa y el conector de tubo. Liberar el gas de la jeringa y enjuagar el conector de tubo con N 2 / CO 2.
    1. Conectar firmemente la jeringa en el conector de tubo. Retire la abrazadera (D.4) y empezar a tomar una muestra de aproximadamente 1 ml.
  3. Después de extraer la muestra y antes de retirar la jeringa, fije la abrazadera (D.4). A continuación, retire la jeringa de muestreo y cerrar firmemente el conector del tubo (D.5) con la tapa de plástico correspondiente (D.6).
  4. Inmediatamente repetir los pasos 7.1-7.3 para el muestreo de cada puerto.
  5. Recoger el siguiente conjunto de muestras cada 24 horas.
    Nota: para muestras adicionales en diferentes intervalos de tiempo, es necesario eliminar una pequeña amporte de la muestra (por ejemplo, 0,2-0,4 ml) inicialmente antes de la muestra puede ser tomada, con el fin de eliminar el medio residual en el interior del tubo de muestreo y para lograr muestras representativas desde el interior de la columna.

8. Métodos de análisis

  1. Oxygen cuantificación:
    Nota: La concentración de oxígeno dentro del medio de flujo a través y el espacio de cabeza de la columna se cuantifica de forma no invasiva y no destructiva usando los sensores ópticos de oxígeno y el oxígeno sensible parches de papel de aluminio fluorescentes de 0,5 x 0,5 cm (los llamados optodes), pegada a lo largo de la pared de cristal interior de la columna utilizando pegamento de silicona (A.6). Se aseguró que el oxígeno parches de papel de aluminio sensibles son insensibles a las especies Fe con el fin de lograr lecturas fiables.
    1. Asegúrese de calibrar el software de ordenador con los parámetros de calibración apropiados para los optodes que se utilizan en la columna. Los sensores ópticos de oxígeno vienen con una calibrat específicaion para la medición utilizando un medidor de oxígeno correspondiente fibra óptica PC-controlada.
    2. Iniciar la medición y tener cuidado para mantener la fibra óptica de polímero de la metro de oxígeno en un ángulo recto a la lámina sensible al oxígeno que se pega dentro de la pared de cristal transparente de la columna.
    3. Repita la medición para cada punto de medición de O2 única en toda la columna.
  2. Fe (II) y el análisis de Fe total de muestras acuosas:
    1. Desde Fe (II) se oxida rápidamente por el oxígeno en el aire a pH neutro, estabilizar las muestras líquidas para acuosa Fe cuantificación (II) inmediatamente en solución 1 M de HCl. Para un volumen de muestra final de 1 ml de la mezcla de 0,5 ml de muestra de líquido con M HCl 0,5 ml 2.
    2. Cuantificar Fe total después de la incubación de una alícuota de la muestra 1 estabilizado-HCl M con hidrocloruro de hidroxilamina (10% p / v, en M HCl 1) durante 30 min. Este reactivo reduce todo el Fe (III) a Fe (II), que luego puede ser cuantificado mediante el ensayo de ferrozina
    3. Realizar una ferrozine ensayo usando un lector de placas de microtitulación. Medir la absorbancia a una longitud de onda de 562 nm. Asegúrese de tener estándares dentro de la gama de Fe detectable (II) y las concentraciones totales de Fe.
      Nota: Si las concentraciones de Fe en la muestra de líquido superan calibraciones estándar, es necesario diluir la muestra estabilizada con HCl 1.
    4. Calcular la concentración de Fe (III) por la diferencia entre el total Fe y Fe (II).

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Representative Results

experimento de control

Experimentos de control abiótico (10 días) muestran que las concentraciones consistentemente bajos de oxígeno (O2 <0,15 mg / L) sin fluctuaciones significativas en el Fe (II) -profile toda la columna de agua afloramiento. La formación de precipitados (presumiblemente Fe (III) (oxyhydr-) óxidos) en el depósito de medio y la ligera disminución de la concentración global Fe (II) a partir de 500 mM a 440 mM más de 10 días indican algunos de difusión de oxígeno a través de conexiones de goma (por ejemplo, E.6; GP.1 en la figura 1) 22 para este experimento, las concentraciones de oxígeno más bajas que eran razonablemente posible eran ≤0.15 mg / L y está en el rango de una cuantificación sensible al oxígeno y por encima del límite de detección de. 0,03 mg / L. los valores de oxígeno por debajo de 0,15 mg / L son, por el remainder de este artículo se refiere como "anoxia".

experimento biótico

Parámetros visibles, el crecimiento celular, y cambios en la columna de agua

Antes de la inoculación en el día 0 no hay precipitados eran visibles (Figura 2 A). Esto indicó que la columna fue configurado correctamente y que no hay oxígeno estaba presente (comparar Figura 3 A) que podría dar lugar a la oxidación de Fe (II) y la formación de Fe (III) precipitados. Como resultado, la concentración de Fe (II) fue constante a lo largo de la columna de agua corriente ascendente como se muestra en el perfil en la Figura 4A. Figura 2 A muestra que el gradiente de la luz se redujo a los superiores 6 cm dentro de lacolumna de agua mediante el uso de la matriz de perlas de vidrio en el cilindro de la columna.

