Introduction
과립구 및 단핵구 식세포 / 산화 버스트 (OB) 활성 분석은 종종 장시간 집중 운동 다음 선천성 면역 기능에 대한 정보를 수집하는 데 사용되는 간단한 직선적 기술이다. 1-4 면역계의 반응을 연구 할 때 이들이 숙주 방어에서 중요한 역할을 감염 부위에 축적 한 최초의 면역 세포이기 때문에, 자극, 과립구 및 단핵구는 특히 중요하다. 5 호중구 과립구의 일종 손상된 근육시키다 최초 셀은 집중 운동 다음 티슈. 6 탐식 및 OB 활성 과립구 및 단핵구 기능 (7)의 가장 일반적인 방법이며 때문에 감염 과정 및 복구 프로세스 모두에서의 중추적 인 역할의 선천성 면역 세포 기능의 지표로서 바람직하다.
이 원고 utili에서 설명하는 분석ZES 기본적인 플로우 사이토 전혈 과립구 및 단핵구와 OB 탐식 활성의 정량적 측정을 제공한다. 이 분석은 시간 소모적 정제 과정없이 수행 될 수 있기 때문에 이러한 기술에서 전혈의 사용은 유리하다. 이러한 분석을 용이하게 연구 설계 및 실험실 기능의 다양성을 수용하기 위해 수정 될 수있다. 예를 들어, 리아 등. 그 호중구 OB 활동을 표시하는 유사한 기술을 이용 외상성 뇌 손상 후 증가되고 호중구 식세포 감소된다. (8) 또 다른 예에서, McFarlin는 외. 알로 사용하는이 기술은 우아한 변형 (APC 바와 )는 식세포 작용 및 OB 활동의 관점에서 과립구 분류 이미지 기반 유동 세포 계측법으로 CD66b 고성능 직렬 APC 공역 CD45 라벨링 π 공역. 7,9
우리의 연구 그룹은이 테의 다양한 적응을 사용하고있다거의 20 년 동안 과체중 비만, 체육 인구의 선천성 면역 기능의 지표로 chnique. 10, 11 텍스트 아래이 분석을 수행하기위한 단계별 지침과 독자를 제공하고 독자가 적응할 수있는 영역을 강조합니다 연구의 요구를 충족한다.
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Protocol
참고 : 모든 혈액 수집 절차는 애팔 래 치아 주립 대학 (ASU) 임상 시험 심사위원회 (IRB)에 의해 규정 된 지침에 따라 실시 하였다.
1. 분석 준비
- (특정 재료 / 장비의 표 참조), 수집 준비 및 절차에 지정된 재료를 구성 할 수 있습니다.
- 12 X 75mm 튜브 라벨.
- 라벨 각 참가자에 대한 두 개의 튜브 다음 식균 작용의 분석 및 OB 활동 분석을위한 하나의 튜브 (검정 잉크와 형광 염료에 대한 "F"[FITC]이 튜브 라벨)에 대해 하나의 튜브 (빨간 잉크와 함께이 튜브 라벨 " dihydroethidium에 대한 H "[HE).
참고 : 멸균 12 X 75mm 튜브의 사용은 의도하지 않은 세포 활성화 및 배경 잡음에 관련된 증가를 최소화하는 것이 좋습니다. - 합니다 (식균 작용 분석을 위해 FITC 제어를 하나의 튜브 : 분석 컨트롤에 대한 세 개의 튜브에 라벨을 검은 벨벳이 튜브에 라벨을K 잉크와 "F")는 OB 활동 분석을위한 하나의 튜브 (HE 제어 : 녹색 잉크로이 관 레이블 : 만 빨간 잉크와 "H") 및 음성 대조군에 대한 하나의 튜브 (혈액이 튜브에 라벨을 와 "혈액 만").
- 라벨 각 참가자에 대한 두 개의 튜브 다음 식균 작용의 분석 및 OB 활동 분석을위한 하나의 튜브 (검정 잉크와 형광 염료에 대한 "F"[FITC]이 튜브 라벨)에 대해 하나의 튜브 (빨간 잉크와 함께이 튜브 라벨 " dihydroethidium에 대한 H "[HE).
- 적어도 하루 분석의 일 전에 원액을 준비한다.
- 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS)를 준비합니다. 18.2 MΩ H 2 O. 900 ㎖로 10 배 PBS 100 ㎖ 묽은 0.2 μm의 필터로 살균 필터입니다. 사용까지 4 ° C에서 보관.
- 멸균 PBS-포도당을 준비합니다. PBS 100 ㎖ 글루코스 1.0 g을 녹인다. 0.2 μm의 필터로 살균 필터입니다. 사용까지 4 ° C에서 보관.
- 멸균 0.1 M 시트 레이트 버퍼를 준비합니다. 시트르산 1.2 g 및 18.2 MΩ H 2 O. 100ml에 구연산 나트륨 1.1 g을 녹이고 4.0 pH를 조정합니다. 0.2 μm의 필터로 살균 필터입니다. 사용까지 4 ° C에서 보관.
