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Developmental Biology

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Published: July 25, 2016 doi: 10.3791/54276
Automatic Translation
*1,2,3,8, *1,8, 1, 6,7, 1, 6,7, 2,3,4, *2,3, *1,5
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran
* These authors contributed equally

Abstract

Maximiser le bénéfice de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) pour la recherche, la modélisation des maladies, des produits pharmaceutiques et des applications cliniques nécessite des méthodes robustes pour la production à grande échelle de types de cellules fonctionnelles, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous démontrons que la manipulation temporelle de WNT, le TGF-β, et les voies de signalisation SHH conduit à des lignes HPSC différenciation des cardiomyocytes très efficace de cellule unique à des passages à la fois la suspension statique et les systèmes de suspension de bioréacteurs agités. Employant cette stratégie a donné lieu à ~ 100% battant sphéroïdes, contenant toujours> 80% de troponine cardiaque des cellules T positives après 15 jours de culture, validés sur plusieurs lignes HPSC. Nous présentons également une variante de ce protocole d'utilisation avec des lignées cellulaires actuellement pas adaptés aux passages à cellule unique, dont le succès a été vérifiée dans 42 lignes HPSC. Cardiomyocytes générés en utilisant ces protocoles expriment des marqueurs spécifiques de la lignée et spectacle attendu electrophysfonctionnalités siologiques. Notre protocole présente une plate-forme simple, robuste et efficace pour la production à grande échelle de cardiomyocytes humains.

Introduction

Les cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et induites des cellules souches pluripotentes (de hiPSCs), ont la capacité d'auto-renouvellement et la capacité de se différencier en cellules des trois couches germinales embryonnaires 1,2. En raison de ces caractéristiques, hPSCs fournissent une source précieuse et illimité pour la production de génération et évolutive de types de cellules pathologiques pertinentes pour la modélisation de la maladie humaine 3-5, pour criblage à haut débit de la drogue et de toxicité des essais 6,7 et potentiellement pour des applications cliniques 8 . Génération de cardiomyocytes de hPSCs offre la possibilité d'étudier spécifiquement les mécanismes de maladies cardio-vasculaires humaines complexes et leurs traitements possibles, déjà au-delà de la portée de nos capacités en raison de l'absence de modèles animaux pertinents et / ou la disponibilité de tissus primaires touchés.

Toutes les applications précitées de hPSCs necessitate la production d'un nombre massif de cardiomyocytes hautement enrichis et fonctionnels. Ainsi, la disponibilité d'une manière efficace, reproductible et évolutive in vitro protocole de différenciation cardiaque approprié pour plusieurs lignes HPSC est crucial. Protocoles de différenciation des cardiomyocytes classiques ont utilisé différentes stratégies telles que la formation de corps embryoïdes 9, les techniques de co-culture 10, l' induction avec des cocktails de cytokines 11 et méthodes de protéine de transduction 12. En dépit des progrès réalisés dans ces techniques, qui souffrent le plus encore d'une mauvaise efficacité, exigent des facteurs de croissance coûteux, ou d'offrir l'universalité limitée lorsque l'on tente d'utiliser plusieurs lignes HPSC. À ce jour, ces défis ont fixé des limites à la production de cardiomyocytes HPSC dérivées pour les études de thérapie cellulaire dans des modèles animaux, ainsi que dans l'industrie pharmaceutique pour la découverte de médicaments 13. Par conséquent, le développement de techniques robustes et abordables pour les grandsproduction -scale de cardiomyocytes fonctionnels HPSC dérivés dans les systèmes de culture évolutive serait largement faciliter leurs applications commerciales et cliniques.

Dans ce manuscrit, nous rapportons le développement d'un système de différenciation cardiaque rentable et intégrée avec une grande efficacité, la reproductibilité et l'applicabilité de CSEh et hiPSCs générés à partir d'une variété de sources et des méthodes de culture, y compris une méthode pour la production à grande échelle de très populations enrichies de cardiomyocytes HPSC dérivées en utilisant un bioréacteur. De plus, nous avons optimisé ce protocole pour les lignes HPSC non adaptées à feeder culture cellulaire libre et / ou simple, comme hiPSCs nouvellement établies ou de grandes cohortes de lignes HPSC pertinentes à l'analyse du mécanisme de la maladie.

