Introduction
Granulocyter och monocyter fagocytos / oxidativ burst (OB) aktivitetsanalys är en enkel, okomplicerad teknik som ofta används för att samla information om medfödda immunförsvar efter långvarig och intensiv träning. 1-4 När man studerar svaret från immunsystemet till en stimulans, granulocyter och monocyter är av särskilt intresse eftersom de spelar en central roll i värdförsvar och är de första immunceller att ackumuleras vid infektionsstället. 5 neutrofiler, en typ av granulocyter, är de första cellerna att translokeras till skadade muskler vävnad efter intensiv träning. 6 Fagocytos och OB aktivitet är de vanligaste åtgärderna av granulocyter och monocyter funktion, 7 och föredras som indikatorer på medfödda immuncellsfunktion på grund av deras centrala roll i både infektionsprocessen och reparationsprocessen.
Den analys som beskrivs i detta manuskript utnyttjandetzes en grundläggande flödescytometer för att ge en kvantitativ bestämning av granulocyter och monocyter fagocytos och OB-aktivitet i helblod. Användningen av helblod i denna teknik är fördelaktig eftersom den gör det möjligt för analysen att genomföras utan en tidsödande reningsprocedur. Denna analys kan enkelt modifieras för att rymma en mängd olika forskningsdesigner och labb kapacitet. Till exempel, Liao et al. Använde en liknande teknik för att visa att neutrofil OB aktivitet ökas och neutrofil fagocytos minskas efter traumatisk hjärnskada. 8 I ett annat exempel, McFarlin et al. Beskrev en elegant modifiering av denna teknik som använder allofykocyanin (APC ) konjugerad CD66b och högpresterande tandem APC-konjugerat CD45 märkning med bildbaserad flödescytometri att klassificera granulocyter i termer av deras fagocytos och OB aktiviteter. 7,9
Vår forskargrupp har använt olika anpassningar av detta technique som en indikator på medfödda immunfunktion hos överviktiga, feta, och atletisk populationer i nästan 20 år. 10,11 Texten nedan kommer att ge läsaren med steg-för-steg-instruktioner för att utföra denna analys och markera områden som läsaren kan anpassa för att möta behoven av sin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla förfaranden blodinsamlingsgenomfördes i enlighet med de riktlinjer som anges av Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).
1. Assay Framställning
- Samla, förbereda och organisera material som för förfarandet (se tabell av specifika material / utrustning).
- Märk 12 x 75 mm rör.
- Etikett två rör för varje deltagare: ett rör för fagocytos analysen (märka detta rör med svart bläck och en "F" för fluoresceinisotiocyanat [FITC]) och ett rör för OB-aktivitetsanalys (märka detta rör med rött bläck och en " H "för dihydroethidium [HE]).
OBS: Användning av sterila 12 x 75 mm rör rekommenderas för att minimera oavsiktlig cellaktivering och tillhörande ökning i bakgrundsbuller. - Märk tre rör för analyskontroller: ett rör för fagocytos analysen (FITC kontroll: märka detta rör med black bläck och en "F"), ett rör för OB-aktivitetsanalys (HE kontroll: märka detta rör med rött bläck och en "H"), och ett rör för den negativa kontrollen (Blood endast: märka detta rör med grönt bläck och "blod bara").
- Etikett två rör för varje deltagare: ett rör för fagocytos analysen (märka detta rör med svart bläck och en "F" för fluoresceinisotiocyanat [FITC]) och ett rör för OB-aktivitetsanalys (märka detta rör med rött bläck och en " H "för dihydroethidium [HE]).
- Bered stamlösningar åtminstone en dag före dagen för analysen.
- Förbered steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Späd 100 ml av 10x PBS med 900 ml 18,2 Mohm H 2 O. Filtersterilisera med en 0,2 pm filter. Lagra vid 4 ° C fram till användning.
- Förbered steril PBS-glukos. Lös upp 1,0 g glukos i 100 ml PBS. Filtersterilisera med en 0,2 pm filter. Lagra vid 4 ° C fram till användning.
- Förbereda den sterila 0,1 M citratbuffert. Lös upp 1,2 g citronsyra och 1,1 g natriumcitrat i 100 ml 18,2 Mohm H 2 O. Justera pH till 4,0. Filtersterilisera med en 0,2 pm filter. Lagra vid 4 ° C fram till användning.