El color verde dentro de los 2.0 cm superiores de la columna el agua 84 hr después de la inoculación indica el crecimiento de las cianobacterias (Figura 2 B). La banda de color naranja claro notable a una profundidad de -3 cm (resaltada por la flecha en la Figura 2 B) por debajo de la banda de color verde se debe a la FE-precipitados que se formaron durante la oxidación de Fe (II) por el oxígeno molecular, producido por las cianobacterias. precipitados similares también fueron visibles en la superficie de la columna de agua. Espuma de color naranja claro formado en la columna de agua de la superficie 84 horas después de la inoculación (Figura 2 B) que indica la producción de O 2 por las cianobacterias. Los precipitados en la superficie de la columna de agua, presumiblemente formado debido a que el oxígeno que está en la desgasificaciónsuperficie. Residual Fe (II) se oxida con el tiempo en la superficie y precipitados en la matriz de perlas de vidrio formada.

gradiente de oxígeno

Antes de la inoculación en el día 0, se determinó la concentración inicial de O 2 en el medio líquido. Figura 3 A muestra claramente que la concentración de O 2 a lo largo de toda la columna de agua estaba siempre por debajo de la concentración presente en el experimento de control. El pre-inoculación O2 -Concentración nunca excedió los valores de 0,13 mg / LO 2 (O2 media = 0,099 ± 0,002 mg / L). Esto indica que la columna era anóxico antes de la inoculación.

Figura 3 B muestra un aumento de la concentración de O 2 en84 horas después de la inoculación con las cianobacterias. Esto, junto con la biomasa verde visible (Figura 2 B) son compatibles con la producción fotosintética y la acumulación de O 2 en la columna. La concentración de O 2 después de 84 horas alcanza una concentración máxima de O 2 = 29.87 mg / L en una profundidad de -0.5 cm por debajo de la superficie de la columna de agua. Los valores de O 2 en la Figura 3 B indican que los niveles de O 2 fueron siempre por encima de la concentración de fondo en la parte superior de 8,5 cm dentro de la columna de agua (O 2> 0,15 mg / l). Notablemente alta concentraciones de O 2 (> 0,50 mg / l) se detectaron -0,5 a -5,5 cm de profundidad por debajo de la superficie de la columna de agua. Las concentraciones más bajas de O 2 ≤ 0,15 mg / L a profundidades por debajo de -10.5 cm, junto con el valor más bajo medido de O2 = 0,09 mg / L a una profundidad de -20.5 cm indican que thesáreas correos eran anóxica.

Fe gradiente (II)

La figura 4 A muestra que el Fe (II) de concentración en el día 0, antes de la inoculación con las cianobacterias, fue constante a lo largo de la columna de agua con una concentración media de Fe (II) media = 282,6 ± 6,8 mM. La concentración en el depósito de medio en el día 0 era Fe depósito (II) = 320,4 ± 11,6 M.

84 h después de la inoculación con cianobacterias la concentración de Fe (II) se redujo considerablemente en los superiores 9 cm dentro de la columna de agua. Figura 4 B muestra una Fe (II) de gradiente distinta, donde las concentraciones de Fe (II) disminuyen a la superficie superior de la columna de agua. Sin embargo, Fe (II) todavía era detectable en la superficie de la columna de agua. Th e más bajo Fe (II) concentración detectada era directamente debajo de la superficie del medio líquido a una profundidad de -0.9 cm. Fe (II) concentraciones aumentó con la profundidad de Fe (II) = 9,9 ± 2,8 M en el -0,9 cm a Fe (II) = 258,6 ± 3,1 micras, con una profundidad de -8.9 cm, formando una lineal positiva empinada Fe (II) de gradiente sobre la profundidad ([Fe (II) d] (d = 1,278 +) ∙ 0,031 -1; d: profundidad (cm) ; R2 = 0,9694) limitada a los superiores de 6,8 cm. Áreas en el medio líquido por debajo de -9 cm de profundidad permanezcan claramente constante y no muestran una disminución significativa en sus concentraciones de Fe (II) en comparación con sus valores iniciales de Fe (II) en el día 0 (T-test; p> 0,05).