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Protocol

1. Préparation de la Culture Media, Revêtement de culture cellulaire Plaques et entretien des indifférencié hPSCs

  1. Préparation des médias
    Note: Stériliser les médias en utilisant un dispositif de 0,22 um de filtration et conserver à 4 ° C à l' abri de la lumière jusqu'à 4 semaines. Noms de réactifs, les fournisseurs et les numéros de catalogue sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
    1. Pour fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) moyenne, mélanger 445 ml DMEM, 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) et 5 ml de milieu de culture cellulaire (par exemple, Glutamax).
    2. Pour CSEh moyen, mélanger 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml Knockout Sérum de remplacement (KO-SR), 5 ml de milieu de culture cellulaire, 5 ml MEM minimum solution essentielle d'acides aminés et 0,5 ml 55 mM β-mercaptoéthanol.
      ATTENTION: β-mercaptoéthanol est toxique. Éviter l'inhalation, ingestion et contact avec la peau.
    3. Pour RPMI-B27 (RB) moyenne, mélanger 475 ml de RPMI 1640, 10 ml B27 minusinsuline, 5 ml de milieu de culture cellulaire, 5 ml de MEM au moins une solution d'acides aminés essentiels, 5 ml de pénicilline / streptomycine et 0,5 ml de 55 mM de β-mercaptoéthanol.
    4. Pour la solution de dissociation (DS), mélanger 10 ml de trypsine à 0,05%, 4 ml KO-SR, 1 ml de collagénase de type IV (1 mg / ml), 5 ml de DMEM-KO et 20 ul de CaCl2 (1 M).
    5. Pour Feeder-cell milieu conditionné, ajouter 15 ml de milieu de CSEh (sans bFGF) à un flacon T75 avec con fl uent des cellules nourricières (de MEF ou fibroblastes de prépuce humain) qui ont été préalablement inactivées par traitement avec soit la mitomycine C ou par irradiation. Récolte milieu conditionné après 24 h et le remplacer par un milieu de CSEh frais. Les cellules peuvent être utilisées pendant jusqu'à 2 semaines.
  2. Revêtement de culture cellulaire Plaques
    1. ECM Gel Coating:
      1. Lors de l'achat, dégeler l'extrait de gel d'ECM à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit dans un état liquide uniformément cohérente, selon les instructions du fabricant. Diluer à un rapportde 1: 2 dans le froid KO-DMEM, aliquote et conserver à -20 ° C.
        Remarque: Lors de la préparation du gel d'ECM, conservez les matériaux nécessaires pour une utilisation dans le aliquotage et le revêtement intérieur froid. La concentration de gel ECM varie avec le numéro de lot. Veiller à ce que la concentration est notée sur aliquotes. Des portions aliquotes peuvent être conservés à -20 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
      2. Décongeler un gel aliquote ECM à 4 ° C. Lors de la décongélation, ajouter du milieu DMEM KO-froid pour obtenir une concentration finale de 0,34 mg / ml. Pipette bien et ajouter 0,75 ml par un puits d'une plaque à 6 puits. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    2. Mitotique inactivé souris embryonnaires Fibroblast Feeder cellulaire (MEF) Revêtement
      Remarque:. Préparation des cellules nourricières MEF a été décrit précédemment 14
      1. Enduire un 6 puits plaque de culture cellulaire avec le facteur d'attachement (AF) ou 0,1% de gélatine (voir étape 1.2.3) à température ambiante pendant 5 min (0,75 ml par un puits d'une plaque à 6 puits).Retirez et laissez la plaque dans l'armoire de biosécurité (BSC) à sécher.
      2. Décongeler MEF en transférant un flacon congelé dans un bain d'eau C 37 ° C pendant environ 2-3 min.
      3. Ajouter 7 ml de milieu FAE à un tube de 15 ml. Lorsque le flacon de cellules est décongelé, transférer lentement le contenu du tube de 15 ml. Centrifuger à 300 g pendant 4 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu MEF.
      4. Compter les cellules et la plaque 1 × 10 6 cellules par 6 plaque de puits (~ 1,7 x 10 5 cellules / puits). Transfert à un incubateur à 37 ° C / 5% de CO 2 et permettent aux cellules de joindre O / N avant utilisation.
    3. Gélatine Revêtement:
      1. Dissoudre 1 g de poudre de gélatine dans de l'eau ultra-pure pour faire une solution à 0,1% (p / v). Incuber pendant 15 min à 37 ° C, puis on autoclave la solution à 121 ° C pendant 15 min. Une fois refroidi, ajouter le nombre requis de puits (0,75 ml par un puits d'une plaque à 6 puits) et incuber pendant 15 min à 37 ° C.
    4. Laminine Revêtement:
      1. Décongeler la laminine (1 mg / ml) à 4 ° C jusqu'à décongélation. 5 pi de solution de laminine, ajouter 1 ml de PBS froid. Pipette bien puis ajouter le nombre requis de puits (0,75 ml par un puits d'une plaque à 6 puits) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    5. Silicon Revêtement de surface Spinner Flask interne:
      1. Laver soigneusement 100 ml spinner flacon (avec 1 verre pendule) avec de l'eau distillée, en utilisant une brosse de nettoyage pour enlever la poussière et / ou des résidus de culture. Remplir avec 70% d'éthanol et après 30 min de rinçage avec de l'eau distillée. Ajouter NaOH 5 M et de laisser O / N.
      2. Retirer une solution de NaOH et rincer le flacon sous l'eau courante pendant 5 min. Remplissez le ballon avec HCl 1 M et laisser reposer pendant 15 min. Laver le ballon avec de l'eau courante pendant 5 min, puis deux fois avec de l'eau distillée deux fois complètementéliminer toute trace de HCl. Laissez le ballon sécher complètement dans le BSC.
      3. Ajouter 1,5 ml de solution de siliciuration dans le ballon et tourner horizontalement pour couvrir toutes les surfaces. Répétez la même procédure pour le pendule de verre.
      4. Chauffer le ballon revêtu dans un four sec à 100 ° C pendant 1 heure ou laisser sécher O / N à la température ambiante. Si chauffé dans un four, laisser refroidir à la température ambiante pendant 30 - 60 min.
      5. Rincer la fiole 3 fois avec de l'eau déminéralisée pendant 15 min chacun, puis stériliser à l'autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
  3. Entretien des indifférenciées hPSCs
    Note:     Pour chacun des protocoles décrits, sauf indication contraire, les cellules sont cultivées et cultivées dans des puits de 6 puits des plaques et des volumes de culture sera donnée appropriée pour ce format.
    1. hPSCs Cultured comme indifférenciées Spheroids dans un système de suspension statique
      Note: Les cellules utilisées dans ces étapes devraient déjà être adaptées auxunicellulaire culture. 15
      1. Commencez l'expérience avec hPSCs cultivées sur gel de ECM dans une plaque de culture à 6 puits à environ 70 - 80% de confluence. Retirez toutes les colonies différenciées en utilisant le stéréomicroscope dans le BSC. Ajouter inhibiteur de ROCK 10 uM Y-27632 et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
        Remarque: Pour retirer les colonies différenciées, utilisez une pointe de pipette pour détacher et retirer délicatement toutes les parties différenciées manuellement sous le stéréomicroscope. Veillez à ne pas retirer les colonies indifférenciées.
      2. Retirer les cellules de l'incubateur et le milieu de aspirée. Laver les cellules avec 1 ml de PBS, supprimer et ajouter 0,5 ml cellule de dissociation enzymatique. Incuber les cellules pendant 4 - 5 min à 37 ° C.
      3. Ajouter 1 ml de milieu de CSEh et récolter les cellules en utilisant un grattoir à cellules. Dissocier les cellules dans des cellules individuelles à l'aide d'une pipette de p1,000. Compter les cellules viables en utilisant le bleu Trypan et un hémocytomètre.
      4. Resuspendre les cellules à 2 x 10 5 c viableElls / ml dans feeder cellules milieu conditionné complétés avec 100 ng / ml de bFGF et 10 inhibiteur de ROCK uM Y-27632. Transférer les cellules sur des plaques de fixation ultra-basses à l'aide d'une pipette de 5 ml (3 ml par puits de plaque à 6 puits).
      5. Après 2 jours, retirez délicatement les cellules de l'incubateur et aspirer la moitié du milieu (environ 1,5 ml). Remplacez-le par du milieu conditionné frais complété avec 100 ng ml bFGF /.
      6. Changer la moitié du milieu tous les jours avec un milieu conditionné additionné de 100 ng ml bFGF / jusqu'au jour 5. Maintenant, soit d'autres cellules de culture, le passage de la culture indifférenciée continue (étape 1.3.1.2 - 5), ou d'utiliser pour la différenciation cardiaque (Section 2 ). Si la culture continue, les cellules de passage tous les 4 - 8 jours.
    2. hPSCs Cultured sur des cellules nourricières et repiquées Utilisation collagénase de type IV
      1. Avant repiquage hPSCs, supprimez toutes les colonies différenciées en utilisant le stéréomicroscope dans le BSC. Aspirer le milieu et laver les cellules avec 1 mlPBS par puits. Enlever puis ajouter 0,75 ml de collagénase de type IV (1 mg / ml) et on incube à 37 ° C pendant 5 à 15 min, tel que requis pour avoir les bords des colonies qui commencent à se décoller.
      2. Aspirer collagénase et ajouter 1 ml de milieu CSEh par puits. Détachez colonies à de petits groupes en utilisant un grattoir à cellules, puis de transférer les cellules à l'aide d'une pipette de p1,000 dans un tube de 15 ml. Veillez à ne pas briser les grappes en petits morceaux.
      3. Laver le milieu bien avec 1 ml de CSEh pour recueillir toutes les cellules restantes et ajouter 15 ml tube. Centrifuger à 100 g pendant 2 min. Aspirer les cellules surnageant et remettre en milieu CSEh additionné de 100 ng ml bFGF /.
      4. Retirer une plaque recouverte MEF de l'incubateur et aspirer le milieu MEF. Transférer les cellules dans un rapport compris entre 1: 3 et 1:10, selon le cas. Changer le milieu tous les jours avec un milieu de CSEh frais supplémenté avec 100 ng ml bFGF /. cellules Passage toutes les 4 - 8 jours.