- Förbered HE stamlösning. Resuspend 1,0 mg HE i 1,0 ml dimetylsulfoxid (DMSO). Blanda försiktigt, prov, och förvara vid -20 ° C fram till användning.
- Förbereda FITC-märkt Staphylococcus aureus (S. aureus) stamlösning (2 x 10 9 partiklar / ml). Resuspendera 10 mg av FITC-märkt S. aureus i 1,5 ml (eller lämplig mängd) av PBS. Dela upp i tre 500 l alikvoter och sonikera enligt tillverkarens rekommendation. Alikvot och förvara vid -20 ° C fram till användning.
- Förbered omärkta S. aureus-stamlösning (2 x 10 9 partiklar / ml). Resuspendera 100 mg omärkt S. aureus i 15 ml (eller lämplig mängd) av PBS. Dela upp i trettio 500 l alikvoter och sonikera enligt tillverkarens rekommendation. Alikvot och förvara vid -20 ° C fram till användning.
- Förbered nya arbetslösningar på dagen för analysen.
- Bered han arbeta lösning. Överföra 10 | il avtinade HE stamlösning till 990 pl av PBS-glukos. Skydda mot ljus och hålla på is fram till användning.
- Förbered FITC-märkt S. aureus arbetslösning (133,333 partiklar / l). Överför 70 ul av den upptinade FITC-märkt S. aureus stamlösning till 980 pl av PBS. Skydda mot ljus och hålla på is fram till användning.
- Förbered omärkta S. aureus arbetslösning (133,333 partiklar / l). Överföring 70 pl av den upptinade omärkt S. aureus stamlösning till 980 pl av PBS. Skydda mot ljus och hålla på is fram till användning.
- Bereda snabbkylningslösningen. Med 750 | il av 0,4% lösning av trypanblått till 11,25 ml steril 0,1 M citratbuffert. Hålla i ett is-vattenbad fram till användning.
- Ha ett certifierat phlebotomist dra blod enligt WHO: s riktlinjer för att dra blod.
- Dra blod in i en 4 ml bloduppsamlingsrör innehållande K 2 EDTA. Ivert bloduppsamlingsrör enligt tillverkarens instruktioner. Hålla bloduppsamlingsröret vid rumstemperatur på en bänk-top rocker fram till användning. Använd detta blod för hela blodstatus (CBC) med vita blodkroppar (WBC) differentialanalys som beskrivs i steg 1.2.1.
- Dra blod in i en 4 ml blod samling rör som innehåller litiumheparin. Vänd bloduppsamlingsröret enligt tillverkarens anvisningar. Håll bloduppsamlingsröret vid RT på en bänk-top rocker fram till användning. Använd detta blod för monocyt och granulocyt fagocytos och OB aktivitetsanalysen som beskrivs i steg 2.
- Märk 12 x 75 mm rör.
- Bestämma mängden av bakterier (dvs., S. aureus) som kommer att behövas för att slutföra analysen för varje prov.
- Använda en hematologi analysator för att utföra en CBC med WBC differentialanalys på blod såsom beskrivs i tillverkarens instruktioner. Anteckna antalet vita blodkroppar (i celler / ml),% neutrofila, och%Monocyt värden.
- Använd ekvationerna nedan för att fastställa neutrofila och monocyt räknas för varje prov.
Neutrofiler (i celler / ml) =% × neutrofila WBC (i celler / ml)
Monocyt räkna (i celler / ml) =% monocyt × WBC (i celler / ml) - Använda ekvationerna nedan för att avgöra fagocyt antalet för varje prov och antalet fagocyter närvarande i 100 pl prov.
Fagocyt count (i celler / ml) = Neutrofilantal (i celler / ml) + monocyt räkna (i celler / ml)
Antal fagocyter i 100 | j, l = (fagocyt count (i celler / ml)) / 10 - Använd ekvationen nedan för att bestämma antalet bakterier (dvs., S. aureus) behövs för varje prov och mängden FITC-märkt S. aureus eller omärkt S. aureus arbetslösning (133,333 partiklar / ml) som ska läggas till varje rör.
OBS! Målbakterien: fagocyt förhållandet 8: 1.
Antalet bakterier som behövs =Antal fagocyter i 100 pl × 8
Volym av FITC eller omärkt arbetslösn behövs (i | j, l) = (antal bakterier som behövs) / (133,333 partiklar / | il)
2. Utför Assay
- Förbereda helblod för analysen.