- 익스텐션 주식 솔루션을 준비합니다. 아르 자형esuspend 디메틸 설폭 사이드의 1.0 ㎖ (DMSO)에 HE 1.0 mg을. 사용할 때까지 -20 ° C에서 부드럽게, 나누어지는 및 저장을 섞는다.
- FITC 표지 된 황색 포도상 구균 (S. aureus에) 저장 용액 (2 × 109 입자 / ㎖)를 준비한다. FITC 표지 S.의 재현 탁 10 mg의 PBS 1.5 ㎖ (또는 적당량)의 구균. 제조업체의 권고에 따라 세 500 μL 씩과 초음파 처리로 나눈다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
- 레이블이없는 S. 준비 구균 스톡 용액 (2 × 109 입자 / ㎖). 레이블이없는 S. 100 mg의 재현 탁 PBS 15 ㎖ (또는 적당량)의 구균. 제조업체의 권장 사항에 따라 서른 500 μL 씩과 초음파 처리로 나눈다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
- 분석 당일 신선 가공 용액을 준비한다.
- 익스텐션 작업 솔루션을 준비합니다. 10 μl를 전송PBS-포도당의 990 μL에 고정 해제 HE 원액. 빛으로부터 보호하고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
- FITC 표지 S. 준비 구균 작업 용액 (133,333 개 / μL). 해동 FITC 표지 S.의 전송 70 μL PBS 980 μL에 구균 원액. 빛으로부터 보호하고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
- 레이블이없는 S. 준비 구균 작업 용액 (133,333 개 / μL). 해동 레이블이없는 S.의 전송 70 μL PBS 980 μL에 구균 원액. 빛으로부터 보호하고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
- 급랭 솔루션을 준비합니다. 멸균 0.1 M 시트 레이트 버퍼의 11.25 ml의 0.4 % 트리 판 블루 용액 750 μl를 추가합니다. 빙수 욕에서 사용할 때까지 보관.
- 공인 phlebotomist는 혈액을 그리기위한 세계 보건기구 (WHO)의 가이드 라인에 따라 혈액을 채취 있습니다.
- K 2 EDTA를 함유 한 4 ml의 혈관에 혈액을 그립니다. 에서제조업체의 지침에 따라 높이 요 혈관. 사용할 때까지 벤치 탑 로커에 실온에서 혈관을 유지합니다. 단계 1.2.1에 설명 된 백혈구 (WBC) 차동 분석 완전한 혈액 카운트 (CBC)이 혈액을 사용합니다.
- 리튬 헤파린을 함유 한 4 ml의 혈관에 혈액을 그립니다. 제조업체의 지시에 따라 혈관을 전환. 사용할 때까지 벤치 탑 로커에 실온에서 혈관을 유지합니다. 2 단계에 설명 된 단핵구와 과립구 식균 작용 및 OB 활동 분석이 혈액을 사용합니다.
- 12 X 75mm 튜브 라벨.
- 각 샘플에 대한 분석을 완료하기 위해 필요하다 (즉, S. 아우 레 우스) 박테리아의 양을 결정한다.
- 제조업체의 지침에 설명 된대로 혈액에 WBC 차동 분석과 함께 CBC을 수행하기 위해 혈액 분석기를 사용합니다. 상기 백혈구 수의 주 (세포 / ㎖), % 호중구, 그리고 %을단핵구 값.
- 각 샘플에 대한 호중구와 단핵구 수를 결정하기 위해 아래의 방정식을 사용합니다.
(세포 / ㎖)에 호중구 수 (세포 / ㎖) = % 호중구 × WBC
(세포 / ㎖)에 단핵구 계수 = (세포 / ㎖)에 WBC × % 단핵구 - 각 샘플에 대한 식세포 수와 시료 100 ㎕에 존재하는 식세포의 수를 결정하기 위해 아래의 방정식을 사용합니다.
(세포 / ㎖)에 식세포 카운트 (세포 / ㎖)에 (세포 / ㎖)에 호중구 + 단핵구 카운트 =
100 μL =에서 식세포의 수 (세포의 식세포 수 (/ ㎖)) / 10 - 각 샘플에 필요한 세균 (예, 황색 포도상 구균)의 수와 FITC 표지 S.의 양을 결정하기 위해 다음 식을 사용하여 구균 또는 레이블이없는 S. 각각의 튜브에 첨가한다 구균 작업 용액 (133,333 입자 / ㎖).
참고 : 대상 박테리아 : 식세포의 비율이 8 : 1입니다.
박테리아의 수 필요 =100 μL × 8 식세포의 수
(μL)에 필요한 FITC 또는 레이블이없는 작업 솔루션의 볼륨 = (필요한 세균의 수) / (133,333 개 / μL)
2. 분석을 수행
- 분석을 위해 전체 혈액을 준비합니다.
- 각 참가자 제어 튜브, 적절히 표지 된 12 X 75mm 튜브의 바닥에 리튬 헤파린 혈액 수집 튜브로부터 전혈 100 μL을 전송하는 연장 길이 피펫 팁을 사용한다. 캡을 교체합니다.
