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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Published: July 25, 2016 doi: 10.3791/54276
Automatic Translation
*1,2,3,8, *1,8, 1, 6,7, 1, 6,7, 2,3,4, *2,3, *1,5
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran
* These authors contributed equally

Abstract

Maximizando o benefício de células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) para a investigação, modelagem doença, farmacêutica e aplicações clínicas requer métodos robustos para a produção em larga escala de tipos de células funcionais, incluindo cardiomiócitos. Aqui demonstramos que a manipulação temporal da WNT, TGF-β, e SHH vias de sinalização leva a linhas HPSC diferenciação de cardiomiócitos altamente eficiente de uma única célula passadas em ambos suspensão estática e sistemas de suspensão biorreactor agitado. Empregando esta estratégia resultou em ~ 100% de bater esferóides, contendo consistentemente> 80% de células T-positivos de troponina cardíaca após 15 dias de cultura, validados em várias linhas HPSC. Nós também um relatório sobre a variação deste protocolo para uso com linhas celulares não está adaptado para passaging de uma única célula, o sucesso do que foi verificado em 42 linhas HPSC. Cardiomiócitos gerados usando estes protocolos expressam marcadores de linhagem específica e show esperado electrophysfuncionalidades iological. Nosso protocolo apresenta uma plataforma simples, eficiente e fiável para a produção em larga escala de cardiomiócitos humanos.

Introduction

As células humanas pluripotentes estaminais (hPSCs), incluindo células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs), têm a capacidade de auto-renovação e a capacidade de se diferenciar em células dos três folhetos embrionários 1,2. Devido a estas características, hPSCs fornecer uma fonte valiosa e ilimitado para a geração e escalonável de produção de tipos de células doenças relevantes para a modelagem de doenças humanas 3-5, para high-throughput screening de drogas e de toxicidade ensaios 6,7 e, potencialmente, para aplicações clínicas 8 . Geração de cardiomiócitos de hPSCs proporciona a oportunidade de investigar especificamente os mecanismos de doenças cardiovasculares humanas complexas e as suas possíveis tratamentos anteriormente, para além do âmbito dos nossos recursos devido à falta de modelos animais relevantes e / ou a disponibilidade de tecidos primários afectadas.

Todas as aplicações acima mencionadas de N hPSCsecessitate a produção de um enorme número de cardiomiócitos altamente enriquecido e funcionais. Assim, a disponibilidade de uma forma eficiente, reprodutível e escalonável protocolo in vitro diferenciação cardíaca adequada para várias linhas HPSC é crucial. Protocolos de diferenciação de cardiomiócitos convencionais têm empregado estratégias diferentes, tais como formação de corpos de embryoid 9, técnicas de co-cultura 10, indução com cocktails de citocinas 11 e métodos de transdução de proteína 12. Apesar dos avanços nestas técnicas, a maioria ainda sofrem de baixa eficiência, necessitam de fatores de crescimento caros, ou oferecer universalidade limitada ao tentar usar várias linhas HPSC. Até à data, estes desafios estabeleceram limites para a produção de cardiomiócitos HPSC derivadas de estudos de terapia celular em modelos animais, bem como na indústria farmacêutica para a descoberta de medicamentos 13. Portanto, o desenvolvimento de técnicas robustas e acessíveis para grandeprodução -scale de cardiomiócitos HPSC derivados funcionais em sistemas de cultura escaláveis ​​seria em grande medida facilitar as suas aplicações comerciais e clínicas.

Neste artigo, é relatado o desenvolvimento de um sistema de diferenciação cardíaca custo-eficaz e integrado com uma elevada eficácia, a reprodutibilidade e a aplicabilidade para hESCs e hiPSCs gerados a partir de uma variedade de fontes e métodos de cultura, incluindo um método para a produção em larga escala de altamente populações enriquecidas de cardiomiócitos HPSC-derivadas utilizando um bioreactor. Além disso, temos aperfeiçoado este protocolo para linhas HPSC não adaptadas ao alimentador de cultura de células livres e / ou único, como hiPSCs recém-criadas ou grandes grupos de linhas HPSC relevantes para análise do mecanismo da doença.