2. Differentiation de hPSCs que Spheroids dans un système de suspension statique

  1. Commencez expérience en utilisant le jour 5 sphéroïdes indifférenciées tel que préparé dans la section 1.3.1.
    Remarque: A ce stade, la taille moyenne des sphéroïdes devrait être de 175 ± 25 um. Un minimum de 50 sphéroïdes doit être utilisé lors du démarrage d'un essai de différenciation.
  2. Transfert sphéroïdes dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 5 ml. Laver le moyen bien avec 1 ml de RB pour recueillir des sphéroïdes restants et ajouter dans le même tube de 15 ml. Laissez les cellules pendant 5 min jusqu'à sphéroïdes ont sédimenté pour former une pastille lâche (NE PAS centrifuger). Aspirer le surnageant, en faisant attention de ne pas prendre de sphéroïdes.
  3. Ajouter 3 ml de milieu RB supplémenté avec 12 uM CHIR99021. Transférer les cellules de nouveau dans un puits d'une ultra-basse plaque de fixation 6 puits. Après 24 heures, répétez l'étape 2.2.
    Remarque: milieu de RB est sensible à la lumière. Lorsque vous travaillez avec un milieu RB, garder la lumière de BSC éteint.
  4. UNEdd 3 ml de milieu RB au culot cellulaire. Transférer les cellules de nouveau dans un puits d'une ultra-basse plaque de fixation 6 puits. Après 24 heures, répétez l'étape 2.2.
  5. Ajouter 3 ml de milieu RB supplémenté avec IWP2, purmorphamine et SB431542 (5 uM chacun). Transférer les cellules de nouveau dans un puits d'une ultra-basse plaque de fixation 6 puits. Après 2 jours répéter l'étape 2.2.
  6. Remettre en suspension les cellules dans 3 ml de milieu RB et de transfert sur une plaque de gélatine revêtues pour permettre aux cellules de se fixer.
    Remarque: A ce stade, les cellules peuvent également être maintenues en suspension. Pour continuer avec la culture de suspension statique, transférer les cellules vers une plaque de fixation ultra-faible.
  7. Changer le support avec 3 ml de milieu RB après 2 jours. Les cultures vont commencer à battre le lendemain. Changer le milieu tous les 3 - 4 jours avec un milieu RB.

3. Différenciation des hPSCs comme Spheroids dans un bioréacteur de suspension Brassé

  1. Commencez l'expérience avec la culture de sphéroïdes indifférenciéed en suspension statique pendant au moins 3 passages (voir la section 1.3.1). Ajouter inhibiteur de ROCK 10 uM Y-27632 et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
  2. Retirer les cellules de l'incubateur et de transférer tous les sphéroïdes dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 5 ml. Laver le milieu bien avec 1 ml de CSEh pour recueillir des sphéroïdes restants et ajouter dans le même tube de 15 ml. Laissez les cellules pendant 5 min jusqu'à sphéroïdes ont sédimenté pour former une pastille lâche (NE PAS centrifuger). Aspirer le surnageant, en faisant attention de ne pas prendre de sphéroïdes.
  3. Laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS. Laissez pendant 5 min jusqu'à sphéroïdes ont sédimenté pour former une pastille lâche (NE PAS centrifuger). Retirer le surnageant et ajouter 0,5 ml de 0,05% de trypsine, plus mM EDTA 0,53. Incuber les cellules pendant 4 - 5 min à 37 ° C.
  4. Retirer les cellules de l'incubateur et ajouter 1 ml de milieu de CSEh. En utilisant une pipette de p1,000, dissocier les cellules en cellules individuelles, compter les cellules en utilisant le bleu Trypan et un hémocytomètre. Remettre en suspension à 2 x 10 5 viabLe cellules / ml dans du milieu conditionné additionné de 100 ng / ml de bFGF et de 10 l'inhibiteur de ROCK iM Y-27632.
  5. Transférer 100 ml de suspension cellulaire dans le flacon de bioréacteur siliconé avec 1 pendule (voir la section 1.2.5). Commencez avec 35 rpm agitation et après augmentation de 24 h à 40 tours par minute.
  6. Après 48 h, arrêter l'agitation pendant 5 - 10 min jusqu'à ce que tous les sphéroïdes se sont installés au fond du flacon. Remplacer la moitié du milieu par du milieu conditionné additionné de 100 ng ml de bFGF /. Répétez le même processus toutes les 24 heures jusqu'à ce jour 5.
    Note: A ce stade, sphéroïdes indifférenciées avec une taille moyenne de 175 ± 25 um devraient être formés.
  7. Arrêter l'agitation pendant 5 à 10 min jusqu'à ce que tous les sphéroïdes sont installés au fond du flacon. Transférer tous les sphéroïdes dans un tube de 50 ml dans un minimum de milieu (de moins de 50 ml). Jeter tout reste fluide dans le flacon de bioréacteur, assurant soigneusement aucun sphéroïdes restent dans le vaisseau.
  8. Leave pendant 5 - 10 min jusqu'à ce que tous les sphéroïdes se sont installés au fond du tube de 50 ml puis retirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot cellulaire lâche. Laver avec 25 ml de PBS avec du calcium et du magnésium ou du milieu RB, puis laisser à nouveau pendant 5 à 10 min jusqu'à ce que tous les sphéroïdes sont installés au bas du tube de 50 ml pour former à nouveau un culot lâche.
  9. Retirez délicatement le surnageant et ajouter 40 ml de milieu RB supplémenté avec 12 uM CHIR99021, inhibiteur de roche de 10 uM et 0,1% d'alcool poly vinylique (PVA). Resuspendre les sphéroïdes et de transférer toutes les cellules de retour dans le flacon de bioréacteur. Ajouter moyen pour rendre le volume total de 100 ml. Redémarrez l'agitation à 40 tours par minute pendant 24 heures.
    Remarque: milieu de RB est sensible à la lumière. Lorsque vous travaillez avec un milieu RB garder le BSC à la lumière éteinte en mode.
  10. Répétez les étapes 03.07 à 03.08.
  11. Retirez délicatement le surnageant et ajouter 40 ml RB milieu additionné de 0,1% de PVA. Resuspendre les sphéroïdes et de transférer toutes les cellules retour à til bioréacteur flacon. Ajouter moyen pour rendre le volume total de 100 ml. Redémarrez l'agitation à 40 tours par minute pendant 24 heures.
  12. Répétez les étapes 03.07 à 03.08.
  13. Retirez délicatement le surnageant et ajouter 40 ml de milieu RB supplémenté avec IWP2, purmorphamine et SB431542 (5 uM chacun). Resuspendre les sphéroïdes et de transférer toutes les cellules de retour dans le flacon de bioréacteur. Ajouter moyen pour rendre le volume total de 100 ml. Redémarrez l'agitation à 40 tours par minute pendant 2 jours.
  14. Répétez les étapes 3,7-3,8.
  15. Retirez délicatement le surnageant et ajouter 40 ml de milieu RB seulement. Resuspendre les sphéroïdes et de transférer toutes les cellules de retour dans le flacon de bioréacteur. Ajouter moyen pour rendre le volume total de 100 ml. Redémarrez l'agitation à 40 tours par minute. sphéroïdes Beating doivent être observées 48-72 heures plus tard.
  16. Changer la moitié du milieu tous les 3 - 4 jours avec du milieu RB seulement en arrêtant l'agitation pendant 5 à 10 min jusqu'à ce que tous les sphéroïdes sont installés au fond du récipient. Retirez délicatement 50 ml de milieu sans déranger les sphéroïdes et CAREFremplacer ully avec 50 ml de milieu de RB frais.