- För varje deltagare och kontrollrör, använda en förlängd längd pipettspetsen att överföra 100 fil helblod från litiumheparin bloduppsamlingsrör till botten av en lämpligt märkt 12 x 75 mm rör. Byt lock.
OBS: Var noga med att undvika att få blod på sidorna av 12 x 75 mm rör. - Använda en mikropipett för att lägga till 10 | j, l av HE arbetslösning till rören märkta med rött bläck och ett "H", inklusive HE kontrollrör. Byt mössor och virvel kort.
- Inkubera alla rör i en 37 ° C vattenbad i 15 min. Sedan, omedelbart överföra alla rör till en is-vattenbad under 12 min.
OBS: Använd en öppen metall rackoch försiktigt skaka stället var 5 min för att säkerställa att rören är snabbt och på lämpligt sätt uppvärmd eller kyld.
- För varje deltagare och kontrollrör, använda en förlängd längd pipettspetsen att överföra 100 fil helblod från litiumheparin bloduppsamlingsrör till botten av en lämpligt märkt 12 x 75 mm rör. Byt lock.
- Lägg till bakterier (dvs S. aureus) till provet och kontrollrören.
- Använd en mikropipett för att lägga till lämplig mängd (beräknad i steg 1.2.4) av omärkt S. aureus arbetslösning till rören märkta med rött bläck och en "H", inklusive HE styrröret. Byt mössor och virvel kort.
- Använd en mikropipett för att lägga till lämplig mängd (beräknad i steg 1.2.4) FITC-märkt S. aureus arbetslösning till rören märkta med svart bläck och en "F", inklusive FITC styrröret. Byt mössor och virvel kort.
- Vortex "bara blod" styrröret, men inte lägga någon typ av bakterier (dvs S. aureus) till det.
- Inkubera alla rör i en 37 ° C vattenbad i 20 min. Använd en öppen metall rack och försiktigt skaka stället var 5 minatt se till att rören är snabbt och på lämpligt sätt värmas. Efter inkubationsperioden, omedelbart överföra alla rör till en is-vattenbad under 1 min.
- Tvätta cellerna.
- Använd en repeater pipett för att lägga till 100 pl iskall släckningslösning till alla rör. Byt mössor, virvel kort, och sedan inkubera alla rör på is under 1 minut.
- Använder en repeater pipett för att tillsätt 1 ml iskall PBS till alla rör. Vortex kort och sedan lägga till ytterligare 2 ml iskall PBS till alla rör och ersätta lock. Centrifugera alla rören under 5 min vid 4 ° C och 270 x g, och sedan aspirera supernatanten.
- Upprepa steg 2.3.2 en gång (totalt 2 tvättar).
- Framställning av prover för flödescytometri.
- Använder en repeater pipett för att tillsätt 50 | il iskall fetalt bovint serum till alla rör. Vortexa kort alla rör.
- Överför alla rör till en lämplig karusell och använda en automatiserad cell lyse förberedelse arbetsstation med röda blod cell (RBC) lysering och WBC fastställande reagens för att lysera RBC och fixerar WBCs såsom beskrivs i tillverkarens instruktioner.
- Efter den automatiserade cellen lyserar kör förberedelse arbetsstation är klar, linda rör i aluminiumfolie och förvara i en 4 ° C kylskåp tills flödescytometrianalys kan utföras.
3. Flödescytometri Acquisition
- Ställ in flödescytometri systemet.
- Värma upp flödescytometri systemet enligt anvisningarna i instruktionsboken som tillhandahålls av tillverkaren. Kontrollera sedan reagens och avfall tanknivåer. Om det behövs, fylla reagensbehållare och / eller tömma avfallstanken.
- Använd "Clean Panel" för att köra systemet rengöringscykeln. Kör sedan justerings och fluidkontroll fluorosfärer, och se till att halv-topp variationskoefficienten (HPCV) för varje detektor ligger inom det förutbestämda intervallet som beskrivs i kvalitetskontroll (QC) protokoll från tillverkningenr.
- Skapa assayspecifika förvärv och instrumentinställning protokoll.
- Skapa assayspecifika förvärvsprotokoll för fagocytos och OB aktivitetsanalyser.
OBS: Förvärvs protokoll som beskrivs här kan anpassas för användning på någon flödescytometer med en blå laser (488 nm), ett filter (530/30) för FITC, och ett filter (575/26) för HE.- Öppna flödescytometri systemet förvärv programvara och skapa en "Ny Protocol".