참고 : 12 X 75mm 튜브의 측면에 혈액을 받고 않도록주의하십시오. - 그는 HE 제어 튜브를 포함 빨간 잉크와 "H"로 표시된 튜브에 솔루션을 작업의 10 μl를 추가하는 마이크로 피펫을 사용합니다. 모자와 소용돌이 간략를 교체합니다.
- 15 분 동안 37 ° C를 물을 욕조에있는 모든 튜브를 품어. 그 후, 즉시 12 분간 빙수 욕 모든 튜브에 옮긴다.
참고 : 오픈 금속 랙을 사용하여부드럽게 튜브 신속하고 적절하게 가온 또는 냉각 된 것을 확인하기 위해 랙마다 5 분을 흔들어.
- 각 참가자 제어 튜브, 적절히 표지 된 12 X 75mm 튜브의 바닥에 리튬 헤파린 혈액 수집 튜브로부터 전혈 100 μL을 전송하는 연장 길이 피펫 팁을 사용한다. 캡을 교체합니다.
- 샘플 및 제어 튜브 (즉, 황색 포도상 구균)을 박테리아를 추가합니다.
- 적당량을 추가 마이크로 피펫을 사용하여 비 표지의 S. (단계 1.2.4로 계산) 익스텐션 제어 튜브를 포함 빨간 잉크와 "H"로 표시된 튜브에 구균 작업 솔루션입니다. 모자와 소용돌이 간략를 교체합니다.
- 적당량을 추가 마이크로 피펫을 사용하여 FITC 표지의 S. (단계 1.2.4로 계산) FITC 제어 튜브를 포함하는 검정 잉크와 "F"로 표시된 튜브에 구균 작업 솔루션입니다. 모자와 소용돌이 간략를 교체합니다.
- 소용돌이은 "혈액 전용"제어 튜브는하지만, 그것을 박테리아의 두 유형 (즉, 황색 포도상 구균)를 추가하지 않습니다.
- 20 분 동안 37 ° C를 물을 욕조에있는 모든 튜브를 품어. 오픈 금속 랙을 사용하여 조심스럽게 랙마다 5 분을 흔들튜브가 신속하고 적절하게 예열되어 있는지 확인합니다. 인큐베이션 기간 후, 즉시 1 분 동안 얼음물 모든 튜브에 옮긴다.
- 세포를 씻으십시오.
- 모든 튜브에 얼음처럼 차가운 급냉 용액 100 μl를 추가 리피터 피펫을 사용합니다. 간단히 모자, 소용돌이를 교체 한 후 1 분 동안 얼음에있는 모든 튜브를 품어.
- 모든 튜브에 얼음처럼 차가운 PBS 1 ㎖를 추가하는 리피터 피펫을 사용합니다. 소용돌이 짧게하고 모든 튜브에 얼음처럼 차가운 PBS의 추가로 2 ml에 추가하고 캡을 교체합니다. 원심 분리기는 4 ° C에서 5 분, 270 XG, 그리고 모든 튜브 뜨는을 대기음.
- 단계를 반복 2.3.2 한 번 (2 세척 총).
- 유동 세포 계측법에 대한 샘플을 준비합니다.
- 모든 튜브에 얼음처럼 차가운 소 태아 혈청 50 μl를 추가 리피터 피펫을 사용합니다. 간단히 모든 튜브를 소용돌이.
- 적절한 회전 목마에 모든 튜브를 전송하고 적혈구의 cel과 자동화 된 세포를 Lyse 준비 워크 스테이션을 사용리터 (RBC) 용균과 WBC가 적혈구를 용균과 제조업체의 지침에 설명 된대로 백혈구를 해결하기 위해 시약을 고정.
- 자동화 된 세포를 Lyse 준비 워크 스테이션 실행이 완료되면 분석 유동 세포 계측법을 수행 할 수있을 때까지 4 ° C 냉장고에 알루미늄 호일과 저장소에 튜브를 포장.
3. 유동 세포 계측법 취득
- 설치 유동 세포 계측법 시스템.
- 제조업체가 제공하는 사용 설명서에 지시에 따라 시스템 유동 세포 계측법을 따뜻하게. 그런 다음, 시약 및 폐기물 탱크 레벨을 확인합니다. 필요한 경우, 반응물 탱크 충전 및 / 또는 폐액 탱크를 비우.
- 시스템을 청소주기를 실행하기 위해 "클린 패널"기능을 사용합니다. 그리고, 정렬과 유체 검증 fluorospheres을 실행하고, 각 검출기에 대한 변화의 절반 피크 계수 (HPCV)가 품질 제어에 기재된 소정의 범위 내에 있는지 확인 (QC) 프로토콜 제조 의해 제공된아르 자형.
- 분석 고유의 수집 및 기기 설정 프로토콜을 만듭니다.
- 식균 작용 및 OB 활동 분석을위한 분석 관련 인수 프로토콜을 만듭니다.