Figura 1
Figura 1. Esquema experimento creó. Los códigos alfanuméricos para artículos se refieren a piezas que se indican en la Tabla 2.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54251/54251fig1large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
La Figura 2. Cambios visibles en la matriz de perlas de vidrio a lo largo del cilindro de la columna antes y 84 horas después de la inoculación con las cianobacterias. Cuadrados de color rosa son los sensores de oxígeno. (A) Cierre de los superiores 6 cm de la columna establecido antes de la inoculación. La columna llena de líquido que muestra un gradiente de luz visible. La matriz de perlas de vidrio se reduce el gradiente de luz visible para los superiores 6 cm.   (B) Cerca de la parte superior de 6 cm 84 horas después de la inoculación. El color verde indica la biomasa visible, más denso en la parte superior de la columna en la intensidad de la luz es más alta. La flecha indica una banda de color naranja apenas visible, que resultó de la formación de Fe(III) precipita debido a la oxidación Fe (II) por O molecular 2 producido por las cianobacterias. espuma de color naranja ligeramente visible en la parte superior de la superficie de la columna de agua indica Fe (III) también está precipitando allí. O 2 desgasificación a través de la superficie hace que la formación de espuma de la Fe (III) precipitados. (C) Descripción general del cilindro columna llena. El crecimiento visible de las cianobacterias se limita a los 4 cm superiores debido a la disponibilidad limitada de la luz con la profundidad. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Perfil de oxígeno dentro de la columna de agua antes y 84 horas después de la inoculación con las cianobacterias. Zero cm de profundidad en el eje y indica el colu aguasuperficie mn. Los valores positivos para profundidades se refieren al espacio de cabeza por encima del nivel medio líquido, mientras que los valores negativos representan profundidades dentro de la columna de agua. Tenga en cuenta la escala logarítmica para O 2 concentraciones en el eje x. La línea discontinua vertical indica el umbral para condiciones anóxicas (O 2 ≤ 0,15 mg / L).   (A) el perfil de oxígeno [0h] antes de la inoculación. Los valores de O2 eran constantemente por debajo de 0,13 mg / L en toda la columna de agua. (B) Perfil de oxígeno 84 horas después de la inoculación. O 2 estaba por encima de 0,5 mg / L en la parte superior de 5,5 cm de columna de agua. Concentraciones de O 2 fueron más altas que las concentraciones de fondo (≥ 0,15 mg / L, línea discontinua) en zonas por encima de la profundidad -8,5 cm. Zonas más profundas eran anóxica con O2 ≤ 0,15 mg / l. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4
Figura 4. Perfil de Fe (II) en la columna de agua antes y 84 horas después de la inoculación con las cianobacterias. Nota: Las barras de error representan repeticiones técnica deducidas a partir de mediciones por triplicado de una muestra en el ensayo FerroZine. (A) Fe (II) Perfil [0h] antes de la inoculación. Los valores de Fe (II) fueron constantes en toda la columna de agua con un valor medio de Fe (II) media = 282,6 ± 6,8 mM. Las variaciones en el Fe (II) resultado el perfil de cuantificaciones solo de ejemplo Fe (II). Fe cuantificación (II) en las muestras por triplicado probablemente conduciría a una menor variación. (B) Fe (II) el perfil 84 hr después de la inoculación. Notablemente más bajas concentraciones (II) Fe en la parte superior de 6,8 cm dentro de la columna de agua. Fe (II) valores por debajo de la profundidad -8.9 cm muestran una mayor Fe(II) las concentraciones que no difieren significativamente de los valores iniciales de Fe (II) antes de la inoculación con las cianobacterias (T-test, p <0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Equipo Cantidad Descripción del Artículo detalles de información
Marca N º de pedido. dirección de referencia
1 matraz Widdel (5 L) Ochs 110015 labor-ochs.de
2 Las botellas de vidrio (5 L) Rotilabo Y682.1 carlroth.com
3 pipetas de vidrio (5 ml) 51714 labor-ochs.de
1 0,22 micras unidad de filtro Steritop (0,22 micras de polietersulfona membrana) Millipore X337.1 carlroth.com
0,5 m 2 Papel de aluminio -
Suministros - N 2 - guantera (100% de N2) -
- N2 / CO2 - gas (90/10, v / v; 50 mbar) -
1 Estéril jeringa de vidrio Luer Lock, lleno de algodón C681.1 carlroth.com
1 agujas de acero inoxidable Luer Lock (150 mm, 1,0 mm de diámetro) 201015 labor-ochs.de
productos químicos 4,8 L MQ-agua -
para solución del medio de 5 L 100 gramos NaCl 433209 sigmaaldrich.com
34 g MgSO 4 208.094 sigmaaldrich.com
7,5 g CaCl 2 C4901 sigmaaldrich.com
1,25 g NH4Cl A9434 sigmaaldrich.com
0,34 g KH 2 PO 4 P5655 sigmaaldrich.com
0,45 g KBr P3691 sigmaaldrich.com
3,3 g KCl P9541 sigmaaldrich.com
200 ml Anóxica Na solución -buffer 2 HCO 3 (22 mM) -
15 mg El selenio y la solución de tungstato (comp. Wu et al., 2014) -
5 ml Na 2 S 2 O 3 solución (1 M) -
2,5 ml Solución de vitaminas marina fototrofo (MP) (comp. Wu et al., 2014) -
5 ml MP oligoelemento solución (comp. Wu et al., 2014) -
Referencia
Wu, W., Swanner, ED, Hao, LK, Zeitvogel, F., Obst, M., Pan, YX, y Kappler, A. (2014). Caracterización de la fisiología celular y minerales interacciones del fototrófico anoxigénica marina Fe (II) oxidante Rhodovulum iodosum - implicaciones para la oxidación Precámbrico Fe (II). FEMS Microbiology Ecology, 88 (3), 503-515.

Tabla 1. Preparación Medio. Lista de equipamiento, suministros y productos químicos para la preparación del medio de cultivo.