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Protocol

1. Preparação de Meios de Cultura, revestimento de placas de cultura celular e Manutenção de Undifferentiated hPSCs

  1. Preparação de mídia
    Nota: Esterilizar mídia usando um dispositivo de 0,22 filtração e armazenar a 4 ° C ao abrigo da luz por até 4 semanas. Nomes de reagentes, fornecedores e números de catálogo estão listadas na Tabela de Materiais.
    1. Para embrionárias de camundongos Fibroblastos (MEF) médio, combinar 445 ml de DMEM, 50 mL Soro Fetal Bovino (FBS) e 5 ml de meio de cultura de células (por exemplo, Glutamax).
    2. Para células estaminais embrionárias humanas Médio, combinar 390 ml KO-DMEM (KO-DMEM), 100 ml KO Soro de substituição (KO-SR), 5 ml de meio de cultura de células, 5 ml de MEM solução mínimo essencial aminoácidos e mM β-mercaptoetanol 0,5 ml 55.
      CUIDADO: β-mercaptoetanol é tóxico. Evitar a inalação, ingestão e contato com a pele.
    3. Para RPMI-B27 (RB) média, misture 475 ml RPMI 1640, 10 ml de menos B27insulina, 5 ml de meio de cultura de células, 5 ml de solução de MEM mínimo essencial aminoácidos, 5 mL de penicilina / estreptomicina e mM β-mercaptoetanol 0,5 ml 55.
    4. Para a dissociação Solução (DS), 10 ml de combinar 0,05% de tripsina, 4 ml KO-SR, 1 mL de colagenase tipo IV (1 mg / ml), 5 ml de DMEM-KO e 20 uL de CaCl2 (1 M).
    5. Por meio condicionado por células de alimentação, adicionar 15 mL de meio de células estaminais embrionárias humanas (sem bFGF) a um frasco T75 com con fluentes de células alimentadoras (MEF ou fibroblastos de prepúcio humano) que foram previamente inactivados por tratamento com mitomicina C ou por irradiação. Colheita meio condicionado após 24 horas e substituir com meio hESC fresco. As células podem ser utilizadas durante até 2 semanas.
  2. Revestimento de placas de cultura celular
    1. ECM Gel Revestimento:
      1. Após a compra, descongelar o extracto de gel de ECM, a 4 ° C até que esteja num estado líquido uniformemente consistente, de acordo com as instruções do fabricante. Dilui-se a uma razãode 1: 2 em frio KO-DMEM médio, alíquota e armazenar a -20 ° C.
        Nota: Durante a preparação do gel de ECM, manter todos os materiais necessários para a utilização no procedimento de revestimento aliquotting e frio. A concentração de gel de ECM varia com o número do lote. Certifique-se a concentração é observado em alíquotas. As aliquotas podem ser mantidos à temperatura de -20 ° C durante até 6 meses.
      2. Descongelar uma alíquota de gel de ECM, a 4 ° C. Quando descongeladas, adicionar meio de KO-DMEM frio para uma concentração final de 0,34 mg / ml. Pipeta bem e adicionar 0,75 ml por um poço de uma placa de 6 poços. Incubar durante 1 hora a 37 ° C.
    2. Mitoticamente inativada embrionárias de camundongos Fibroblastos Feeder celular (MEF) Revestimento
      Nota:. Preparação de células alimentadoras MEF foi descrito anteriormente 14
      1. Bata de uma placa de cultura de células de 6 poços com factor de fixação (AF) ou 0,1% de gelatina (ver o passo 1.2.3) à temperatura ambiente durante 5 minutos (0,75 ml por um poço de uma placa de 6 poços).Retire e deixe placa no gabinete de biossegurança (BSC) para secar.
      2. Descongelar MEF por transferência de uma ampola congelada a um banho de água a 37 ° C durante cerca de 2-3 minutos.
      3. Adicionar 7 ml de meio de MEF para um tubo de 15 ml. Quando o frasco de células é descongelada, transferir-se lentamente o conteúdo do tubo para 15 ml. Centrifugar a 300 xg durante 4 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de MEF.
      4. Contar as células e placa 1 x 10 6 células por placa de 6 poços (1,7 x 10 ~ 5 células / poço). Transfira para uma incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 e permitir que as células para anexar O / N antes da utilização.
    3. Revestimento de Gelatina:
      1. Dissolve-se 1 g de pó de gelatina em água ultrapura para fazer uma solução a 0,1% (v / w). Incubar durante 15 min a 37 ° C, em seguida a solução em autoclave a 121 ° C durante 15 min. Quando arrefecida, adicionar ao número necessário de poços (0,75 ml por um poço de uma placa de 6 poços) e incubar durante 15 min a 37 ° C.
    4. Laminina Revestimento:
      1. Descongelar laminina (1 mg / ml) a 4 ° C até ser descongelado. Para 5 ml de solução de laminina, adicionar 1 ml de PBS frio. Pipeta bem, em seguida, adicionar a quantidade necessária de poços (0,75 ml por um poço de uma placa de 6 poços) e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
    5. Silicon Revestimento de superfície Spinner Flask Interno:
      1. Lave cuidadosamente um frasco de agitação de 100 ml (com um pêndulo de vidro) com água destilada, utilizando uma escova de limpeza para remover a poeira e / ou resíduo de cultura. Encha com etanol a 70% e após 30 min de lavagem com água destilada. Adicionar NaOH 5 M e deixar O / N.
      2. Remoção da solução de NaOH e lavar o balão em água corrente durante 5 min. Encher o balão com HCl 1 M e deixar durante 15 minutos. Lavar o frasco com água corrente durante 5 minutos, em seguida, duas vezes com água duplamente destilada para completamenteremover qualquer vestígio de HCl. Deixar o balão secar completamente no BSC.
      3. Adicionar 1,5 ml de solução de siliconização ao balão e girar horizontalmente para cobrir todas as superfícies. Repetir o mesmo procedimento para o pêndulo de vidro.
      4. Aquecer o balão revestido num forno seco a 100 ° C durante 1 h ou deixar secar O / N à temperatura ambiente. Se aquecida em um forno, deixar arrefecer até à temperatura ambiente durante 30 - 60 min.
      5. Lavar o balão de 3 vezes com água desionizada durante 15 min cada, em seguida esterilizar em autoclave a 121 C durante 20 min.
  3. Manutenção de células indiferenciadas hPSCs
    Nota:     Para cada um dos protocolos descritos, a menos que especificado em contrário, as células são cultivadas e cultivadas em poços de placas de cultura de 6 poços e volumes será dada apropriado para este formato.
    1. hPSCs cultivadas como indiferenciadas Spheroids em um sistema de suspensão estática
      Nota: As células utilizadas nestes passos já deve estar adaptado paraunicelular cultura. 15
      1. Iniciar experiência com hPSCs cultivadas em gel de ECM em uma placa de cultura de 6 poços a aproximadamente 70 - 80% de confluência. Remova todas as colónias diferenciadas usando o microscópio estereoscópico no BSC. Adiciona-se 10 uM de inibidor ROCHA Y-27632 e incuba-se a 37 ° C durante 1 h.
        Nota: Para remover as colônias diferenciadas, use uma ponteira de separar e remova cuidadosamente todas as partes diferenciadas manualmente, ao microscópio estereoscópico. Tenha cuidado para não remover colônias indiferenciadas.
      2. Remover as células de incubadora e médio aspirado. Lavam-se as células com 1 ml de PBS, remover e adicionar 0,5 ml de enzima de dissociação de células. Incubar as células durante 4-5 minutos a 37 ° C.
      3. Adicionar 1 ml de meio hESC e colheita das células utilizando um raspador de células. Dissociar as células em células individuais utilizando uma pipeta P1,000. Contar as células viáveis ​​utilizando azul tripano e um hemocitómetro.
      4. Ressuspender as células para 2 x 10 5 c viávelells / ml em meio de células condicionado alimentador suplementado com 100 ng / mL de bFGF e 10 pM de inibidor ROCHA Y-27632. Transferir as células para placas ultra-baixas anexo usando uma pipeta de 5 ml (3 ml por cavidade de placa de 6 poços).
      5. Depois de 2 dias, remove cuidadosamente células da incubadora e meia aspirado do meio (aproximadamente 1,5 ml). Substitua por meio condicionado fresco suplementado com 100 ng / ml bFGF.
      6. Alterar a metade do meio de todos os dias com meio condicionado suplementado com 100 ng / ml bFGF até o dia 5. Agora, ou mais células de cultura, a passagem para a cultura indiferenciado continuou (passo 1.3.1.2 - 5), ou use para a diferenciação cardíaca (Seção 2 ). Se a cultura contínua, células de passagem a cada 4 - 8 dias.
    2. hPSCs cultivadas em células alimentadoras e passadas Usando colagenase tipo IV
      1. Antes passaging hPSCs, remova quaisquer colónias diferenciadas usando o microscópio estereoscópico no BSC. Aspirar o meio e lava-se as células com 1 mlPBS por poço. Remove seguida, adicionar 0,75 ml de colagenase de tipo IV (1 mg / ml) e incuba-se a 37 ° C durante 5-15 min, conforme necessário para ter os bordos das colónias a partir de descascar.
      2. Aspirar colagenase e adicionar 1 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas por poço. Retire colônias para pequenos grupos, utilizando um raspador de células, em seguida, transferir as células usando uma pipeta P1,000 para um tubo de 15 ml. Tenha cuidado para não quebrar os aglomerados em pedaços pequenos.
      3. Lave o meio hESC bem com 1 ml para coletar as células restantes e adicionar ao tubo de 15 ml. Centrifugar a 100 g durante 2 min. Aspirar as células do sobrenadante e ressuspender em meio de células estaminais embrionárias humanas, suplementado com 100 ng / ml de bFGF.
      4. Retirar uma placa revestida MEF da incubadora e aspirar o meio de MEF. Transferência das células a uma razão entre 1: 3 e 1:10, conforme apropriado. Mudança do meio ao dia com o meio de células estaminais embrionárias humanas fresco suplementado com 100 ng / ml de bFGF. células de passagem a cada 4 - 8 dias.