참고 : 여기에 설명 된 획득 프로토콜 사이토 블루 레이저 (488 nm의) 어떠한 흐름에서 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다, FITC에 대한 필터 (30분의 530) 및 HE에 대한 필터 (26분의 575).- 시스템 수집 소프트웨어 유동 세포 계측법을 열고 "새 프로토콜"을 만들 수 있습니다.
- 식세포 작용 분석 (FITC)와 OB 활동 분석에 대해 "FL2 매개 변수"(HE)에 대해 "FL1 매개 변수"를 선택합니다.
- 플롯 만들기 (즉, 앞으로 분산 [FSC] 대 측면 분산은 [SSC] 도트 플롯, FL1 히스토그램, FL2 히스토그램) 취득이 필요합니다.
- WBC에 (백혈구)에 대한 다각형 영역을 작성, 과립구와 단핵구 금융위원회 대 SSC 플롯에 인구와 FL1과 FL2 히스토그램에 선형 영역을 만들 수 있습니다. 세트 A & #(34) 중지 WBC에 게이트 50,000 이벤트 "계산합니다.
- 분석 특정 이름을 가진 프로토콜을 저장합니다.
- 식균 작용 및 OB 활동 분석을위한 분석 관련 기기 설정 프로토콜을 만듭니다.
- 드래그 및 시스템 수집 소프트웨어 유동 세포 계측법의 "수집 관리자"로 "리소스 탐색기"에서 (단계 3.2.1에 정의)은 "분석 관련 인수 프로토콜을"놓습니다.
참고 :이 방법으로 추가 정보는 항상 작업리스트의 끝 부분에 표시됩니다. - 작업 목록에 샘플 정보를 입력하고, 작업 목록을 저장합니다.
- 4 ℃로 냉장고에서 대조군 샘플 튜브를 제거하고 15 분 동안 실온에서 평형을 허용한다. 그런 다음, 간단히 각 제어 샘플 튜브를 소용돌이.
- 음성 대조군 샘플을 실행하는 단계 3.2.1에 정의 된 "분석 관련 인수 프로토콜"를 사용 (즉, 혈액 만 해당) 및 양성 대조군샘플 (즉, HE 제어 FITC 제어) 유동 세포 계측법 시스템으로. 히스토그램을 검토하고 필요에 따라 광전자 증 배관 (PMT)를 FITC 및 피코 에리 트린 (PE) 채널의 전압을 조정합니다.
- 컨트롤 샘플 와동 상기 작업리스트의 순서에 따라 시스템 회전식 유동 세포 계측법에 옮긴다. 그런 다음, 샘플링 챔버 내에서 회전 목마를 배치하고 제어 샘플에 대한 데이터를 수집하기 위해 사이토 도구 모음 "시작"버튼을 클릭합니다. 설정 프로토콜은 "프로 설정 XXX"를 저장합니다.
- 드래그 및 시스템 수집 소프트웨어 유동 세포 계측법의 "수집 관리자"로 "리소스 탐색기"에서 (단계 3.2.1에 정의)은 "분석 관련 인수 프로토콜을"놓습니다.
- 식균 작용 및 OB 활동 분석을위한 분석 관련 인수 프로토콜을 만듭니다.
- 유동 세포 계측법 시스템 연구 샘플을 획득.
- 4 ° C 형 냉장고에서 연구 샘플 튜브를 제거하고 15 분 동안 실온에 평형 수 있습니다.
- 샘플이 평형화하는 동안, 프로젝트 작업 목록을 만들기 위해 작업리스트 공간에 미리 정의 된 연구 별 획득 프로토콜을 끕니다.
- "설정 프로토콜"이 &에 연결되어 있는지 확인합니다# 34;. 단계 3.2.2에 정의 된 분석 관련 설정 프로토콜 "그럼, 식별 정보를 입력 (예를 들어, 연구 이름, 번호, 방문 번호, 대상 ID를 그릴) 작업 목록에 각각의 튜브에 대해.
- 그리고 15 분의 평형 기간, 소용돌이 연구 샘플 후 작업리스트의 순서에 따라 시스템의 회전 목마 세포 계측법 흐름에 전송할 수 있습니다. 그런 다음, 샘플링 챔버 내에서 회전 목마를 배치하고 연구 샘플에 대한 데이터를 수집하기 위해 사이토 도구 모음 "시작"버튼을 클릭합니다.
- 각 샘플의 보고서 패널 RBC 용해 효율 및 WBC 세포 소집단 분포 비율 절대 수 및 형광 강도를 검사하여 데이터의 품질을 검토한다.
주 : 데이터 품질이 기준 모두가 소정 범위 내에있는 경우에 허용 가능한 것으로 간주된다. 모든 조건이 충족되지 않는 경우, 샘플은 재 처리되어야한다. - 깨끗하고 유동 세포 계측법 시스템을 종료합니다. 유동 세포 계측법을 저장두 개의 다른 컴퓨터 드라이브에 데이터가 우발적 인 데이터 손실을 방지 할 수있다.
4. 데이터 분석
- 식세포 작용 분석을 수행합니다.