4. Différenciation des hPSCs utilisant des cultures non Adapté à cellule unique repiquage

Remarque: Cette approche est particulièrement utile pour la différenciation rapide d'un nombre élevé de lignes HPSC sans avoir à adapter aux techniques de culture unique de cellules, un processus énormément de main-d'œuvre et de temps. Cette technique est applicable aux lignées cellulaires qui sont très sensibles à la dissociation enzymatique des cellules, telles que les lignes nouvellement créées HPSC.

  1. Commencez l'expérience avec hPSCs cultivées sur MEF (comme dans la section 1.3.2) qui sont environ 70 - 80% confluentes. Retirez toutes les colonies différenciées en utilisant le stéréomicroscope dans le BSC.
  2. Retirer moyen et ajouter 0,5 ml Dissociation Solution (DS). Incuber pendant 0,5 à 1 min jusqu'à ce que les cellules MEF ont arrondi et les bords des colonies hPSCs devenu clair. Enlever rapidement DS et ajouter 0,75 ml collagénase de type IV (1 mg / ml).
  3. Incuberles cellules pendant 5 à 15 min à 37 ° C. Vérifiez les cellules sous le microscope pendant la période d'incubation, et quand des colonies entières commencent à décoller et à se détacher, enlever collagénase et ajouter 1,5 ml de milieu de CSEh.
    Remarque: Si après 15 minutes la plupart des colonies sont encore attaché, mettre les cellules vers incubateur. Vérifiez les cellules au microscope toutes les 5 min. Veillez à ne pas laisser les cellules de collagénase pendant plus de 30 min. S'il y a beaucoup de colonies flottantes dans la solution de collagénase, ne retirez pas la collagénase; il suffit d'ajouter 1 ml de milieu CSEh.
  4. En utilisant une pipette de p1,000, pipeter doucement colonies pour détacher des colonies dans son ensemble. Ne pas casser les colonies en petits morceaux. Transférer les cellules dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 5 ml. Laver le puits avec 1 ml de milieu de hESC pour recueillir toutes les cellules restantes à ajouter dans le même tube. Laissez pendant 5 min jusqu'à ce que toutes les colonies ont sédimenté (NE PAS centrifuger).
  5. Retirez délicatement le surnageant et ajouter 2 ml CSEh medium supplémenté avec 100 ng / ml de bFGF. Transférer les cellules dans une plaque de fixation ultra-faible en utilisant une pipette de 5 ml (1 ml dans chaque puits d'une plaque à 24 puits et 3 ml dans chaque puits d'une plaque à 6 puits). Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant au moins 6 heures (maximum de 12 heures).
  6. Pendant ce temps, préparer le nombre nécessaire de laminine revêtu puits / plaques pour l'étape 4.7. ratios de transfert de cellules recommandée sont 1 confluentes puits d'une plaque à 6 puits à 2 puits d'une plaque de 24 puits (ou l'équivalent par unité de surface).
  7. Après 6 heures, soigneusement transférer les agrégats de colonies dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 5 ml. Laver la plaque avec un milieu RB pour collecter les agrégats restants et ajouter dans le même tube de 15 ml (0,5 ml par puits pour 24 puits et 1 ml par puits pour les plaques à 6 puits). Attendre 5 min jusqu'à ce que le sédiment agrégats, puis aspirer soigneusement le surnageant. Veillez à ne pas perturber le culot lâche.
  8. Ajouter 2 ml de milieu RB complété avec 12 uM CHIR99021 et transvaser soigneusementavec une pipette de 5 ml pour les laminine préalablement préparé des puits revêtus (comme dans la Section 1.2.4) pour permettre aux cellules de se fixer.
  9. Après 24 heures, retirez soigneusement le milieu dans chaque puits et ajouter 1 ml de milieu RB seulement.
    Note: Certains des agrégats auront seulement attaché très faiblement à la plaque de culture; il est donc important de ne pas supprimer tous les grands agrégats qui ont pu se détacher au cours de la procédure de changement de milieu. Il est toutefois important d'éliminer autant de petits débris cellulaires que possible.
  10. Après 24 heures, retirez soigneusement le moyen et ajouter du milieu RB supplémenté avec IWP2, purmorphamine et SB431542 (5 uM chacun).
  11. Changer le milieu après 2 jours avec un milieu de RB seulement. Les cellules commencent à se battre le lendemain.
  12. Changer le milieu tous les 3 - 4 jours avec un milieu de RB seulement.