- Välj "FL1 Parameter" för fagocytos analys (FITC) och "FL2 Parameter" för OB-aktivitetsanalys (HE).
- Skapa tomter (dvs framåtspridning [FSC] vs sidospridning [SSC] punktdiagram, FL1 histogram, FL2 histogram) som krävs för förvärv.
- Skapa polygonala regioner för WBC (vita blodkroppar), granulocyter och monocyt populationer på FSC mot SSC tomt och skapa linjära områden på FL1 och FL2-histogram. Ställ in ett & #34; Stop Count "på 50.000 händelser för WBC porten.
- Spara protokollen med analysspecifika namn.
- Skapa assayspecifika instrumentinställning protokoll för fagocytos och OB aktivitetsanalyser.
- Dra och släpp "analysspecifika förvärvsprotokoll" (definierade i steg 3.2.1) från "Resource Explorer" till "Acquisition Manager" på flödescytometri systemet förvärv programvara.
OBS: Information sätts på detta sätt visas alltid i slutet av arbetslistan. - Ange prov information i arbetslistan, och spara arbetslistan.
- Avlägsna provstyrrören från 4 ° C kylskåpet och låt dem ekvilibrera till rumstemperatur under 15 min. Sedan kort virvel varje kontrollprov rör.
- Använd "analysspecifika förvärvsprotokoll" definieras i steg 3.2.1 att köra negativa kontrollprovet (dvs endast blod) och den positiva kontrollenprover (dvs., HE kontroll, FITC-kontroll) genom flödescytometri systemet. Granska histogram och justera fotomultiplikatorröret (PMT) spänningar i FITC och fykoerytrin (PE) kanaler som behövs.
- Vortex kontrollproven och överföra dem till flödescytometri systemet karusell enligt den ordning på arbetslistan. Sedan placera karusellen i provtagningskammaren och klicka på verktygsfältet "Start" -knappen Cytometer att samla in data för kontrollproverna. Spara "xxx Ställa Pro" inställning protokoll.
- Dra och släpp "analysspecifika förvärvsprotokoll" (definierade i steg 3.2.1) från "Resource Explorer" till "Acquisition Manager" på flödescytometri systemet förvärv programvara.
- Skapa assayspecifika förvärvsprotokoll för fagocytos och OB aktivitetsanalyser.
- Förvärva studie prover på flödescytometri systemet.
- Avlägsna de studie provrören från 4 ° C kylskåpet och låt jämvikta till rumstemperatur under 15 min.
- Medan proverna jämvikts drar de fördefinierade studiespecifika förvärvsprotokoll till arbetslistan utrymme för att göra en projektarbetslista.
- Kontrollera att inställningen "protokoll" är kopplad till &# 34;. Assayspecifika inställningsprotokoll "definieras i steg 3.2.2 Ange sedan identifierande information (till exempel studera namn, dra nummer, besök nummer, under förutsättning ID) för varje rör i arbetslistan.
- Efter 15 minuters jämviktsperiod, virvelstudieprov och överföra dem till flödescytometri systemet karusell enligt den ordning på arbetslistan. Sedan placera karusellen i provtagningskammaren och klicka på verktygsfältet "Start" -knappen Cytometer att samla in data för studieproverna.
- Granska kvaliteten på de uppgifter genom att inspektera RBC lys effektivitet och WBC cellgruppen distribution, proportioner, absoluta räknas, och fluorescensintensiteter på panelrapporten för varje prov.
OBS: Datakvaliteten anses vara godtagbart om alla dessa kriterier är inom sina fördefinierade gränser. Om alla kriterier inte uppfylls, bör prov upparbetas. - Ren och stänga av flödescytometri systemet. Lagra flödescytometriuppgifter om två olika datorer enheter för att förhindra oavsiktlig dataförlust.
4. Dataanalys
- Utför fagocytos analys.
- Konsolidera alla fagocytos (dvs F-märkt) prov och kontrollista modsdata (LMD) datafiler i en mapp. Öppna sedan flödescytometrianalys programvara och dra filerna till provutrymmet.
- Ställ WBC, granulocyt, monocyt, och lymfocyter grindar.
- Dubbelklicka på filnamnet för att öppna någon av de "FITC kontrollprover". Använd rullgardinsmenyerna för att ställa in x-axeln till "FSC" och "linjär" och y-axeln till "SSC" och "linjär".