<td> <td>
Cant. Árbitro. Descripción del Artículo detalles de información
para 1 (UN) cilindro de cristal Y310.1 carlroth.com * Encargo modificada por la planta de fabricación de vidrio
2 g (A.1) Lana de vidrio 7377.2 carlroth.com
1,03 L (A.2) Las cuentas de vidrio (ø 0,55 - 0,7 mm) 11079105 biospec.com
6 (A.3) tapón de goma de butilo (Ø 1,2 cm) 271.024 labor-ochs.de
1 (A.4) Placa de Petri, de vidrio (Ø 8,0 cm) T939.1 carlroth.com
40 ml (A.5) Los polímeros de pegamento OTTOSEAL S68 adchem.de
11 (A.6) oxígeno lámina de sensor óptico (para el análisis de oxígeno, véase a continuación) - bajo pedido - presens.de
para 4 (SEGUNDO) medio Glándulas
4 (B.1) tubo de goma (35 mm, 7 mm de diámetro) 770.350 labor-ochs.de
4 (B.2) conector del tubo Luer Lock (3,0 mm, bloqueo Luer macho = LLM) P343.1 carlroth.com
4 (B.3) conector del tubo Luer Lock (3,0 mm, bloqueo Luer hembra = LLF) P335.1 carlroth.com
4 (B.4) tubo de goma (25 mm, 0,72 mm ID) 2600185 newageindustries
.com
para 1 (DO) Panel de espacio de cabeza Intercambio de Gases
1 (C.1) tubo de goma (50 mm, 7 mm ID) 770.350 labor-ochs.de
2 (C.2) aguja de acero inoxidable Luer Lock (150 mm, 1,0 mm de diámetro) 201015 labor-ochs.de
2 (C.3) jeringa de vidrio Luer Lock (10 ml) C680.1 carlroth.com
2 g (C.4) suelta de algodón -
2 (C.5) tapón de goma de butilo (ø 1,75 cm) 271.050 labor-ochs.de
1 (C.6) aguja de acero inoxidable (40 mm, 1,0 mm ID) Sterican 4665120 bbraun.de
1 (C.7) aguja de acero inoxidable Luer Lock (150 mm, 1,5 mm de diámetro) 201520 labor-ochs.de
(LLF) Posición: connecto hembra Luer Lockr parcial en C.7
10 ml (C.8) Los polímeros de pegamento OTTOSEAL S68 adchem.de
para 1 (RE) puerto de muestreo
1 (D.1) aguja de acero inoxidable (120 mm, 0,7 mm de diámetro) Sterican 4665643 bbraun.de
1 (D.2) tubo de goma (40 mm, 0,74 mm de diámetro) 2600185 newageindustries
.com
2 (D.3) tubo de contracción por calor (35 mm, 3 mm de diámetro interior encogido) 541458-62 conrad.de
1 (D.4) abrazadera del tubo STHC-C-500-4 tekproducts.com
1 (D.5) conector del tubo Luer Lock (1,0 mm, LLF) P334.1 carlroth.com
1 (D.6) tapa de plástico Luer Lock (LLM) CT69.1 carlroth.com
para 1 (MI) botella medio
1 (E.1) Botella de cristal (5 L) Rotilabo Y682.1 carlroth.com
1 (E.2) tapón de goma de butilo (por GL45) 444704 labor-ochs.de
1 (E.3) capilar de acero inoxidable (300 mm, 0,74 mm de diámetro) 56736 sigmaaldrich.com
1 (E.4) capilar de acero inoxidable (50 mm, 0,74 mm ID) 56737 sigmaaldrich.com
4 (E.5) Tubo retráctil (35 mm, 3 mm de diámetro interior encogido) 541458-62 conrad.de
2 (E.6) tubo de goma (100 mm, 0,74 mm de diámetro) 2600185 newageindustries
.com
1 (E.7) conector del tubo Luer Lock (1,0 mm, LLF) P334.1 carlroth.com
1 (E.8) jeringa de vidrio Luer Lock (10 ml) C680.1 carlroth.com
1 g (E.9) suelta de algodón -
1 (E.10) tapón de goma de butilo (ø 1,75 cm) 271.050 labor-ochs.de
1 (E.11) Aguja de acero inoxidable (40 mm, 0,8 mm de diámetro) Sterican 4657519 bbraun.de
para 1 (F) Panel de distribución medio
1 (F.1) jeringa de vidrio Luer Lock (5 ml) C679.1 carlroth.com
1 (F.2) tapón de goma de butilo (ø 1,75 mm) 271.050 labor-ochs.de
2 (F.3) aguja de acero inoxidable (40 mm, 0,8 mm de diámetro) Sterican 4657519 bbraun.de
2 (F.4) tubo de goma (40 mm, 0,74 mm de diámetro) 2600185 newageindustries
.com
para 2 (GRAMO) botellas de disparo
2 (G.1) Botella de cristal (2 l) Rotilabo X716.1 carlroth.com
2 (G.2) tapón de goma de butilo (por GL45) 444.704 labor-ochs.de
4 (G.3) capilar de acero inoxidable (50 mm, 0,74 mm ID) 56736 sigmaaldrich.com
2 (G.4) tubo de goma (30 mm x 0,74 mm de diámetro) 2600185 newageindustries
.com
2 (G.5) tubo de goma (100 mm x 0,74 mm ID) 2600185 newageindustries
.com
2 (G.6) conector del tubo Luer Lock (1,0 mm, LLF) P334.1 carlroth.com
1 (G.7) Luer Lock conector de 3 vías (LLF, 2x LLM) 6134 cadenceinc.com
equipamiento adicional
1 (L) Fuente de luz Samsung SI-P8V151DB1US samsung.com
1 (PAG) Bomba peristáltica Ismatec EW-78017-35 coleparmer.com
4 (Pt) tubo de bombeo (0,89 mm ID) EW-97628-26 coleparmer.com
4 (S1 / 2) capilar de acero inoxidable (200 mm, 0,74 mm de diámetro) 56736 sigmaaldrich.com
4 (W3 / 4) staicapilar de acero NLES (400 mm, 0,74 mm ID) 56737 sigmaaldrich.com
2 (GP) Paquete de gas (10 L) - Supel-Foil inerte (PFC Tedlar) 30240-U sigmaaldrich.com
con 2 (GP.1) tubo de goma (30 mm, 6 mm ID) 770.300 labor-ochs.de
1 (Gp.2) conector del tubo Luer Lock (3,0 mm, LLM) P343.1 carlroth.com
1 (Gp.3) conector del tubo Luer Lock (3,0 mm, LLF) P335.1 carlroth.com
Suministros 2 - N / CO 2 2 - línea de gas (90/10, v / v; 50mbar) -
2 - Hermético de jeringa (20 ml) C681.1 carlroth.com
1 - mechero Bunsen -
1 - La fibra óptica medidor de oxígeno para la cuantificación de oxígeno Presens TR-FB-10-01 presens.de
1 - Bomba aspiradora -
1 - pegamento de silicona para optodes oxígeno Presens PS1 presens.de
-: Artículos marcados con un guión (-) están generalmente disponibles y no comoelemento ESPECÍFICOS