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Representative Results

Afin d'établir une méthode simple pour la différenciation à grande échelle de cardiomyocytes de hPSCs, nous avons créé un protocole dans lequel les cellules ont été traitées d' abord avec un activateur WNT / β-caténine (CHIR99021) 16 et ensuite avec des inhibiteurs de la WNT / β- caténine et facteur de croissance transformant β de (TGF-β) des voies (16 IWP2 et SB431542 17, respectivement) et , enfin , un activateur du Sonic hedgehog (Shh) voie (purmorphamine) 17 (figure 1A). Dans notre stratégie de différenciation, environ 50% des sphéroïdes (175 ± 25 um de diamètre sphéroïde de la taille) a commencé à battre les 7 jours après le début de la différenciation, qui a ensuite porté à 100% par jour 10. Il est intéressant, en utilisant ce protocole, sphéroïdes différenciés ont été observés à continuer de battre jusqu'à 60 jours après la différenciation initiation 18. Les études de population sur sphéroïdes dissociéesexaminé par cytométrie de flux a révélé qu'au jour 15, plus de 90% de la population contenait troponine T cardiaque positive (cTnT +) des cellules, alors que moins de 12% des cellules étaient positives pour le muscle lisse et marqueurs endothéliaux (3,1% de facteur de von Willebrand (vWF +), 8,4% d' alpha-actine positif des muscles lisses (ASMA +)) 18. À ce jour, le protocole de différenciation de suspension statique a été testé sur 5 CSEh et 4 hiPSC lignes, avec des sorties résultant dans environ 90% de battre sphéroïdes de chaque ligne, montrant la reproductibilité élevée de ce protocole entre les différentes lignes HPSC (figure 1B).

Afin de développer une plate - forme intégrée pour la production à grande échelle de cardiomyocytes humains, nous avons appliqué notre stratégie de différenciation de suspension statique à une suspension bioréacteur agité (figure 2A). Les sphéroïdes différenciateurs ont montré un comportement similaire dans le bioréacteur environnementdu comme dans le système statique (figure 2B) et d' environ 100% de sphéroïdes ont été observés à battre au jour 10 18. immunocoloration dans les sections de battage sphéroïdes recueillies au jour 30 en utilisant des anticorps dirigés contre cTnT et le facteur de transcription cardiaque NKX2-5, a montré l' expression cytoplasmique et nucléaire de ces protéines, respectivement (figure 2C). Le rendement total de cellules dans la culture en suspension dynamique était d'environ 90 - 100 millions de cellules dans 100 ml de volume de travail après 15 jours de culture de différenciation. Avec ce qui est le cas, le rendement des cardiomyocytes peut atteindre jusqu'à environ 54-90000000 cellules (avec l'observé 60-90% différenciation efficacité) de 20 millions de hPSCs à partir, inoculés dans la phase d'expansion de hPSCs comme des cellules individuelles. Nous avons examiné en outre les propriétés électrophysiologiques des cardiomyocytes différenciés selon la méthode patch clamp à cellule unique. Battre sphéroïdes à partir des cultures de bioréacteurs étaientdissociées en cellules individuelles au jour 30 et potentiels d'action enregistrés sur les cellules représentatives en utilisant toute la technique de patch clamp de la cellule. Les données ont montré la présence de trois types de cellules cardiaques principaux (atrial-, nodal- et les cellules ventriculaires-like) dans la population de cellules individuelles 18.