2. diferenciaramção de hPSCs como Spheroids em um sistema de suspensão estática

  1. Comece experimento utilizando dia 5 esferóides indiferenciadas como preparada no ponto 1.3.1.
    Nota: Nesta etapa, o tamanho médio de esferóides deve ser de 175 ± 25 pM. Um mínimo de 50 esferóides deve ser usado quando se inicia um experimento de diferenciação.
  2. Transferência esferóides para um tubo de 15 ml usando uma pipeta de 5 mL. Lavar a forma RB bem com 1 mL para recolher quaisquer restantes esferóides e adicionar ao mesmo tubo de 15 ml. Deixar as células durante 5 min até esferóides tiverem sedimentado para formar uma pelota solta (Não centrifugar). Aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não tomar quaisquer esferóides.
  3. Adicionar 3 ml de meio suplementado com RB 12 uM CHIR99021. Transferir as células de volta para um poço de uma placa de 6 poços de ultra-baixo de fixação. Após 24 horas, repita o passo 2.2.
    Nota: médio RB é sensível à luz. Quando se trabalha com meio RB, manter a luz BSC desligado.
  4. UMADD 3 ml RB médias ao sedimento celular. Transferir as células de volta para um poço de uma placa de 6 poços de ultra-baixo de fixação. Após 24 horas, repita o passo 2.2.
  5. Adicionar 3 ml de meio suplementado com RB IWP2, purmorphamine e SB431542 (5 | iM cada). Transferir as células de volta para um poço de uma placa de 6 poços de ultra-baixo de fixação. Após 2 dias, repita o passo 2.2.
  6. Ressuspender as células em 3 ml de meio de RB e transferência para uma placa revestida com gelatina para permitir que as células se fixem.
    Nota: Nesta fase, as células também podem ser mantidos em suspensão. Para continuar com a cultura em suspensão estática, transferir as células de volta para uma placa ultra-low anexo.
  7. Mudar o meio com 3 ml de meio RB após 2 dias. As culturas vai começar a bater dia seguinte. Alterar o meio a cada 3 - 4 dias com meio RB.

3. Diferenciação de hPSCs como Spheroids em um biorreator suspensão agitada

  1. Iniciar a experiência com a cultura esferóides indiferenciadod em suspensão estática durante pelo menos 3 passagens (ver secção 1.3.1). Adiciona-se 10 uM de inibidor ROCHA Y-27632 e incuba-se a 37 ° C durante 1 h.
  2. Remover as células da incubadora e transferir todos os esferóides para um tubo de 15 ml usando uma pipeta de 5 mL. Lava-se a células estaminais embrionárias humanas forma bem com 1 mL para recolher quaisquer restantes esferóides e adicionar ao mesmo tubo de 15 ml. Deixar as células durante 5 min até esferóides tiverem sedimentado para formar uma pelota solta (Não centrifugar). Aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não tomar quaisquer esferóides.
  3. Lavam-se as células por adição de 1 ml de PBS. Deixe por 5 min até esferóides tiverem sedimentado para formar uma pelota solta (Não centrifugar). Remover o sobrenadante e adicionar 0,5 ml de tripsina a 0,05% mais EDTA 0,53 mM. Incubar as células durante 4-5 minutos a 37 ° C.
  4. Remover as células a partir do incubador e adicionar 1 mL de meio de células estaminais embrionárias humanas. Com uma pipeta P1,000, dissociar as células em células individuais, contar as células utilizando azul tripano e um hemocitómetro. Ressuspender a 2 x 10 5 VIABle células / ml em meio condicionado complementado com 100 ng / mL de bFGF e 10 pM de inibidor ROCHA Y-27632.
  5. Transferir 100 ml de suspensão de células para o balão biorreator siliconizada com um pêndulo (ver Secção 1.2.5). Comece com agitação 35 rpm e depois de aumento de 24 hr a 40 rpm.
  6. Após 48 horas, parar a agitação durante 5 - 10 minutos até que todos os esferóides tenham assentado no fundo do frasco. Substituir metade do meio com meio condicionado complementado com 100 ng / ml de bFGF. Repita o mesmo processo a cada 24 horas até o dia 5.
    Nota: Nesta fase, esferóides indiferenciadas, que possuem um tamanho médio de 175 ± 25 pM deveriam ser formado.
  7. Pare agitação durante 5 - 10 minutos até que todos os esferóides tenham assentado no fundo do frasco. Transferir todos os esferóides para um tubo de 50 ml numa quantidade mínima de meio (menos do que 50 ml). Descartar qualquer forma fica no frasco biorreactor, com cuidado assegurando que nenhuma esferóides são restante no recipiente.
  8. leave o 5 - 10 minutos até que todos os esferóides se instalaram na parte inferior do tubo de 50 ml, em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pelete de células soltas. Lava-se com 25 ml de PBS com cálcio e magnésio ou meio RB, em seguida, sair de novo para 5 - 10 minutos até que todos os esferóides se instalaram na parte inferior do tubo de 50 mL para formar de novo um sedimento solto.
  9. Remova cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 40 ml de meio RB suplementado com 12 mM CHIR99021, 10 mM inibidor Rock e álcool poli vinílico 0,1% (PVA). Volte a suspender as esferóides e transferir todas as células de volta para o frasco biorreator. Adicionar meio para fazer o volume total de 100 mL. Reiniciar a agitação a 40 rpm durante 24 h.
    Nota: médio RB é sensível à luz. Quando se trabalha com meio RB manter o BSC à luz desligada modo.
  10. Repita os passos 3,7-3,8.
  11. Remova cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 40 ml RB meio suplementado com 0,1% de PVA. Volte a suspender as esferóides e transferir todas as células de volta para tele biorreator frasco. Adicionar meio para fazer o volume total de 100 mL. Reiniciar a agitação a 40 rpm durante 24 h.
  12. Repita os passos 3,7-3,8.
  13. Remova cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 40 ml de meio RB suplementado com IWP2, purmorphamine e SB431542 (5 m cada). Volte a suspender as esferóides e transferir todas as células de volta para o frasco biorreator. Adicionar meio para fazer o volume total de 100 mL. Reiniciar a agitação a 40 rpm durante 2 dias.
  14. Repita os passos 3,7-3,8.
  15. Remova cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 40 ml de meio RB somente. Volte a suspender as esferóides e transferir todas as células de volta para o frasco biorreator. Adicionar meio para fazer o volume total de 100 mL. Reiniciar a agitação a 40 rpm. esferóides batendo devem ser observadas 48-72 horas mais tarde.
  16. Mudar metade do meio a cada 3 - 4 dias com meio apenas por RB parar a agitação durante 5 - 10 minutos até que todos os esferóides tenham assentado no fundo do vaso. Cuidadosamente remover 50 ml de meio sem perturbar os esferóides e Carefully substituir com 50 ml de meio RB fresco.