- Använd "polygon gate väljaren" för att förbereda en grind av den totala WBC-populationen.
OBS: Var noga med att inkludera alla cellerna vid kanterna på diagrammet. Märk denna port "WBC". - Dubbelklicka på "nya WBC gate" och använda drop-ned menyer för att ställa in x-axeln till "FSC" och "Linjär" och y-axeln till "SSC" och "Linjär".
- Använd "polygon gate väljaren" för att ställa in "granulocyt gate" och monocyt gate ", och använd sedan" elliptiska gate väljaren "för att ställa in" lymfocytinramningen ". Märk varje port i enlighet därmed. Dra" grinddata (%) "åt sidan, så att cellerna lätt ses.
- Ställ in "Fagocytos Positive gate" och "Fagocytos Negativ gate" för granulocyter och monocyt populationer.
- Dubbelklicka på "FITC kontrollprov" som används i steg 4.1.2.1. Klicka sedan på "granulocyt gate" och använder rullgardinsmenyerna för att ställa in x-axeln till "FL1" och "Log" och y-axeln till "SSC" och "Linear".
- Använd "torget gate väljaren" för att ställa en "Fagocytos negativ gate" och en "Fagocytos Positive gate ".
OBS: Eftersom FITC kontrollprover inte fick bakteriella (dvs S. aureus) stimuli, bör alla celler teoretiskt fagocytos negativt. Använda diskretion när man fastställer gränserna för dessa populationer. - Upprepa steg 4.1.3.1 och Steg 4.1.3.2 för monocyt populationen.
- Lägg statistik för "% av WBC", "fluorescensintensitet", och "% fagocytos positiva celler" för granulocyter och monocyt populationer.
- Klicka på "FITC kontrollprov" som används i steg 4.1.2.1. Markera "granulocyt gate", och klicka sedan på "arbetsyta" och "Lägg Statistik". Markera "Geometric Mean" och "FL1 Log" och klicka på "Lägg till". Då valde "Frekvens av Parent" statistik och klicka på "Lägg till".
OBS: Detta kommer att ge fluorescensintensiteten (geometriskt medelvärde) av hela granulocyt befolkningen ochden procentuella andelen av WBC (moder) som är granulocyter. - Klicka på "FITC kontrollprov" som används i steg 4.1.2.1. Markera "Fagocytos Positiv gate" av granulocyt befolkningen, och klicka sedan på "arbetsyta" och "Lägg Statistik". Markera "Geometric Mean" och "FL1 Log" och klicka på "Lägg till". Välj sedan "Frekvens av Parent" statistik och klicka på "Lägg till".
OBS: Detta kommer att ge fluorescensintensiteten (geometriskt medelvärde) av fagocytos positiva granulocyter och andelen av granulocyter (huvud) som är fagocytos positiv. - Upprepa steg 4.1.4.1 och steg 4.1.4.2 för monocyt befolkningen.
- Klicka på "FITC kontrollprov" som används i steg 4.1.2.1. Markera "lymfocytinramningen", och klicka sedan på "arbetsyta" och "Lägg Statistik". Markera "Frekvens av Parent" statistik och klicka på "Lägg till".
OBS: Dettakommer att ge den procentuella andelen av WBC (moder) som är lymfocyter. - Markera alla portar och statistik som skapats i provet FITC-kontrollen som används i steg 4.1.2.1. Dra dem till "Alla prover" i "gruppen" panel längst upp på skärmen.
OBS: Detta kommer att tillämpa dessa inställningar för alla studieproverna. - Spara och namn fungerar som en .wsp fil i samma mapp som innehåller mappen LMD.
- Klicka på "FITC kontrollprov" som används i steg 4.1.2.1. Markera "granulocyt gate", och klicka sedan på "arbetsyta" och "Lägg Statistik". Markera "Geometric Mean" och "FL1 Log" och klicka på "Lägg till". Då valde "Frekvens av Parent" statistik och klicka på "Lägg till".
- Justera enskilda prov grindar.
- Klicka på "första provet" i datamängden och bekräftar att WBC porten passar in cellfördelningen på skärmen. Om det inte, klicka och dra kanterna på grinden justera porten för det provet. Klicka på "högerpilen" (dvs "˃") för att gå vidare till nästa prov. Upprepa detta steg tills alla prover har granskats.