Tabla 2. Columna puesta a punto. Las cantidades, los números de referencia alfanuméricos y descripciones de los artículos de equipo para la puesta en marcha experimental.

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Discussion

Las comunidades microbianas en el océano Precámbrico fueron regulados por, o modificados como resultado de, su actividad y las condiciones geoquímicas imperantes. En la interpretación de los orígenes de BIF, los investigadores generalmente inferir la presencia o actividad de los microorganismos basado en la sedimentología o geoquímica de BIF, por ejemplo, Smith et al. 23 y Johnson et al. 24. El estudio de los organismos modernos en ambientes modernos que tienen análogos geoquímicos a ambientes antiguos es también un valioso enfoque, por ejemplo, Crowe et al. 11 y Koeksoy et al. 14. Un tercer enfoque es la utilización de organismos modificados en los sistemas de laboratorio que simulan los procesos que tienen lugar en el océano Precámbrico, por ejemplo, Krepski et al. 25. Este tipo de enfoque es útil para probar hipótesis específicas, y eliminar los factores biológicos que pueden estar presentes en los sistemas modernos química o, pero no eranparte del océano Precámbrico (por ejemplo, plantas acuáticas y animales). Por lo tanto, se presenta un método de prueba de concepto para un sistema de surgencia dinámica, de laboratorio, en el que la actividad de las bacterias (ciano-) y su influencia en el resultado perfiles geoquímicos se puede evaluar en condiciones controladas de laboratorio. Nuestra columna puede ser utilizado para probar hipótesis acerca de los organismos y procesos que contribuyen a la deposición del BIF, y las firmas biológicas retenidos en BIF.

Hemos optimizado el protocolo para la configuración de la columna para que el montaje es fácilmente comprensible y conducible. Sin embargo, algunos pasos en el protocolo deben abordarse con cuidado y lo ideal sería llevado a cabo con la ayuda de una persona que ayuda. En particular, la conexión de las botellas medianas al cilindro de la columna necesita ser realizada rápidamente a fin de evitar la contaminación de la solución del medio con el oxígeno. El uso de equipo no estéril o trabajar bajo condiciones de laboratorio no estériles resultará in la contaminación del experimento y los resultados poco fiables. Por lo tanto, es una necesidad absoluta para esterilizar el equipo y mantener condiciones estériles (que trabaja en una campana de flujo laminar o 40 cm al lado de un mechero Bunsen) al configurar el experimento y la recogida de muestras. Además, algunos parámetros físico-químicas de la columna moral causado cambios químicos durante el largo tiempo de establecimiento de la columna en el experimento. Las partes que están hechas de tubo de goma parecen tener un coeficiente de difusión para el oxígeno que es lo suficientemente alta como para afectar de manera significativa la botella depósito de medio y conducir a la oxidación de Fe (II) y la precipitación mineral en la solución del medio. El consumo abiótica de> 10% de Fe (II) debido a la precipitación durante el experimento abiótico más de 10 días (a comparar: Los resultados representativos) necesita ser tomada en cuenta para futuros experimentos a largo plazo. La fuente de luz que se utilizó en el estudio actual creó un gradiente de luz dentro del hundimiento superior 6 cmde la columna. Los espectros de luz cubrió las longitudes de onda activas de fotosíntesis de la clorofila a y b en Synechococcus y permitió el crecimiento y la actividad fotosintética. De hecho, la fuente de luz es uno de los parámetros más importantes con respecto a los organismos fototrofos desde tanto, la calidad y la cantidad de luz pueden influir altamente bacterias fototrofos 11,13. Las variaciones de longitudes de onda y rangos espectrales, considerando también la radiación UV más alto durante el Precámbrico, pueden permitir más conocimientos sobre las reacciones de luz biogeoquímicos dependientes. Durante los experimentos de incubación de luz, nos dimos cuenta de que la luz se llevó a cabo a través de la pared de vidrio de la columna, la emisión de luz a través de los puertos de muestreo y en la parte inferior de la columna. Para futuros experimentos, el vidrio en la parte superior de la columna debe ser sustituido por material de vidrio no luz conductora. El gradiente de la luz debe ser medido en un simulacro de puesta a punto, ya que no había manera fácil y barata de medir el gradiente de luz dentro delsistema de columna cerrada disponible. Asumimos un cambio significativo en el tiempo de la profundidad máxima de penetración de la luz debido a la absorción de la luz por las células y minerales. La medición del gradiente de luz in situ durante el experimento será de interés para futuros experimentos. El uso de perlas de dispersión de luz en la matriz de perlas de vidrio y la cuantificación de la luz dispersada desde el exterior podría ser una posibilidad para cuantificar la disponibilidad de luz relativa en ciertas profundidades en el tiempo. Una mejora adicional incluiría una cubierta que no necesita estar pegado, pero podría ser fácilmente conectado y eliminado con una brida y una abrazadera que rodea. Un orificio de suministro de medios de comunicación y la descarga de 4 puntos resultaría en un campo de flujo más homogéneo dentro de la columna. Más estrecho posicionamiento de los principales puertos de muestreo para muestras líquidas se traduciría en una mayor resolución de muestreo de los gradientes biológicos y geoquímicos dentro de la columna.