4. Diferenciação de hPSCs utilizando culturas não adaptados a Passaging única célula

Nota: Esta abordagem é especialmente útil para a diferenciação rápida de um elevado número de linhas HPSC sem ter de se adaptar às técnicas de cultura de célula única, um processo que consome extremamente intensivo de trabalho e de tempo. Esta técnica é aplicável a linhas celulares que são altamente sensíveis à dissociação enzimática de células, tais como linhas HPSC recém-criadas.

  1. Iniciar a experiência com hPSCs cultivadas em MEF (como no ponto 1.3.2), que são cerca de 70 - 80% confluentes. Remova todas as colónias diferenciadas usando o microscópio estereoscópico no BSC.
  2. Remova o meio e adicionar 0,5 ml de dissociação Solution (DS). Incubar durante 0,5-1 min até que as células MEF foram arredondados para cima e as bordas das colônias hPSCs tornam-se claras. remover rapidamente DS e adicionar 0,75 mL de colagenase tipo IV (1 mg / ml).
  3. Incubaras células durante 5-15 min a 37 ° C. Verifique as células ao microscópio durante o período de incubação, e quando colônias inteiras estão começando a decolar e retirar, remova colagenase e adicionar 1,5 ml de meio hESC.
    Nota: Se após 15 min a maioria das colónias ainda estão ligados, colocar as células de volta para incubador. Verificar as células ao microscópio a cada 5 min. Tenha cuidado para não deixar as células em colagenase durante mais de 30 min. Se houver muitas colónias flutuantes na solução de colagenase, não remova a colagenase; basta adicionar 1 ml de meio hESC.
  4. Com uma pipeta P1,000, gentilmente pipeta colônias de separar colônias como um todo. Não quebre as colônias em pedaços pequenos. Transferir as células num tubo de 15 ml usando uma pipeta de 5 mL. Lava-se a bem com 1 mL de meio de células estaminais embrionárias humanas para recolher quaisquer células restantes para adicionar ao mesmo tubo. Deixe por 5 minutos até que todas as colónias tiverem sedimentado (Não centrifugar).
  5. Remova cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 2 ml hESC mediUM suplementado com 100 ng / ml de bFGF. Transferir as células em uma placa de ultra-baixo anexo usando 5 ml de uma pipeta (1 ml em cada poço de uma placa de 24 poços e 3 mL em cada poço de uma placa de 6 poços). Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante pelo menos 6 horas (máximo de 12 h).
  6. Durante este tempo, preparar o número necessário de tubos de laminina poços / placas para o passo 4.7. rácios de transferência de células recomendadas são um confluente poço de uma placa de 6 poços para 2 poços de uma placa de 24 poços (ou quantidade equivalente por unidade de superfície).
  7. Após 6 horas, transferir cuidadosamente os agregados colônia em um tubo de 15 ml usando 5 ml pipeta. Lava-se a placa com meio de RB para recolher quaisquer agregados remanescentes e adicionar ao mesmo tubo de 15 ml (0,5 ml por poço de 24 poços e 1 ml por poço para placas de 6 poços). Aguarde 5 minutos até que o sedimento agregados, em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Tenha cuidado para não perturbar o pellet solto.
  8. Adicione 2 ml de meio RB suplementado com 12 mM CHIR99021 e transferir cuidadosamentecom uma pipeta de 5 ml para os seus poços pré-revestidos preparados de laminina (tal como na Secção 1.2.4) para permitir que as células se fixem.
  9. Após 24 horas, retire cuidadosamente o meio em cada poço e adicionar 1 ml de meio RB somente.
    Nota: Alguns dos agregados só vai ter anexado muito fracamente com a placa de cultura; por isso é importante para não remover quaisquer grandes agregados que podem ter se soltado durante o procedimento de mudança de meio. É importante, no entanto, para remover o máximo de pequenos detritos célula quanto possível.
  10. Após 24 horas, retire cuidadosamente a médio e adicione meio RB suplementado com IWP2, purmorphamine e SB431542 (5 m cada).
  11. Mudar o meio após 2 dias com único meio RB. As células vão começar a bater dia seguinte.
  12. Alterar o meio a cada 3 - 4 dias, com apenas meio RB.