- Klicka på "WBC gate" för det första provet i datamängden och bekräftar att "Granulocyte gate "," monocyt gate "och" lymfocytinramningen "för varje prov passar lämpligt cellfördelningen på skärmen. Justera vid behov. Klicka på" högerpilen "(dvs" ˃ ") för att gå vidare till nästa prov .
- Upprepa steg 4.1.5.2 tills alla prover har granskats. Klicka sedan på "Spara".
- Visa data i ett elektroniskt kalkylprogram.
- Klicka på ikonen "Table Editor" längst upp på skärmen. Klicka på "Redigera", "Nyckelord" och "$ DATUM" för att inkludera datum provtagning på sista kalkylbladet. Klicka sedan på "Redigera", "Nyckelord" och "@ SAMPLEID1" att inkludera provtagning identifiering på den slutliga kalkylblad. Upprepa för "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", och "@ SAMPLEID4".
- Justera "Table Editor" skärmen och "prov" skärm så att de kan både ses på datorskärmen. Select någon "prov" på provarket. Därefter drar varje statistik av intresse för "Table Editor".
- Dra "Freq. Av moder" statistik listas under "granulocyt gate" till "Table Editor". Skriv "% WBC som Granulocyter" under "Namn" kolumnen i "Table Editor".
- Dra "Geometric Mean" statistik listas under "granulocyt gate" till "Table Editor". Skriv "Geometric Mean Fluorescence, Granulocyter" under "Namn" kolumnen i "Table Editor".
- Dra "Freq. Av moder" statistik listas under "granulocyt / Fagocytos Positiv gate" till "Table Editor". Skriv "% fagocytos Positiva granulocyter" under "Namn" kolumnen i "Table Editor".
- Dra "Geometric Mean" statistik listas under "granulocyt / Fagocytos Positiv gate" till the "Table Editor". Skriv "Geometric Mean fluorescens, fagocytos positiva granulocyter" under "Namn" kolumnen i "Table Editor".
- Dra "Freq. Av moder" statistik listas under "monocyt gate" till "Table Editor". Skriv "% WBC som Monocyter" under "Namn" kolumnen i "Table Editor".
- Dra "Geometric Mean" statistik listas under "monocyt gate" till "Table Editor". Skriv "Geometric Mean Fluorescence, Monocyter" under "Namn" kolumnen i "Table Editor".
- Dra "Freq. Av moder" statistik listas under "monocyt / Fagocytos Positiv gate" till "Table Editor". Skriv "% fagocytos Positiva Monocyter" under "Name" kolumnen i "Table Editor".
- Dra "Geometric Mean" statistik listas under "monocyt / Phagocytosis Positiv gate "till" Table Editor ". Skriv" Geometric Mean fluorescens, fagocytos Positiva Monocyter "under" Namn "kolumnen i" Table Editor ".
- Dra "Freq. Av moder" statistik listas under "lymfocytinramningen" till "Table Editor". Skriv "% WBC som lymfocyter" under "Namn" kolumnen i "Table Editor".
- Dra och släpp de parametrar som syns i "Table Editor" tills de arrangeras i önskad ordning.
- Klicka på "Spara". Klicka sedan på "Skapa tabell" för att visa data i en kalkylbladsformat. Klicka på "Spara som" för att spara och namn fungerar som .xlsx fil.
- Upprepa steg 4,1 för OB-aktivitetsanalys (dvs H-märkt) prover och kontrollera LMD datafiler.
OBS: Var noga med att ersätta alla hänvisningar till fagocytos med hänvisningar till OB aktivitet. - Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
- Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
- Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
- Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
- Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
- Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
- Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
- McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
- Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
- Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
- Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
- Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Långvarig och intensiv träning har djupgående effekter på medfödda immunförsvaret, inklusive naturliga mördarceller funktion, makrofag cytokin-medierad svar på virusinfektion, och granulocyter och monocyter fagocytos och OB aktivitet. Flera studier tyder på att granulocyter och monocyter fagocytos ökar betydligt efter träning, vilket speglar den inflammation som induceras av muskelskador och metaboliska krav. I kontrast, granulocyt och monocyt OB aktivitet minskar efter övning och kan vara en immun indikator på ökad mottaglighet för infektion. Till exempel, Figur 1 visar att fagocytos av S. aureus av granulocyter ökar omedelbart och 1,5-timmar efter en 75-km cykling bout (70% VO2max), återvänder till det normala i nästa morgon. Monocyt fagocytos på liknande påverkas av denna nivå av motion. Figur 2 visar att granulocyt OB aktivitet är minskningd för åtminstone 21-h efter 75 km cykling. Monocyt OB aktivitet också minskade efter 75 km cykling.