Pour les deux techniques de différenciation mentionnés ci - dessus, hPSCs doivent être adaptés et / sans alimentation ou une seule cellule culture en suspension 19-21. Cependant, certaines lignes HPSC sont très sensibles à la dissociation enzymatique des cellules et présentent une perte significative de viabilité des cellules après la dissociation, telle que l'on peut observer dans les lignes nouvellement créées hiPSC. En outre, lorsque l'on travaille avec de grandes cohortes de lignes, en adaptant tout feeder sans culture et une seule cellule serait extrêmement laborieuse et prend du temps. Pour répondre à ces questions, sphéroïdes indifférenciées ont été remplacés par des agrégats de cellules indifférenciées (Figure 3A).Nos données montrent que l'utilisation de cette technique modifiée, les grappes battant paraissaient 7 jours après l'initiation de la différenciation. La reproductibilité de cette version modifiée a été confirmée par 42 lignes de hiPSC, où toutes les lignées testées générés sur plus de 60% ​​des cellules cTnT + moyenne par jour 15 pour chaque expérience réalisée (figure 3B). Immunocoloration en utilisant des anticorps contre cTnT et NKX2-5 en grappes battant dissociées ont présenté une expression cytoplasmique et nucléaire, respectivement (figure 3C).

Figure 1
Figure 1. Schéma de cardiomyocytes Différenciation de hPSCs en suspension statique et des données représentatives. (A) la conception expérimentale de la différenciation des hPSCs à cardiomyocytes dans le système de suspension statique. (B) Evaluation de l'efficacitéla différenciation cardiaque est mesuré en comptant le nombre de sphéroïdes battant (en%). Voici les moyennes d'au moins 3 expériences de différenciation de chacun des 5 CSEh et 4 lignes hiPSC 18. Moyenne générale de battre sphéroïdes de toutes les lignes est d'environ 90%. Les barres d'erreur représentent SD (n = 3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Schéma de l' ensemble des cardiomyocytes Différenciation de hPSCs en suspension dynamique et des données représentatives. (A) la conception expérimentale de la différenciation des hPSCs à cardiomyocytes dans le système de suspension dynamique. RI: inhibiteur de Rock (B) image de contraste de phase de la journée 5 sphéroïdes (r représentantesult de la ligne Royan H5 CSEh). Barre d'échelle de 200 um (C) Immunomarquage de CSEh dérivées de battre sphéroïdes sectionnés au jour 30 pour Nkx2.5 et cTnT. Barre d' échelle de 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
La figure 3. Schéma global des cardiomyocytes Différenciation de hPSCs en utilisant des cultures non adaptées à une cellule unique repiquage. (A) de la conception expérimentale de la différenciation des hPSCs à cardiomyocytes en utilisant des cultures non adaptées à des passages d' une cellule unique. (B) par cytométrie de flux analyse des agrégats dissociés afficher sur plus de 60% ​​cTnT + cellules moyennes dans 42 lignes hiPSC testées. (C) Immunomarquage de dissociées cardiomyocytes provenant dehiPSCs pour Nkx2.5 et cTnT (résultat représentant 646-4 ligne hiPSC). Barre d' échelle 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Cardiomyocytes dérivés de hPSCs sont une source extrêmement attrayante pour une utilisation dans la modélisation des maladies humaines, le dépistage dépistage des drogues / toxicité et, peut-être à l'avenir, les thérapies régénératives. L'un des principaux obstacles à l'utilisation de ces cellules cependant, est la capacité de fournir suffisamment de matériaux de haute qualité pour leur utilisation efficace. En utilisant notre protocole décrit, nous proposons une méthode qui surmonte cette limitation.

Récemment, de petites molécules synthétiques ciblant les voies de signalisation spécifiques impliqués dans cardiogenèse ont été décrits pour améliorer la différenciation cardiaque 16,17,22,23. Ceux-ci sont maintenant utilisés comme une alternative aux cytokines recombinantes et de sérum, contenant de nombreux facteurs indéfinis et montrant la variation de lot. Le principal avantage d'un petit protocole molécule, autre que sa spécificité est qu'il est peu coûteux et les facteurs de composants ont généralement une durée de vie prolongée par rapport à des milieux contenant des cytokines ou des facteurs de croissance. Étant donné que les petites molécules utilisées dans notre protocole rapporté sont des agents de bas poids moléculaire, ils sont structurellement et fonctionnellement définis et peuvent diffuser facilement à travers la membrane cellulaire 24,25.