- 단일 폴더로 식균 (즉, F는 표지 된) 샘플 제어 목록 모드 데이터 (LMD) 데이터 파일을 모두 통합. 이어서, 분석 소프트웨어 유동 세포 계측법을 열고 표본 공간에 파일을 드래그.
- WBC에, 과립구, 단핵구 및 림프구 게이트는 설정합니다.
- 은 "FITC 제어 샘플"중 하나를 열려면 파일 이름을 더블 클릭합니다. X 축 설정 드롭 다운 메뉴를 사용하여 "FSC '과'직선 '및 Y 축"SSC "및"선형 "이다.
- 총 WBC 인구의 게이트를 준비하기 위해 "다각형 게이트 선택"를 사용합니다.
참고 : 차트의 가장자리에있는 모든 셀을 포함해야합니다. 이 게이트 "WBC"를 레이블. - "새로운 WBC 게이트"두 번 클릭하고 드롭을 사용하여메뉴에는, X 축에 "FSC"및 "선형"과 Y 축 "SSC"및 "선형"로 설정 내려.
- ". 이에 따라 각 게이트 레이블. 드래그"는 "다각형 게이트 선택"림프구 게이트의 "를 설정하는"타원형 게이트 선택의 "를 사용하여 다음과"는 "과립구 게이트"와 단핵구 게이트 설정을 사용 (%) 게이트 데이터를 "옆으로 떨어져 세포를 쉽게 볼되도록.
- 은 "탐식 긍정적 게이트"와 과립구와 단핵구 인구에 대한 "탐식 네거티브 게이트"로 설정합니다.
- 단계 4.1.2.1에서 사용 된 "FITC 제어 샘플"을 두 번 클릭합니다. 그런 다음, "과립구 게이트"을 클릭하고 x 축에 "FL1"과 "로그"과 y 축에 "SSC"와 "선형"로 설정 드롭 다운 메뉴를 사용합니다.
- 는 "탐식 네거티브 게이트"와 "탐식 멋 부리를 설정합니다"광장 게이트 선택 "을 사용하여필자 게이트 ".
참고 : FITC 제어 샘플을 박테리아 (즉, 황색 포도상 구균) 자극을받지 않았기 때문에, 모든 세포는 이론적으로 식균 작용 음을해야한다. 이러한 인구에 대한 경계를 설정할 때 재량을 사용하십시오. - 단계를 반복 4.1.3.1와 단핵 세포 인구 단계 4.1.3.2.
- "WBC의 %", "형광 강도"와 과립구와 단핵구 인구에 대한 "%의 식균 작용 양성 세포"에 대한 통계를 추가합니다.
- 단계 4.1.2.1에서 사용 된 "FITC 제어 샘플"을 클릭합니다. 은 "과립구 게이트"을 강조하고 "통계 추가" "작업"을 클릭합니다. "기하 평균"과 "FL1 로그인"을 선택하고 "추가"를 클릭합니다. 그런 다음 "주파수 부모의"통계를 선택하고 "추가"를 클릭합니다.
주의 : 이것은 전체 과립구 모집단의 형광 강도 (기하 평균)을 수득하고과립구 있습니다 WBC (부모)의 비율입니다. - 단계 4.1.2.1에서 사용 된 "FITC 제어 샘플"을 클릭합니다. 과립구 인구의 "탐식 양의 문"을 강조하고 "통계 추가" "작업"을 클릭합니다. "기하 평균"과 "FL1 로그인"을 선택하고 "추가"를 클릭합니다. 그런 다음 "주파수 부모의"통계를 선택하고 "추가"를 클릭합니다.
참고 :이 식균 작용 긍정적 인 과립구의 형광 강도 (기하 평균) 및 탐식 긍정적 인 과립구 (부모)의 비율을 줄 것이다. - 단계를 반복 4.1.4.1와 단핵 세포 인구 단계 4.1.4.2.
- 단계 4.1.2.1에서 사용 된 "FITC 제어 샘플"을 클릭합니다. 은 "림프구 게이트"를 선택한 다음 "작업"을 클릭하고 "통계 추가". 은 "주파수 부모의"통계를 선택하고 "추가"를 클릭합니다.
참고 :이림프구이다 WBC (부모)의 비율을 줄 것이다. - 단계 4.1.2.1에서 사용되는 FITC 제어 샘플에서 만든 게이트와 통계를 모두 선택합니다. 화면 상단의 "그룹"패널에서 "모든 샘플"로 드래그합니다.
참고 :이 연구의 모든 샘플에 이러한 설정을 적용합니다. - 저장하고 LMD 폴더가 포함 된 동일한 폴더에이 .wsp 파일로 이름을 작동합니다.
- 단계 4.1.2.1에서 사용 된 "FITC 제어 샘플"을 클릭합니다. 은 "과립구 게이트"을 강조하고 "통계 추가" "작업"을 클릭합니다. "기하 평균"과 "FL1 로그인"을 선택하고 "추가"를 클릭합니다. 그런 다음 "주파수 부모의"통계를 선택하고 "추가"를 클릭합니다.