Sin embargo, los primeros resultados demuestrand que la columna de flujo continuo vertical puede ser considerado como un apropiado montaje experimental para investigar los procesos microbianos y los cambios geoquímicas en un sistema de afloramiento. Sostenemos que esta columna sirve como un prototipo para demostrar la funcionalidad global del sistema. Supuestos Además, nuestros resultados validan, ampliamente difundidos, los resultados del modelo, e inferencias a partir de la geoquímica sedimentaria que un chemocline entre los resultados de Fe (II) de oxígeno y si cianobacterias están presentes en una Fe (II) ricos en el sistema 20 de surgencia. Las condiciones anóxicas antes de la inoculación reflejan un océano Precámbrico antes de la colonización por las cianobacterias o organismos capaces de fotosíntesis oxigénica. Con el aumento del oxígeno en las aguas superficiales, el afloramiento de Fe (II) se oxida y precipita como Fe (III) minerales, como ocurrió durante la deposición del BIF 26 .La creación de un chemocline y la formación de minerales puede ser evaluada para extrapolar geoquímica procesos en el entorno de mayor escalas. Sin embargo, para ampliación de la escala de los resultados evaluados a los ambientes naturales (antiguos), los procesos físicos adicionales deben ser considerados. Advectiva transporte lateral, por ejemplo, podría perturbar el establecimiento de un chemocline, lo mismo que las turbulencias inducidas por el viento en las aguas superficiales.

La extracción de muestras de líquido de la columna de agua para Fe (II), las mediciones de Fe total y el no invasiva O 2 cuantificación fueron capaces de realizar un seguimiento de la evolución de un frente de reacción entre estas especies químicas de una manera simple, rápida y fiable . La baja concentración de Fe (III) en muestras tomadas de la columna establecido en los experimentos de control abióticos indican claramente que aunque algunos de oxidación producido en la botella medios de comunicación, la propia columna se cerró herméticamente en O externo 2 afluencia. Además, estos resultados indican que nuestro protocolo de muestreo mantiene muestras anóxicas para Fe cuantificación (II). Los cambios en el pH no se registraron durante los experimen columnat y puede tener un efecto dominante sobre Fe-especiación. Sin embargo, el sistema de flujo pasante actual fue amortiguada por 22 mM NaHCO 3 que está en equilibrio con la anóxica N 2 / CO 2 atmósfera en el espacio de cabeza y permite mantener un pH circum-neutral durante al menos 84 h. Sin embargo, la cuantificación in situ de la pH puede ser un parámetro importante para entender completamente los procesos geoquímicas en potenciales experimentos a largo plazo y la extrapolación a (antiguos) sistemas de océano abierto. La matriz de perlas de vidrio, que se utiliza para estabilizar los gradientes geoquímicas establecen en el cilindro de la columna, dio lugar a una acumulación de Fe-precipitados en el subsuelo de la columna de agua. Nuestra hipótesis es que los precipitados acumulados no tienen un efecto dominante sobre nuestro experimento 84 horas. Sin embargo, la biomasa podría inducir la degradación de los procesos redox en Fe-precipitados que resultan en el ciclismo Fe. Esto debe tenerse en cuenta en relación con los posibles experimentos a largo plazo (<84 h). De hecho, la luzinducida por el ciclismo Fe-redox y una liberación de Fe a la piscina hierro ferroso se pudieron observar y cuantificados en los experimentos (Wu, W., Maisch, M., Kappler, A., Pan, Y. réplica a largo plazo (21 días) , y Swanner, ED fotoquímico Fe (III) de reducción estabilizado Fe (II) en los oasis de oxígeno Archean. Geología. (en prep.)).