Granulocyter och monocyter fagocytos av S. aureus, men inte granulocyter och monocyter OB aktivitet är korrelerade till systemisk inflammation biomarkörer Figur 3 visar den blygsamma korrelationen mellan granulocyter fagocytos och serum C-reaktivt protein (CRP) nivåer (Pearson produkt-moment korrelation,. r = 0,44; P <0,01 ) i 106 överviktiga / feta kvinnor. Serum CRP är också korrelerad till monocyter fagocytos av S. aureus (Pearson produkt-moment korrelation, r = 0,30; P <0,01). Dessutom, blod neutrofiler / leukocytantalet (Pearson produkt-moment korrelation, r = 0,62 och r = 0,61, respektive; P <0,001), body mass index (Pearson produkt-moment korrelation, r = 0,50 och r = 0,40, respektive; P <0,001), seruminsulinnivåer (r = 0,30 och r =0,23; P <0,03), och blod A 1C nivåer (Pearson produkt-moment korrelation, r = 0,28 och r = 0,21, respektive, P <0,04) är korrelerade till granulocyter och monocyter fagocytos av S. aureus. I allmänhet är dessa uppgifter tyder på att hög granulocyter och monocyter fagocytos i vila ämnen är ett tecken på systemisk inflammation.
Figur 1: granulocyt Fagocytos påverkas av intensiv uthållighetsträning Granulocyt fagocytos ökade omedelbart och 1,5-timmar efter en 75-km cykling bout vid 70% av VO2max.. Med 21-h efter träning, återvände granulocyt fagocytos till något under pre-motion nivåer. * anger skillnad från pre-motion (Upprepade mätningar ANOVA med parat t-test post-hoc-analys, när så är lämpligt, N = 19; P <0,05). Värdena är migett ± standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Granulocyt Oxidativ Burst aktivitet påverkas av intensiv uthållighetsträning Granulocyt oxidativ burst aktivitet minskade omedelbart, 1,5-h och 21-timmar efter en 75-km cykling bout vid 70% av VO2max. * anger skillnad från pre-motion (Upprepade mätningar ANOVA med parat t-test post-hoc-analys, när så är lämpligt, N = 19; P <0,05). Värdena är medelvärde ± standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript ger en steg-för-steg-protokoll för bestämning av två indikatorer på granulocyt- och monocyt-funktion. Vi har identifierat några steg som är kritiska till framgång för denna analys. Ett sådant steg är isbadet inkubation som inträffar omedelbart före tillsatsen av bakterier. Noggrann kylning av alla prover kommer att minimera effekten av temperaturen på fagocytos och OB aktivitet. Ett annat kritiskt steg är tillsatsen av bakterierna till varje prov. A 8: 1 bakterier: fagocyt förhållande ger optimala resultat; men andra forskare kan finna att detta förhållande kommer att behöva modifieras för att producera lämpliga resultat. En annan avgörande steg är användningen av RBC lyse och WBC fäst reagens för att lysera de röda blodkropparna och fixera VBK. Användningen av denna sådana reagens garanterar fullständig lys av RBC och gör det möjligt för forskarna att säkert lagra bearbetade prover vid 4 ° C över natten, och sedan köra dem genom flödescytometern nästa dag. Tidigare arbete (opublicerad) indicates som RBC lyse och WBC fixering kan användas för att fördröja flödescytometri av fasta prover med så många som 12 timmar utan att kompromissa med dataintegritet.