- 개별 샘플 게이트를 조정합니다.
- 데이터 세트의 "첫 번째 샘플"을 클릭하고 WBC 게이트가 적절하게 화면에 셀 분포에 맞는지 확인합니다. 그것을 클릭하고 드래그하지 않는 경우 게이트의 가장자리는 샘플에 대한 게이트를 조정합니다. "오른쪽 화살표"를 클릭 (즉, "˃") 다음 샘플으로 이동합니다. 모든 샘플이 검토 될 때까지이 단계를 반복합니다.
- 데이터 세트의 첫 번째 샘플은 "WBC 게이트"를 클릭하고 "그란 확인"각각의 샘플이 적절하게 화면에 셀 분포를 적합하십시오. 필요에 따라. 조정을 클릭합니다"오른쪽 화살표 ulocyte 게이트 ","단핵구 게이트 "및"림프구 게이트 "(즉,"˃ ") 다음 샘플으로 이동합니다 .
- 모든 샘플까지 단계를 반복 4.1.5.2 검토되고있다. 그런 다음 "저장"을 클릭합니다.
- 전자 스프레드 시트 프로그램의 데이터를 보여준다.
- 화면 상단의 "표 편집기"아이콘을 클릭합니다. 최종 스프레드 시트에 샘플링 날짜를 포함하는 "편집", "키워드"및 "$ 날짜"를 클릭합니다. 그런 다음, 최종 스프레드 시트에 샘플링 식별을 포함하는 "편집", "키워드"및 "@ SAMPLEID1"을 클릭합니다. "SAMPLEID2 @", "SAMPLEID3 @"및 "SAMPLEID4 @"를 반복합니다.
- 은 "표 편집기"화면 그들이 모두 컴퓨터 화면에 볼 수 있도록 "샘플"화면을 조정합니다. 실리샘플 시트에있는 모든 "샘플"중부 표준시. 그런 다음 "표 편집기"에 관심있는 각각의 통계를 끕니다.
- 은 "표 편집기"로 "과립구 게이트"에 나열된 "주파수. 부모의"통계를 끕니다. 입력 "표 편집기"의 "이름"열에서 "과립구 % 정도의 WBC".
- 은 "표 편집기"로 "과립구 게이트"에 나열된 "기하 평균"통계를 끕니다. 은 "표 편집기"의 "이름"열에서 "기하 평균 형광, 과립구"를 입력합니다.
- 은 "표 편집기"로 "과립구 / 탐식 긍정적 게이트"에 나열된 "주파수. 부모의"통계를 끕니다. 은 "표 편집기"의 "이름"열 아래 유형 "% 탐식 긍정적 인 과립구".
- 토륨하기 위해 "과립구 / 탐식 긍정적 게이트"에 나열된 "기하 평균"통계를 드래그전자 "표 편집기". 은 "표 편집기"의 "이름"열에서 "기하 평균 형광, 탐식 긍정적 인 과립구"를 입력합니다.
- 은 "표 편집기"로 "단핵구 게이트"에 나열된 "주파수. 부모의"통계를 끕니다. 입력 "표 편집기"의 "이름"열에서 "단핵구 % 정도의 WBC".
- 은 "표 편집기"로 "단핵구 게이트"에 나열된 "기하 평균"통계를 끕니다. 은 "표 편집기"의 "이름"열에서 "기하 평균 형광, 단핵구"를 입력합니다.
- 은 "표 편집기"로 "단핵구 / 탐식 긍정적 게이트"에 나열된 "주파수. 부모의"통계를 끕니다. 은 "표 편집기"의 "이름"열에서 "% 탐식 긍정적 인 단핵구"를 입력합니다.
- 은 "단핵구 / Phagocy 아래에 나열된"기하 평균 "통계를 드래그표 편집기의 "를"tosis 긍정적 인 게이트를 표 편집기 "이름"의 열 "의"에서 "기하 평균 형광, 탐식 긍정적 인 단핵구를."입력 ".
- 은 "표 편집기"로 "림프구 게이트"에 나열된 "주파수. 부모의"통계를 끕니다. 입력 "표 편집기"의 "이름"열에서 "림프구 % 정도의 WBC".
- 드래그 앤 그들이 선호하는 순서로 배열 될 때까지 "표 편집기"에서 볼 수있는 매개 변수를 놓습니다.
- "저장"을 클릭합니다. 그런 다음, 스프레드 시트 형식으로 데이터를 표시하는 "표 만들기"를 클릭합니다. 을 클릭하여 저장하고 .XLSX 파일로 이름 해결하려면 "다른 이름으로 저장".
- 반복 OB 활동 분석을위한 단계 4.1 (즉, H는 표지) 샘플 및 LMD 데이터 파일을 제어 할 수 있습니다.