experimentos de columna futuras incorporarán ambos diversos microorganismos y variaciones en la composición de medio de cultivo. Esto permite la simulación de diversas condiciones ambientales que son representativos para las diferentes etapas durante la transformación del Océano Precámbrico. Por ejemplo, la sílice puede ser añadido al medio para simular las concentraciones de 0,67 a 2,2 mM que estaban presentes en el agua de mar Precámbrico 27. Además, la concentración de sulfato en la solución del medio podría ser cambiado para hacer frente a variaciones en la composición del agua de mar Precámbrico. Las variaciones del medio de cultivo probablemente influirán en la physiology y el efecto de los microorganismos en los patrones geoquímicas en la columna de agua 19 que la configuración de la columna actual nos permite investigar in situ. Además de eso, los experimentos previstos implicarán comunidades microbianas más complejos tales como fototróficas Fe bacterias (II) -oxidizing (por ejemplo, Kappler et al.) 28, microaerophilic Fe (II) bacterias -oxidizing (por ejemplo, Krepski et al.) 29 y cianobacterias. Los experimentos de columna ayudarán a desmenuzar la contribución individual de estos procesos microbianos para la deposición de las formaciones de hierro en bandas. Sin embargo, para la interpretación y la extrapolación a los ambientes antiguos (y modernos), debe ser derivada con mucho cuidado. El hábitat microbiano que se simula en los modelos de estudio actuales tan sólo las funciones básicas de una columna de potencial hídrico Precámbrico afloramiento marino: flujos verticales de Fe (II), un gradiente de luz de la zona fótica, atmósfera anóxica y cianobacterias. En anunciocondición, las condiciones en el sistema de afloramiento artificial potencialmente favorecen el crecimiento de las cianobacterias, debido a las temperaturas constantes y 24 condiciones de luz hr potencialmente conducen a O 2 mayores tasas de producción, mientras que el O elevada 2 concentraciones posteriormente conduce a tasas más altas de Fe (II) de oxidación . Por lo tanto, el presente estudio no se puede interpretar como un experimento que sirva para todas las hipótesis sobre el origen del BIF.

Sin embargo, la configuración permite la investigación in situ de diversos procesos geoquímicos y la variación y la simulación de ciertas condiciones de contorno (la disponibilidad de luz, composición del medio, fundentes). La cuantificación de los parámetros individuales y las interacciones geoquímicas en condiciones de laboratorio controlado puede dar una visión de ambientes antiguos y modernos. Por otra parte, el sistema de columna nos permite poner a prueba hipótesis acerca de cómo las condiciones geoquímicas regulan la actividad microbiana. Por ejemplo, ha sido la hipótesisd que las altas concentraciones de Fe (II) en los sistemas de surgencia Precámbricos pueden haber limitado la producción fotosintética de oxígeno debido a la toxicidad de Fe (II), en ambientes oxigenados iluminadas por el sol 20. Las investigaciones futuras, además, incorporar los flujos químicos y tasas volumétricas que permiten a los cálculos estequiométricos cualitativos y cuantitativos de la cinética de reacción en la columna de agua artificial. observaciones individuales serán luego unidos para evaluar un modelo para simulaciones ambientales individuales. Con la columna configurado, ahora estamos en condiciones de investigar la respuesta de la tensión directa de bacterias (ciano-) a los flujos de alta Fe (II) y de la luz en un sistema de afloramiento in situ que representa las condiciones de la Tierra primitiva marinos 20. La columna también se puede utilizar para probar hipótesis acerca de las firmas geoquímicas producidos por la actividad microbiana, por ejemplo, la evolución de las composiciones isotópicas Fe lo largo de un sistema de afloramiento donde Fe se oxida (por ejemplo, Czaja et (II)al.) 30. Además, las perlas de vidrio que estabilizan los gradientes químicos dentro de la columna podría ser sustituido con arena o sedimentos. Es, por tanto, también es posible aplicar esta columna para simulaciones de los gradientes geoquímicos que podrían ocurrir en los sedimentos marinos o de agua dulce habitadas por microorganismos (por ejemplo, Melton et al.) 31.