Jusqu'à présent, différentes méthodes ont été appliquées à hPSCs afin d'établir des techniques de différenciation robustes, évolutives; cependant, la plupart de ces méthodes ont été établies en 2D et des cultures statiques à petite échelle, ce qui peut offrir une mauvaise évolutivité et l'homogénéité. Des techniques telles que l' agrégation forcée, les technologies micro-impression et des cultures de micro-porteuses 26-29 viennent maintenant en usage, mais en dépit de quelques progrès dans ce domaine, ces méthodes sont encore loin de fournir le nombre de cellules nécessaires à leur utilisation en haute systèmes -Demande. reproductibilité et une évolutivité limitée ou non prouvée, et les coûts élevés en raison de la nécessité pour les médias coûteux (mTeSR1 ou StemPro-34) ou de micro-porteuses à la fois l'expansion des hPSCs et leur différenciation dirigée vers cardiomyocytes 30,31, sont les inconvénients de l' utilisation de ces méthodes à haut débit hPSCs technologies.

Dans cette étude, nous avons rapporté un protocole simple, robuste et évolutive pour la production de cardiomyocytes HPSC dérivés. La reproductibilité de ce protocole a été validé avec plus de 40 lignes HPSC différentes, la validation la plus vaste signalé à ce jour. Par rapport à des protocoles de suspension rapportés précédemment, cette méthode présente de grands avantages en termes d'évolutivité, de la reproductibilité, l'accessibilité, l'efficacité et la fonctionnalité des cardiomyocytes générés. Le succès de notre protocole de différenciation est complètement dépendante de la qualité élevée des hPSCs utilisés pour l'étude. Il est donc essentiel de vérifier le caryotype de chaque ligne et l'expression forte et soutenue des marqueurs de pluripotence par immunocoloration et PCR avant de commencer l'expérience. En particulier, lorsque la culture de cellules dans le bioréacteur, il est crucial d'utiliser hPSCs qui ont been repiqué au niveau d'une seule cellule pour au moins trois passages avant le début de la différenciation. Dans nos protocoles, nous avons utilisé des sphéroïdes ayant une taille moyenne de 175 ± 25 um, qui ont été générées sphéroïdes après 5 jours. Le jour où les sphéroïdes satisfont à cette restriction de taille peut varier en fonction du taux de lignes individuelles HPSC de croissance; Par conséquent, il est important que la taille, plus que le jour de la croissance, est prise en considération.

Ce protocole peut également être manipulé pour devenir convenable pour les lignées cellulaires sensibles et les grandes cohortes de lignes HPSC. Bien que ce protocole se traduit par des cardiomyocytes hautement enrichi, la pureté peut être améliorée en combinant le protocole de différenciation avec un procédé de sélection métabolique tel que le milieu de lactate enrichi en 32. En outre, l'amélioration de la maturation et la fonctionnalité des cardiomyocytes dérivés décrits dans ce protocole peuvent être appliquées par la génération de trois dimensions, cardiaque alignétissus 33. L'une des limites de ce protocole est que les sous-types particuliers de cardiomyocytes ne sont pas spécifiquement générés, tout simplement un mélange d'auriculaire, ventriculaire et les cellules ganglionnaires. Une enquête plus poussée dans ce domaine est nécessaire pour élaborer des protocoles de différenciation qui peuvent produire des cardiomyocytes spécifiques du sous-type hautement enrichi à grande échelle. Bien que certains protocoles à petite échelle ont été développées à ce jour, devront être rigoureusement testés pour garantir scale-up est possible 34 les méthodes.

Le développement de ces plates - formes intégrées peut être considérée comme une étape importante vers la commercialisation des technologies de cardiomyocytes HPSC dérivées pour les cliniques, pharmaceutiques, l' ingénierie tissulaire, et dans l' organe vitro applications / organoïdes de développement.

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Disclosures

Le Chang Institut de recherche cardiaque Victor ne participe pas à, ni ne tolère, la destruction d'embryons humains pour la recherche. Sa contribution à cette étude a été limitée à travailler sur les cellules souches pluripotentes humaines induites.

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Life Technologies 10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR) Life Technologies 10828028
Glutamax Life Technologies 35050061
MEM Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Miltenyi Biotec 130-093-843
RPMI1640 Life Technologies 11875093
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190144
DPBS Life Technologies 14287072
Attachment Factor (AF) Life Technologies S006100
ECM Gel Sigma-Aldrich E1270
Laminin Invitrogen 23017-015
DMEM Life Technologies 11965-092                                                                                                       
Fatal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071
B27 minus insulin Gibco A18956-01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063
0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
Collagenase Type IV Life Technologies 17140-019
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C7902
Mitomycin C Bioaustralis BIA-M1183
CHIR99021 Miltenyi Biotec 130-104-172
IWP2 Miltenyi Biotec 130-105-335
SB431542 Miltenyi Biotec 130-095-561
Purmorphamine Miltenyi Biotec 130-104-465
ROCK inhibitor Y-27632 Miltenyi Biotec 130-104-169
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Poly Vinyl Alcohol (PVA) Sigma-Aldrich 363073
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Trypan Blue Bio-Rad 145-0013
Accumax  Innovative Cell Technologies Inc. AM105
Sigmacote  Sigma-Aldrich SL2 
CELLSPIN Integra Biosciences 183 001
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml  Integra Biosciences 182 023
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Prepared in-house (or commercially available)
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines Prepared in-house (or commercially available)

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References

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