참고 : OB 활동에 대한 참조로 식균 작용에 대한 모든 참조를 대체해야합니다. - Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
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Representative Results
장기간 집중적 인 운동은 자연 살해 세포 기능, 바이러스 성 감염에 대 식세포 사이토 카인 매개 응답 및 과립구와 단핵구의 식균 작용 및 OB 활동을 포함한 선천성 면역 기능에 심각한 영향을 보유하고 있습니다. 여러 연구는 근육 손상 및 신진 대사 요구에 의해 유도 된 염증을 반영하는 과립구와 단핵 탐식의 대폭 증가 후 운동을 나타냅니다. 반면, 과립구와 단핵구 OB 활동은 운동 후 감소 및 감염에 대한 감수성 증가의 한 면역 지표가 될 수있다. 예를 들어, 그림 1은 S.의 식균 작용을 보여줍니다 과립구에 의해 구균은 다음 날 아침에 정상에 복귀, 75 km의 자전거 한판 승부 (70 % VO 2MAX) 후 즉시 1.5 시간 증가된다. 단핵 세포의 식균 작용은 유사 운동이 수준에 의해 영향을 받는다. 2는 그림 과립구 OB 활동의 감소가 있음적어도 21 시간 75 km 후 사이클링 라. 단핵구 OB 활동은 75 km 사이클링 후 감소된다.
S.의 과립구와 단핵구 식균 작용 구균이 아니라 과립구와 단핵구 OB 활동, 전신 염증 바이오 마커에 상관 관계 (3)는 과립구 식균 작용 및 혈청 C 반응성 단백질 (CRP) 수치 (피어슨 제품 순간 상관 관계 사이의 완만 한 상관 관계를 보여줍니다;. R = 0.44; P <0.01 ) 106 과체중 / 비만 여성입니다. 혈청 CRP는 S.의 단핵 식세포 상관된다 구균 (피어슨 제품 순간 상관 관계; R = 0.30; P <0.01). 또한, 혈중 호중구 / 백혈구 (피어슨 적률 상관 각각 R = 0.62이고 r = 0.61; P <0.001), 체질량 지수 (피어슨 적률 상관; R = 0.50, R = 0.40, 각각; P <0.001), 혈청 인슐린 농도 (R = 0.30, R =0.23; P <0.03), 혈액 1C 수준 (피어슨 제품 순간 상관 각각 R = 0.28이고 r = 0.21; P <0.04)은 S.의 과립구와 단핵 탐식에 상관 관계 구균. 일반적으로 이러한 데이터는 휴식 과목에서 높은 과립구와 단핵 세포의 식균 작용은 전신 염증을 나타내는 것을 나타냅니다.
그림 1 :. 과립구 탐식은 강렬한 지구력 운동에 의해 영향을받는 과립구의 식균 작용은 VO 2MAX의 70 %에서 75 km의 자전거 시합 후 즉시 1.5 시간 증가된다. 21 시간 후 - 운동으로, 과립구 식세포 작용이 약간 운동 전 수준 아래에 돌아왔다. * 운동 전 다른 표시 (쌍 t-test를 사후 분석 반복 측정 ANOVA, 적절한 경우, N = 19, P <0.05). 값은 나에게있다± 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 과립구 산화 버스트 활동이 강렬한 지구력 운동 과립구의 산화 버스트 활동에 의해 영향을받는된다 VO 2MAX의 70 %에서 75 km의 자전거 시합 후 즉시 1.5 시간 및 21 시간의 감소. * 운동 전 다른 표시 (쌍 t-test를 사후 분석 반복 측정 ANOVA, 적절한 경우, N = 19, P <0.05). 값은 평균 ±에게 있습니다 표준 오류입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 원고는 과립구 및 단핵구 함수의 두 개의 지표를 결정하기위한 단계적인 프로토콜을 제공한다. 우리는이 분석의 성공에 중요한 몇 가지 단계를 확인했다. 그러한 단계는 세균의 첨가 직전에 발생 빙욕 배양한다. 모든 샘플을 철저히 냉각 식세포 및 OB 활성에 대한 온도의 영향을 최소화한다. 다른 중요한 단계는 각각의 샘플에 대한 박테리아의 추가이다. 8 : 1 세균 : 식세포 비율이 최적의 결과를 생성한다; 그러나 다른 연구자들은이 비율이 적절한 결과를 산출하도록 수정 될 필요가 있는지 찾을 수있다. 또 다른 중요한 단계는 백혈구를 적혈구를 용균하고 해결하기 위해 RBC의 용균과 WBC 고정 시약의 사용이다. 이 같은 시약의 사용은 적혈구의 완전한 용해를 보장하고 안전하게 밤새 4 ℃에서 처리 된 샘플을 저장 한 후 다음날 흐름 cytometer 통해 실행할 연구자 수있다. 이전 작업 (미 출판) 인도어RBC의 용균 및 WBC 고정 데이터 무결성을 손상시키지 않고 많은 12 시간 고정하여 시료의 유동 세포 계측법을 지연시키는 축열.