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Representative Results

A fim de estabelecer um método simples para a diferenciação em larga escala de cardiomiócitos de hPSCs, criámos um protocolo em que as células foram tratadas inicialmente com um activador da via Wnt / β-catenina (CHIR99021) 16 e subsequentemente com inibidores da via Wnt / β- catenina e vias de crescimento factor de transformação de-β (TGF-β) (IWP2 16 e SB431542 17, respectivamente) e, finalmente, um activador do sonic hedgehog (SHH) via (purmorphamine) 17 (Figura 1A). Na nossa estratégia de diferenciação, (175 ± 25 um de diâmetro esferóide tamanho) começou a bater 7 dias após o início da diferenciação, o que, em seguida, aumentada para 100% no dia 10. Curiosamente, utilizando este protocolo, foram observados cerca de 50% dos esferóides esferóides diferenciadas para continuar batendo até 60 dias após o início de diferenciação 18. Estudos populacionais sobre esferóides dissociadasexaminadas por citometria de fluxo revelou que no dia 15, mais do que 90% da população continham células troponina T positivas (TnT +), enquanto que menos de 12% das células foram positivas para o músculo liso e marcadores de células endoteliais (3,1% Willebrand Factor de von (vWF +), 8,4% de alfa actina de músculo liso-positivo (ASMA +)) 18. Até à data, o protocolo de diferenciação suspensão estática foi testado em células estaminais embrionárias humanas 5 e 4 hiPSC linhas, com saídas, resultando em aproximadamente 90% de superar esferóides de cada linha, mostrando a elevada reprodutibilidade deste protocolo entre diferentes linhas HPSC (Figura 1B).

A fim de desenvolver uma plataforma integrada para a produção em larga escala de cardiomiócitos humanos, aplicou-se a estratégia de diferenciação suspensão estática para um biorreactor de suspensão agitada (Figura 2A). Os esferóides diferenciação apresentaram comportamento semelhante no biorreator eMBIENTE como no sistema estático (figura 2B) e foram observadas cerca de 100% de esferóides estar batendo no dia 10 18. A imunocoloração nas secções de bater esferóides recolhidos no dia 30 utilizando anticorpos contra TnT e o factor de transcrição cardíaca NKX2-5, mostrou expressão citoplasmática e nuclear destas proteínas, respectivamente (Figura 2C). O rendimento total de células na cultura em suspensão dinâmico foi de aproximadamente 90 - 100 milhões de células em 100 ml de volume de trabalho, após 15 dias de cultura de diferenciação. Sendo este o caso, o rendimento dos cardiomiócitos pode atingir até cerca de 54-90000000 células (com o observado 60 - eficácia diferenciação de 90%) a partir de 20 milhões de hPSCs de partida, inoculadas em fase de expansão hPSCs como células individuais. Nós, adicionalmente, examinaram as propriedades eletrofisiológicas de cardiomiócitos diferenciadas utilizando o método de patch-clamp de uma única célula. Batendo esferóides das culturas de biorreatores foramdissociado em células individuais no dia 30 e de ação potenciais gravados em células representativas que utilizem toda a técnica patch clamp celular. Os dados mostraram que a presença dos três tipos de células principais cardíaca (atrial-, nodal- e células ventriculares-like) na população de células individuais 18.