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Disclosures

Los autores tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Marcos Nordhoff ayudó en el diseño e implementación de conexiones de la tubería. Ellen Struve ayudó a seleccionar y adquirir los equipos utilizados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Widdel flask (5 L) Ochs 110015 labor-ochs.de
Glass bottles (5 L) Rotilabo Y682.1 carlroth.com
Glass pipettes (5 ml) 51714 labor-ochs.de
0.22 µm Steritop filter unit (0.22 µm Polyethersulfone membrane) Millipore X337.1 carlroth.com
Aluminum foil
Sterile Luer Lock glass syringe, filled with cotton C681.1 carlroth.com
Luer Lock stainless steel needles (150 mm, 1.0 mm ID) 201015 labor-ochs.de
NaCl Sigma 433209 sigmaaldrich.com
MgSO4 Sigma 208094 sigmaaldrich.com
CaCl2 Sigma C4901 sigmaaldrich.com
NH4Cl Sigma A9434 sigmaaldrich.com
KH2PO4 Sigma P5655 sigmaaldrich.com
KBr Sigma P3691 sigmaaldrich.com
KCl Sigma P9541 sigmaaldrich.com
Glass cylinder Y310.1 carlroth.com
Glass wool 7377.2 carlroth.com
Glass beads (ø 0.55 - 0.7 mm) 11079105 biospec.com
Butyl rubber stopper (ø 1.2 cm) 271024 labor-ochs.de
Petri Dish, glass (ø 8.0 cm) T939.1 carlroth.com
Polymers glue OTTOSEAL S68 adchem.de
Optical oxygen sensor foil (for oxygen analysis, see below) – on request – presens.de
Rubber tubing (35 mm, 7 mm ID) 770350 labor-ochs.de
Luer Lock tube connector (3.0 mm, Luer lock male = LLM) P343.1 carlroth.com
Luer Lock tube connector (3.0 mm, Luer lock female = LLF) P335.1 carlroth.com
Rubber tubing (25 mm, 0.72 mm ID) 2600185 newageindustries.com
Rubber tubing (50 mm, 7 mm ID) 770350 labor-ochs.de
Luer Lock stainless steel needle (150 mm, 1.0 mm ID) 201015 labor-ochs.de
Luer Lock glass syringe (10 ml) C680.1 carlroth.com
Loose cotton  –
Butyl rubber stopper (ø 1.75 cm) 271050 labor-ochs.de
Stainless steel needle (40 mm, 1.0 mm ID) Sterican 4665120 bbraun.de
Luer Lock stainless steel needle (150 mm, 1.5 mm ID) 201520 labor-ochs.de
position: Luer Lock female connector part at C.7
Polymers glue OTTOSEAL S68 adchem.de
Stainless steel needle (120 mm, 0.7 mm ID) Sterican 4665643 bbraun.de
Rubber tubing (40 mm, 0.74 mm ID) 2600185 newageindustries.com
Heat shrink tubing (35 mm, 3 mm ID shrunk) 541458 - 62 conrad.de
Tube clamp STHC-C-500-4 tekproducts.com
Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) P334.1 carlroth.com
Luer Lock plastic cap (LLM) CT69.1 carlroth.com
Glass bottle (5 L) Rotilabo Y682.1 carlroth.com
Butyl rubber stopper (for GL45) 444704 labor-ochs.de
Stainless steel capillary (300 mm, 0.74 mm ID) 56736 sigmaaldrich.com
Stainless steel capillary (50 mm, 0.74 mm ID) 56737 sigmaaldrich.com
Shrink tubing (35 mm, 3 mm ID shrunk) 541458 - 62 conrad.de
Rubber tubing (100 mm, 0.74 mm ID) 2600185 newageindustries.com
Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) P334.1 carlroth.com
Luer Lock glass syringe (10 ml) C680.1 carlroth.com
Loose cotton  –
Butyl rubber stopper (ø 1.75 cm) 271050 labor-ochs.de
Stainless Steel needle (40 mm, 0.8 mm ID) Sterican 4657519 bbraun.de
Luer lock glass syringe (5 ml) C679.1 carlroth.com
Butyl rubber stopper (ø 1.75 mm) 271050 labor-ochs.de
Rubber tubing (40 mm, 0.74 mm ID) 2600185 newageindustries.com
Glass bottle (2 L) Rotilabo X716.1 carlroth.com
Butyl rubber stopper (for GL45) 444704 labor-ochs.de
Stainless steel capillary (50 mm, 0.74 mm ID) 56736 sigmaaldrich.com
Rubber tubing (30 mm x 0.74 mm ID) 2600185 newageindustries.com
Rubber tubing (100 mm x 0.74 mm ID) 2600185 newageindustries.com
Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) P334.1 carlroth.com
Luer Lock 3-way connector (LLF, 2x LLM) 6134 cadenceinc.com
Light source Samsung SI-P8V151DB1US samsung.com
Peristalic pump Ismatec EW-78017-35 coleparmer.com
Pumping tubing (0.89 mm ID) EW-97628-26 coleparmer.com
Stainless steel capillary (200 mm, 0.74 mm ID) 56736 sigmaaldrich.com
Stainless steel capillary (400 mm, 0.74 mm ID) 56737 sigmaaldrich.com
Supel-Inert Foil (Tedlar - PFC) gas pack (10 L) 30240-U sigmaaldrich.com
Rubber tube (30 mm, 6 mm ID) 770300 labor-ochs.de
Luer Lock tube connector (3.0 mm, LLM) P343.1 carlroth.com
Luer Lock tube connector (3.0 mm, LLF) P335.1 carlroth.com
Gas-tight syringe (20 ml) C681.1 carlroth.com
Bunsen burner –
Fiber optic oxygen meter for oxygen quantification Presens TR-FB-10-01 presens.de
Vacuum pump –
Silicone glue for oxygen optodes Presens PS1 presens.de

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References

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Maisch, M., Wu, W., Kappler, A., Swanner, E. D. Laboratory Simulation of an Iron(II)-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria. J. Vis. Exp. (113), e54251, doi:10.3791/54251 (2016).

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