Denna procedur kan lätt ändras för att möta kapaciteten och intressen forskaren, men det bör understrykas att optimering är nödvändig när anpassningar görs. Några av de vanligaste anpassningar som har rapporterats är att målet bakterier, etiketten / sond, och inkubationstiden. Forskare har gett enastående resultat när Escherichia coli 7,8 användes i stället för S. aureus som mål-patogen (både vid 8: 1 förhållande). En svamp, såsom Saccharomyces cerevisiae, kan också vara lämpliga som ersättning för E. coli. Dessutom forskare använder ofta en pH-känslig molekylär sond, 7,12 i stället för FITC, som prob för fagocytos. Likaså sonder annan än HE används vanligtvis för att mäta OB aktivitet, including dichlorofluorescin diacetat (DCF-DA) 10 och dihydrorhodamine 123 (DHR). 13 Rapporterad inkubationstider varierar från 20 min till 120 min, 12,14,15 med McFarlin rapporterar att den maximala svarstiden kan variera med bakterie mål. 7 Det bör också noteras att de optimala inkubationstider kan variera mellan fagocytos och OB aspekter av analysen. 7
Som med alla laboratorieanalyser, kan felsökning vara nödvändigt vid upprättandet av denna teknik i en ny forskningsmiljö. Författarna rekommenderar att optimering av bakterierna: fagocyt förhållande är nyckeln till framgång för denna analys. Författarna noterar också att data från ett prov ska kasseras från analys om färre än 80% av cellerna i granulocyter befolkningen från en icke-sjuk deltagare är FITC positiva; i denna situation, kan provet återställt och återanalyserades, om möjligt.
Det finns några begränsningar igranulocyter och monocyter fagocytos och OB-aktivitetsanalys som beskrivs i detta manuskript. En sådan begränsning är den exklusiva användningen av FSC och SSC för att identifiera cellpopulationer av intresse. Användningen av cellytemarkörer skulle göra det möjligt för forskare att positivt identifiera cellpopulationer. 10 skulle emellertid tillsättningen av den här funktionen kräver mer än en vanlig flödescytometer, och är därför utanför ramen för detta manuskript. En annan begränsning med denna analys är att den förlitar sig på effekten av trypanblått för att släcka fluorescensen av sönder som inte har internaliserats genom immuncellerna av intresse. En pH-känslig molekylär sond 7,12 kan användas som ett alternativ till FITC i situationer där internalisering är ett bekymmer. Eftersom en sådan sond är bara fluorescerande i sura miljöer, såsom de i endocytiska vesiklar, representerar den förvärvade fluorescens endast internaliserade partiklar. Dessutom har flera forskare kritiserat den nuvarande analysen, eftersom det göres inte inkludera en parallell uppsättning av prover som är inkuberade i isvatten i stället för vid 37 ° C för att kontrollera för baslinjen immuncellsaktivitet. Vid flera tillfällen, ingår vi denna "is tillstånd" vid verkställandet av granulocyter och monocyter fagocytos och OB-aktivitetsanalys, och fann att det inte avsevärt förbättra kvaliteten på data (opublicerade).
Sammanfattningsvis beskriver detta manuskript en teknik för att mäta fagocytos och OB aktivitet i granulocyter och monocyter. Detta är en enkel, okomplicerad analys som lätt kan modifieras för att redogöra för laboratoriekapacitet och forskningsintressen. I motion vetenskaps- och fetmarelaterad forskning, kommer denna åtgärd av medfödda immunförsvar tillåta utredaren att undersöka effekterna av många potentiella motmedel, inklusive viktminskning, kompletterar användning, koståtgärder och andra livsstilsförändringar. Vid mastering denna teknik, kommer forskarna att kunna övervaka akutoch kroniska förändringar i immuncellfunktion som svar på diet, motion och många andra stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Zack Shue, Casey John och Lynn Cialdella-Kam för deras hjälp under optimering av detta förfarande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes, with cap | VWR | 20170-579 | You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only"). |
| PBS (10x), pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| Glucose, powder | Life Technologies | 15023-021 | |
| Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous | Life Technologies | D12345 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled | Life Technologies | S-2859 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| 4.0 ml vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried | VWR | BD367861 | You will need 1 K2EDTA blood collection tube per sample. |
| 4.0 ml vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated | VWR | BD367884 | You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample. |
| COULTER Ac·T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., hematology analyzer |
| COULTER Ac·T 5diff Rinse | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac·T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac·T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff Diluent | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µl extended-length pipette tips | VWR | 37001-526 | |
| Insulated ice pan | VWR | 89198-980 | For ice water bath. |
| Open metal tube rack | VWR | 60916-702 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| TQ-Prep Workstation | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., automated cell lyse preparation workstation |
| ImmunoPrep Reagent System | Beckman Coulter | 7546999 | i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system |
| Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Sheath Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres |
| FlowJo Software | FlowJo | FlowJo | i.e., flow cytometry analysis software |
| Excel Software | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., electronic spreadsheet program |