Para as duas técnicas de diferenciação mencionados acima, hPSCs precisa de ser adaptado para e / ou livre de alimentação de uma única célula de cultura em suspensão 19-21. Algumas linhas HPSC no entanto, são altamente sensíveis a dissociação de células enzimática e mostram perda significativa de viabilidade celular após a dissociação, tal como pode ser observado em linhas hiPSC recém-criadas. Além disso, quando se trabalha com grandes grupos de linhas, adaptando todos Alimentador livre e da cultura de uma única célula seria extremamente trabalhoso e demorado. Para resolver estas questões, esferóides indiferenciadas foram substituídos por agregados de células indiferenciadas (Figura 3A).Nossos dados mostram que o uso desta técnica modificada, os clusters batendo apareceu 7 dias após o início diferenciação. A reprodutibilidade desta versão modificada foi confirmado usando 42 linhas hiPSC, onde todas as linhas testadas gerados em mais de 60% ​​de células médias + TnT por dia 15 para cada experimento realizado (Figura 3B). A imunocoloração utilizando anticorpos contra e TnT NKX2-5 em aglomerados batendo dissociadas mostraram expressão citoplasmática e nuclear, respectivamente (Figura 3C).

figura 1
Figura 1. Esquemático de Cardiomyocyte Diferenciação de hPSCs em suspensão estática e dados representativos. (A) Projeto Experimental de hPSCs diferenciação de cardiomiócitos em sistema de suspensão estática. (B) Avaliação da eficiência dediferenciação cardíaca é medida pela contagem do número de esferóides batendo (%). Mostrado aqui são as médias de pelo menos 3 experiências de diferenciação de cada um dos 5 hESC e 4 linhas hiPSC 18. média geral de bater esferóides de todas as linhas é de aproximadamente 90%. As barras de erro representam SD (n = 3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Esquema geral de cardiomiócitos Diferenciação de hPSCs em Suspensão Dinâmico e dados representativos. (A) Projeto Experimental de diferenciação hPSCs de cardiomiócitos em sistema de suspensão dinâmica. RI: inibidor Rock (B) imagem de contraste de fase do dia 5 esferóides (r Representanteesultado da linha Royan H5 hESC). Barra de escala de 200 mm (C) imunomarcação de células estaminais embrionárias humanas derivadas de bater esferóides seccionados no dia 30 para Nkx2.5 e cTnT. Barra de escala de 100 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Esquema geral de cardiomiócitos Diferenciação de hPSCs utilizando culturas não adaptadas para Passaging única célula. (A) Projeto Experimental de hPSCs diferenciação de cardiomiócitos utilizando culturas não adaptadas às passaging única célula. (B) Citometria de fluxo análise dos agregados dissociadas mostrar, em média, mais de 60% ​​de cTnT + células em 42 linhas hiPSC testados. (C) imunocoramento dissociada derivado de cardiomiócitoshiPSCs para Nkx2.5 e cTnT (resultado Representante 646-4 linha hiPSC). Barra de escala de 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os cardiomiócitos derivados de hPSCs são uma fonte extremamente atraente para uso em modelagem doença humana, os testes de triagem / toxicidade do fármaco e, talvez, no futuro, as terapias de regeneração. Um dos principais obstáculos para a utilização destas células no entanto, é a capacidade de fornecer o material de alta qualidade suficiente para a sua utilização eficaz. Usando nosso protocolo descrito, oferecemos um método que supera essa limitação.

Recentemente, pequenas moléculas sintéticas visando vias específicas de sinalização envolvidos na cardiogenesis têm sido descritos para melhorar 16,17,22,23 diferenciação cardíaca. Estes estão agora a ser utilizado como uma alternativa para as citocinas recombinantes e de soro, contendo muitos factores indefinidas e que mostram a variação de lote. A principal vantagem de uma pequena protocolo molécula, diferente da sua especificidade, é que é de baixo custo e factores componente geralmente têm um tempo de conservação prolongado, em comparação com meio contendo as citocinas ou factores de crescimento. À medida que as pequenas moléculas utilizadas no nosso protocolo relatado são agentes de baixo peso molecular, que são estruturalmente e funcionalmente definidas e podem difundir facilmente através da membrana celular 24,25.