이 절차는 용이 연구원의 능력과 흥미를 충족하도록 변경 될 수 있지만, 적응이 이루어질 때 최적화가 필요한 것이 강조되어야한다. 보고 된 가장 일반적인 적응 중 일부는 타겟 박테리아, 라벨 / 프로브 및 배양 시간한다. 대장균은 7,8 S. 대신에 사용될 때 연구자 뛰어난 결과를 생산 구균 대상 병원체로 (모두 8에서 : 1 비율). 이러한 사카 cerevisiae의 같은 균류는 또한 E. 대용으로 적합 할 수있다 대장균. 또한, 연구진은 자주 식균 작용을위한 프로브와 같은 pH 민감성 분자 프로브, 대신 FITC의 7,12를 사용합니다. HE 일반적 OB 활성을 측정하기 위해 사용되는 것보다 마찬가지로 includin 다른 프로빙g의 dichlorofluorescin 디 아세테이트 (DCF-DA) 10 123 dihydrorhodamine (DHR). (13)보고 배양 시간은 20 분에서 120 분, McFarlin은 최대 응답 시간이 박테리아 목표에 따라 다를 수 있다는보고와 12,14,15에 따라 다릅니다. 7 그것은해야 또한 최적의 배양 시간은 분석의 식균 작용 및 OB 측면 사이에서 변할 수도있다. (7)
새로운 연구 환경에서이 기술을 설정할 때 모든 실험실 분석과 마찬가지로, 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 저자는 박테리아의 최적화 조언 : 식세포의 비율이 분석을위한 성공의 열쇠입니다. 저자는 또한 비 질병 참가자로부터 과립구 세포 모집단의 80 % 미만이 양 FITC하는 경우의 샘플 데이터를 분석 폐기되어야 함을주의; 이러한 상황에서, 샘플을 다시 회수 할 수 있고, 가능하다면 재 - 분석.
받는 몇 가지 제한 사항이 있습니다과립구와 단핵구 식균 작용 및 OB 활동 분석은이 논문에서 설명했다. 그러한 제한은 관심있는 세포 집단을 식별 FSC 및 SSC의 전용이다. 세포 표면 마커의 사용은 연구자들이 긍정적 세포군의 동정을 행 하였다. (10) 그러나,이 기능의 추가가 사이토 기본 흐름 이상을 필요로 허용하고,이 원고의 범위를 벗어나는 따라서 인 것이다. 이 분석의 또 다른 한계는 관심 면역 세포에 의해 내재화되지 않은 프로브의 형광을 종결 트리 판 블루의 효능에 의존한다는 것이다. pH를 성 분자 프로브는 7,12 내재화가 문제가되는 상황에서 FITC에 대한 대안으로 사용될 수있다. 이러한 프로브는 세포 내 이입 소포에서와 같은 산성 환경에서만 형광체이기 때문에, 획득 된 형광 내면화 입자만을 나타낸다. 이 않기 때문에 또한, 몇몇 연구자들은 현재의 분석을 비판ES 기준선 면역 세포 활성에 대한 제어 얼음 물 대신에 37 ℃에서 배양 된 샘플의 병렬 세트를 포함하지. 여러 경우에, 우리는 과립구 및 단핵구와 OB 탐식 활성 분석을 수행 할 때 "얼음 상태"를 포함하고 크게 (미공개) 데이터의 품질이 향상되지 않는 것을 알았다.
요약하면,이 원고는 과립구 및 단핵구에 식균하고 OB 활성을 측정하는 방법을 설명한다. 이것은 쉽게 실험실 능력 및 연구 분야를 설명하기 위해 수정 될 수있는 간단하고, 간단한 분석이다. 운동 과학 - 비만 관련 연구에서 선천성 면역 기능이 측정은 조사가 체중 감소, 보충 교재 사용,식이 개입 및 기타 생활 습관의 변화 등 많은 잠재적 대책의 효과를 탐구 할 수 있습니다. 이 기술을 마스터하면, 연구진은 급성 모니터링 할 수 있습니다다이어트, 운동, 그리고 많은 다른 자극에 응답하여 면역 세포의 기능 및 만성 변경됩니다.
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Acknowledgments
저자는이 절차의 최적화 동안 그들의 도움을 잭 슈, 케이시 존, 린 Cialdella - 캄을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes, with cap | VWR | 20170-579 | You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only"). |
| PBS (10x), pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| Glucose, powder | Life Technologies | 15023-021 | |
| Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous | Life Technologies | D12345 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled | Life Technologies | S-2859 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| 4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried | VWR | BD367861 | You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample. |
| 4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated | VWR | BD367884 | You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample. |
| COULTER Ac·T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., hematology analyzer |
| COULTER Ac·T 5diff Rinse | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac·T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac·T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff Diluent | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µl extended-length pipette tips | VWR | 37001-526 | |
| Insulated ice pan | VWR | 89198-980 | For ice water bath. |
| Open metal tube rack | VWR | 60916-702 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| TQ-Prep Workstation | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., automated cell lyse preparation workstation |
| ImmunoPrep Reagent System | Beckman Coulter | 7546999 | i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system |
| Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Sheath Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres |
| FlowJo Software | FlowJo | FlowJo | i.e., flow cytometry analysis software |
| Excel Software | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., electronic spreadsheet program |