Até agora, diversos métodos foram aplicados para hPSCs, a fim de estabelecer, técnicas de diferenciação robustos escaláveis; No entanto, a maioria destes métodos foram estabelecidos como culturas estáticas 2D e de pequena escala, que pode oferecer pobre escalabilidade e homogeneidade. Técnicas como a agregação forçada, tecnologias de micro-impressão e culturas micro-transportadora 26-29 agora estão entrando em uso, mas, apesar de alguns avanços nesta área, estes métodos ainda estão longe de fornecer os números de células necessárias para a sua utilização em alta sistemas -demand. reprodutibilidade limitada ou não comprovada e escalabilidade, e os custos elevados devido à necessidade de meios caros (mTeSR1 ou StemPro-34) ou micro-operadoras, tanto para expansão da hPSCs e sua diferenciação direcionado para cardiomyocytes 30,31, são as desvantagens de usar esses métodos em tecnologias hPSCs alto rendimento.

Neste estudo, que relataram um protocolo simples, robusta e escalável para a produção de cardiomiócitos HPSC-derivados. A reprodutibilidade deste protocolo foi validado com mais de 40 linhas HPSC diferentes, a validação mais extensa relatado à data. Em comparação com protocolos de suspensão relatados anteriormente, este método mostra grandes vantagens em termos de escalabilidade, reprodutibilidade, acessibilidade, eficácia e funcionalidade dos cardiomiócitos gerados. O sucesso do nosso protocolo de diferenciação é completamente dependente da qualidade dos hPSCs utilizados para o estudo. Por isso, é crucial para verificar cariótipo de cada linha e a expressão elevado e sustentado de marcadores de pluripotência por imunocoloração e PCR antes de iniciar o experimento. Particularmente, quando a cultura de células no biorreactor, é crucial usar hPSCs que Been passadas ao nível de uma única célula por pelo menos três passagens antes do início da diferenciação. Nos nossos protocolos temos utilizado esferóides com um tamanho médio de 175 ± 25 pM, que foram gerados esferóides após 5 dias. O dia que os esferóides satisfazer esta limitação de tamanho pode variar dependendo da taxa de crescimento das linhas de HPSC individuais; Por conseguinte, é importante que o tamanho, mais do que o dia de crescimento, é tomado em consideração.

Este protocolo pode também ser manipulada para se tornar adequado para linhas de células sensíveis e grandes grupos de linhas HPSC. Embora este protocolo resulta em cardiomiócitos altamente enriquecidas, a pureza pode ser melhorada pela combinação com o protocolo de diferenciação um método de selecção metabólica tal como o meio enriquecido em lactato 32. Além disso, melhorias na maturação e funcionalidade dos cardiomiócitos derivados descritos neste protocolo pode ser aplicado pela geração de tridimensional cardíaca, alinhadotecidos 33. Uma das limitações deste protocolo é que subtipos específicos de cardiomiócitos não são especificamente gerado, simplesmente uma mistura de fibrilação ventricular e as células nodais. Outras investigações neste campo é necessário para desenvolver protocolos de diferenciação que podem produzir cardiomiócitos específicos do subtipo altamente enriquecido em grande escala. Embora alguns protocolos de pequena escala tenham sido desenvolvidos até à data, os métodos que têm de ser rigorosamente testados para assegurar o aumento de escala é possível 34.

Desenvolvimento de tais plataformas integradas pode ser considerado como um passo importante para a comercialização de tecnologias cardiomiócitos HPSC derivadas para clínica, farmacêutica, engenharia de tecidos e em órgãos vitro aplicações de desenvolvimento / organ�de.

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Disclosures

O Chang Instituto de Pesquisa Cardíaca Victor não se envolver em, nem tolera, a destruição de embriões humanos para pesquisa. A sua contribuição para este estudo foi limitado a trabalhar em células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Life Technologies 10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR) Life Technologies 10828028
Glutamax Life Technologies 35050061
MEM Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Miltenyi Biotec 130-093-843
RPMI1640 Life Technologies 11875093
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190144
DPBS Life Technologies 14287072
Attachment Factor (AF) Life Technologies S006100
ECM Gel Sigma-Aldrich E1270
Laminin Invitrogen 23017-015
DMEM Life Technologies 11965-092                                                                                                       
Fatal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071
B27 minus insulin Gibco A18956-01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063
0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
Collagenase Type IV Life Technologies 17140-019
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C7902
Mitomycin C Bioaustralis BIA-M1183
CHIR99021 Miltenyi Biotec 130-104-172
IWP2 Miltenyi Biotec 130-105-335
SB431542 Miltenyi Biotec 130-095-561
Purmorphamine Miltenyi Biotec 130-104-465
ROCK inhibitor Y-27632 Miltenyi Biotec 130-104-169
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Poly Vinyl Alcohol (PVA) Sigma-Aldrich 363073
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Trypan Blue Bio-Rad 145-0013
Accumax  Innovative Cell Technologies Inc. AM105
Sigmacote  Sigma-Aldrich SL2 
CELLSPIN Integra Biosciences 183 001
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml  Integra Biosciences 182 023
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Prepared in-house (or commercially available)
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines Prepared in-house (or commercially available)

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References

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